Transkriptom profilini yaratish orqali Leontopodium Alpinum (Edelweiss) kallus madaniyati ekstraktining qarishga qarshi ta'siri

Iltimos, bosingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

Annotatsiya:Edelveys (Leontopodium Alpinum) Asteraceae oilasiga mansub yovvoyi gul bo'lib, toshli ohaktosh joylarda o'sadi. Bu erda biz edelweiss kallus madaniyati ekstraktining samaradorligini (Leontopodium Alpinum kallus madaniyati ekstrakti; LACCE) in vitrodan in vivo jonligacha bir nechta tahlillar, shuningdek, transkriptom profilini o'rganib chiqdik. Bir nechta in vitro tahlil natijalari UVB bilan davolashga javoban LACCE ning kuchli antioksidant faolligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, LACCE yallig'lanish va ajinlarni bostirdi; ammo, namlash faolligi LACCE tomonidan oshirildi. In vivo klinik sinov shuni ko'rsatdiki, LACCE ning yuz va teri to'qimalariga doimiy qo'llanilishi platsebo bilan solishtirganda antiperiorbital ajinlar, terining elastikligi, terining zichligi va terining qalinligini yaxshilagan. RNK-Sequencing natijalari inson genlarining kamida 16,56 foizi keratinotsit hujayralarida ifodalanganligini ko'rsatdi. Bir nechta KRT oqsillarini kodlaydigan LACCE yuqori tartibga solinadigan genlar; DDIT4, BNIP3 va IGFBP3 rivojlanish jarayonining ijobiy tartibga solinishi, dasturlashtirilgan hujayra o'limi, keratinizatsiya va teri to'siqlarini hosil qiluvchi kornifikasyonda ishtirok etdi, bu esa inson terisiga ko'plab afzalliklarni beradi. Aksincha, pastga regulyatsiya qilingan genlar stressga javob beradigan genlar, jumladan metall, oksidlanish, yaralanish, gipoksiya va virus infektsiyasi bo'lib, LACCE teriga hech qanday zararli stressni keltirib chiqarmaydi. Bizning keng qamrovli tadqiqotimiz LACCE qarishga qarshi kosmetika uchun istiqbolli vosita ekanligini ko'rsatdi.

Kalit so‘zlar:qarishga qarshi; kallus; edelveys;teri hujayralari; transkriptom

1.Kirish

Edelveys(Leontopodium noble sub sp. Alpinum(Cass.) Greuter) - Asteraceae oilasiga mansub yovvoyi gul boʻlib, Shveytsariya Alp togʻlari kabi baland togʻlardagi qoyali ohaktosh joylarda oʻsadi [1,2]. Qisqa muddatli oq gullarning noyobligi tufayli edelveys Alp va Karpat tog'lari bilan bog'liq go'zallik va poklikni ifodalaydi. Bundan tashqari, Avstriya, Bolgariya, Ruminiya, Sloveniya va Shveytsariya kabi ko'plab mamlakatlar edelveysni milliy ramz sifatida qabul qiladi.

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

Uzoq vaqt davomida edelveys an'anaviy tibbiyot sifatida qorin og'rig'i, bronxit, diareya, dizenteriya va isitmaga qarshi ishlatilgan. Yaqinda bir nechta tadqiqotlar sichqon va kalamushlarda [3] va inson keratinotsitlari va endotelial hujayralarida [4] yallig'lanishga qarshi edelveys ekstrakti samaradorligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, edelveysning ildiz ekstrakti tarkibida xolinergik neyrotransmissiyani kuchaytiruvchi tarkibiy qismlar mavjud bo'lib, bu uning antidemans agentlari [5] va antioksidantlar uchun potentsialini ko'rsatadi.

leontopodik kislota A va 35-kofeoilkin kislotasi, ular qarishga qarshi vosita sifatida ishlatilishi mumkin [6]. Bundan tashqari, edelveys ekstraktlari Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia va Streptococcus pyogenesga qarshi antibakterial ta'sir ko'rsatdi, bu ularning nafas olish va qorin bo'shlig'i kasalliklarida etnom-tibbiy qo'llanilishini ko'rsatdi [7].

