Oldingi bazolateral amigdala neyronlari masofaviy qo'rquv xotirasini o'z ichiga oladi. 1-qism

Kirish:

Atrof-muhitga tahdid soladigan signallar ko'pincha qo'rquv xotiralarini keltirib chiqaradi, ammo ularning qanday shakllanishi va saqlanishi faol ravishda o'rganilmoqda.

Qo'rquv xotirasi bizning miyamizdagi xotira shaklidir. Bu xotiraning o'ziga xos shakli bo'lib, bizni ko'pincha qo'rquv, qo'rquv va asabiylashtiradi. Ammo bu qo'rquv xotirasi va bizning xotiramiz o'rtasidagi munosabatlar juda murakkab.

Birinchidan, qo'rquv xotiralari bizning qisqa muddatli xotiramiz bilan hech qanday aloqasi yo'q. Ko'pgina qo'rquv xotiralari bizning uzoq muddatli xotira banklarida saqlanadi. Shuning uchun ba'zan bizning ongimizda uzoq vaqtdan beri xotiralar suzadi.

Ikkinchidan, qo'rquv xotiralari bizning xotiramizga ta'sir qilishi shart emas. Bu bizning e'tiborimiz va kayfiyatimizdagi o'zgarishlarga olib kelishi mumkin bo'lsa-da, xotira yo'qolishiga olib kelishi haqida hech qanday dalil yo'q. Ko'p odamlar ba'zi dahshatli narsalarni boshdan kechirganlaridan keyin ham juda kuchli xotiralarni ko'rsatishi mumkin.

Va nihoyat, qo'rqinchli xotiralar bizning hayotimiz mavzusiga aylanishiga yo'l qo'ymasligimiz kerak. Biz ushbu xotiralarni qayta ishlash va ijobiy tomonga o'tish uchun ijobiy harakatlar qilishimiz kerak. Bunga terapiya olish, ijtimoiy faollik, tana va miyani mashq qilish, ijobiy fikrlash va ruhiy salomatlikni saqlash kiradi.

Shunday qilib, qo'rqinchli xotiralar bizga juda ko'p stress va noqulaylik tug'dirishi mumkin bo'lsa-da, biz o'z qobiliyatlarimiz va harakatlarimizga ishonishimiz kerak. Biz bu qo'rqinchli xotiralarga duch kelishimiz, xotiramizni mustahkamlashimiz, o'sishimiz va yaxshiroq, o'ziga ishongan odamlarga aylanishimiz mumkin. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak. Cistanche deserticola xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki Cistanche deserticola ko'plab noyob effektlarga ega bo'lgan an'anaviy xitoylik dorivor material bo'lib, ulardan biri xotirani yaxshilashdir. Qiymaning samaradorligi uning tarkibidagi turli faol moddalar, jumladan kislota, polisakkaridlar, flavonoidlar va boshqalardan kelib chiqadi. Bu ingredientlar turli yo'llar bilan miya salomatligini mustahkamlashi mumkin.

Qisqa muddatli xotirani qanday yaxshilashni bilish tugmasini bosing

Yaqinda paydo bo'lgan qo'rquv xotirasini esga olish, xotirani shakllantirish jarayonida faollashtirilgan miyaning bir nechta mintaqalarida neyronlarning qayta faollashishini aks ettiradi, bu anatomik ravishda taqsimlangan va o'zaro bog'langan neyron ansambllari qo'rqinchli xotira engrammalarini o'z ichiga olganligini ko'rsatadi.

Uzoq muddatli qo'rquv xotirasini eslab qolish paytida anatomik jihatdan o'ziga xos faollashuv reaktivatsiyasi engramlarining qanchalik davom etishi, asosan, o'rganilmaganligicha qolmoqda. Biz taxmin qildikki, oldingi bazolateral amigdaladagi (BLA) salbiy valentlikni kodlaydigan asosiy neyronlar qo'rquv xatti-harakatlarini qo'zg'atish uchun uzoqdan qo'rquv xotirasini eslab qolish vaqtida keskin qayta faollashadi.

