2.6. Kaspaza-3 va Kaspaza-6 ifodasi

Sistanx glikozidi, shuningdek, yurak va jigar to'qimalarida SOD faolligini oshirishi va har bir to'qimalarda lipofusin va MDA tarkibini sezilarli darajada kamaytirishi, turli xil reaktiv kislorod radikallarini (OH-, H₂O₂ va boshqalar) samarali tozalash va DNKning shikastlanishidan himoya qilishi mumkin. OH-radikallar tomonidan. Cistanche feniletanoid glikozidlari erkin radikallarni kuchli tozalash qobiliyatiga ega, S vitaminiga qaraganda yuqori darajada kamaytirish qobiliyatiga ega, sperma suspenziyasida SOD faolligini yaxshilaydi, MDA tarkibini kamaytiradi va sperma membranasi funktsiyasiga ma'lum bir himoya ta'siriga ega. Cistanche polisaxaridlari D-galaktoza sabab bo'lgan eksperimental qarigan sichqonlarning eritrotsitlari va o'pka to'qimalarida SOD va GSH-Px faolligini oshirishi, shuningdek o'pka va plazmadagi MDA va kollagen miqdorini kamaytirishi va elastin miqdorini oshirishi mumkin. DPPHga yaxshi tozalash ta'siri, qarigan sichqonlarda gipoksiya vaqtini uzaytirish, sarumdagi SOD faolligini yaxshilash va eksperimental qarigan sichqonlarda o'pkaning fiziologik degeneratsiyasini kechiktirish Hujayra morfologik degeneratsiyasi bilan tajribalar Cistanche yaxshi antioksidant qobiliyatiga ega ekanligini ko'rsatdi. va terining qarish kasalliklarini oldini olish va davolash uchun dori bo'lish potentsialiga ega. Shu bilan birga, Cistanchedagi echinacoside DPPH erkin radikallarini tozalashning muhim qobiliyatiga ega va reaktiv kislorod turlarini tozalash va erkin radikallar keltirib chiqaradigan kollagen degradatsiyasini oldini olish qobiliyatiga ega, shuningdek, timin erkin radikal anionining shikastlanishiga yaxshi ta'sir ko'rsatadi.

Antioksidant uchun Cistanche Tubulosa bilan tanishish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

TgAPP sichqonlari kaspaz {0}} gen ekspresyonining o'sishini ko'rsatdi (8C1, H1-rasm), bu WT sichqonlarining hipokampisiga nisbatan sezilarli va 30 foizdan ko'proq edi (8H1-rasm; p <0,05). Kaspaza{9}} ifodasiga kelsak, transgen va transgen bo'lmagan sichqonlar o'rtasida hech qanday farq kuzatilmadi (8C2, H2-rasm).

Quercetin va rutin bilan davolash hipokampusdagi kaspaza {0}} mRNK darajasini statistik jihatdan sezilarli darajada kamaytirishga muvaffaq bo'ldi (8H1-rasm; p < 0.05), inhibisyon foizlari taxminan 17 foizni tashkil etdi. urg'ochi va erkak sichqonlar uchun mos ravishda 27 foiz. Miya yarim korteksida faqat erkaklarda rutin bilan davolashda sezilarli farqlar kuzatildi (8C1-rasm; p <0,05).

Kaspaz-6 haqida, quercetin va rutin bilan davolash korteks yoki gippokampda statistik jihatdan ahamiyatli ta'sir ko'rsatmadi (8C2, H2-rasm), ammo ikkinchisida TgAPP erkaklaridagi Kaspaz-6 ga moyillik ko'rsatdi. kamayadi (8H2-rasm).

2.7. Yallig'lanish belgilari

Yallig'lanish vositachilari IL-1, TNF- va IFN- gen ekspressiyasi uchun olingan natijalar 9-rasmda ko'rsatilgan.

TgAPPda WT sichqonlariga nisbatan har ikki jinsdagi korteks va gippokampusda IL{0}} gen ekspresyonida 20 foizga sezilarli o'sish kuzatildi (9C1, H1; p-rasm). < 0,05). TNF-ga kelsak, TgAPPda yuqoriroq mRNK darajalari ko'rsatilgan bo'lsa-da, WT sichqonlarida ular statistik ahamiyatga ega emas (9C2, H2-rasm). IFN-ga kelsak, erkaklarda uning ifodalanishida taxminan 30 foizga o'sish kuzatildi, bu faqat korteksda statistik ahamiyatga ega edi (9C3-rasm; p <0,05).

Ayollarda ham, erkaklarda ham quercetin va rutin bilan davolash TgAPP sichqonlarini nazorat qilish bilan solishtirganda miya yarim korteksi va hipokampusdagi IL{0}} ifodasini kamaytirishga muvaffaq bo'ldi (9C1, H1-rasm; p < {{8). }}.05), WT sichqonlariga o'xshash qiymatlarni olish va ayniqsa, erkak sichqonlarning hipokampilarida pastroq (9H1-rasm; p <0.05).

Ikkala flavonoid bilan davolashning IL{0}} ifodasiga umumiy ta'siri TNF- yoki INF- bilan kuzatilmadi. Shunday qilib, TgAPP erkaklari, quercetin bilan davolashda, hipokampal TNF-da (9H2-rasm; p < 0.05) va kortikal IFN- ifodasida (9C3-rasm; p <0.05) sezilarli pasayish kuzatildi.

2.8. Degeneratsiyalanuvchi neyronlar va ularning proektsiyalarini baholash

WT sichqonlari bilan solishtirganda transgen TgAPP sichqonlari sinovdan o'tkazilgan yoshda neyrodegeneratsiyaning xarakterli belgilari kuzatilmadi, shuningdek, quercetin va rutin bilan davolash TgAPP bilan solishtirganda 4 hafta davomida hech qanday o'zgarishlarni ko'rsatmadi (S1-rasm, qo'shimcha ma'lumotlar).