Oldingi bir qancha tadqiqotlar edelveys ekstrakti birikmalarini tahlil qilgan. Masalan, kapillyar xromatografiya usulida edelveysning havo qismlaridan 12 ta farmakologik ahamiyatga ega birikmalar, jumladan flavonoidlar, kofein kislotalar va leontopodik kislotalar aniqlandi [8]. Edelveys o'simliklaridan antioksidantlarni ajratib olish uchun markazdan qochma bo'linish xromatografiyasi (CPC) va yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) usullari ishlab chiqilgan [6]. Ma'lumki, edelveys ekstraktining havo qismlari va ildizlari orasidagi faol birikmalari xilma-xildir[3]. Masalan, edelveysning tukli ildizlari login va 5-metoksi-login kabi farmakologik faol lignanlarni hosil qiladi, ular kumush nitrat, saxaroza, metiljasmonat va xamirturush ekstrakti kabi bir qancha boshqa komponentlar tomonidan rag'batlantirilishi mumkin. 9].Cistanche ekstraktining foydalariBundan tashqari, 11 xil Leontopodium turlarining metabolik naqshlari ularning taksonomiya munosabatlarida yadro magnit-rezonans (1H NMR) spektroskopiyasi va suyuq xromatografiya-mass spektrometriyasi (LC-MS) yordamida aniqlangan.

Cistanche qarishga qarshi bo'lishi mumkin

O'simlik kallusini o'simlik yarasini yopish uchun yaralash yoki in vitro tizimni sun'iy ravishda o'tkazish orqali osonlikcha qo'zg'atiladigan uyushmagan yoki differentsiatsiyalanmagan hujayra massalari sifatida ta'riflanishi mumkin. O'simlik kallusi antiseptik o'sish sharoitida ozuqa moddalari va o'simlik o'sish regulyatorlarini qo'shish orqali sun'iy ravishda etishtiriladi. Hozirgi vaqtda bioreaktorda bir xil sifatga ega bo'lgan ko'p sonli o'ziga xos o'simlik hujayralarini ishlab chiqarish mumkin. Bundan tashqari, o'simlik hujayrasi totipotentlik deb ataladigan qobiliyatga ega, bu o'simlik hujayrasining butun etuk o'simlikni ishlab chiqarish uchun genetik salohiyati [11]. Shunday qilib, o'ziga xos o'simlik kallusidan etuk o'simlik hosil qilish mumkin. Bundan tashqari, kallus noyob va yo'qolib ketish xavfi ostida turgan o'simliklarni saqlab qolish uchun o'simliklarni qayta tiklash uchun keng qo'llanilishi mumkin [12,13].

Hayvon hujayralari singari, o'simlik hujayralari ham jarohatlardan so'ng o'simliklarni rag'batlantirish va qayta tiklashni osonlashtirish qobiliyatiga ega [14]. O'simlik ildiz hujayralari kosmetika sanoatida paydo bo'ladigan materiallar sifatida qaralsa-da, mavjud materiallar cheklangan. Yangi o'simlik manbalarini aniqlash va ularning kosmetika bilan bog'liq funktsional komponentlarini baholash muhimdir.

Edelweiss ekstraktlari farmatsevtika vositalarida qo'llanilishi bilan mashhur; ammo, edelweiss ekstraktining tabiiy kosmetik manba sifatida ta'siri kamdan-kam hollarda xabar qilinadi. Bu erda biz edelweiss kallus ekstraktining (Leontopodium Alpinum kallus madaniyati ekstrakti; LACCE) in vitrodan in vivogacha bir nechta tahlillar yordamida edelweiss barglaridan olingan samaradorligini o'rganib chiqdik va transkriptom profillash yordamida LACCE sabab bo'lgan molekulyar mexanizmni aniqladik.