Usullari:

TRAP2 va Ai14 sichqonlarining kattalar avlodlaridan foydalanib, kontekstli qo'rquvni (elektr toki urishi) yoki faqat kontekstni konditsioner qilish (zarbasiz) (n=5/guruh) davomida Fos-faollashuvidan o'tgan aBLA neyronlarini "TRAP" qilish uchun doimiy tdTomatoexpression ishlatilgan. . Uch hafta o'tgach, sichqonlar uzoqdan xotirani eslab qolish uchun bir xil kontekst belgilariga qayta ta'sir qilishdi va keyin Fosimmunohistokimyo uchun qurbon qilindi.

Natijalar:

TRAPed (tdTomato +), Fos + va qayta faollashtirilgan (ikkita yorliqli) neyron ansambllari kontekstli sichqonlarga qaraganda qo'rquvda kattaroq edi, aBLA ning o'rta pastki mintaqasi va o'rta/kaudal dorsomedial kvadrantlari barcha uchta ansambl populyatsiyasining eng katta zichligini ko'rsatadi.

Pomidor + ansambllari kontekstda va qo'rquv guruhlarida asosan glutamaterjik bo'lgan bo'lsa, masofaviy xotirani eslab qolish paytida muzlatish harakati ikkala guruhdagi ansambl o'lchamlari bilan bog'liq emas edi.

Munozara:

Xulosa qilamizki, aBLA-ni o'z ichiga olgan qo'rquv xotirasi uzoq vaqt oralig'ida shakllansa va saqlanib qolsa-da, plastisiya engram neyronlarining populyatsiya hajmiga emas, balki elektrofiziologik reaktsiyalariga ta'sir qiladi, qo'rquv xotirasini kodlaydi va uzoq muddatli qo'rquv xotirasini eslab qolishning xulq-atvor namoyon bo'lishiga olib keladi.

Kirish

Qo'rquvni qo'zg'atuvchi stimullar ko'pincha atrof-muhit belgilarini xavfli hayot hodisalari bilan bog'laydigan mustahkam va mustahkam assotsiativ xotiralarni hosil qiladi.

Xuddi shunday idrok etilgan tahdidlar bilan keyingi uchrashuvlar qo'rquv xotirasini eslab qolishni aks ettiruvchi yanada mustahkam himoya xatti-harakatlariga olib keladi. Qo'rquv bilan bog'liqlikni qayta ishlashdagi xatolar salbiy valentli psixiatrik natijalarga olib kelishi mumkin, jumladan, tashvish va travmadan keyingi stress buzilishi (TSSB) (Tovote va boshq., 2015).

Qo'rquv xotirasi ostida yotgan mexanizmlarning to'liq murakkabligini tushunish qo'rquv bilan bog'liq psixiatrik kasalliklarni keltirib chiqaradigan va normal qo'rquvni qayta tiklash uchun yangi terapevtik maqsadlarni taklif qiladigan funktsional aylanish anormalliklarini aniqlash uchun juda muhimdir.

So'nggi bir necha o'n yilliklar davomida qo'rquv xotirasi bo'yicha tadqiqotlar asosan qisqa muddatli xotirani shakllantirish, saqlash va eslab qolishga qaratilgan (Kimand Jung, 2006; Kim va Cho, 2020; Li va boshq., 2021).

Studieshave qo'rquv xotirasini shakllantirish va saqlash uchun mas'ul bo'lgan keng tarqalgan o'zaro bog'langan CNS neyronal ansambllarini nazarda tutgan (Ramirez va boshq., 2013; Liu va boshq., 2014; Roy va boshq., 2022). Ushbu ansambllarning sezilgan tahdidlar bilan faollashishi xotira engrami deb nomlanuvchi doimiy jismoniy izni ifodalovchi potentsial sinaptik uzatishga olib keladi (Yuan va boshq., 2011; Miyawaki va Mizuseki, 2022).

Qisqa muddatli xotirani eslab qolish dastlab xotira shakllanishi paytida faollashtirilgan bir xil neyronal ansambllarning qayta faollashishini aks ettiradi, bu dalillarga ko'ra, hatto bitta neyronal ansamblning qisman faollashishi ham qo'rquv bilan bog'liq xatti-harakatlarni keltirib chiqarishi mumkin, bu xotirani eslab qolishdan dalolat beradi (Roy va boshq., 2022). ). Garchi potentsiallashtirilgan elektron sxemalar qisqa muddatli qo'rquv xotirasini tushuntirishi mumkin bo'lsa-da, ularning uzoq muddatli qo'rquv xotirasida ishtirok etish darajasi noma'lumligicha qolmoqda.

