Abstrakt

Cistanche tubulosa(Schenk) Orobanchaceae oilasiga mansub qimmatbaho oziq-ovqat va dorivor o'simlik bo'lgan Wight Xitoyning Shinjon janubida keng tarqalgan. Uning asosiy bioaktiv feniletanoid glikozid tarkibiy qismlari,echinacosidevaakteozid (verbaskozid), anti-oksidlanish, yallig'lanishga qarshi va immunitetni tartibga solish kabi bir nechta farmakologik faoliyatni taqdim eting. Standartlashtirilmagan an'anaviy qayta ishlash protseduralari ko'pincha ushbu asosiy faol birikmalarning sezilarli yo'qotilishiga olib keladi, bu esa dorivor va funktsional oziq-ovqat mahsulotlarini cheklaydi.Cistanche tubulosaqaynatma bo'laklari. Ushbu tadqiqot yangi uchun zamonaviy qayta ishlash parametrlarini optimallashtirishga qaratilganCistanche tubulosaakteozid va echinakozidning tiklanishini maksimal darajada oshirish va antioksidlovchi-stress va yallig'lanishga qarshi bioaktivlikni, shuningdek, hujayra darajasida optimal qayta ishlangan qaynatma bo'laklarining asosiy molekulyar mexanizmini yanada aniqlashtirish uchun bo'laklar.

Dilim qalinligi, bug'da pishirish davomiyligi va pechda quritish harorati uchun tegishli diapazonlarni ko'rish uchun bir faktorli tajribalar o'tkazildi. Ko'p faktorli o'zaro ta'sir modellarini yaratish uchun uch faktorli uch darajali Box-Behnken javob-yuzaki metodologiyasi ikki tomonlama baholash ko'rsatkichlari sifatida akteozid va echinacoside tarkibidan foydalangan holda qabul qilindi. Keyinchalik, lipid peroksidatsiyasi va o'tkir yallig'lanish shikastlanishini taqlid qilish uchun lipopolisakkarid (LPS) bilan stimulyatsiya qilingan RAW264.7 sichqoncha makrofagi hujayra modeli yaratildi. Antioksidant-stress kuchini baholash va signal o'tkazish yo'llarini o'rganish uchun MTT, ROS floresan aniqlash, ELISA va Western blot kabi bir qator biokimyoviy tahlillar amalga oshirildi.

Eksperimental natijalarga ko'ra, optimal ishlov berish parametrlari bo'lak qalinligi 0,6 sm, bug'da ishlov berish 6 minut va quritish harorati 57 darajaga o'rnatildi. Ushbu amaliy ishlov berish sharoitida akteozid va echinakozidning o'lchangan tarkibi mos ravishda 7,25% va 31,62% ga etdi, bu nazariy prognoz qiymatlari bilan yaxshi muvofiqligini ko'rsatdi. Hujayra asosidagi tahlillar shuni ko'rsatdiki, eng yaxshi ishlov berilganCistanche tubulosaQaynatma bo'lagi ekstraktlari LPS bilan sinovdan o'tgan RAW264.7 makrofaglarida azot oksidi (NO) va malondialdegid (MDA) kontsentratsiyasini sezilarli darajada kamaytiradi. Shu bilan birga, u superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), laktat dehidrogenaza (LDH) va glutation (GSH) miqdorining ortishi bilan birga hujayra ichidagi antioksidant ferment faolligini sezilarli darajada oshirdi. TNF-, IL-1 va IL-6 kabi yallig'lanishga qarshi vositachilarning sekretsiya darajalari ham dozaga bog'liq tarzda bostirildi. Western-blot aniqlash buni tasdiqladiCistanche tubulosaekstraktlar p38/AKT/JNK/NF‑kB signal kaskadlarida asosiy oqsillarning ortiqcha fosforlanishini cheklaydi.

Xulosa qilib aytganda, ushbu optimallashtirilgan zamonaviy qayta ishlash protokoli feniletanoid glikozidlarning xarakterli hosildorligini samarali ravishda yaxshilaydi (akteozid va echinacoside).Cistanche tubulosaqaynatma bo'laklari. Qayta ishlangan o'simlik materiallari LPS tomonidan qo'zg'atilgan makrofaglarning shikastlanish modelida sezilarli anti-oksidlovchi-stress va yallig'lanishga qarshi ta'sir ko'rsatadi, uning farmakologik mexanizmi qisman p38/AKT/JNK/NF-KB yallig'lanish signalizatsiyasining haddan tashqari faollashuvini inhibe qilish orqali amalga oshiriladi. Ushbu ish standartlashtirilgan sanoat ishlab chiqarish uchun ishonchli texnik parametrlarni ta'minlaydi va undan olingan antioksidant funktsional oziq-ovqat mahsulotlarini ishlab chiqish uchun eksperimental yordam beradi.Cistanche tubulosa.