2. Materiallar va usullar

2.1. Edelweiss Callus ishlab chiqarish

Edelweiss urug'lari tijorat maqsadida sotib olindi. Edelveys urug'lari 30s davomida 7{2}}% etanolda namlangan, so'ngra distillangan suv bilan yuvilgan. Yana urug'lar 0,3 foizli natriy gipoxloritida (Vako, Osaka, Yaponiya) 20 daqiqa chayqatiladi va distillangan suv bilan yuviladi. Sterilizatsiya qilingan urug'lar asosiy Murashige va Skoog (MS) muhitida (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niderlandiya) unib chiqdi. Aseptik holatda edelweiss barglari kichik bo'laklarga (0,5 dan 1 sm gacha) kesilgan. Biz oʻsimlik hujayralarining dastlabki bosqichini 0.5-3 mg/ml 6-benzilaminopurin (6-BAP) (Duchefa Biochemie) va 0.3-1 oʻz ichiga olgan MS muhitida qoʻzgʻatdik. mg/mL 2,4-Dixlorofenoksiasetik kislota (2,4-D)(Duchefa Biochemie) zulmatda 25±2 daraja [15]. MS muhitining pH qiymati 1N NaOH (Duchefa Biochemie) yordamida 5,8 ga o'rnatildi. Induktsiya qilingan kallus petri idishida ko'paytirildi. Tanlangan kallus liniyasi Koreyaning Incheon shahridagi BIO-FD&C Co., Ltd.ning Qarishga qarshi tadqiqot institutida bioreaktorda yetishtirildi. O'stirilgan kallus yig'ib olinadi va uch marta distillangan suv bilan yuviladi.cistanche ChingizxonKallus ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq muzlatilgan quritgich (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Koreya) yordamida suvsizlangan. Quritilgan edelveys kallusi distillangan suvda 50 daraja 8 soat davomida aralashtiriladi. Kallus ekstraktlari 10 daqiqa davomida 98 daraja issiqlik ekstrakti bilan olingan.

2.2. Inson teri hujayralari madaniyati

Edelveys ekstraktining inson teri hujayralariga, keratinotsitlar (HaCaT) hujayralari va normal inson Detroit 551 fibroblastiga (ATCC, Manassas, VA, AQSh) baholangan ta'siri Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Welgene, Gyeongsan-si, Koreya) da o'stirilgan. ) 10 foizli homila sigir zardobi (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) va 1 foiz antibiotik-antimikotik (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) bilan 37 daraja haroratda 5 foiz CO2 holati bilan to'ldiriladi.

2.3. MTT tahlili orqali hujayra metabolik faolligini baholash

Inson teri hujayralarining hujayra o'sishi, ko'payishi va omon qolishiga LACCE ning sitotoksikligini baholash uchun MTT({{0}}(45-dimetiltiazol-2-yl){{3} },5-difeniltetrazolium bromid) tahlili avval aytib o'tilganidek amalga oshirildi[16,17]. Qisqacha aytganda, har bir quduqqa mos ravishda 5×10* hujayra zichligidagi HaCaT va Detroit 551 hujayralar 96-quduq plastinkasida 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Shundan so‘ng yakuniy konsentratsiyalar 0,1 foizni tashkil etdi. , 0,5 foiz va 1 foiz LACCE 24 soat davomida davolandi. Nazorat sifatida distillangan suv ishlatilgan. LACCE davolashdan so'ng, vosita olib tashlandi, keyin 4 mLof 5 mg / ml MTT (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) qo'shildi va 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Muhitni olib tashlagach, 100 mL dimetilsulfoksid (DMSO) (Sigma) qo'shildi va 10 daqiqa davomida eritildi.cistanche umrini uzaytirishTo'lqin uzunligi absorbansi 570 nm da Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrofotometr (Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Finlyandiya) yordamida o'lchandi. Hujayra hayotiyligi quyidagi formula yordamida olingan. Hujayra hayotiyligi (foiz)=(davolangan hujayralar uchun absorbans miqdori/nazorat hujayralarining absorbsiyasi miqdori)× 100.

2.4. DPPH tahlili orqali antioksidant faollikni baholash

LACCE ning antioksidant faolligi yuqorida tavsiflanganidek DPH (2,2-difenil-1-pikril-gidrazin-gidrat) tahlilida o'lchandi [18]. Qisqasi, 0,1 ml yakuniy konsentrasiyalari 0,1 foiz , {{10}},5 foiz va 1 foiz LACCE 0,1 ml 0,1 mM ichida ishlov berildi DPPH (Sigma-Aldrich) ning 0.4 ml etanol ishtirokida. Biz ijobiy nazorat sifatida 0,001 foiz askorbin kislotadan (S vitamini) (Sigma-Aldrich) foydalandik. Namunalar 10 soniya davomida yaxshilab aralashtiriladi va xona haroratida qorong'i sharoitda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi. To'lqin uzunligi absorbsiyasi 517 nm da Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spektrofotometri (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) yordamida o'lchandi. Radikal tozalash faolligi quyidagi formula yordamida hisoblangan. Tozalash faolligi (foiz )=[1-(sinov namunasini yutish/nazoratni yutish)]×100.