Uzoq muddatli qo'rquv xotirasining mustahkamlanishi qisqa muddatli xotiraning progressiv yoki vaqti-vaqti bilan mustahkamlanishiga bog'liq deb hisoblansa-da, yaqinda o'tkazilgan bir qator tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, qisqa muddatli qo'rquv xotirasi neyron ansambllari vaqtga bog'liq ravishda qayta tashkil etiladi, bu esa saqlangan xotiraning boshqa neyronal ansamblga ko'chishiga olib keladi. bir xil miya hududi (DeNardo va boshq., 2019) yoki umuman boshqa miya hududlari (Frankland va Bontempi, 2005; Do Monte va boshq., 2016).

Bazolateral amigdala (BLA) qo'rquv xotirasining ajralmas qismi bo'lgan miya mintaqasi bo'lib, yaqinda va uzoqdan qo'rquv xotirasini eslab qolishda ishtirok etgan (Maren va boshq., 1996; Gale va boshq., 2004; Kitamura va boshq., 2017; Liu va boshqalar. ., 2022).

Ta'kidlash joizki, hisobotlarda BLAda qisqa muddatli qo'rquv-xotiraning o'ziga xos engrammasi tasvirlangan, u (1) xotirani shakllantirish jarayonida faollashadi, (2) xotirani eslab qolish paytida qayta faollashadi va (3) qo'rqinchli bo'lmagan kontekstlarda qo'rquvga o'xshash xatti-harakatlarni keltirib chiqarishi mumkin. Royet boshq., 2022; Zaki va boshq., 2022). Shu bilan birga, xotirani shakllantirish jarayonida faollashtirilgan aBLA neyron ansambli uzoqdan xotirani eslab qolish vaqtida qay darajada qayta faollashgani hali ham aniq emas.

Ushbu tadqiqotda biz BLAfear xotira ansamblining qayta faollashishi qo'rquv holatidan 3 hafta o'tgach uzoq vaqt nuqtasida kuzatiladi degan gipotezani sinab ko'rdik. Ayniqsa, oldingi BLA (aBLA) uchun lokalizatsiya qilingan qo'rquv stimuliga javob beradigan salbiy valentli neyronlarga ega bo'lgan BLA uy sxemalari ham qo'rqinchli, ham mukofotga intiladigan xatti-harakatlarga hissa qo'shadigan (Hu, 2016) alohida ahamiyatga ega (Goosensand Maren, 2001; Kim va boshq., 2016, 2017; Chjan va boshq., 2020).

ABLA ga e'tibor qaratgan holda, biz ikkinchi avlod TargetedRecombination in Activated Populations (TRAP2) transgen sichqonlaridan (DeNardo va boshq., 2019) ishladik, bunda Cre-rekombinaz faolligi yaxshilangan Cre orqali c-fos zudlik bilan erta gen promotor kuchaytiruvchi elementlar bilan bog'langan. -estrogen retseptorlari (ER) kompleksi. Ushbu kompleksni ifodalovchi neyronlar doimiy Cre rekombinatsiyasiga duchor bo'lishi mumkin, ya'ni ER agonisttamoksifen yoki uning qisqaroq ta'sir qiluvchi analogi 4-gidroksitamoksifen (4-OHT) yordamida Cre ning doimiy ifodalanishini ta'minlaydigan "TUZOQ" bo'lishi mumkin. -bog'liq effektoror reportyor molekulalar.

Bu erda biz TRAP2 sichqonlari va Cre ga bog'liq bo'lgan tdTomato reportyor liniyasi Ai14 (Madisen va boshq., 2010) ni kesib o'tdik va kontekstli qo'rquvni tartibga solish paytida TRAPed aBLA neyronlari (tdTomatopozitiv) masofaviy xotira rekall paytida qayta faollashtirilganligini (ekspress Fos immunoreaktiv oqsili) miqdorini aniqladik. 3 haftadan keyin.

Qisqa muddatli qo'rquv xotirasida bo'lgani kabi, bizning topilmalarimiz aBLAda uzoq muddatli glutamaterjik qo'rquv xotirasi neyronal ansambllarining mavjudligini qo'llab-quvvatlaydi.