Kalit so'zlar: Cistanche tubulosa; qaynatma bo'laklarini qayta ishlash texnologiyasi; akteozid; echinacoside; antioksidlovchi stress; RAW264.7 makrofagi; p38/AKT/JNK/NF‑kB signalizatsiya yo'li

1. Kirish

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight Orobanchaceae oilasiga tegishli bo'lib, uning go'shtli poyasi rasmiy dorivor qismdir. Bu cho'l dorivor o'simlik asosan Xitoyning Shinjonning qurg'oqchil janubida ekilgan. Xitoyning an'anaviy o'simlik amaliyotida,Cistanche tubulosaBuyrak-yangini tonlash, qonning mohiyatini to'ldirish va ichak harakatini bo'shashtirish kabi hujjatlashtirilgan terapevtik funktsiyalari bilan klassik tonik o't bo'lib xizmat qiladi. Klinik jihatdan u bel va tizzalardagi og'riq-zaiflikni, buyrak etishmovchiligidan kelib chiqadigan bepushtlikni va ichakning quruqligidan kelib chiqqan ich qotib qolishni yo'qotish uchun qo'llaniladi.

Feniletanoid glikozidlar eng muhim biologik faol belgilar hisoblanadiCistanche tubulosa. Xitoy farmakopeyasida echinakozid va akteozidning umumiy miqdori malakali dorivor materiallar uchun 1,50% dan kam bo'lmasligi kerakligi ko'rsatilgan. Shunga qaramay, hozirgi asosiy ishlab chiqarishCistanche tubulosaQaynatma bo'laklari hali ham qadimgi qo'lda ishlov berish jarayonlariga amal qiladi: yangi xom o'tni namlash, yaxshilab namlash, tilim va tabiiy quritish yoki sharobni bug'lash. Ushbu an'anaviy yondashuvlar aniq miqdoriy texnik xususiyatlarga ega emas. Feniletanoid glikozidlarning termal beqarorligi ko'pincha qayta ishlash jarayonida faol tarkibiy qismlarning jiddiy buzilishiga olib keladi, bu yakuniy mahsulot sifatini pasaytiradi va keng ko'lamli yuqori sifatli ishlab chiqarishni cheklaydi. Hozirgi vaqtda faqat cheklangan tadqiqotlar qayta ishlash texnologiyasini optimallashtirish bilan biologik faollikni tekshirishni birlashtiradi; Aksariyat tadqiqotlar uyali funktsional tekshiruvsiz kimyoviy tarkibiy qismlarni aniqlaydi, bu esa Google uchun sanoat transformatsiyasi uchun bo'shliqlarni yaratadi....

Oksidlanish stressi ko'plab surunkali metabolik va yallig'lanish kasalliklari uchun asosiy patologik tetik rolini o'ynaydi. Haddan tashqari reaktiv-kislorod turlarining (ROS) to'planishi redoks gomeostazini buzadi, makrofaglarning haddan tashqari faollashishini va yallig'lanishga qarshi sitokinlarning massiv chiqarilishini qo'zg'atadi, oksidlanish va yallig'lanish o'rtasida ayovsiz tsiklni hosil qiladi. Mavjud farmakologik tadqiqotlar buni isbotladiCistancheFeniletanoid glikozidlarning kelib chiqishi antioksidant va yallig'lanishga qarshi xususiyatlarga ega. Avvalgi hayvonlar tajribalari buni ko'rsatdiCistanche tubulosaumumiy glikozidlar Nrf2/HO‑1 antioksidant signalini faollashtirish orqali sepsis kemiruvchilar modellarida jigar shikastlanishini yaxshilagan. dan ajratilgan lignan-glikozid komponentlariCistanche tubulosaRAW264.7 makrofaglarida PI3K/AKT yo'lini modulyatsiya qilish orqali LPS tomonidan qo'zg'atilgan yallig'lanish reaktsiyalarini yumshata oladi. Biroq, yangi optimallashtirilgan qayta ishlash sharoitida ishlab chiqarilgan qaynatma qismlari kuchli antioksidlovchi-stress bioaktivligini saqlab qolishi tizimli ravishda baholanmagan. Beton molekulyar tartibga solish mexanizmi hali ham chuqurroq o'rganishni talab qiladi.

