Sistanxdan olingan akteozid PI3K/AKT/mTOR yo'lini faollashtirish orqali glyukokortikoidlar keltirib chiqaradigan osteoporozni yaxshilaydi.
Dec 23, 2022
Abstrakt
Maqsad
Glyukokortikoidlar klinik amaliyotda keng qo'llaniladi; ammo, ular kabi yon ta'sirga olib kelishi mumkinosteoporoz. AkteozidCistanche dan (ACT) turli kasalliklarga qarshi kurashda ishlatilgan. Tadqiqot ACT ning glyukokortikoid ta'sirida samaradorligini baholash uchun o'tkazildi.osteoporoz(GIOP) va uning potentsial mexanizmi.
Usullari
Induktsiya qilish uchun deksametazon (Dex) mushak ichiga yuborildiosteoporozkalamush modelida va ACT og'iz orqali berilgan. ACT Dex-stimulyatsiya qilingan holda in vivo to'ldirildiosteoblastikMC3T3-E1 hujayralari. mRNK darajasini baholash uchun RT-qPCR o'tkazildisuyak shakllanishi(Runx2, CoL1A1) va suyak rezorbsiyasi (OPG va RANKL). Sarum OC va CTX darajasini baholash uchun tijorat Elishay to'plami qo'llanildi. Western blot PI3K/AKT/mTOR signalizatsiya yo'lidagi oqsil darajasini baholash uchun amalga oshirildi. Osteoblastning hayotiyligi va apoptozni baholash uchun CCK-8 tahlili va oqim sitometriyasi amalga oshirildi.
Natijalar
ACT Deks bilan bog'liq bo'lgan suyak mikrotuzilmasining yomonlashuvini pasaytirdi, qon zardobidagi OK darajasini oshirdi va CTX (P) darajasini pasaytirdi.< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and apoptozni kuchaytirdi; ammo, bu ta'sir ACT tomonidan sezilarli darajada susaytirildi (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).
Xulosa
dan ACTCistancheDexdan kelib chiqqan osteoporozni yumshatish uchun PI3K/AKT/mTOR signalizatsiya yo'lini faollashtirish orqali osteoprotektiv ta'sir ko'rsatishi mumkin.
Kalit so‘zlar:Akteozid Cistancheglyukokortikoidlar keltirib chiqaradiganosteoporoz
Kirish
Osteoporoz (OP) skeletning umumiy kasalligi bo'lib, suyak massasining pastligi, suyak to'qimalarining mikro tuzilishining buzilishi va suyak gomeostazasidagi nomutanosiblik bilan tavsiflanadi [1]. OP har yili 8,9 milliondan ortiq sinishlarni keltirib chiqaradi va osteoporozli yoriqlar deyarli har 3 soniyada sodir bo'ladi va umrbod nogironlik yoki o'limga olib keladi [2]. Glyukokortikoidlar (GC) odatda yuqumli bo'lmagan yallig'lanish kasalliklarini (masalan, astma va yallig'lanishli ichak kasalligi) va otoimmün sharoitlarni davolash uchun qo'llaniladi [3]. Biroq, uzoq muddatli GK foydalanish OP holatlarining 30 foizidan ko'prog'iga va osteonekroz holatlarining 10 foizidan ko'prog'iga moyil bo'ladi [4]. GK lar bevosita osteoblast proliferatsiyasi va differentsiatsiyasini inhibe qiladi [5], kamolotga va faollikni pasaytiradi va osteoblastlarning apoptozini qo'zg'atadi, bu esa o'z navbatida glyukokortikoidlar keltirib chiqaradigan osteoporoz (GIOP) rivojlanishiga olib keladi [6]. Bundan tashqari, ortib borayotgan dalillar osteoblast disfunktsiyasi suyaklarning yo'qolishining asosiy sababi ekanligini ko'rsatadi. Shuning uchun osteoblastlar soni va funktsiyalarining ko'payishi OPning, ayniqsa GIOPning oldini olishning asosiy strategiyasi bo'lib ko'rinadi.