Shunisi e'tiborga loyiqki, aBLA neyron ansambllarining hajmi, konditsioner yoki masofaviy xotirani eslab qolish paytida yoki ikkalasi ham faollashtirilganmi, qo'rquvning xatti-harakati bilan bog'liq emas edi, bu qo'rquvning tabiati o'rganish bilan bog'liq plastiklik va uning uzoqdan qo'rquv xotirasiga yakuniy ta'siri ansambl neyronlarining elektrofiziologik reaktsiyalari bilan bog'liqligini ko'rsatadi. , Ansambl aholisining kattaligi emas, birinchi navbatda uzoqdan qo'rquv xotirasi xatti-harakatlarini boshqaradi.

Materiallar va usullar

Axloqiy tasdiqlash

Eksperimental protseduralar Texas sog'liqni saqlash universiteti San-Antonio instituti hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan va Laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha Milliy tadqiqot kengashi qo'llanmasiga mos keladi.

Hayvonlar

Gomozigotali Fos2A−iCreER/2A−iCreER knockin (TRAP2, #030323) va R26Ai14/+ (Ai14, #007914) sichqonlarining naslchilik juftlari (Jekson Laboratories) erkak gemizigotli TRAP4g:Airing (Airing) hosil qilish uchun kesishgan. Sutdan ajratilgandan keyin sichqonlar guruhlangan va kemiruvchilar uchun to'shak (Sani-chips; Harlan Teklad, Madison, WI, AQSh) bo'lgan plastik kataklarga (29 × 18 × 13 sm) joylashtirilgan. :10 yorug'lik-qorong'i tsikl (chiroqlar soat 0600 da yonadi). Oziq-ovqat va suv ad libitum mavjud edi. Tajribalar sichqonlar 3 oylik bo'lganda boshlangan.

Xulq-atvorga odatlanish

Ilgari chop etilgan tadqiqotlarda bo'lgani kabi (DeNardo va boshq., 2019), sichqonlar tekshirilmagan eksperimental sharoitlarga (masalan, ishlov berish, yangi kontekstni o'rganish va boshqalar) javoban cfos induktsiyasini minimallashtirish uchun kontekstli qo'rquvni sozlashdan oldin darhol besh kun ketma-ket odatlanish mashg'ulotlarini o'tkazdilar. 1B-rasm).

Har bir kunlik odatlanish sessiyasi 3 daqiqa davom etdi va konditsioner kamerasiga ta'sir qilishdan iborat (HabitestModular System, Coulbourn Instruments). Kamera sezgi signallari (1) 70% etanol (hid bilish belgisi), (2) metall panjara qavati (haptik ishora), (3) naqshli fon (vizual ishora) va (4) ko'rinadigan yorug'lik (vizual ishora) dan iborat.

Bundan tashqari, barcha sichqonlar konditsioner kameraga joylashtirilgunga qadar bir daqiqa davomida qo'lda ushlab turilgan va kameradan chiqqandan so'ng 10 soniya davomida muloyimlik bilan "qidirilgan". Ko'nikish seanslari sichqonlar konditsioner kunida boshdan kechiradigan muomalaga taqlid qilish uchun mo'ljallangan edi, bundan tashqari qorin bo'shlig'iga (IP) in'ektsiya amalga oshirilmagan.

Kontekstli qo'rquvni tartibga solish

Keyin sichqonlar tasodifiy tarzda qo‘rquv sharoitlari (zarba) va kontekstga bog‘liq (zarbasiz/faqat kontekst) guruhlarga tayinlandi. Konditsionerlash 0-kuni boshlandi va sichqonlar konditsioner kameraga joylashtirilgan va 2-sonli tadqiqotga ruxsat berilgan. min. Keyingi 4 daqiqa ichida qoʻrquv holatida boʻlgan sichqonlar 1 soniya davom etgan va 0.75 mAintenslikdagi bir qator besh futlik zarbalarni oldi.