2.9. Ionotropik glutamat retseptorlarining ifodasi

Nazorat qiluvchi TgAPP sichqonlari uchun olingan qiymatlarni WT sichqonlari uchun olingan qiymatlar bilan solishtirganda retseptorlar ifodasida sezilarli farqlar topilmadi. Quercetin yoki rutin bilan davolashda ushbu ionotrop retseptorlarning ifodalanishiga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi (jadval S5, qo'shimcha ma'lumotlar).

3. Munozara

Bizning tadqiqotimizning maqsadi ikkita flavonoid, quercetin va rutinning neyrodegeneratsiya va / yoki kognitiv funktsiyaga ta'siridan qat'i nazar, AD patogenezining birinchi bosqichlarida ta'sirini baholash edi. Korteks va gippokamp miyaning tahlil qilinadigan joylari edi, chunki ular ADda eng ko'p ta'sirlangan miya tuzilmalaridir. Shuni hisobga olish kerakki, quercetin va rutin ikkita flavonoiddan birini o'z ichiga olgan formulali parhez orqali, AD hayvonlari modelida faol moddasi bo'lgan sog'lom inson parhezini taqlid qilish uchun kiritilgan.

Xususan, C57B6 sichqonchasidagi transgen APPswe GSH/GSSG nisbati, MDA darajalari, antioksidant fermentlar quvvati, APP ifodasi, BACE1 faolligi va kaspaza-3 va IL-1 ifodalariga sezilarli ta'sir ko'rsatdi. Odamlarda APP mutatsiyalari odatda tipik AD ni keltirib chiqaradigan bo'lsa-da, ular asosan APP transgen sichqonlarida faqat amiloid patologiyasi bilan bog'liq va sezilarli neyrodegeneratsiya yo'q [14,15], chunki bizning transgen sichqonlarimiz TgAPPda hech qanday xarakterli belgilar kuzatilmagan. WT sichqonlari (Qo'shimcha ma'lumotlar, S1-rasm). Gippokampal neyronlarning 40 -6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) bilan qarama-qarshi bo'lishi bizga yadro morfologiyasini kuzatish imkonini berdi, chunki bu birikma nuklein kislotalar uchun floresan bo'yoqdir. Biz parchalangan yoki lobulyar yadrolarni kuzatmadik, odatda apoptotik; shuningdek, WT bo'limlari bilan bog'liq TgAPP nazorat transgenik liniyasining hipokampal gistologik bo'limlarini solishtirganda hech qanday ajoyib farqlarni kuzatmadik; Nazorat TgAPP sichqonlariga nisbatan quercetin va rutin muolajalari o'rtasida hech qanday farqni kuzatmadik.

Tahlil qilinadigan AD biokimyoviy xususiyatlar panelida biz birinchi navbatda ikkita flavonoid dietasidan birida GSH / GSSG nisbatini aniqlashga e'tibor qaratdik, chunki GSH darajasining kamayishi ADning eng muhim erta biokimyoviy belgilaridan biridir [16,17] ] va uning patogenezi va kasallikning rivojlanishi davomida kuzatilgan. Miyaning GSH darajasini o'lchash [18] va yaqinda qondagi GSH darajalari [19] ADning dastlabki bosqichlari uchun diagnostik belgilar sifatida istiqbolli bo'lib kelmoqda. Bundan tashqari, endogen GSH do'konlarini o'zlari yoki ularning prekursorlari bilan to'ldirishga harakat qilindi [20-22]. Bizning tadqiqotimizda WT hayvonlariga nisbatan TgAPP sichqonlarida, erkaklarda ham, urg'ochilarda ham, miyaning ikkala sohasida ham hujayralarni kamaytirish kuchining (GSH/GSSG) pasayishi kuzatildi. WT va TgAPP sichqonlarining korteksida va gippokampida GSH/GSSG nisbati erkaklarda ayollarnikiga qaraganda past edi. Quercetin va rutin dietalari davolanmagan TgAPP sichqonlariga nisbatan GSH / GSSG nisbatini sezilarli darajada oshirdi va bu o'sish hipokampusda aniqroq edi. Erkaklarda quercetin yoki rutin bilan davolashda GSH va GSSG darajalari va GSH/GSSG nisbatidagi o'zgarishlar, redoks kuchini oshirish bilan bog'liq holda, ayollarga qaraganda ko'proq namoyon bo'ldi. Bizning aniqlashimiz natijalari Tg2576 sichqonlarining jinsi bilan bog'liq bo'lgan farqlarni bir tomondan makromolekulalarning oksidlovchi shikastlanishiga sezuvchanligining muhim asosini ko'rsatishi mumkin, chunki glutation tizimi ko'p biologik funktsiyalarda ko'p qirrali reduktantdir va profilaktika ta'sirida. boshqa tomondan, uning fiziologik holatini tiklashda flavonoidli parhezlar. Ushbu munozara davomida ko'rib turganimizdek, biz TgAPP sichqonlarida kuzatilgan ta'sirlar to'plamini tushuntirishi mumkin bo'lgan asosiy o'q sifatida GSH/GSSG nisbatining oshishini belgilab oldik.