O'simlik dori-darmonlari, ayniqsa, tabiiy birikmalarga asoslangan dorilar, turli kasalliklarni davolash uchun ming yillar davomida qo'llanilgan [7]. Cistanche Xitoy farmakopiyasida qayd etilgan qimmatbaho o't bo'lib, Shinjon-Uyg'ur avtonom rayonining janubiy hududida o'sadi va cho'l jenshen sifatida tanilgan [8]. Cistanche immunitetni oshirish, buyrakni himoya qilish, qarishga qarshi, antioksidant, yallig'lanishga qarshi va neyroprotektiv ta'sirlar kabi turli xil ta'sirga ega ekanligi isbotlangan [9].Akteozid(ACT) neyronal apoptozni inhibe qilish [10], jigar shikastlanishini yumshatish [11], yallig'lanishga qarshi [12], antioksidant [13] kabi biologik faollikka ega bo'lgan Cistanchedagi fenil etanolik glyukoziddir. , diabet [14] va semizlik [15], shuningdek, artikulyar xaftaga nasli [16] oldini olish. Bundan tashqari, bir nechta tadqiqotlar ACT ning farmakokinetikasi haqida xabar berdi va terapevtik ta'sir og'iz orqali qabul qilish atigi 0,12% bo'lsa ham mavjudligini tasdiqladi. ACT in vivo faol metabolitlari bo'lgan oldingi dori hisoblanadi [17].
Chjan va boshqalar. ACT ning kalamushlarda ovariektomiya natijasida kelib chiqqan suyak yo'qolishiga potentsial himoya ta'sirini ko'rsatdi [18]. ACT diabetik kalamushlarda suyak yo'qotilishining oldini olish uchun IGF-1/PI3K/mTOR signalizatsiya yo'lini modulyatsiya qiladi [19]. PI3K/AKT/mTOR yo'li turli kasalliklarda, shu jumladan GIOPda muhim tartibga soluvchi rollarga ega ekanligi xabar qilingan [20]. Naringin PI3K/AKT/mTOR signalizatsiya yo'lini tartibga solish orqali GIOPni engillashtiradi [21]. Bundan tashqari, bu signalizatsiya yo'li osteoblastlarning differentsiatsiyasini [22], suyak shakllanishini [23] va sinishning davolanishini [24] tartibga soladi. Biroq, ACT ning GIOPdagi potentsial roli va u PI3K/AKT/mTOR signalizatsiya yo'lining modulyatsiyasi bilan tartibga solinishi noma'lum.
Ushbu tadqiqot in vitro GIOP kalamush modeli va osteoblastlarda ACT ning himoya ta'sirini tushunish va asosiy molekulyar mexanizmlarni tushuntirishga qaratilgan.
Materiallar va usullar
Eksperimental hayvonlar
Shanxay laboratoriya hayvonlar markazidan (CAS, Shanxay, Xitoy) og'irligi 280–340 g bo'lgan qirq 8-haftalik erkak Sprague-Dawley (SD) kalamushlari olingan. Eksperimental hayvonlarni parvarish qilish tartib-qoidalari Qiqihar Tibbiyot Universitetining Hayvonlar etikasi qo'mitasining Uchinchi filial kasalxonasi tomonidan tasdiqlangan protokolga muvofiq amalga oshirildi. Va tadqiqot ARRIVE ko'rsatmalariga muvofiq o'tkazildi. Hayvonlar hayvonlar markazlarida patogenlar bo'lmagan, 24 ± 2 daraja, 12 soat yorug'lik va qorong'u davrlar, 50 ± 5 foiz namlik, oziq-ovqat va suvdan erkin foydalanish imkoniyatiga ega bo'lgan hayvonlar markazlarida joylashtirilgan.