LPS bilan stimulyatsiya qilingan RAW264.7 makrofagi yaxshi qabul qilingan in-vitro yallig'lanish-oksidlanish-zarar modeli bo'lib, tabiiy mahsulotlarning antioksidant va yallig'lanishga qarshi ta'sirini baholash uchun keng qo'llaniladi. Ushbu tadqiqotda biz birinchi navbatda bitta faktorli skriningni o'tkazamiz, so'ngra yuqori akteozid va echinakozid hosildorligiga qaratilgan standartlashtirilgan dilimlash-bug'lash-quritish texnik parametrlarini olish uchun Box-Behnken reaktsiyasi-sirtini optimallashtirish. Optimallashtirilgan damlamali mahsulotlarni olganimizdan so'ng, biz o'simlik ekstraktlarini tayyorlaymiz va LPS tomonidan ishlab chiqarilgan RAW264.7 uyali shikastlanish modelini qabul qilamiz. Oksidlanish-stress-biokimyoviy-markerni o'lchash, sitokin Elishay miqdorini aniqlash va Western-blot yo'li tahlilini o'z ichiga olgan bir nechta eksperimental platformalar anti-oksidlovchi-stress samaradorligi va signalni uzatish mexanizmini aniqlashtirish uchun ishlatiladi. Ushbu tadqiqot yuqori sifatli tajriba miqyosidagi ishlab chiqarish uchun amaliy jarayon parametrlarini taqdim etadiCistanche tubulosaBarqaror anti-oksidlanish-stress faolligiga ega bo'lgan qaynatma bo'laklari va Shinjondan ishlab chiqarilgan funktsional oziq-ovqat va xun qo'shimchalari mahsulotlarini keyinchalik ishlab chiqish uchun eksperimental asos yaratadi.Cistanche tubulosaresurslar.

2. Materiallar va usullar

2.1 Xom ashyo, reagentlar va asboblar

YangiCistanche tubulosago‘shtli poyalari Xitoyning Shinjon-Uyg‘ur avtonom rayoni Xotan shahridan kuzda yig‘ib olingan. RAW264.7 sichqoncha monotsit-makrofagli leykemiya hujayra liniyasi Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Uxan, Xitoy) dan sotib olindi. Xromatografik darajadagi asetonitril va metanol Merck (Germaniya) tomonidan yetkazib berildi. Yo'naltiruvchi standart moddalar echinacoside va acteosid (tozaligi 98% dan yuqori yoki teng) Pekin Shimoliy Veyye Metrologiya Texnologiyalari Tadqiqot Institutidan olingan. Dimetil sulfoksid (DMSO) Sigma‑VETEC (AQSh) dan sotib olindi. DMEM yuqori glyukoza muhiti, BCA umumiy protein tahlili to'plami Thermo Fisher Scientific (AQSh) kompaniyasining mahsulotlari edi. Homila sigir zardobi (FBS) BI (Isroil) dan sotib olindi. Penitsillin-streptomitsin ikki antikor eritmasi HyClone (AQSh) dan kelgan. NO, MDA, SOD, CAT, GSH uchun tijorat tahlil to'plamlari Beyotime Biotechnology (Shanxay, Xitoy) dan sotib olingan. LDH aniqlash to'plami va lipopolisakkarid (LPS,E. coli055:B5) Solarbio (Pekin, Xitoy) dan olingan.

Asosiy laboratoriya asboblari orasida Shimadzu yuqori samarali suyuqlik-xromatografiya (HPLC) tizimi, LabTech aylanadigan bug'lanish moslamasi, burilish tipidagi yuqori tezlikda xitoy o'tlarini maydalagich, termostatik quritish pechi, bug'li qozon o'qish uskunasi, BioTek SYNERGY1-o'qish moslamasi, multiplate mo'ljallangan. FA1204N elektron analitik tarozi, CF1524R sovutgichli sentrifuga, BSC‑1300IIA2 bioxavfsizlik shkafi va BDS200‑PH teskari optik mikroskop.

2.2 Bir faktorli ishlov berish tajribalari

YangiCistanche tubulosago'shtli poyalari turli qalinlikdagi (0,2 sm, 0,4 sm, 0,6 sm, 0,8 sm, 1,0 sm, 1,2 sm) bo'laklarga kesilgan. Dilimlar turli muddatlarda bug'langan (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Keyin materiallar turli xil harorat gradyanlari ostida quritilgan (atrof-muhit 25 daraja, 40 daraja, 50 daraja, 60 daraja, 70 daraja, 80 daraja). To'liq quritilgan qaynatma bo'lagi namunalari kukunga aylantirildi va HPLC komponentining keyingi miqdorini aniqlash uchun 40 meshli elakdan o'tkazildi.

2.3 Akteozid va Echinacoside tarkibini aniqlash

Namuna eritmasini tayyorlash: 1,0 g maydalangan qaynatma bo'lagi kukunini tiqinli konussimon kolbaga aniq torting. 100 ml 50% metanol eritmasini aniq qo'shing. 30 daqiqa namlashdan so'ng 40 daqiqa ultratovush ekstraktsiyasini bajaring. Sovutgandan so'ng, erituvchining vazn yo'qotilishini 50% metanol bilan to'ldiring, teng ravishda aralashtiring va statik cho'kishiga imkon bering. Supernatant HPLC in'ektsiyasi uchun 0,22 mkm mikroporoz membrana orqali filtrlandi.

Malumot uchun standart eritma tayyorlash: akteozid va echinakozid etalon moddalarining tegishli miqdorini aniq torting, o'lchov kolbalarida 50% metanol bilan eritib oling, ketma-ket gradient standart eritmalarni tayyorlang, 0,22 mkm filtrli membrana bilan filtrlang.