Yaqinda GSH/GSSG nisbati oddiygina redoks buferi sifatida emas, balki asosiy tartibga solish mexanizmi sifatida ishlaydi, bu esa oqsillarga hujayradagi tiol-disulfid muvozanatini qattiq nazorat qilish orqali o'zlarining tabiiy konformatsiyasi va funksionalligiga erishishga imkon beradi. proteoma. Muxtasar qilib aytganda, glutation tizimi sog'lom proteomani saqlab qolish uchun zarur bo'lib, glutation-qaytarilish gomeostazining buzilishi (ya'ni, genetik yoki farmakologik) autofagiya samaradorligidagi buzilishlar tufayli oqsil agregatsiyasini oshirishini ko'rsatadi [23]. Shuning uchun, glutation redoks gomeostazini saqlab qolishga qaratilgan strategiyalar AD kabi oqsillarni yig'ish bilan bog'liq kasalliklarda terapevtik salohiyatga ega bo'lishi mumkin. Proteomaning saqlanishi bilan AD patogenezida ishtirok etadigan ubiquitin-proteazoma degradatsiyasi mexanizmi chambarchas bog'liq. Proteazoma neyron gomeostazini, shu jumladan oksidlangan va agregatlangan oqsillarning katabolizmini saqlashda hal qiluvchi ahamiyatga ega bo'lgan bir nechta substratlarni tanlab parchalaydi. BACE1 ubiquitinatsiyaga uchraydi va ubiquitin-proteazoma yo'lini blokirovka qilish BACE1 degradatsiyasini inhibe qilishi va natijada BACE1 fermentativ faolligining ko'payishiga, ko'proq parchalanadigan mahsulot C99 va A 1-40 va A { ning ko'payishiga olib kelishi ko'rsatilgan. {8}} neyronal va neyron bo'lmagan hujayralarda [10]. Bizning oldingi tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, flavonoidlar, quercetin va rutin neyroblastoma hujayralarida proteazoma funktsiyasining modulyatsiyasi bilan bog'liq bo'lgan turli signal yo'llari va molekulyar tarmoqlarga ta'sir qiladi [9]. Bundan tashqari, kamaytirilgan glutation (GSH) bilan to'ldirilgan neyronlar proteazoma faolligini tiklagani va agregat shakllanishini kamaytirgani ko'rsatilgan [11], chunki proteazoma funktsiyasi redoks holati bilan tartibga solinadi [24]. Shu sababli, hayvonlarda quercetin yoki rutin dietasiga ega bo'lgan GSH / GSSG nisbatining oshishi ilgari ex vivo ko'rsatilgan proteazomaning quercetin va rutin tomonidan modulyatsiyasi bilan mos keladi.

Yuqorida aytib o'tilganidek, oksidlanish-qaytarilish nomutanosibligi yuqori darajada oksidlovchi modifikatsiyalangan oqsillarga olib keladi, ular to'planib, agregatlar hosil qiladi, bu esa proteazomalarning buzilishiga olib keladi [25]. Shunday qilib, oksidlovchi stressning AD patogenezida hal qiluvchi rolini hisobga olgan holda, oksidlovchi stressning biomarkerlari, shu jumladan lipid peroksidatsiyasi (MDA darajalari) va antioksidant fermentlar, TgAPP va WT sichqonlarida korteks va hipokampusda baholandi. SOD, CAT, GR va GPx kislorodli erkin radikallarga qarshi ta'sir qiluvchi va tanadagi erkin radikallarning metabolizmini tartibga soluvchi va erkin radikallarni tozalash tizimida rol o'ynaydigan eng muhim antioksidant fermentlar bo'lib, tanadagi hujayralarni lipid peroksidlanishidan himoya qiladi. . Bizning tadqiqotimizda APPning haddan tashqari ko'payishi natijasida TgAPP sichqonlarida WT sichqonlariga nisbatan antioksidant ferment faolligining umumiy pasayishi kuzatildi, bu CAT uchun statistik ahamiyatga ega. GSH darajasining pasayishiga mos ravishda, TgAPP sichqonlarida lipid peroksidatsiyasi sezilarli darajada oshdi. Inson ADdagi oksidlovchi stressning manbai juda murakkab va ko'p omilli bo'lsa-da, sichqonlarda rivojlangan amiloid patologiyasi miyada oksidlovchi stressning kuchayishiga olib keladigan patologik jarayonni boshlash uchun etarli ko'rinadi [26]. Rutin bilan davolash qilingan hayvonlarda erkaklar va urg'ochilarda korteksdagi CAT faolligi va hipokampusdagi GR faolligi oshgan. Faqat rutin bilan davolash qilingan hayvonlar korteksdagi CAT va GR genlarini ifodalashda va erkaklar va urg'ochilarda gippokampda va urg'ochi sichqonlarning gippokamplarida GPxda o'zgarishlarni boshdan kechirdilar. Shu nuqtai nazardan, bir nechta tabiiy birikmalar proteazoma va redoks regulyatsiyasi o'rtasidagi o'zaro bog'lanishga ta'sir qilishi ko'rsatilgan. Aniqrog'i, quercetin ma'lum Nrf2 faollashtiruvchisi [27] bo'lib, u proteazoma funktsiyasini rag'batlantirish orqali antioksidant xususiyatlarini namoyish etadi, oksidlovchi stressga chidamliligini oshiradi va hujayralar uzoq umr ko'rishni ta'minlaydi [28].