Zarbalar sichqonlarga oldindan aytib bo'lmaydigan oraliqlarda, ammo sichqonlar o'rtasida izchil bo'lgan. Kontekstli sichqonlar oyoq zarbalaridan tashqari bir xil protokoldan o'tdilar (1C-rasm). Vazifani tugatgandan so'ng, har bir sichqonchaga yuqorida tavsiflanganidek tayyorlangan 4:1 nisbatda kungaboqar va kastor yog'i kokteylida eritilgan 4-gidroksitamoksifen (4-OHT, 100 mg/kg, IP) yuborildi (DeNardo va boshq., 2019).

Keyin sichqonlar uy qafaslariga qaytarildi, u erda ular normal yashashni davom ettirishdan oldin kamida 72 soat davomida xulq-atvor to'plamiga ulashgan xonada bezovtalanmagan.

Qo'rquvni tartibga solishdan uch hafta o'tgach (21-kun), sichqonlar konditsionerlik paytida mavjud bo'lgan bir xil sensorli signallar bilan sinov kamerasiga qayta ta'sir qilishdan iborat bo'lgan masofaviy xotirani eslab qolish sinovidan o'tkazildi (1D-rasm). Sichqonlarga kamerani 5 daqiqa davomida o'rganishga ruxsat berildi, bu vaqt davomida qo'rquv harakati (postural muzlash) FreezeFrame 4 video kuzatuv dasturi (ActiMetrics, Wilmette IL, AQSh) yordamida baholandi.

Miyaning fiksatsiyasi va gistologiyasi

Xotirani eslab qolish sinovidan to‘qson daqiqa o‘tgach, sichqonlar izofluran (kislorodda 5%) bilan chuqur anesteziya qilindi, so‘ngra 30 ml geparinlangan (100 U/ml) izotonik fiziologik eritma, so‘ngra 100 ml 4% paraformal (FAP) bilan transkardiyak perfuziya o‘tkazildi. )0,1 M fosfat buferida.

Miyalar olib tashlandi, 4% PFA 6 soat davomida xona haroratida (∼22◦C) va kriyoprotektedin 30% sukroz-0.01 M fosfat tampon tuzi (PBS) kamida 2 kun davomida o'rnatildi.

Keyin miyalar muzlatish mikrotomida (Leica Microsystems, Wetzlar, Germaniya) 30 mkm qalinlikdagi koronal bo'laklarga bo'lingan va aBLA (Paxinos va Franklin, 2019) o'z ichiga olgan bo'laklarga bo'linib, polivinilpirolidon (PVP) kriyoprotektorida C − 2 0 ° C da saqlangan.

Immunogistokimyo

Immunitetni bo'yash yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi (Mitchell va boshq., 2018; Maruyama va boshq., 2019).

Qisqacha aytganda, PVP krioprotektorini olib tashlash uchun bo'laklar PBS da yuvildi va fiksatsiya paytida hosil bo'lgan avtomatik floresan aldegidlarni olib tashlash uchun natriy borgidrid (0,5%) bo'lgan PBSda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Qo'shimcha PBS yuvishdan so'ng, bo'limlar blokirovka qiluvchi buferda (3% echki zardobida, 0,05% Triton-X-100 PBSda) 2 soat davomida ~ 22 ° C da inkubatsiya qilindi, so'ngra apoliklonal quyonni o'z ichiga olgan blokirovka buferida 4 ° C da inkubatsiya qilindi. -Fos birlamchi antikor (Ab) 72 soat (1:1500, sinaptik tizimlar #226 003) yoki monoklonal sichqoncha CaMKII primerAb 24 soat davomida (1:500, Enzo Life Sciences, #ADI-KAM-CA002).

Keyingi yuvinishdan so'ng Fos va CaMKII bo'limlari 2 soat davomida ∼22◦C da alohida quyonlarga qarshi biotinlangan echki IgG ikkinchi darajali Ab (1:250 EMD Millipore #AP132B) da inkubatsiya qilindi, so'ngra 0 da ketma-ket yuvildi. 05 M tris-buferli sho'r suv (TBS) va 0,1 Msodium asetat keyin TBS asosidagi blokirovka qiluvchi eritmada 1 soat davomida streptavidin-Alexa Fluor 488 (1:250, Invitrogen # S11223) ta'siriga qo'yiladi.

Nihoyat, bo'limlar Tris buferida yuvildi va Fluoromount-G (Invitrogen, #00-4958-02) bilan slaydlarga o'rnatildi.