Xromatografik sozlash: COSMOSIL C₁₈ analitik ustun; mobil fazali tizim: mobil faza A: 0,1% fosfor kislotasining suvli eritmasi; mobil faza B: asetonitril. Aniqlash to'lqin uzunligi 330 nm sifatida o'rnatildi; ustun harorati 35 daraja; oqim tezligi 1 ml/min. Akteozid va echinakozid miqdorini miqdoriy hisoblash uchun tashqi standart usul qo'llanildi. Keng qamrovli baholash balli=(ekinakozid tarkibi × 50 %) + (akteozid tarkibi × 50 %). Keng qamrovli ballar ishlov berish holati samaradorligini baholashning umumiy ko'rsatkichi bo'lib xizmat qildi.

2.4 Box-Behnken Response-Surface Experimental Design

Bir faktorli eksperimental natijalarga asoslanib, Design-Expert 13.0 dasturi Box-Behnken uch faktorli uch darajali eksperimental tartibni amalga oshirish uchun ishlatilgan. Bo'lak qalinligi (X₁, sm), bug'lash bilan ishlov berish vaqti (X₂, min), quritish harorati (X₃, daraja) mustaqil o'zgaruvchilar sifatida tanlangan. Akteozid tarkibi (Y₁, %) va echinacoside tarkibi (Y₂, %) javob qiymatlari edi. O'n etti guruh tajribalari o'tkazildi. Har bir omil uchun nol darajasi bitta faktorli testlarda olingan optimal parametrga muvofiq tanlangan. Yuzaki javob sinovlari tugallangandan so'ng, modelning variatsiyasini tahlil qilish, 3D-javob-yuzani chizish va holatni bashorat qilish tugallandi. Amaliy tekshirish tajribalari nazariy prognoz qilingan parametrlarni amaldagi ishlab chiqarish qiymatlariga moslashtirgandan so'ng amalga oshirildi.

2.5 Hujayra madaniyati va namuna tayyorlash

Qaynatma bo'lagi xom ashyo optimallashtirilgan ishlov berish sharoitida ishlab chiqarilgan. O'simlik kukuni yuqorida aytib o'tilgan namunani tayyorlash protokoli bo'yicha ekstraksiya qilingan, aylanma bug'lanish orqali konsentrlangan va qattiq ekstrakt kukunini olish uchun vakuumda quritilgan. Ekstrakt kukunini DMSOda eritib, hujayrali tajribalar uchun to'liq DMEM muhiti (tarkibida 10% FBS va 1% penitsillin-streptomitsin mavjud) bilan suyultirilgan zahira eritmasi tayyorlandi; yakuniy DMSO ish kontsentratsiyasi 0,1% (v/v) ostida nazorat qilindi. RAW264.7 makrofaglari DMEM to'liq muhitida 37 daraja, 5% CO₂ namlangan inkubator muhitida yetishtirildi.

2.6 MTT Sitotoksiklik tahlili

RAW264.7 xujayralari hujayra zichligi 8 × 10⁴ hujayra/ml bo'lgan 96-quduqli mikroplastinkalarga ekilgan. Eksperimental guruhlarga erituvchini nazorat qilish guruhi (0,1% DMSO muhiti), LPS-model guruhi (yakuniy LPS konsentratsiyasi 1 ug/ml) va bir nechtaCistanche tubulosaekstrakti konsentratsiyasi guruhlari (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). O'simlik namunasi bilan 2 soat oldin inkubatsiyadan so'ng LPS (1 ug/ml yakuniy konsentratsiya) erituvchi nazorat guruhidan tashqari har bir guruhga qo'shildi. Inkubatsiya 24 soat davom etdi. Keyin MTT reaktivi (5 mg/ml) qo'shildi va 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Supernatantni to'kib tashlang, har bir quduqqa 150 mL DMSO qo'shing, 15 daqiqa davomida 37 daraja chayqatiladi. 490 nm to'lqin uzunligidagi yutilish qiymati mikroplata o'quvchida o'qildi va hujayraning omon qolish darajasi hisoblab chiqildi. Keyingi funktsional testlar uchun xavfsiz ishlash konsentratsiyasi diapazoni aniqlandi.

2.7 Hujayra ichidagi ROS o'lchovi

RAW264.7 makrofaglari har bir quduq uchun 4 × 10⁵ hujayra zichligida oltita quduqli plitalarga emlangan. Hujayraga yopishgandan so'ng, guruhlash davolash amalga oshirildi: erituvchini nazorat qilish guruhi, LPS-model guruhi va KT ekstrakti bilan davolash guruhlari (12,5, 25, 50, 100 ug/ml). Namuna bilan 2 soatlik oldindan ishlov berishdan so'ng LPS 1 ug/ml qo'shildi, hal qiluvchi nazorat guruhidan tashqari, 24 soat inkubatsiya qiling. Hujayra ichidagi ROS darajasi to'plam ko'rsatmalariga muvofiq floresan-zondni yuklash usuli yordamida aniqlandi. Floresan intensivligi floresan mikroplata o'quvchi bilan o'lchandi (qo'zg'alish 488 nm, emissiya 525 nm).