GIOP modeli qurilishi
7 kunlik moslashuvchan oziqlantirishdan so'ng, kalamushlar tasodifiy sonlar jadvali usuli yordamida nazorat va model guruhlariga bo'lindi, Deksametazon (Dex, Sigma-Aldrich Sent-Luis, MO, AQSh) 6 hafta davomida haftasiga ikki marta 5 mg / kg AOK qilindi. model guruhidagi kalamushlarda OPni qo'zg'atish uchun mushak ichiga kiriting [25]. Nazorat guruhidagi kalamushlarga (n = 10) teng miqdorda fiziologik eritma yuborildi. Har ikki guruhdagi kalamushlarda 6 xaftada tana vaznida sezilarli o'zgarishlar kuzatilmadi. Keyinchalik, model guruhidagi kalamushlar model guruhiga, ACT past dozali guruhiga (Model plus ACT-L) va ACT yuqori dozali guruhiga (Model plus ACT-H) bo'lingan. ACT (HPLC 98 foiz) Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Xitoy) dan olingan va suvli erituvchi suspenziyasi bilan ishlov berilgan. 50 mg/kg/kun va 1{23}}0 mg/kg/kun ACT dozalari past va yuqori dozali guruhlardagi kalamushlarga (har bir guruhga 8 ta kalamush) mos ravishda og'iz orqali yuborilgan va 8 hafta davom etdi. Ular orasida namuna hajmi oldingi tadqiqot asosida hisoblab chiqilgan [26]. Ikki tomonlama ahamiyatlilik darajasi 0,05 [95 foiz ishonch oralig'i ( = 0,05)], 80 foiz quvvat va ta'sir hajmi 0,5 ni hisobga olgan holda, quvvat tahlili har bir guruhga 6 ta hayvondan iborat namuna hajmini taxmin qildi. 30 foiz osteoporozning tegishli ta'sir darajasi. Bundan tashqari, 20 foizni tashlab ketish darajasi bilan har bir guruhga 8 ta hayvon (jami 32 ta kalamush) ideal deb topildi.
Sichqoncha zardobi namunalari
8 hafta o'tgach, kalamushlar 10 foizli xloralgidrat (400 mg / kg, intraperitoneal, Solarbio, Pekin Xitoy) bilan behushlik qilindi, qon qorin aortasidan to'plandi, xona haroratida pıhtılaştırıldı va 10 daqiqa davomida 3500 rpm / min tezlikda santrifüj qilindi. Sarum keyingi foydalanishgacha 1,5 ml santrifüj naychalarida saqlangan.
Suyak mineral zichligini baholash
Suyak mineral zichligi (BMD) DAX kichik hayvonlarning suyak densitometri (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanxay, Xitoy) tomonidan ishlatilgan. Qisqacha aytganda, kalamushlar yotgan holatda joylashtirildi va orqa oyoq-qo'llari tashqariga qarab joylashtirildi. Kalamushlarning o'ng son suyagi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq skanerdan o'tkazildi va BMD qiymatlari qayd etildi [27].
Suyak morfologiyasini tahlil qilish
Tajriba oxirida kalamushlar ortiqcha xloralgidratni qorin bo'shlig'iga yuborish orqali evtanizatsiya qilindi va femurlar 70 foizli etanolda mahkamlandi. Keyinchalik, oldingi tadqiqotda tavsiflanganidek VivaCT 40mCT tizimida skanerlash va suyak hajmi/umumiy hajmi (BV/TV), suyak trabekulyar soni (Tb.N), suyak trabekulyar qalinligi (Tb.Tn) va suyak trabekulyar ajralish ko'rsatkichlari o'tkazildi. (Tb.Sp) baholandi [28]. Evtanaziya uchun SD kalamushlar suyak morfologiyasi tahlilidan so'ng, 10% xloralgidrat (350 mg / kg) intraperitoneal in'ektsiya yo'li bilan behushlik qilindi.