BACE1 ning to'qimalarga xos ifodasi APPni normal qayta ishlash uchun juda muhimdir va uning disregulyatsiyasi ifodasi AD patogenezida rol o'ynashi mumkin. BACE1 asosan hipokampal neyronlarda, korteksda va serebellar granulyar qatlamda ifodalanadi [10]. Shuni ta'kidlash kerakki, oldingi tadqiqotlar Shvetsiya mutant APP transgen sichqonlari barqaror holatda miya A darajasini sezilarli darajada oshirganligini ko'rsatdi [29], bu BACE1 AD patogenezida amiloidogen yo'lda muhim rol o'ynashini va yaxshi terapevtik maqsad ekanligini ko'rsatdi. AD davolash uchun. Bizning tadqiqotimizda kvarsetin va rutin bilan davolashda BACE1 faolligining sezilarli darajada pasayishi kuzatildi, bu sichqonlarda A cho'kmasining kamayishiga hissa qo'shishi mumkin. Biz faqat BACE1 fermenti, quercetin va rutin ingibitorlari sifatida ishlashdan ko'ra ko'proq proteazoma faolligini tiklash gipotezasiga asoslanib, GSH/GSSG nisbatining oshishi bilan bog'liq bo'lgan BACE1 faolligini pasayishiga olib kelishi mumkin. Shu ma'noda, ma'lumki, BACE1 ingibitorlarining APPswe (shved mutatsiyasi) parchalanish joyiga yo'naltirilishi plazma membranasiga etib bormasdan oldin sodir bo'ladi, APPwt (yovvoyi tip) esa hujayra yuzasida paydo bo'lgan erta endosomada qayta ishlanadi. Shuning uchun, APPwt ni ajratuvchi BACE1 ba'zan APPni qayta ishlashdan oldin hujayra yuzasida BACE1 inhibitori bilan bog'lanadi, ammo APPswe ni qayta ishlovchi ferment emas [30]. Aynan shu sababli, APPlarni qayta ishlashning aberrant lokalizatsiyasi BACE1 inhibitörleri sifatida quercetin va rutinning potentsialini sezilarli darajada kamaytirishi mumkin. Shunday qilib, biz ushbu in vivo modeldagi BACE faolligining pasayishi fermentning inhibisyonu tufayli emas, balki GSH/GSSG nisbatining oshishi bilan bog'liqligini qo'llab-quvvatlashga ko'proq moyilmiz. Har holda, BACE1 faolligining pasayishi TgAPP sichqonlarida -amiloid ishlab chiqarishni kamaytirishga qaratilgan taxminiy urinish sifatida talqin qilinishi mumkin. Gippokampdagi quercetin va rutinning BACE1 faolligini pasaytirishga eng ajoyib ta'siriga kelsak, shuni ta'kidlash kerakki, korteks hipokampusga qaraganda ancha yuqori neyron zichligiga ega [31] va AD patologik fenotipidagi proteazomaning tanlab buzilishi. korteks gippokampdan ko'ra ko'proq himoyasiz va ta'sirlanadi [32].

Muolajalarning BACE1 fermenti faolligiga ta'sirini aniqlagandan so'ng, biz uning ifodasini baholashga qiziqdik. Qizig'i shundaki, TgAPP sichqonlari o'rtasida WT sichqonlari bilan solishtirganda BACE1 ifodasida sezilarli farqlar topilmadi va quercetin yoki rutin bilan davolashda sezilarli o'zgarishlar kuzatilmadi. Shuning uchun, BACE1 fermenti faolligining ortishi ekspressivlikning oshishi bilan bog'liq emasga o'xshaydi. Shu nuqtai nazardan, Apelt va boshq. [14] 9 oydan 13 oygacha bo'lgan Tg2576 sichqonlarida kortikal BACE1 faolligining oshishini aniqladi, shu bilan birga BACE1 oqsili va mRNKning ifoda darajasi yoshga qarab o'zgarmadi. Bundan tashqari, eriydigan amiloid A 1-42 emas, balki A 1-42 fibrillyar amiloidi BACE1 oqsili ifodasini ko'tarishi mumkinligini tasdiqlovchi dalillar topildi va shuning uchun amiloid izoformlari nisbatidagi kichik o'zgarishlar amiloid agregat konformatsiyasini va hujayra shikastlanishini modulyatsiya qilishi mumkin. 33]. Shunday qilib, biz aniqlagan faolligining oshishi bilan BACE1 ifodasida o'zgarishning yo'qligi sichqonchamiz TgAPP modelimizdagi fibrillar amiloid A 1-42 izoformasiga nisbatan eruvchan amiloid A 1-42 ning tarqalishini hisobga olishi mumkin.