2.8 NO, MDA, SOD, CAT, LDH va GSH ni aniqlash

Tegishli hujayra ishlovidan so'ng, Griess reaktsiyasini qo'llagan holda NO o'lchash uchun hujayra madaniyati supernatanti yig'ildi. Biriktirilgan hujayralar oldindan sovutilgan PBS bilan yuvildi, muz ustida lizing qilindi, hujayra lizatining supernatanti santrifüjdan keyin yig'ib olindi (10 000 r/min, 4 daraja, 5 min). BCA to'plami har bir namunadagi umumiy protein kontsentratsiyasini aniqladi. MDA, GSH va fermentativ faollik ko'rsatkichlari SOD, CAT, LDH tarkibi to'plamning foydalanish qo'llanmalariga qat'iy rioya qilgan holda tekshirildi.

2.9 Yallig'lanishga qarshi sitokinlarni Elishay orqali aniqlash

RAW264.7 hujayralari jami 16 soat davomida namunadan oldingi davolash va LPS stimulyatsiyasini oldi. Hujayra madaniyatining supernatanti yig'ildi va santrifüj qilindi. Supernatantdagi TNF‑ , IL‑1 , IL‑6 kontsentratsiyasi tijorat ELISA to'plamlari bilan aniqlangan.

2.10 Western-Blot tahlili

45 daqiqa LPS va namuna ko-inkubatsiyasidan so'ng, RAW264.7 xujayralari proteaz-fosfataza inhibitori kokteyli bilan to'ldirilgan RIPA lizis buferi yordamida lizing qilindi. Hujayra lizati 5 daqiqa davomida 10 000 r/min 4 darajadan past santrifüj qilindi. BCA to'plami umumiy protein kontsentratsiyasini aniqladi. Namuna oqsillari (har bir chiziq uchun 50 ug) 100 daraja metall hammomda 5 daqiqa davomida denatüratsiya qilindi. SDS‑PAGE gel elektroforezi maqsadli oqsillarni ajratdi, keyin ular PVDF membranalariga o'tkazildi. Membranalar 5% yog'siz sutli TBST eritmasi bilan 1 soat davomida bloklandi. p38, p‑p38, AKT, p‑AKT, JNK, p‑JNK, NF‑kB p65, p‑NF‑kB p65 va GAPDHga qaratilgan birlamchi antikorlar kechasi 4 darajada inkubatsiya qilindi. TBST yuvilgandan so'ng, mos keladigan ikkilamchi antikorlar xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Takroriy yuvishdan so'ng, oqsil diapazoni ko'rish uchun ECL ultra-sezgir kimilyuminesans reagenti qo'llanildi. Nisbiy fosforlanish-oqsil ifoda darajasini baholash uchun tarmoqli kulrang shkalasi miqdoriy tahlili amalga oshirildi.

2.11 Statistik tahlil

GraphPad Prism 8.0.2 dasturi statistik hisob-kitoblar va grafiklarni chizish uchun ishlatilgan. Eksperimental miqdoriy ma'lumotlar natijalari o'rtacha ± standart og'ish (\\(\\bar{x} \\pm s\\)) sifatida ifodalangan. Guruhlararo taqqoslash uchun bir tomonlama ANOVA va undan keyin post-hoc ko'p taqqoslash testlari qo'llanildi. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Eksperimental natijalar

3.1 Bir faktorli tajribalar natijalari

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 sm) ichki moddaning chiqishiga to'sqinlik qildi, yakuniy aniqlanadigan komponent tarkibini pasaytirdi. Ruxsat etilgan bug'lash vaqti (10 daqiqa) va quritish harorati (60 daraja) ostida 0,4 sm qalinlikdagi bo'lak qalinligi eng yuqori umumiy baholash balliga erishdi.

Bug'lash bilan ishlov berishning davomiyligi: bo'lak qalinligi 0,4 sm ga o'rnatilganda va quritish harorati 60 darajada saqlanganida, bug'lash vaqtining etarli emasligi o'simlik hujayrasi tuzilishini etarli darajada yo'q qila olmadi, shuning uchun faol moddalar eriydi. Bug'lash vaqti 6 daqiqadan oshib ketganda, haddan tashqari bug'lash shikastlangan o'simlik to'qimasini va echinakozid va akteozidning degradatsiyasini keltirib chiqardi. Shuning uchun 6 minut avval bug'da pishirishning maqbul davomiyligi sifatida aniqlandi.

Pechda quritish harorati gradienti tajribalari uchun: tilim qalinligi 0,4 sm va bug'lash vaqti 6 minut. Komponent tarkibi ma'lum diapazonda quritish haroratining oshishi bilan ko'tarildi. Quritish harorati 60 darajadan oshganidan so'ng, yuqori haroratli termal parchalanish maqsadli moddalar tarkibining sezilarli pasayishiga olib keldi. Shunday qilib, keyingi javob sirtini optimallashtirish uchun dastlabki optimal quritish harorati sharti sifatida 60 daraja tanlangan.