2.5. Vodorod peroksid (H2O2) tahlili bilan antioksidant faollikni baholash

Vodorod periks hujayralarda kislorodsiz radikallarni hosil qiladi, natijada hujayra o'limiga olib keladi. Biz LACCE bilan ishlangan namunalarda vodorod peroksiddan kelib chiqqan hujayra o'lim darajasini sinab ko'rdik. Har bir quduqqa 5×105 hujayra zichligidagi HaCaT hujayralari 24-quduq plastinkasida 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Shundan so'ng, yakuniy 0.1 foiz , 0.5 foiz va 1 foiz LACCE konsentratsiyasi 8 soat davomida 1 mM H, O ishtirokida ishlov berildi. Ijobiy nazorat sifatida 0,033 foiz NAC (Sigma-Aldrich) ishlatilgan. MTT tahlili HO2 sabab bo'lgan LACCE bilan ishlov berilgan namunalarning hujayra omon qolish darajasini o'lchash uchun ishlatilgan. Bundan tashqari, biz metilen ko'k bo'yash orqali hujayra morfologiyasini kuzatdik (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh).

2.6. Haqiqiy vaqtda teskari transkripsiya (RT) - PCR

LACCE ning ajinlarga qarshi, namlovchi va yallig'lanishga qarshi ta'sirini o'rganish uchun biz ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq QuantiTect Primer Assays (Qiagen, Hilden, Germaniya) yordamida marker genlarini kuchaytiruvchi ma'lum primerlar bilan real vaqt rejimida RT-PCR o'tkazdik. Detroit 551 xujayralari 5 × 10 har bir quduqqa 4 hujayra zichligi 96-quduq plastinkasida 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Shundan so'ng, yakuniy konsentratsiyalar 0.1 foiz , 0.5 foiz va 1 foiz LACCE 24 soat davomida davolandi. cDNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq liziz reagentlari va RT reagentlarini o'z ichiga olgan qPCR (Toyobo, Osaka, Yaponiya) uchun SuperPrep Cell Lysis & RT Kit yordamida turli LACCE konsentrasiyalari bilan ishlov berilgan tegishli Detroit 551 hujayralaridan sintez qilindi. LACCE davolashda ajinlarga qarshi ta'sir ko'rsatish uchun Matrix Metalloproteinase-2(MMP-2) kodlovchi genning ifodasi Thunderbird SYBR qPCR Mix to'plami (Toyobo) yordamida real vaqtda RT-PCR orqali aniqlandi. ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga asoslanadi. LACCE davolash orqali namlashni baholash uchun Aquaporin 3 (AOP3) ni kodlovchi genning ifodasi real vaqtda RT-PCR orqali tekshirildi. Yallig'lanishga qarshi tahlil bo'lsa, har bir quduq uchun 5×104 hujayra zichligidagi HaCaT hujayralari 96-quduq plastinkasida 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Muhitni olib tashlaganingizdan so'ng, UVB HaCaT hujayralarida nurlantirildi. UVB nurlanishi uchun CL-1000 UV qutisi (Analytik Jena AG, Jena, Germaniya) tomonidan 5 mJ/sm' ishlatilgan. Shundan so'ng, yakuniy konsentratsiyalar 0,1%, 0,5% va 1% LACCE 4 soat davomida davolandi. Biz ijobiy nazorat sifatida deksametazon (Dex) (Sigma-Aldrich) dan foydalandik. LACCE davolashning yallig'lanishga qarshi ta'siri uchun, mos ravishda COX2 va iNOS ni kodlovchi genlarning ifodasi real vaqtda RT-PCR yordamida aniqlandi. Alohida genlarning ifodasi GAPDH gen ifodasiga normallashtirildi. 2.7. Viooda kosmetika agenti sifatida LACCEni klinik baholash