APPni qayta ishlashda ishtirok etadigan fermentlarning gen ekspressiyasini aniqlagandan so'ng, biz quercetin va rutinning APPni amiloidogen bo'lmagan qayta ishlashda ishtirok etadigan ferment-sekretazaga ta'sirini baholadik. Biz ADAM10 ga e'tibor qaratdik, chunki u -sekretazaning fiziologik jihatdan eng muhim konstitutsiyaviy izoformasidir. ADAM10 sAPP va C-terminal fragmentlarini (-CTF) ishlab chiqarish uchun A domenidagi APPni parchalash orqali neyrotoksik oligomerik A plaklarining paydo bo'lishiga qarshi turadi [34,35]. Bizning tadqiqotimizda topilgan ADAM10 ifodasidagi o'zgarishlar statistik ahamiyatga ega bo'lmasa-da, WT sichqonlariga nisbatan TgAPP sichqonlarida ADAM10 ifodasining biroz pasayishi kuzatildi. Asosan, rutin bilan davolash o'rganilayotgan miyaning ikkala sohasida ADAM10 gen ekspressiyasini oshirish tendentsiyasini ko'rsatdi. Postina va boshqalar. [36] AD sichqonchasi modelining hipokampusidagi yovvoyi turdagi ADAM10 ning yuqori regulyatsiyasi sAPP sekretsiyasini vositachiligini ko'rsatdi, bu esa A blyashka hosil bo'lishini inhibe qilishga olib keldi. Kversetinning ta'siri alyuminiy xlorid bilan qo'zg'atilgan AD kalamush modelida o'rganildi, bu davolanmaganlarga nisbatan hipokampusdagi -sekretazaning (ADAM10 va ADAM17) sezilarli darajada yaxshilanganligini ko'rsatadi. Bu shuni ko'rsatadiki, quercetin -sekretaz genlarini faollashtirish orqali amiloidogen bo'lmagan yo'lni oshirish potentsialiga egadir [37]. Klinikadan oldingi ma'lumotlar miyaning sAPP darajasini oshirish AD bilan bog'liq simptomlarni yaxshilash va sinaptik nuqsonlarni kamaytirish uchun potentsial strategiya ekanligi haqidagi farazni mustahkamlaydi. ADAM10 va BACE1 APP parchalanishi uchun raqobatlashadi, shuning uchun ADAM10 faolligini kuchaytirish neyrotoksik amiloid hosil bo'lishini inhibe qilishi mumkin. Bundan tashqari, sAPP stress JNK-signal yo'lining faollashishiga to'sqinlik qilishi mumkin, bu esa proteazoma degradatsiyasiga olib keladigan NF-kB-induktsiyali fosforillanish faolligini faollashishiga olib keladi [38]. Shu sababli, kasallik bilan bog'liq protein agregatlarining shakllanishi va to'planishi sezilarli darajada kamayadi va hujayra proteazoma faolligi kuchayadi, bu esa proteostazni tartibga solishda sAPP funktsiyasini tasdiqlaydi [39]. Bundan tashqari, sAPP ayniqsa glutamat AMPA retseptorlari sintezini va uning savdosini tartibga solishini ko'rsatdi [40]. Tadqiqotimizda biz rutin bilan davolashda ADAM10 ifodasining biroz ortishi glutamaterjik sinaptik uzatishga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini o'rganib chiqdik. Qo'shimcha ma'lumotlar bo'limida ko'rsatilgandek, quercetin va rutin dietasida ushbu ionotrop retseptorning ekspressiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatilmagan, ehtimol AMPA retseptorini tartibga solish uchun etarli bo'lmagan ADAM10 ifodasining zaif o'sishi tufayli (Qo'shimcha ma'lumotlar). , S2-rasm va S5-jadval).

Shuni hisobga olish kerakki, in vitro tadqiqotlar ADAM10 substratlarining keng assortimentini ko'rsatdi [41] va shuning uchun nomaxsus ADAM{3}}targetlash natijasida olingan nomaqbul ta'sirlar saraton ko'payishi, hujayra yopishishi va rivojlanishida aniqlanishi mumkin. T xujayrasi/NK-hujayra prekursori va yallig'lanish va boshqalar [42]. Ushbu cheklovni chetlab o'tish uchun bizning tadqiqotimiz sAPP ning chiqarilishini fiziologik jihatdan ko'proq rag'batlantirishga qaratilgan strategiyani taklif qiladi. Ushbu yondashuv insonning sog'lom ovqatlanishi orqali iste'mol qilinadigan faol moddani (quercetin yoki rutin) uzoq muddatli iste'mol qilishga asoslangan bo'lishi mumkin. Biroq, ADAM10 ning ko'payishi flavonoid dozasiga bog'liqmi yoki potentsial foydali ta'sir taxminiy yon ta'sirlardan ustun yoki yo'qligini aniqlash uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi.

APPswe ifodasiga kelsak, sichqon genomiga inson APP transgenining kiritilishi APPswe tug'ilishdan haddan tashqari ifodalanganligini kafolatlasa-da, APP mRNK va oqsil hipokampal darajalari hayvonlar rivojlanishida sezilarli tebranishlarni ko'rsatishi, sichqonlar paydo bo'lganda maksimal bo'lishi haqida xabar berilgan. asemptomatik (1-oylik) va to'liq simptomatologiya yuzaga kelganda kamayadi [43]. Ushbu muammoga qaramasdan, korteksda ham, hipokampusda ham APP ifodasi bizning tadqiqotimizdagi WT sichqonlari bilan solishtirganda sezilarli darajada yuqori edi. Quercetin yoki rutin bilan keyingi davolash erkaklar va urg'ochi sichqonlar uchun miyaning ikkala sohasida ham bunday ifodani sezilarli darajada kamaytirishga muvaffaq bo'ldi. Ushbu topilmalar Augustin va boshqalar tomonidan bildirilganlarga mos keladi. [44] 4-oylik urgʻochi TgAPP sichqonlarida quercetin kabi flavonollarga boy Ginkgo biloba (Egb761) ning standartlashtirilgan ekstraktini oʻrganib, APP mRNK va oqsil darajasining pasayishini aniqladi. Tg2576 sichqonlarida APP translatsiyasining yuqori regulyatsiyasi prodromal va erta simptomatik bosqichlarda sodir bo'lishini hisobga olsak, APP tarjimasini quercetin yoki rutin bilan tiklash bizning TgAPP sichqonlarimizda va, ehtimol, erta bosqichlarda sodir bo'lgan bo'lishi mumkin. simptomatik bosqich, natijada APPning kortikal va hipokampal darajalari, BACE1 faolligi va kaspaza-3 faollashuvi kamayadi.