Rasmga tushirish va tahlil qilish

Tegishli lazer chiziqlari bilan jihozlangan Zeiss LSM710 lazerli skanerlovchi konfokal mikroskop bilan interfeysli A{0}}bitli fotoko'paytiruvchi trubkasi 20× ob'ektiv (NA 0,8) va skanerlash boshi teshik o'lchami yordamida aBLA tasvirlarini olish uchun ishlatilgan. 47,5 mkm. Har bir tasvir uchun ImageJ dasturi (NIH, Bethesda, MD) tdTomato (yaʼni, TRAPed, qizil) va Alexa-488(Fos, yashil) floresansining alohida piksel xaritalarini yaratish uchun ishlatilgan.

Ikkilamchi yorliqlash uchun piksel chegarasi intensivligi va to'lqin uzunligining o'zaro kelishini aniqlash Fo'ning asosiy Ab bilan va ilgari tasvirlanmagan holda qayta ishlangan to'qimalar qismlarini solishtirish orqali aniqlandi (Mitchell va boshq., 2018; Maruyama va boshq., 2019). Hujayralarni hisoblash va birgalikda lokalizatsiya ma'lumotlari yordamida olingan. Thesemi-avtonom ImageJ plagini EzColocalization (Stauffer va boshq., 2018).

aBLA tasvirlari deyarli teng o'lchamdagi uchta rostro-kaudal submintaqalarga bo'lingan, har bir kichik mintaqa tobregmaga nisbatan rostral-kaudal stereotaksik koordinatalarning o'ziga xos diapazoni bilan aniqlangan: rostral, -0,8 dan -1,1 mm; o'rta, -1,2 dan -1,5 mm; va kaudal, -1,6 dan -1,9 mm (Paxinos va Franklin, 2019). ImageJ-dagi Regionof Interest (ROI) menejeri keyinchalik theaBLA-ni perimetriga nisbatan dorsal-ventral va medial-lateral kvadrantlar bo'ylab ajratish uchun ishlatilgan. Keyinchalik bu shablon har bir belgilangan rostral-kaudal submintaqadagi allimages uchun qo'llanildi.

aBLAperimeter demarkatsiyasi ImageJ EzColocalizationplug-in bilan har bir tasvirda barcha neyronlar sonining 2-D fazoviy syujetini yaratish uchun ishlatilgan. Keyin rostral, o'rta va kaudal subregionlar ichidagi fazoviy uchastkalar alohida-alohida qoplangan. Buning natijasida rostral pastki mintaqa uchun 10 ta qo'rquv va 10 ta kontekst, o'rta kichik mintaqa uchun 10 ta qo'rquv va 13 ta kontekst va kaudal pastki mintaqa uchun 12 ta qo'rquv va 13 ta kontekst syujetlari paydo bo'ldi.

Kontekst guruhidagi koʻproq submintaqa tasviri chizmalarini tuzatish uchun 1.0(10/10), 0.77 (10/13) va 0.92 tuzatish omillari. (12/13) mos ravishda kontekst guruhining rostral, o'rta va kaudal pastki mintaqaviy uchastkalariga qo'llanildi. Kontekst ma'lumotlarida hisoblashning topografik taqsimotini bir xilda qoldirishga yo'l qo'ymaslik uchun har bir aBLAsub-hududidan qaysi aniq sonlarni chiqarib tashlashni aniqlash uchun MS Excel-dagi tasodifiy sonlar generatori ishlatilgan.

Keyinchalik, biz aBLA kichik hududlarini 1-4 gacha bo'lgan kvadrantlarga ajratdik (2D-rasmga qarang). Buning uchun kesishuv koordinatasi (0,0) MS-Excel dasturida 2-D tekisligidagi nuqta sifatida aniqlandi, bunda har bir kvadrantning maydoni taxminan toʻrtdan biriga teng boʻladi. har bir rostral-kaudal subregionning umumiy maydoni. Kvadrant o'qlari va har bir sonning xy koordinatalari aniqlandi va soat yo'nalishi bo'yicha 30◦ aylantirildi va shu bilan ularni aBLA anatomik o'qiga moslashtirdi.

Submintaqalar va ularning kvadrantlari o'lchamidagi kichik o'zgarishlarni hisobga olish uchun hisoblash ma'lumotlari sirt maydoni (hisob/mm2) bo'yicha normallashtirildi, shunday qilib xabar qilingan qiymatlar har bir submintaqa yoki kvadrant uchun hisoblash zichligini aks ettiradi.