3.2 Box‑Behnken Response‑Surface optimallashtirish va tekshirish

Dizayn matritsasi bo'yicha Box-Behnken tajribalarining o'n etti guruhi yakunlandi. Variant-tahlil natijalari shuni ko'rsatdiki, akteozid va echinacoside tarkibi uchun regressiya modellari statistik ahamiyatga ega (\\(P)<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >bo'lak qalinligi.

Model matematik hisobi orqali nazariy optimal ishlov berish parametrlari: bo'lak qalinligi 0,600 sm, bug'da ishlov berish vaqti 5,685 min, quritish harorati 57,009 daraja. Haqiqiy sanoatda foydalanish imkoniyatini hisobga olgan holda, parametrlar bo'lak qalinligi 0,6 sm, bug'lash vaqti 6 min, quritish harorati 57 darajaga o'rnatildi. Parallel tasdiqlash bo'yicha uchta tajriba o'tkazildi. Ushbu amaliy sharoitda o'lchangan akteozid miqdori 7,25% ni, echinacoside miqdori 31,62% ga etdi. O'lchangan qiymatlar va nazariy bashorat o'rtasidagi og'ish 5% dan past bo'lib qoldi, bu esa bu javob-yuzaki modeli ishonchli va haqiqiy qaynatma bo'laklarini ishlab chiqarishni boshqarish uchun qo'llanilishini isbotladi.

3.3 Optimallashtirilgan ishlov berilganlarning sitotoksikligi skriningiCistanche tubulosaRAW264.7 hujayralarida ekstrakti

MTT sitotoksisitesi natijalari shuni ko'rsatdiki, 0‑100 ug/ml gacha bo'lgan ekstrakt konsentratsiyasi RAW264.7 makrofaglariga aniq toksik ta'sir ko'rsatmagan va hatto hujayra ko'payishini rag'batlantirish tendentsiyasini ko'rsatgan. Davolanish kontsentratsiyasi 200 ug/ml va 400 ug/ml ga ko'tarilganda, hujayraning omon qolish darajasi erituvchi nazorat guruhiga nisbatan sezilarli darajada kamaydi, bu konsentratsiyaga bog'liq sitotoksiklikni ko'rsatdi. Shuning uchun 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/ml, 100 ug/ml konsentratsiya gradientlari keyingi oksidlovchi-stress va yallig'lanish bilan bog'liq hujayra tahlillari uchun xavfsiz ish konsentrasiyalari sifatida tanlangan.

3.4 Cistanche tubulosaLPS-stimulyatsiya qilingan makrofaglarda hujayra ichidagi ROS darajasining pasayishi

Solventni nazorat qilish guruhi bilan solishtirganda, LPS-model guruhining hujayra ichidagi ROS floresan intensivligi juda sezilarli darajada oshdi (\\(P)<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaekstrakti, hujayra ichidagi ROS to'planishi dozaga bog'liq ravishda kamaydi. Har bir dori bilan davolash guruhi LPS modeli guruhiga nisbatan ROSning statistik jihatdan sezilarli darajada kamayganini ko'rsatdi (\\(P)<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 NO va MDA tarkibiga ta'siri

NO faollashtirilgan makrofaglar tomonidan chiqarilgan klassik yallig'lanish vositachisi bo'lib xizmat qiladi. MDA lipid-peroksidlanish oksidlanish shikastlanishini aks ettiruvchi oltin standart biomarkerdir. Solventni nazorat qilish guruhi bilan solishtirganda, LPS stimulyatsiyasi RAW264.7 hujayralarida NO va MDA tarkibini sezilarli darajada oshirdi (\\(P)<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosaekstrakti bilan ishlov berish NO konsentratsiyasini sezilarli darajada kamaytirishi mumkin. MDA ko'rsatkichi uchun: 12,5 ug/ml guruhi statistik jihatdan sezilarli yaxshilanishga olib kelmadi; 25‑100 ug/ml konsentratsiyali guruhlar MDA darajasini sezilarli darajada kamaytirdi (\\(P)<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Antioksidant bilan bog'liq biokimyoviy ko'rsatkichlarga ta'siri SOD, CAT, LDH, GSH

LPS sinovidan so'ng hujayra ichidagi SOD, CAT, LDH fermentativ faolligi, shuningdek, GSH tarkibi erituvchi nazorat guruhiga nisbatan keskin pasaydi (\\(P)<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaQaynatma bo'lagi ekstraktlari LPS tomonidan qo'zg'atilgan oksidlovchi insultlarga qarshi hujayraning endogen antioksidant mudofaa qobiliyatini tiklashi mumkin.