Fermentga bog'liq immunosorbent tahlili (ELISA)
Tijoriy Elishay to'plamlari kalamushlar zardobida osteokalsin (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) va C-terminal telopeptid (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) darajasini aniqlash uchun ishlatilgan. Qisqacha aytganda, reagentlar muvozanatlash va eritmani yuvish va standart ishlashga tayyorlash uchun 18-25 darajada olib tashlandi. Enzim plitalari Plitalar standart, bo'sh va namunali quduqlar bilan o'rnatildi. Quduqlarga taxminan 100 mkl namunadagi suyultiruvchi eritma qo'shildi, 37 daraja haroratda 90 daqiqa inkubatsiya qilindi va 37 daraja haroratda 60 daqiqa davomida biotinillangan antikor bilan almashtirildi. Yuvib bo'lgandan so'ng, fermentni bog'laydigan ishchi eritma qo'shildi va 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Substrat eritmasi (90 mkl) qo'shildi va yorug'likdan himoyalangan holda 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Standart quduqlarda ko'k gradient paydo bo'lganda, 50 mL tugatish eritmasi qo'shildi va OD450 ning o'zgarishi tahlil qilindi.
Teskari transkripsiya - miqdoriy real vaqtda PCR (RT-qPCR)
TRlzol LS reagenti kalamushlar va ACT bilan ishlangan MC3T{2}}E1 hujayralari sarumiga qo'shildi va umumiy RNK xona haroratida inkubatsiyadan so'ng xloroform qo'shildi. RNK kontsentratsiyasi va tozaligi Nanodrop ND-1000 spektrofotometrida A260/280 absorbansini o'lchash orqali tasdiqlandi. SuperScript II teskari transkriptaza to'plami RNKning cDNKga teskari transkripsiyasi uchun ishlatilgan. Keyinchalik, cDNK shablon sifatida qo'llanildi, primer qo'shildi va SYBR-Green PCR master miks to'plami aralashtirildi va ddH2O bilan 20 mL gacha qo'shildi va PCR kuchaytirish reaktsiyasi Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR yordamida amalga oshirildi. tizimi (ABI, CA, AQSh). GAPDH normallashtirish uchun ichki ma'lumotnoma sifatida ishlatilgan va nisbiy ifoda darajalari 2−DDCt usuli yordamida hisoblangan va uch nusxada bajarilgan. Runt bilan bog'liq transkripsiya omili 2 (Runx2), kollagen turi I 1 (CoL1A1), yadro omili-kB ligandning retseptorlari faollashtiruvchisi (RANKL), osteriks va osteoprotegerin (OPG) uchun primer ketma-ketligi 1-jadvalda keltirilgan.
Western blot tahlili
Hujayralarga 1 foiz proteaz inhibitori bo'lgan RIPA lizat qo'shildi va har bir guruhdan jami protein hujayralar lizisidan so'ng 5 daqiqa davomida 4 daraja chayqatish orqali yig'ildi. Har bir guruhdagi oqsillar kontsentratsiyasini aniqlash uchun BCA tahlil to'plami ishlatilgan. Shundan so'ng, oqsil namunalari 10 foizli natriy dodesil sulfat (SDS) buferi bilan teng hajmda aralashtiriladi va oqsil denaturatsiyasi uchun suv hammomida 95 daraja 5 daqiqa davomida qaynatiladi. 12 foizli SDS-poliakrilamidli vertikal jel tayyorlandi va jel qotib qolgandan so'ng, 120 mA 90 min jel elektroforezini ajratish uchun 30 ug protein namunasi olindi. Keyin oqsil PVDF membranasiga 90 V da 120 daqiqa davomida uzatildi. 5 foizli sigir zardobi albumini bilan yopishtirilgandan so'ng, PVDF membranasi marker va maqsadli oqsil guruhining molekulyar og'irligiga qarab kesildi va mos keladigan asosiy antikor bilan 4 daraja kechada inkubatsiya qilindi. P-AKT, p-mTOR va p-PI3K ga qarshi quyon poliklonal antikorlari 1:1000 nisbatda suyultirildi (Proteintech, Wuhan, Xitoy). TBST 30 daqiqa davomida yuvilgan va 1 soat davomida xona haroratida mos keladigan horseradish peroksidaza bilan belgilangan ikkilamchi antikor bilan inkübe qilingan. Blot yaxshilangan xemiluminesans reagentlari yordamida ingl. Protein bantlarining zichligi Image J yordamida aniqlandi. GAPDH nisbiy protein darajasini hisoblash uchun nazorat sifatida ishlatilgan.