Bundan tashqari, boshqa joylarda Tg2576 sichqonlarida (neyronlarning yo'qolishi bo'lmaganda) xotira buzilishi boshlanganida, bizning tadqiqotimizda aniqlanganidek, hipokampusda kaspaza{1}} faollashuvining ko'payishi qayd etilgan. , hujayradan tashqari amiloidning cho'kishidan oldin dendritik tikanlar kamayishi bilan birga [46]. Nerv tizimidagi kaspazalarning apoptotik bo'lmagan rolini tasdiqlovchi dalillar mavjud bo'lib, neyronlarning o'limisiz [47] va kaspaza{6}} faolligi dendritik tikanlar uchun lokalizatsiya qilingan, bu erda kalsinevrin darajasini oshirishi mumkin. O'z navbatida, kalsinevrin tomonidan qo'zg'atilgan AMPA-ga o'xshash retseptorlarning GluR1 subbirligining fosforillanishi postsinaptik disfunktsiyaga olib keladi. Transgenez natijasidagi kaspaza-3 ifodasi qiymatlarimiz TgAPP sichqonlarining hipokampusidagi dendritik tikanlar darajasida kaspaza-3 ifodasining ortishi haqida xabar bergan boshqa tadqiqotchilar tomonidan olingan qiymatlarga mos keladi. [48]. APP o'zining aminokislotalar ketma-ketligida kaspaza-3 uchun uchta alohida bo'linish joyini o'z ichiga olganligi sababli, ulardan ikkitasi hujayradan tashqari domen darajasida va biri APP dumining hujayra ichidagi C-terminal qismida joylashgan [49], gidroliz APP ning kaspaza-3 tomonidan proteolitik qayta ishlanishini amiloidogen yo‘l [50] foydasiga o‘zgartirishi mumkin, bu esa 31 aminokislotadan (C31) iborat sitotoksik C-terminaldan olingan peptidning chiqishiga olib keladi. misol [51]. Bu shuni ko'rsatadiki, kaspaza-3 APPdan zaharli fragmentning chiqarilishini kuchaytirishga vositachilik qilishi mumkinligi sababli, kaspaza-3 ifodasini quercetin yoki rutin bilan kamaytirish agregatlangan oqsilni tozalash imkonini beradi. Bundan tashqari, yuqorida aytib o'tilganidek, biz kalsinevrin bilan faollashtirilgan kaspaza-3ning GluR1 subunitini defosforillash qobiliyatiga asoslanib, glutamaterjik sinaptik uzatishda kaspaza{24}} ifodasining ko'payishi va kamayishi ta'sirini o'rganib chiqdik. postsinaptik darajadagi AMPA retseptorlari. Ushbu molekulyar modifikatsiyalar glutamaterjik sinaptik uzatishni va hipokampusdagi dendritik tikanlar darajasida neyronal plastisiyani o'zgartiradi [48]. Nazariy jihatdan, TgAPP sichqonlarida kaspaza{29}} faolligini farmakologik inhibe qilish ADga o'xshash fenotiplarni sinaptik buzilishlarni keltirib chiqaradigan mexanizmdan qutqarishi mumkin. Biroq, bizning TgAPP sichqonchamizdagi kaspaza{31}} ifodasining ko'payishiga qaramay, biz yuqorida aytib o'tilganidek, WT sichqonlari bilan solishtirganda AMPA retseptorlari ifodasida sezilarli farqlarni topmadik. Kaspaza{32}} ifodasidagi o'zgarishlar AMPA retseptorlari ifodasida sezilarli o'zgarishlarni keltirib chiqaradigan darajada sezilarli bo'lmasligi mumkin (Qo'shimcha ma'lumotlar, S2-rasm va S5-jadval).

Kaspaz{0}} ifodasi qiymatlariga kelsak, TgAPP va WT sichqonlari o'rtasida sezilarli farqlar topilmadi. Kaspaza -6 faollashuvi muhim sitoskeletal oqsillarni (Tau va -tubulin) parchalaydigan, shu bilan noto'g'ri katlanmış oqsillarning ubiquitin-proteazoma degradatsiyasini va bir qator aktinni tartibga soluvchi post-sinaptik zichlikni buzadigan neyronal stressning muhim vositachisi sifatida aniqlangan. oqsillar [52]. Bizning tadqiqotimizda kaspazaning o'zgarmagan ifodasi -6 WT sichqonlari bilan solishtirganda ushbu transgen sichqonlar baholangan yoshda neyrodegeneratsiyaning xarakterli belgilari yo'qligiga mos keladi (Qo'shimcha ma'lumotlar, S1-rasm).