Bizning TRAP2 tizimi tomonidan qo'lga olingan neyronlarning qo'zg'atuvchi fenotipini baholash uchun, glutamaterjik neyronlarning belgilangan belgisi bo'lgan kaltsiy-kalmodulinga bog'liq protein kinaz II (CaMKII) bilan konditsioner-TRAPed tdTomatoekspressiyasining birgalikda lokalizatsiyasi (McDonald va boshq.), 2002 kvantdan olingan. ImageJ hujayra hisoblagich plaginidan foydalangan holda sichqoncha uchun kamida uchta BLA bo'limi tasvirlari.

Statistika

Statistik test Prism 9.5.1 dasturida (GraphPad, San-Diego, CA, AQSH) amalga oshirildi va Shapiro-Wilk testi yordamida barcha maʼlumotlar toʻplamining normal taqsimlanishi testini oʻz ichiga oldi. Uzluksiz maʼlumotlar uchun guruh taqqoslashlari ikki dumli juftlashtirilmagan talaba bilan amalga oshirildi. t-testlari yoki ikki yoki uch tomonlama ANOVA, so'ngra mos ravishda Sidak va Tukeyning ko'p taqqoslash testi, muhimANOVA o'zaro ta'siridan keyin juftlik bilan taqqoslash uchun.

Pirsonning r-koeffitsienti va mos keladigan P-qiymatini aniqlash uchun guruh ichidagi korrelyatsiya tahlili o'tkazildi. Korrelyatsiyalar Fisher'sZ transformatsiyasi yordamida guruhlar bo'ylab taqqoslandi (qo'shimcha jadval 1). Guruh ma'lumotlari o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi. Statistik ahamiyatga ega bo'lgan P < 0.05.

Natijalar

Qo'rquvni tartibga solish uzoqdan qo'rquv xotirasini uyg'otadi

Qo‘rquv xotirasini shakllantirish jarayonida faollashgan aBLA neyronlari masofaviy xotirani eslab qolish vaqtida qay darajada faollashishini aniqlash uchun sichqonlar qo‘rquv (n=5) yoki kontekst (n=5) holatidan so‘ng 4-OHT in'ektsiyasidan o‘tdi. (1A–C rasmlar).

Qo'rquv xotirasining shakllanishini (ya'ni, qo'rquvni o'rganishni), davolashning muhim o'zaro ta'sirini (zarba va zarba yo'q) va vaqt oralig'ini (har bir zarbadan so'ng 3{17}} s oraliq) muzlatish xatti-harakatlarini o'rganishda [ikki tomonlamaANOVA, F(5, 40)=6.733, P=0.0001]. Qo‘rquvga uchragan sichqonlar 3 (BL ning 275 ± 68%, P=0.0203), 4 (BL ning 486 ± 76%, P < 0,0001) va 5 (402 ± 26) zarbadan so‘ng dastlabki holatga nisbatan muzlash vaqtining ko‘payishini ko‘rsatdi. BL ning %, P <0,0001) va zarbadan keyin kontekstli shartli sichqonlarga nisbatan 4 (kontekstning 251 ± 38%, p <0,0001) va 5 (kontekstning 375 ± 25%, p <0,0001).

Kutilganidek, masofaviy xotirani eslab qolish uchun konditsioner kameraga qayta ta'sir qilish 21-sonli konditsionerdan so'ng, qo'rquvga ega sichqonlar kontekstni boshqarish bilan solishtirganda muzlatish uchun ancha vaqt sarflaganini ko'rsatdi[346 ± 18%, juftlashtirilmagan t-testi, t(8) {{7} }.16, P < 0.0001] (1D-rasm).
Birgalikda, 1-rasmdagi ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, bizning qo'rquvni tartibga solish protokoli qo'rquv xotirasining mustahkam shakllanishiga va qo'rquv xotirasini uzoqdan eslab qolishga olib keldi.