Hujayra madaniyati va guruhlanishi
Sichqoncha pre-osteoblastlari MC3T3-E1 Xitoy toʻqimalari madaniyati toʻplamidan (CTCC, Xitoy) xarid qilingan va 10% homila sigir zardobi va 100 U/ml penitsillin va 100 mg/ml streptomitsinni oʻz ichiga olgan -MEMda yetishtirilgan. 37 daraja va 5 foiz CO2 da namlangan inkubator. Suyak differentsiatsiyasi madaniyati uchun 10 mM- -glitserofosfat va 50 mg/ml askorbin kislotani (Sigma-Aldrich) -MEM bilan aralashtirish orqali osteogen induksion muhit yaratildi va induktsiya qilish uchun MC3T3-E1 hujayralariga qo'shildi. ularning farqlanishi. 3 kundan keyin vosita o'zgartirildi. Ishqoriy fosfataza (ALP) hayotiyligi uchun 14 kunlik kulturalardan foydalanilgan. Bundan tashqari, hujayralar 30 daqiqa davomida PI3K inhibitori LY294002 (10 mkM) bilan oldindan ishlov berildi, so'ngra Dex va ACT bilan davolash qilindi.
Hujayra hayotiyligini tahlil qilish
ACT bilan davolash qilingan osteoblastlarning hayotiyligini baholash uchun Hujayralarni hisoblash to'plami-8 (CCK-8) tahlili o'tkazildi. MC3T3-E1 xujayralari 5 × 103 hujayra/quduqda 96 ta quduq plastinkalariga ekilgan. 1 mkM Dex miqdori oldingi tadqiqotlar [29] asosida ko'rib chiqildi va ACT ning gradient konsentratsiyasi (10−8, 10−7, 10−6 va 10−5 M) bilan birgalikda inkubatsiya qilindi. 96-Quduq plastinkalaridagi madaniyat muhiti 10:1 nisbatda aralashtirish muhiti va CCK-8 reagenti qo‘shilgandan so‘ng almashtirildi. 37 darajada 1 soat davom etgan inkubatsiyadan so'ng OD450 ning o'zgarishi baholandi.
Osteoblast apoptoz sonini aniqlash
Turli xil muolajalarga duchor bo'lgan MC3T3-E1 hujayralari EDTAsiz tripsin yordamida hazm qilindi va santrifüj orqali yig'ildi. 1 × bog'lovchi bufer bilan yuvilgandan so'ng, 5 mkL Annexin V-FITC qo'shildi va xona haroratida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi, 5 mkL PI bilan to'ldiriladi va 200-mesh neylon to'rdan o'tkazildi. Namunalar FACScan oqim sitometriyasi tizimi yordamida tahlil qilindi.
ALP faolligini tahlil qilish
MC3T3-E1 xujayralari 24-quduq plastinkalariga emlandi va gipsdan keyin ACT va Dex qo'shildi. Hujayra madaniyat muhiti madaniyat uchun osteogenik differentsiatsiya muhiti bilan almashtirildi. Hujayra lizis eritmasi (P0012J, Beyotime Biotechnology) yordamida hujayralar lizisidan foydalangandan so'ng, supernatant santrifüjlash orqali yig'ildi va standart egri chizilgan. ALP faolligini baholash uchun ALP to'plami (P0132S, Beyotime Biotechnology) ishlatilgan va OD450 hisoblangan.
Statistik tahlil
Uch nusxada uchta mustaqil tajriba o'tkazilgandan so'ng, ma'lumotlar GraphPad Prism 6.0 dasturi yordamida tahlil qilindi va o'rtacha ± standart og'ish sifatida ifodalandi. ANOVA bir nechta guruhlar o'rtasidagi statistik farqlarni solishtirish uchun ishlatilgan. P-qiymati < 0.05 statistik jihatdan boshqacha hisoblangan.