Neyroinflamatuar vositachilarning sezilarli o'sishi AD bilan og'rigan bemorlarda, asosan keksa plaklar atrofida kuzatilgan [53-55]. Astrositlar mikrogliya va neyronlarga GSH ning asosiy yetkazib beruvchisi hisoblanadi. Surunkali yallig'lanish va oksidlovchi stress paytida astrositlar toksik yallig'lanish vositachilari va erkin radikallarni chiqaradi, mikrogliya va neyrodegeneratsiyaning faollashuvini tezlashtiradi [56]. Ta'kidlash joizki, hujayra ichidagi glutationning kamayishi inson mikrogliyalari va astrositlarida yallig'lanish yo'llari, p38 MAP-kinaz, Jun-N-terminal kinaz (JNK), NF-kB faollashishi bilan bog'liq [57]. Shu munosabat bilan biz hayvonlar modelimizdagi IL-1, IFN- va TNF- darajalarini aniqlashga va ularga quercetin va rutinning ta'sirini aniqlashga qaror qildik. Ma'lumki, yallig'lanish A peptid va APPni noto'g'ri qayta ishlashga yordam beradi, peptid agregatsiyasini rag'batlantiradi va o'z navbatida A reaktivligini o'zgartiradi [58]. Shunday qilib, bizning tadqiqotimizda biz TgAPP sichqonlarida yallig'lanishga qarshi vositachilar IL-1, TNF- va IFN-ning mRNK darajasini WT sichqonlariga nisbatan oshirganligini kuzatdik, bu esa APPlarning haddan tashqari ifodalanishi neyro-yallig'lanish kaskadlarini keltirib chiqarishi mumkinligini ko'rsatdi. glia va neyronlarda bir qator molekulyar yo'llarni ishga tushiradi, bu yallig'lanish reaktsiyasini faollashtiradi. Quercetin va rutin erkaklarda ham, ayollarda ham, o'rganilgan miya hududlarida IL{18}} gen ifodasini susaytirishi mumkin edi. Bir nechta dalillar quercetinning CNS darajasida yallig'lanishga qarshi ta'sirini qo'llab-quvvatlaydi, chunki u iNOS induktsiyasida ishtirok etadigan yadroviy omil-kappa B (NF-kB) [59] kabi transkripsiya omillarining faollashuvini inhibe qilishi mumkin. shuning uchun IL-1, TNF- va IFN- [60] kabi mediatorlarning chiqarilishini kamaytiring. GSH ning yallig'lanish reaktsiyasiga ta'siri haqida shuni ta'kidlash kerakki, GSH yallig'lanishga qarshi sitokinlarning (TNF-, IL-1 va IL) ifodalanishi uchun optimal sitokin darajasini saqlab turishda ishtirok etadi. -6) GSHning kamayishi tufayli ko'payadi, yallig'lanishga qarshi sitokinlarning (ya'ni, IL-10) ifodasi o'zgarmagan. GSH gomeostazining bu o'zgarishi NF-kB va JNK signalizatsiya yo'llarining regulyatsiyasi tufayli sodir bo'ladi, bu esa neyron hujayralari o'limiga olib keladigan apoptotik yo'l bo'lishi mumkin [61]. Bizning tadqiqotimizda NF-kB ning quercetin va rutin tomonidan pastga regulyatsiyasi GSH / GSSG gomeostazini tiklash uchun ishonchli mexanizm bo'lishi mumkin va shuning uchun yallig'lanishga qarshi va yallig'lanishga qarshi sitokinlar o'rtasidagi muvozanatning sababi bo'lishi mumkin. Nihoyat, BACE1 promotori NF-kB bog'lanish joyiga ega bo'lganligi sababli, NF-kB ning yallig'lanish bilan qo'zg'atilgan faollashuvi BACE1 ifodasini tartibga solishni osonlashtiradi va keyinchalik A ishlab chiqarishni oshiradi [62]. Shunday qilib, agar quercetin va rutin dietasida NF-kB ning regulyatsiyasi pasaysa, BACE1 faolligi yallig'lanishga qarshi emas, balki yallig'lanishga qarshi sitokinlarning chiqarilishini tartibga solish natijasida kamayadi.

4. Materiallar va usullar

4.1. Eksperimental hayvonlar

Eksperimental AD ning hayvon modeli sifatida inson amiloid prekursor oqsilining (hAPP) shved qo'sh mutatsiyasini ifodalovchi transgen sichqon (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) ishlatilgan [14]. Sichqoncha - bu hamster prion oqsil promouteri nazorati ostida qo'sh shved mutatsiyasiga (K670N/M671L; Lys670→Asn va Met671→Leu) ega bo'lgan inson A PP695 izoformini ifodalovchi heterozigot chizig'i [63]. Natijada, bu sichqonchada inson amiloidi - prekursor oqsili (A PP) darajasi sichqonchaning A PP darajasidan olti baravar yuqori. Bundan tashqari, bu sichqoncha A 40 va A 42 ning yuqori darajasini ko'rsatadi. A depozitlari 9 oylikdan boshlanadi [63]. Tg2576 hipokampus va korteksda APPswe transgen ifodasi asosan neyronaldir [64].

Salbiy nazorat sifatida bir xil koloniyadan [65,66] yovvoyi turdagi (WT) sichqonlar ishlatilgan. Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) sichqon koloniyasi laboratoriyamizda Tg2576 heterozigot erkaklar va yovvoyi tipdagi urg'ochilardan ishlab chiqilgan. Transgen ota-onalar Navarra universiteti (Pamplona, ​​Ispaniya) qoshidagi Amaliy tibbiy tadqiqotlar markazining Neyrologiya bo'limidan doktor Diana Frechilla tomonidan sovg'a qilingan [67].

Hayvonlar alohida ventilyatsiya qilingan kataklarga joylashtirildi va 22–24 ◦C haroratda 12- soat yorug'lik/qorong'u tsiklda 50-60 foiz namlikda saqlanadi. Hayvonlar protokollari Madridning Komplutens universitetining Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi (IACUC) tomonidan tasdiqlangan va ilmiy maqsadlarda foydalaniladigan hayvonlarni himoya qilish bo'yicha 2010/63/ Evropa Direktivasiga va hayvonlarning farovonligi to'g'risidagi Ispaniya qonunchiligiga to'liq mos keladi. Qirollik farmoni 53/2013, 2013 yil 1 fevral).

4.2. Sichqonlarning genotip tahlillari

Transgenlik tug'ilgandan keyin 30 kun ichida dum biopsiyasi orqali aniqlandi. Hayvonlarning genotip tahlillari PCR yordamida o'tkazildi. Tg2576 (TgAPP) geterozigotali chiziq ekanligini hisobga olib, kiritish geni (PrP, prion oqsilidan) ijobiy reaktsiya nazorati sifatida ishlatilgan. Genomik DNK NID buferida (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50) proteinaza K (0,1 mkg/mkl) bilan hazm qilingan sichqon dumlaridan olingan. mM MgCl2, 0,05 foiz jelatin, 0,45 foiz NP-40 va 0,4 foiz Tween 20) 56 ◦C da 3 soat davomida chayqatiladi. DNK parchalari izopropanol bilan cho'ktirildi va 70 foiz etanol bilan yuvildi. DNK cho'kmalari 30 µL TE buferida (10 mM Tris-1 mM EDTA) eritildi. DNKning tozaligi va kontsentratsiyasi 260 va 280 nm da aniqlandi.