3.7 Yallig'lanishga qarshi sitokin TNF-, IL-1, IL-6 chiqarilishiga inhibitiv ta'siri

Elishay aniqlash natijalari LPS stimulyatsiyasi RAW264.7 makrofaglaridan TNF‑ , IL‑1 , IL‑6 sekretsiyasini kuchli targ‘ib qilganligini ko‘rsatdi (\\(P)<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosaEkstrakt bilan davolash konsentratsiyasidan so'ng, bu uchta asosiy yallig'lanishga qarshi sitokinlarning chiqarilish miqdori asta-sekin bostirilib, aniq dozaga javob korrelyatsiyasini ko'rsatdi. Bu o'simlik ekstrakti faollashtirilgan makrofaglardan yallig'lanishga qarshi sitokin sekretsiyasini to'xtatib, kuchli yallig'lanishga qarshi funktsiyani amalga oshirishini tasdiqladi.

3.8 p38/AKT/JNK/NF‑kB signalizatsiya yo'li fosforillanishi bo'yicha reglament

Western-blot eksperimental ma'lumotlari shuni ko'rsatdiki, p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK va p‑NF‑kB/NF‑KB nisbati LPS modeli guruhida hal qiluvchi nazorat guruhiga nisbatan sezilarli darajada oshgan (\\(P)<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaekstrakt aralashuvi p‑p38/p38 va p‑JNK/JNK nisbatlarini sezilarli darajada kamaydi (\\(P)<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaQaynatma bo'lagi ekstrakti p38/AKT/JNK/NF-KB signalizatsiya tarmog'ining giper-fosforillanish faollashuvini bostirish orqali oksidlovchi-yallig'lanish shikastlanishini engillashtirdi.

4. Munozara

Xitoy farmakopeyasida an'anaviy qayta ishlash talablariCistanche tubulosaasosan nopoklikni olib tashlash, yuvish, namlash, kesish va quritishni o'z ichiga oladi, tilim qalinligi, bug'lash muddati va quritish harorati uchun aniq raqamli parametrlarni ko'rsatmasdan. Standart bo'lmagan qo'lda ishlov berish tijorat qaynatmalari bo'laklari sifatining katta o'zgarishiga olib keladi. Feniletanoid glikozidlar (ekinakozid va akteozid) issiqlikka chidamli bioaktiv birikmalardir. Noto'g'ri isitish vaqti yoki harorati kimyoviy parchalanishni keltirib chiqaradi va dorivor qiymatini kamaytiradi. Bir faktorli tajribalarimiz shuni ko'rsatdiki, etarli darajada va haddan tashqari bug'lash, shuningdek, haddan tashqari yuqori quritish harorati maqsadli glikozid komponentlarini yo'qotishiga olib keladi. Keyinchalik Box‑Behnken ko'p faktorli optimallashtirish amaliy ishlab chiqarish parametrlarini oldi: bo'lak qalinligi 0,6 sm, bug'lash 6 min, quritish 57 daraja. Bunday holda, akteozid va echinacoside tarkibi 7,25% va 31,62% ga yetdi, bu farmakopeya minimal sifat chegarasidan ancha oshib ketdi. Ushbu optimallashtirilgan protokol Shinjonni standartlashtirilgan sanoat qayta ishlash uchun mumkin bo'lgan miqdoriy texnik ma'lumotlarni taqdim etadi.Cistanche tubulosa.

Oksidlanish stressi va yallig'lanish bir-biri bilan chambarchas bog'langan patologik jarayonlardir. Ortiqcha ROS lipid peroksidatsiyasini keltirib chiqaradi va MDA hosil qiladi, bu esa tug'ma immun makrofaglarni yanada faollashtiradi. Faollashtirilgan makrofaglar ko'p miqdorda NO va ko'plab yallig'lanishga qarshi sitokinlarni chiqaradi, bu esa aksincha hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarishni kuchaytiradi va o'z-o'zini kuchaytiruvchi oksidlovchi-yallig'lanish aylanasini hosil qiladi. Tabiiy o'simlikdan olingan antioksidant moddalar endogen antioksidant ferment tizimini ko'tarib, yallig'lanish signallarining uzatilishini cheklash orqali ushbu patologik halqani buzishi mumkin. Ushbu in-vitro tadqiqotida optimal tarzda qayta ishlanganCistanche tubulosaQaynatma bo'lagi ekstraktlari ROS, NO va MDA darajasini pasaytirdi, shu bilan birga LPS bilan stimulyatsiya qilingan RAW264.7 makrofaglarida SOD, CAT, LDH faolligini va GSH tarkibini kuchaytirdi. Bir vaqtning o'zida u TNF-, IL-1, IL-6 yallig'lanishga qarshi-sitokin sekretsiyasini inhibe qilib, integratsiyalashgan anti-oksidlovchi-stress va yallig'lanishga qarshi qobiliyatni namoyish etdi.

Mitogen-faollashtirilgan-protein-kinazlar oilasining p38, JNK molekulalari AKT va NF-KB bilan birgalikda makrofaglarning yallig'lanish-oksidlanish reaktsiyalariga vositachilik qiluvchi markaziy signal uzatish markazini tashkil qiladi. LPS stimulyatsiyasidan so'ng yuqori oqim signali p38, JNK va AKT ning fosforillanish faollashuvini qo'zg'atadi, bu NF‑KB p65 subunit fosforilatsiyasini va yadro translokatsiyasini ketma-ket rag'batlantiradi. Faollashtirilgan NF‑kB transkripsiya omili sifatida ishlaydi va yallig'lanishga qarshi sitokin va oksidlovchi stress bilan bog'liq genlarning katta partiyalarini transkripsiyasini boshlaydi. Bizning Western-blot natijalari shuni ko'rsatdiCistanche tubulosaekstrakti p38, JNK, AKT va NF‑kB p65 fosforillanishini bostirishi mumkin. Shunday qilib, biz uning anti-oksidlovchi-stress va yallig'lanishga qarshi bio-faolligiga, hech bo'lmaganda, p38/AKT/JNK/NF-kB signalizatsiya o'qining haddan tashqari faollashuvini blokirovka qilish orqali erishiladi, deb xulosa qilamiz.

Hozirgi tadqiqotda bir qancha cheklovlar mavjud. Barcha funktsional tekshiruvlar in-vitro hujayra madaniyati darajasi bilan cheklangan. Optimallashtirilgan qaynatma bo'laklarining in-vivo farmakodinamik ishlashini tekshirish uchun in-vivo hayvonlar namunasidagi qo'shimcha tajribalar talab qilinadi. Bundan tashqari, ushbu tadqiqot qaynatma bo'laklaridan jami aralash ekstraktni qabul qildi, shuning uchun biz echinacoside, acteosid va boshqa kichik ikkilamchi metabolitlarning individual hissasini ajrata olmaymiz. Kuzatuv tadqiqotlari tegishli anti-oksidlovchi-stress kuchini solishtirish va muvofiqlik ta'sirini tekshirish uchun monomer birikmalarini ajratishi mumkin. Shunga qaramay, bizning hozirgi ishimiz hali ham amaliy ishlov berish texnologiyasi parametrlarini va rivojlanish uchun dastlabki mexanik dalillarni taqdim etadi.Cistanche tubulosa- tegishli sog'liqni saqlash mahsulotlari.

5. Xulosa

Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, Box-Behnken javob sirt metodologiyasi (bo'lak qalinligi 0,6 sm, bug'lash 6 min, quritish harorati 57 daraja) tomonidan optimallashtirilgan modernizatsiya qilingan ishlov berish jarayoni uning akteozid va echinacoside tarkibini sezilarli darajada oshirishi mumkin.Cistanche tubulosaqaynatma bo'laklari. Ushbu optimal qayta ishlangan o'simlik bo'laklaridan tayyorlangan ekstraktlar LPS tomonidan qo'zg'atilgan RAW264.7 makrofaglarining shikastlanishiga qarshi sezilarli anti-oksidlovchi-stress va yallig'lanishga qarshi ta'sir ko'rsatadi. Asosiy mexanizm hujayra ichidagi antioksidant mudofaa tizimini tiklash va p38/AKT/JNK/NF‑KB yallig'lanish signalizatsiya yo'lining haddan tashqari faollashuvini inhibe qilish bilan bog'liq. Ushbu tadqiqot standartlashtirilgan sanoat ishlab chiqarish va funktsional-oziq-ovqat mahsulotlarini ekspluatatsiya qilish uchun mustahkam eksperimental asos yaratadiCistanche tubulosaresurslar.

Ma'lumotnomalar

Lin J, Yu H, Zhao Y va boshqalar. Ekinakozidni ekstraktsiya qilishCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight va uning sepsis kalamushlarida jigar shikastlanishiga himoya ta'sirini tekshirish. Food Sci Technol, 2023, 43: e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y va boshqalar. Lignan glikozidlarining yallig'lanishga qarshi ta'siriCistanche tubulosaPI3K/AKT yo'li orqali LPS/IFN-induktsiyalangan RAW264.7 makrofag hujayralariga tayanadi. Hozirgi farmatsevtik biotexnologiya, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singx RK va boshqalar. Oksidativ stress va metabolik kasalliklar: patogenezi va terapevtik strategiyalar. Hayot fanlari, 2016,148:183-193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. LPS-stimulyatsiya qilingan RAW264.7 hujayralarida dise-necionyl cis-xellactonning yallig'lanishga qarshiligi va uning eruvchan epoksid gidrolazadagi inhibitiv faolligi. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin MAPK va NF‑kB signalizatsiya yo'llarini bostirish orqali makrofaglarda lipopolisakkaridlar keltirib chiqaradigan yallig'lanish reaktsiyalarini engillashtiradi. Etnofarmakologiya jurnali, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. Yallig'lanish, hujayra o'limi va orqa miya shikastlanishidan keyin glial chandiq shakllanishida PI3K / AKT signalizatsiya yo'li. Hujayra proliferatsiyasi, 2022,55(9):e13275.