Qo'rquvni o'rganish ansambl uchun mustahkam mintaqaga xos aBLA ni keltirib chiqaradi

TRAPed (tdTomato +) sonining tahlili qo'rquv sharoitida (110 ± 6,2) kontekstga bog'liq (77 ± 3,1) sichqonlarga qaraganda fos-faollashtirilgan aBLA populyatsiyasining sezilarli darajada ko'pligini aniqladi [juftlanmagan t-test, t (8)=4 .782, P=0.0014] (1-jadval). Kutilganidek, kontekstli neyronlarning ~ 70% va qo'rquv TRAPed neyronlarining ~ 80% (n=6 aBLA bo'limlari/guruhlari) CaMKII + (1A, B qo'shimcha rasmlari) bo'lib, ular asosan glutamaterjik proektsion neyronlar ekanligini ko'rsatadi.

Oldingi hisobotlarga o'xshab (Kim va boshq., 2016), biz theaBLA ni uchta rostrokaudal submintaqalarga ajratdik: rostral, o'rta va kaudal (2A-C-rasmlar) va TRAPed sonining zichligini (hisob / mm2) pastki mintaqalar bo'ylab solishtirdik. davolash guruhlari o'rtasida (2D-rasm). Ikki tomonlama ANOVA submintaqa va davolash o'rtasida sezilarli o'zaro ta'sirni aniqladi [F(2,24)=7.7099,P=0.0038].

Guruh ichidagi tahlillar shuni ko'rsatdiki, TRAPed soni rostralga nisbatan qo'rquv (239 ± 9) va kontekst (144 ± 12) guruhlarida o'rta aBLA kichik mintaqasida ko'proq bo'lgan (qo'rquv: 86 ± 6, P < { {8}}.0001; kontekst: 81 ± 9, P=0.0035) va kaudal (qo‘rquv: 123 ± 15, P < 0,0001; kontekst: 90 ± 12, P {{20) }}.0132) kichik hududlar.

Guruhlar orasidagi tahlil shuni ko'rsatdiki, TRAPed sonining zichligi qo'rquv holatidagi sichqonlarning o'rta kichik mintaqasida sezilarli darajada kattaroq bo'lgan (P < 0.0001).

TRAPed neyronlarning joylashishini yanada aniqlashtirish uchun biz rostral, o'rta va kaudal aBLA submintaqalarini to'rtta kvadrantga bo'ldik (2E-rasm). O'rta kichik mintaqada hisoblash zichligiga asosiy davolash ta'siri kuzatildi [uch tomonlama ANOVA, F(1,32)=17.44, P=0.0002] bilan 3 (218 ± 29 ga qarshi 107 ± 17, P=0.0031) va 4 (240 ± 16 va 101 ± 12, P < 0,0001) kvadrantlarda kontekst guruhiga qaraganda qo'rquvda yuqori TRAPedcount zichligi.

Biz aBLA sub-mintaqalari bo'ylab guruh ichidagi va kvadrant ichidagi TRAPed sonining zichligini yanada baholadik (2E-rasm va qo'shimcha jadval 2). Rostral pastki mintaqa (59 ± 8) bilan solishtirganda, qo'rquv guruhining 2 kvadranti o'rtada (245 ± 21, P < 0.0001) va kaudalda (172 ± 23,) yuqoriroq TRAP zichligiga ega. P=0.0040) kichik hudud.

Keyinchalik, butun aBLA, uning o'rta pastki mintaqasi va ansambl sonining zichligi kontekst va qo'rquv sharoitidagi guruhlar o'rtasida farq qiladigan o'rta va kaudal submintaqalarning kvadrantlarida muzlash harakati va TRAPed neyron ansamblining hajmi o'rtasidagi munosabatni baholadik. Qo'rquv yoki kontekst guruhida (2F-rasm) hech qanday muhim korrelyatsiya kuzatilmadi, bu qo'rquv xatti-harakati aBLA sub-mintaqalarida qo'rquvni o'rganish fosenmbli hajmini aks ettirmaydi.

Birgalikda, 2-rasmdagi topilmalar shuni ko'rsatadiki, qo'rquv konditsionerligi kontekstli konditsionerlikdan ko'ra aBLAda kattaroq fos ansambliga olib kelgan. Ansambl neyronlari o'rta aBLA kichik mintaqasida eng zich joylashgan edi, ammo qo'rquv xatti-harakati ansambl populyatsiyasi hajmiga mos kelmadi.

For more information:1950477648nn@gmail.com