PrP va APP genlari PCR orqali kuchaytirildi. Transgen sichqonlarni skrining uchun ishlatiladigan primerlar ketma-ketligi quyidagicha edi: PrP oldinga: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP teskari: GTGGATACCCCCCCCCCCAGCCTAGACC; APP teskari: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. PCR reaktsiyasining bosqichlari quyidagicha edi: 94 ◦C da 90 soniya davomida denatürasyon, 60 ◦C da 60 s va 72 ◦C da 90 soniya davomida 39 tsikl, so'ngra 72 ◦C da 7 daqiqa davomida yakuniy uzaytirish.

Barcha holatlarda APP genining salbiy nazorati (DNK mog'orsiz) va ijobiy nazorat ko'rib chiqildi. Olingan PCR mahsulotlari 70 V (doimiy kuchlanish) da 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmshtadt, Germaniya) buferida 1,5 foizli agaroz jellarida elektroforez bilan ajratilgan va keyin bo'yash orqali tasvirlangan. GelRed (Millipur).

4.3. Hayvonlarni davolash

TgAPP sichqonlari va yovvoyi turdagi 6-7 haftalik, boshlang'ich tana vazni 16,2 ± 0,8 g bo'lgan yovvoyi hayvonlar quyidagi to'rtta guruhga (n=8/guruhga) tasodifiy ajratildi: ( a) ishlov berilmagan TgAPP; (b) Quercetin bilan davolash qilingan TgAPP; (c) Rutin bilan ishlangan TgAPP; va (d) ishlov berilmagan yovvoyi tur. Erkak va urg'ochi sichqonlar o'rganilganligi sababli, ikkita guruh guruhlari tashkil etildi. 45 haftalik yoshida sichqonlar 4 hafta davomida quercetin yoki rutin bilan davolashni boshladilar.

Quercetin (3,30,40,5,7-pentahidroksiflavon) va rutin gidrat (kersetin-3-O-rutinosidgidrat) 95 foizdan yuqori yoki unga teng bo'lgan va Sigma-Aldrichdan sotib olingan. Flavonoidlarning har biri kuniga 30 mg flavonoid/kg tana vazniga mos keladigan 200 ppm konsentratsiyasida standart dietaga (Harlan Iberica, Barselona, ​​Ispaniya) kiritilgan. Davolanmagan sichqonlar faqat qo'shimchalarsiz standart dietani oldilar. Ad libitum iste'mol qilish uchun dietalar va suv berildi.

4.4. Biokimyoviy va gistologik tahlillar uchun miya to'qimasini tayyorlash

Davolashning oxirida sichqonlar bir kechada ro'za tutdilar, ular bachadon bo'yni dislokatsiyasi yordamida evtanizatsiya qilindi va butun miya tezda olib tashlandi. Miya 4 ◦C da sho'r suvda yuvilgan va araxnoid membrana ehtiyotkorlik bilan olib tashlangan. Keyin hipokampus va korteks izolyatsiya qilindi. Namunalar keyingi foydalanishgacha darhol -80 ◦C da saqlanadi.

Ba'zi hayvonlarning butun miyasi gistologik bo'limlarni olish uchun ishlatilgan, ular uchun bachadon bo'yni dislokatsiyasi yordamida evtanizatsiya qilingandan so'ng, miyalar izopentanga -80 ◦C da botirish orqali muzlatilgan. Shundan so'ng darhol kriostatda (Leica CM1850, Nussloch, Germaniya) 120 mkm masofada, hid bilish lampochkasidan serebellumgacha miyaning koronal qismlari (qalinligi 30 mikron) qilingan. Barcha protsedura -20 ◦C da amalga oshirildi. Gistologik bo'limlar slaydlarda to'plangan va tahlil qilinmaguncha -80 ◦C da saqlanadi (Qo'shimcha usullarga qarang).

4.5. Glutation

Glutation testlari uchun miya yarim korteksi va gippokamp namunalari oksidlanish-qaytaruvchi buferda -5 foiz trixlorid sirka kislotasi (RQB-5 foiz TCA) (ilgari N2 bilan 15 daqiqa muzda pufaklangan) konsentratsiyada gomogenlashtirildi. 25 mg/ml (w/v). Namunalar 10 soniya davomida sonikatsiya bilan qayta suspenziya qilindi, so'ngra 12, 000 × g da 4 ◦C da 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi va supernatantlar yig'ildi.

Keyinchalik, olingan supernatantda Senft va boshqalar tomonidan tasvirlangan o-ftaaldegid usuli yordamida GSH va GSSG darajasini aniqlash uchun spektroflorometrik usullar qabul qilindi. [68]. GSH va GSSG qiymatlari biologik namuna bo'lmaganida spontan reaktsiya uchun tuzatildi. Ikkala holatda ham supernatantlar xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va keyin flüoresans FLUOSTAR mikroplata o'quvchi (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Vyurtemberg, Germaniya) yordamida o'lchandi, qo'zg'alish filtri 360 nm (o'tkazish qobiliyati 5 nm) bilan o'rnatildi. va emissiya filtri 460 nm (tarmoq kengligi 5 nm) da o'rnatiladi. Har bir namunadagi GSH va GSSG kontsentratsiyasi ma'lum GSH standartlaridan interpolyatsiya qilingan. GSH va GSSG ning kontsentratsiyasi nmol GSH/mg oqsili sifatida ifodalangan, bu esa glutationning redoks nisbati GSH/GSSG ni hisoblash imkonini berdi.

Qolgan granulalar 24{1}} mL 0,1 M NaOH ichida toʻliq eriguncha vortekslangan, bunda standart sifatida sigir zardobidagi albumindan foydalangan holda bitsinxonin kislotasi (BCA) usuli bilan oqsil kontsentratsiyasini oʻlchashgan.

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】