LACCE ning yuzni ko'tarish va periorbital ajinlar, terining elastikligi, teri zichligi va terining qalinligini yaxshilash bo'yicha samaradorligini baholash bo'yicha klinik tadqiqot Ellead kompaniyasi tomonidan standart operatsiya tartib-qoidalari asosida tasdiqlanganidan keyin o'tkazildi (Ver. 3.{1} }) (Ellead, Seongnam, Koreya) oziq-ovqat va dori vositalari xavfsizligi vazirligi (MFDS) va Ellead standart operatsion tartib-qoidalari (EL-P{) tomonidan tavsiflangan Koreyaning yaxshi klinik amaliyotlari yo‘riqnomasiga (B1-2015-4-002) muvofiq Ellead IRB {4}}).

LACCE in vivo ta'sirini tekshirish uchun biz to'rt xil omil bo'yicha LACCE ni klinik baholashni o'tkazdik: yuzni ko'tarish va periorbital ajinlarni yaxshilash, terining elastikligi, terining zichligi va terining qalinligi. Buning uchun to'rt hafta davomida klinik baholashda o'rtacha yoshi 48,04 ± 4,28 bo'lgan jami 21 nafar ko'ngilli ayol ishtirok etdi, ular keyinchalik 40 yoshli 12 nafar ko'ngilli va 50 yoshli to'qqiz nafar ko'ngilliga bo'lingan.

Klinik sinov barcha ko'ngillilar uchun uchta turli vaqt nuqtalarida, asosiy, 2 hafta va 4 haftada o'tkazildi. Tadqiqot boshlanishidan bir hafta oldin to oxirigacha barcha ko'ngillilar teri, kosmetika va sanitariya yordamini yaxshilash uchun qo'shimcha muolajalarni o'tkazmadilar, bu natijalarga ta'sir qilishi mumkin edi. Ko'ngillilarning yuzlarini tozalovchi ko'pik yordamida yuvgandan so'ng, ko'ngillilar doimiy harorat (20-24 daraja) va namlik (40 foiz -60 foiz nisbiy namlik) bo'lgan boshqariladigan xonada kamida 30 daqiqa turishdi. . Biz o'lchovni ko'ngillilarning yuzlarining chap yoki o'ng tomonida tasodifiy amalga oshirdik. Bizning testimiz ikki tomonlama ko'r test bo'lib, unda na sub'ektlar, na tadqiqotchilar qaysi mahsulot sinov namunasi ekanligini bilishmaydi. Kamaytirilgan va ko'tarilgan stavkalarni hisoblash formulalari 1-jadvalda tasvirlangan.

2.8. Yuzni ko'tarish va periorbital ajinlarni yaxshilashni o'lchash

Dastlabki bosqichda barcha ko'ngillilar uchun periorbital ajinlar, terining elastikligi, terining zichligi, yonoqdagi terining qalinligi va og'iz burchagidagi yuzni ko'tarish o'lchandi. Shundan so'ng, ikki xil namunalar, LACCE va platsebo (nazorat) kuniga ikki marta (ertalab va kechqurun) yuzning belgilangan maydoniga qo'llanildi. Ko'ngillilar ikki xil guruhga bo'lingan: I guruh (LACCE chap yuz sohasiga qo'llangan, platsebo esa o'ng yuz sohasiga qo'llangan) va II guruh (platsebo chap yuz sohasiga qo'llangan, LACCE esa yuzning chap qismiga qo'llangan. o'ng yuz sohasi). Davolanishdan ikki va to'rt hafta o'tgach, LACCE ta'sirini platsebo bilan solishtirganda baholash uchun bir xil o'lchovlar o'tkazildi.

Periorbital ajinlar terining mikro tuzilishi va ajinlarini tekshirish uchun ideal bo'lgan PRIMOS High Resolution (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, AQSh) optik 3D (o'lchov) teri o'lchash tizimi yordamida tahlil qilindi. Ikki xil pürüzlülük parametrlari, Ra (o'rtacha pürüzlülük), bu pürüzlülük profilining profil balandliklarining mutlaq qiymatlarining o'rtacha qiymati va Rg (o'rtacha kvadrat pürüzlülük) profil balandligining o'rtacha ildiz kvadrati pürüzlülük profili, o'lchandi.

Ushbu maqola Genes 2020, 11, 230 dan olingan; doi: 10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes