Spontan gipertenziv kalamushlarda Diekkolning gipertenziv nefropatiyaga ta'siri

Ang II vazokonstriksiyani keltirib chiqaradi va natijada gipertenziyani keltirib chiqaradi [30]. Gipertenziyada RAAS tizimli ravishda faollashadi va RAASning ko'tarilishi bir nechta organlarda, masalan,buyrak[31,32]. Intrarenal RAASning giperaktivatsiyasi gipertenziya va surunkali kasallikning muhim mexanizmi hisoblanadibuyrak kasalligi[31,32]. TGF 1 va Ang II ham intrarenal RAAS faollashuvini keltirib chiqaradi va EMT ni keltirib chiqaradigan angiotensinogen, renin, ACE va AT1R ifodalarini kuchaytiradi [33]. Bizning tadqiqotimizda SHRlarning sistolik qon bosimi ECE yoki DK qo'llanilishi bilan sezilarli darajada kamaydi. SHR larning zardobdagi Ang II darajasi ECE yoki DK qo'llanilishi bilan sezilarli darajada kamaydi. SHR korteksi va medullasida AT1R ifodasi ECE yoki DK qo'llanilishi bilan sezilarli darajada kamaydi.

RAAS ning ko'tarilishi, masalan, AT1R ning ortib borayotgan ifodasi, TGF 1 ning pastga signalizatsiya yo'lini faollashtiradi [34]. RAAS tomonidan faollashtirilgan TGF 1 SMADga bog'liq va SMADga bog'liq bo'lmagan yo'llar orqali EMT ni keltirib chiqaradi [33]. SMADga bog'liq bo'lgan signalizatsiya yo'li sifatida TGF 1 signalizatsiyasi TGF RII va TGF RI orqali uzatiladi va SMAD2/3 ning faollashishiga olib keladi. [10]. SMAD4 SMAD2/3 bilan bog'lanadi va SMAD kompleksining yadroga ko'chirilishiga yordam beradi [10]. Translokatsiya qilingan SMADlar EMT genlarining Snail, Twist va ZEB [34] kabi ifodalarini yuqori tartibga soladi. Bizning tadqiqotimizda AT1R ning ifodasi SHR korteksi va medullasida WKY kalamushlariga qaraganda sezilarli darajada yuqori bo'lgan va ECE yoki DK ma'muriyati tomonidan kamaygan. TGF va SMAD2/3 ning SHR korteksi va medullasida ifodalanishi ECE yoki DK ma'muriyati tomonidan kamaydi.

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK INFEKTSIONINI YAXSHILADI

EMT E-kaderin kabi epiteliya belgisini yo'qotish va -SMA, vimentin va fibronektin kabi mezenxima belgilariga erishish bilan tavsiflanadi [35]. E-kaderin epiteliya hujayralarida eng ko'p ifodalangan kaderin bo'lib, epiteliya belgisi sifatida tez-tez ishlatiladi [36]. -SMA miofibroblast hujayralarining fenotipik belgisi bo'lib, uning ifodalanishi EMT ning ilg'or bosqichlari xususiyatidir [37]. -EMTdan o'tuvchi SMA-ekspressiv miyofibroblastlar haddan tashqari ECM sintezini va anormal ECM remodelatsiyasini keltirib chiqaradi vabuyrakfibroz [37]. Gipertenziv nefropatiya glomeruloskleroz va interstitsial fibrozni keltirib chiqaradi, bu esa qon bosimining pasayishiga olib keladi.buyrak funktsiyasiva sezilarli proteinuriya [6]. Bizning tadqiqotimizda SHRlarning medulla va korteksida vimentin va -SMA ifodasi oshirildi va ECE yoki DK ma'muriyati tomonidan kamaytirildi. SHRlarning medulla va korteksidagi fibroz maydoni miqdori ko'paydi va ECE yoki DK ma'muriyati tomonidan kamaytirildi. SHRlarning glomerulyar skleroz indeksi oshirildi va ECE yoki DK qo'llanilishi bilan kamaytirildi.

SHRlarning siydik miqdori o'sha yoshdagi WKY kalamushlari bilan solishtirganda asta-sekin kamaydi [38]. Ma'lumki, siydikda natriy qancha ko'p bo'lsa, siydik bilan kaliy shunchalik kam bo'ladi. Bundan tashqari, odamlarda o'tkazilgan tadqiqotlarda siydik Na / K nisbati qon bosimining oshishi va qon bosimining tez buzilishi bilan bog'liq.buyrak funktsiyasi[39]. Bizning tadqiqotimizda SHR larning siydik miqdori WKY kalamushlariga qaraganda past edi, garchi suv olish miqdori SHR va WKY kalamushlari o'rtasida farq qilmasa ham. SHR ning siydikdagi Na/K nisbati WKY kalamushlari, SHRlar va ECE yoki DK bilan davolash qilingan guruhlar orasida sezilarli darajada farq qildi. Siydikdagi Na/K nisbati insoniy tadqiqotlarda natriy va kaliyni oziq-ovqat bilan iste'mol qilish belgisi sifatida ishlatilgan [39]. Natriyni iste'mol qilish ortishi bilan qon bosimi ortdi. Biroq, kaliyni ko'paytirish natriyning siydik bilan chiqarilishini ko'paytirish orqali qon bosimini pasaytirdi [40]. Shuning uchun siydik Na/K nisbati odamlarda BP bilan bog'liq [40]. Bizning tadqiqotimizda barcha hayvonlar yuqori natriyli parhez bilan oziqlanmagan, bu nima uchun guruhlar orasidagi siydik Na / K nisbati sezilarli farq ko'rsatmaganligini tushuntiradi. Gipertenziya proteinuriyani oshiradi [37]. Ma'lumki, siydikda albumin va kreatinin nisbati glomerulyar filtratsiya tezligining pasayishi bilan bog'liq [41]. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, SHRlarda mikroalbuminuriya rivojlanishi siydikda past molekulyar og'irlikdagi oqsillarni yo'qotishiga olib keladigan ustun naycha shikastlanishidan kelib chiqadi [42,43]. Bizning tadqiqotimizda SHR ning siydik albuminining kreatininga nisbati WKY kalamushlariga qaraganda yuqori edi va ECE yoki DK qo'llanilishi bilan kamaydi.

Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, bir nechta polifenollar ACE faolligiga inhibitiv ta'sir ko'rsatadi [14-17]. Biroq, bu tadqiqotlar faqat ACE inhibitiv faolligini IC50 qiymati sifatida qayd etdi, bu ijobiy nazoratning 50% inhibisyon kontsentratsiyasidir va ular hayvonlarda gipertenziv nefropatiyaga qarshi antihipertenziv yoki himoya ta'sirini ko'rsatmadi. Bir tadqiqot shuni ko'rsatdiki, ECE 2- da BPni pasaytirgan.buyrak1-klip Goldblatt gipertonik kalamushlar [44]. Pirogallol-phloroglucinol-6,6-biekkol qon tomir disfunktsiyasini modulyatsiya qilish orqali yuqori yog'li dietadan kelib chiqqan gipertoniya hayvonlari modelida qon bosimini pasaytirdi [45]. Biroq, bu tadqiqotlar faqat qon bosimining pasayishini ko'rsatdi va ECE gipertenziv nefropatiyani susaytirishning biron bir ta'sirini ko'rsatmaganligini baholamadi. Bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, ECE va DK AT1R / TGF / SMAD2 / 3 ifodasini kamaytirdi.buyrakva qon zardobidagi Ang II darajasini pasaytiradi. Bundan tashqari, ECE va DK EMTni kamaytirdi,buyrakfibroz va glomerulyar skleroz. ECE va DK gipertenziv nefropatiyani susaytirishda foydali bo'lishi mumkin

4. Materiallar va usullar

4.1. ECE tayyorlash va DK izolyatsiyasi

ECE Aqua Green Technology Co., Ltd. (Jeju, Koreya) dan olingan. E. kava toza suv bilan yaxshilab yuvilib, xona haroratida 48 soat davomida havoda quritilgan. U maydalangan va 50 foiz etanol qo'shilgan, so'ngra 85 ◦C da 12 soat qizdirilgan. ECE filtrlangan va keyin konsentrlanganda, 40-60 daqiqa davomida yuqori haroratda qizdirilganda sterilizatsiya qilingan va keyin purkagich bilan quritilgan. E. cavaning vakili florotanninlardan biri bo'lgan Direktor keyinchalik izolyatsiya qilingan. Qisqacha aytganda, markazdan qochma bo'linish xromatografiyasi toza suv, etil asetat, n-geksan va metanol aralashmasini aralashtiradigan ikki fazali erituvchi tizim yordamida amalga oshirildi (nisbat 7: 7: 2: 3). Organik statsionar faza ustunda bajarildi va mobil faza kolonnada kamayish tartibiga rioya qilgan holda bajarildi (daqiqada 2 ml) va ajratish uchun ishlatilgan. Biz doktor Son va boshqalarning usullariga amal qildik. (2019) [45].

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK EKSIZLIGINI YAXSHILADI

4.2. Gipertenziya hayvonlar modeli

Erkak SHRs (8 haftalik) va erkak WKY kalamushlari (8 haftalik) Orient Bio (Sungnam, Koreya) dan sotib olindi va taxminan 24 ◦C doimiy haroratda, 50-55 foiz nisbiy namlikda va yorug'likda saqlangan. qorong'u sikl 12 soat/12 soat. Sichqonchaning sublimatsiyasi 1 hafta davomida o'tkazildi. Kalamushlar tasodifiy oltita guruhga bo'lingan (har bir guruhga beshta kalamush): (i) WKY guruhi, unda kalamushlar 4 hafta davomida ichimlik suvi bilan og'iz orqali yuborilgan; (ii) SHR guruhi, unda kalamushlar 4 hafta davomida ichimlik suvi bilan og'iz orqali yuborilgan; (iii-v) SHR guruhi, unda kalamushlar ECE bilan og'iz orqali (iii) 50 mg / kg / kun, (iv) 100 mg / kg / kun va (v) 4 uchun 150 mg / kg / kun haftalar; (vi) SHR guruhi, unda kalamushlar 4 hafta davomida kuniga 2,5 mg / kg DK bilan og'iz orqali yuborilgan. 4 haftadan so'ng, suv iste'moli, siydik miqdori va siydik kimyoviy tahlili 24 soat davomida metabolik qafas bilan tasdiqlangan. Metabolik tahlilni tugatgandan so'ng, barcha kalamushlar Gachon universiteti hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasining axloqiy tamoyillariga muvofiq qurbon qilindi (tasdiqlash raqami: LCDI-2019-0121).

4.3. Immunogistokimyo

Buyrak to'qimasikerosin bloklari 8 mkm da bo'lingan, jelatin bilan qoplangan slaydlarga joylashtirilgan va 3 kun davomida 37 ° C da quritilgan. Thebuyrakto'qimalar slaydlari deparafinizatsiya qilindi va keyin 10 daqiqa davomida 0.3 foizli vodorod periks (Sigma-Aldrich, MO, AQSh) bilan inkubatsiya qilindi. Shundan so'ng, slaydlar uch marta fosfat tamponli sho'r suv (PBS) bilan yuvildi va antikorlarning o'ziga xos bo'lmagan bog'lanishini inhibe qilish uchun hayvonlar zardobi bilan inkubatsiya qilindi. Bundan tashqari, ular birlamchi antikorlar (anti-AT1R, anti-E-kaderin, anti- -SMA va anti-vimentin) bilan inkubatsiya qilindi va PBS bilan uch marta yuvildi. Keyin to'qimalar slaydlari ABC to'plamidan (Vector Laboratories, Burlingame, CA, AQSh) biotinlangan ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi, blokirovka qiluvchi eritma bilan 3 soat davomida inkubatsiya qilindi va PBS bilan uch marta yuvildi. To'qimalarning slaydlari 3 daqiqa davomida substrat sifatida 3,{13}}diaminobenzidin bilan ishlab chiqilgan, ksilenga asoslangan DPX eritmasi (Sigma-Aldrich) bilan o'rnatilgan va yorug'lik mikroskopida (Olympus Optical Co., Tokio, Yaponiya) tasvirlangan. .

4.4. RNK ekstraktsiyasi va miqdoriy real vaqtda polimeraza zanjiri reaktsiyasi (qRT-PCR)

Sichqondan olingan RNKbuyrakto'qimalar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq RNAiso Plus reaktivi (TAKARA, Yaponiya) yordamida ajratilgan. Thebuyrakto'qimalar dastlab ikki qismga bo'lingan, ya'ni korteks qismi va medulla qismi. Buyrak to'qimalari mayda kesilib, kukun holiga keltirildi va kukunlar 1 ml RNAiso Plus reaktivi bilan qayta suspenziya qilindi, 0.1 ml toza xloroform (Amresco, Solon, OH, AQSh) bilan aralashtirildi va keyin 13,000× g da 20 daqiqa davomida 4 ◦C da santrifüjlanadi. Santrifüjdan so'ng, supernatant 0,25 ml sof glade izopropil spirti bilan aralashtirildi va ekstrakte qilingan RNK granulalari 70% spirt bilan yuvildi va 7500 × g haroratda 5 daqiqa davomida 4 ° C da santrifüj qilindi. Quritilgan granulalar 10-30 µl dietilpirokarbonat bilan ishlangan toza suvda eritildi va RNK miqdori aniqlandi va NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, AQSh) yordamida tekshirildi. Qo'shimcha DNK (cDNK) cDNK sintezi to'plami (PrimeScript™, TAKARA) yordamida RNKdan tayyorlangan. Miqdoriy real vaqtda polimeraza zanjiri reaktsiyasi (qRT-PCR) RNK darajasini aniqladi.buyrakto'qimalar. Oldinga va teskari primerlar distillangan suv bilan aralashtirildi va keyin 10 µl aralashmalar 384-quduqli qRT-PCR plastinkasiga joylashtirildi. Keyinchalik cDNA va SYBR yashil (TAKARA) qo'shildi va keyin qRT-PCR mashinasi (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh) yordamida tasdiqlandi. Qiziqarli genlar S1 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. Biz doktor Son va boshqalarning usullariga amal qildik. 2019 [45].

4.5. Ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA)

Sarum Ang II darajasini tasdiqlash uchun olingan qonning bir alikvoti (1,5 dan 1,7 ml gacha) sarum ajratuvchi naychalarga qo'shildi (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, AQSh) va keyin xona haroratida 2000 × g da 20 daqiqa davomida santrifüj qilindi. . Shundan so'ng, ajratilgan sarum yangi naychaga o'tkazildi va chuqur muzlatgichda saqlanadi. Ang II ELISA to'plami (MyBioSource, San-Diego, CA, AQSh) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq sarum mavjudligini tahlil qilish uchun ishlatilgan. Ang II hayvonlardan qon to'planganidan keyin 1 hafta ichida o'lchandi.

4.6. Gistologik tahlil

4.6.1. Massonning trixrom (MT) bo'yog'i

Masson trikromi (MT) bo'yog'i fibrozni tasdiqlaydibuyrak.Parafin o'rnatilgan bloklarbuyrakto'qimalar 8 mkm qalinlikda bo'linib, qoplamali slaydga joylashtirildi va 3 kun davomida 37 ° C da quritildi. To'qimalarning slaydlari ksilen va spirt bilan parafinizatsiya qilindi va 24 soat davomida Bouin eritmasi bilan qayta fiksatsiya qilindi va 3 daqiqa davomida oqadigan suv bilan yuvildi. Slaydlar 10 daqiqa davomida Weigert temir gematoksilin eritmasi va 15 daqiqa davomida Biebrich qizil-kislotali fuksin eritmasi bilan botirildi va keyin 10 daqiqa davomida fosfomolibdik-fosfotungstik kislota eritmasi bilan farqlandi. Nihoyat, slaydlar 3 daqiqa davomida anilin ko'k eritmasiga o'tkazildi va keyin suv bilan yuvildi. Bo'yalgan slaydlar ksilenga asoslangan DPX eritmasi (Sigma-Aldrich) bilan o'rnatildi va yorug'lik mikroskopi (Olimpus) orqali ko'rildi. Kollagen tolalari fibroz hududida ko'k rangga ega bo'lib ko'rinadibuyrakepiteliya qizil rangga o'xshaydi. MT bilan bo'yalgan fibroz joylari ImageJ dasturi yordamida o'lchandi. MT bilan bo'yalgan buyrakning asl tasvirlari RGB tasvirlariga aylantirildi, so'ngra bu tasvirlar rangli dekonvolyutsiya plaginidan foydalangan holda ImageJ dasturiy ta'minoti yordamida dekonvolved qilindi.

4.6.2. Davriy kislotali-Schiff (PAS) bo'yoqlari

Davriy kislota-Schiff (PAS) dog'i glomerulyar shikastlanishni tasdiqladibuyrak. Parafin o'rnatilgan bloklarbuyrakto'qimalar 8 mkm qalinlikda bo'linib, qoplamali slaydga joylashtirildi va 3 kun davomida 37 ° C da quritildi. To'qimalarning slaydlari ksilen va spirt bilan deparafinizatsiya qilindi, suv bilan hidratlandi, 5 daqiqa davomida 0,5 foizli davriy kislota eritmasi bilan oksidlandi va suv bilan yuvildi. Slaydlar 15 daqiqa davomida Schiff reagenti bilan botiriladi va keyin 5 daqiqa davomida iliq suv bilan yuviladi. Nihoyat, slaydlar 1 daqiqa davomida Mayer gematoksilin eritmasiga o'tkazildi va keyin suv bilan yuvildi. Bo'yalgan slaydlar ksilenga asoslangan DPX eritmasi (Sigma-Aldrich) bilan o'rnatildi va yorug'lik mikroskopi (Olimpus) orqali ko'rildi.

Glomeruli tasodifiy tanlab olindi va glomerulyar zarar PAS bo'yalgan holda yarim miqdoriy baholash usuli (0-4 darajalar) yordamida baholandi.buyrakto'qimalarning slaydlari.

(1) 0 daraja: oddiy glomeruli; (2) 1-darajali: minimal skleroz (sklerotik hudud 25 foizgacha); (3) 2-darajali: o'rtacha skleroz (sklerotik hudud 25% dan 50% gacha); (4) 3-darajali: o'rtacha - og'ir skleroz (sklerotik hudud 50% dan 75% gacha); (5) 4-darajali: og'ir skleroz (sklerotik hudud 75 foizdan 100 foizgacha); Glomeruloskleroz indeksi (GSI) quyidagi tenglama yordamida hisoblangan: (4 × n4) plyus (3 × n3) plyus (2 × n2) plyus (1 × n1) / n4 plyus n3 plyus n2 plyus n1 va n0, bu erda n ( x) sonibuyrakhar bir sinfda glomerulyar skleroz [46]. Ushbu tahlil davolash guruhlarida niqoblangan kuzatuvchi tomonidan amalga oshirildi.

4.7. Sistolik qon bosimi, diastolik qon bosimi va o'rtacha arterial qon bosimi o'lchovlari

Sistolik qon bosimi, diastolik qon bosimi va o'rtacha arterial bosim invaziv bo'lmagan CODA quyruq manjeti tizimi (Kent Scientific Corp., Torrington, CT, AQSh) yordamida o'lchandi. Sichqonchaning sublimatsiyasi 20 daqiqa davomida 5 kun davomida o'tkazildi va oxirgi kuni qon bosimi o'lchandi.

4.8. TCMK-1 hujayralari yordamida in vitro modellashtirish

TCMK{0}} hujayralari, sichqonchaning proksimal tubula hujayralari qatori American Type Culture Collection (Vashington, DC, AQSH) dan xarid qilingan. Madaniyat muhiti sifatida yuqori glyukozali Dulbecco modifikatsiyalangan burgut muhiti (Gibco; Grand Island, NY, AQSH), 10 foiz homila sigir zardobi (FBS) va 1 foiz penitsillin-streptomitsin ishlatilgan. Angiotensin II bilan davolash qilingan TCMK{5}} hujayralarida ECE va DK ning inhibitiv ta'sirini tekshirish uchun biz ECE (5, 25, 50 mkg/ml) va DK (1,8 mkg/ml) ni 100 nmol/L angiotensin II bilan davolashdik. (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) 12 soat. Telmisartan (1 mkmol/L, Sigma-Aldrich) AT1 retseptorlari antagonisti uchun ishlatilgan va angiotensin II dan oldin 3 soat davomida oldindan davolash qilingan [47].

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK OG'RIG'INI YANGILAYDI

4.9. Protein va Western Blottingni tayyorlash

Angiotensin II bilan ishlov berilgan TCMK-1 hujayralaridan oqsilni ajratib olish uchun hujayralar fosfataza va proteinaz inhibitori (EzRIPA; ATTO; Tokio, Yaponiya) bilan RIPA lizis buferi yordamida qirib tashlandi va muzda 20 inkubatsiya qilindi. min. 13,{4}}× g da 20 daqiqa, 4 ◦C da santrifüj qilingandan so'ng, toza supernatantlar yangi naychaga o'tkazildi va supernatantlar kontsentratsiyasi bitsinxonin kislotasini tahlil qilish to'plami (BCA to'plami; Thermo Fisher Scientific,) bilan tahlil qilindi. Inc.; Waltham, MA, AQSH). TCMK-1 hujayralaridan oqsil ifodasini tekshirish uchun blotting o'tkazildi. Teng miqdordagi lizat oqsillari (30 mkg / bo'lak) elektroforez yordamida 10% natriy dodesil sulfat-poliakrilamid jeli bilan ajratildi. Keyin, ishlaydigan oqsillar poliviniliden ftorid membranalariga o'tkazildi, ular suyultirilgan asosiy antikorlar (Anti{11}}aktin, AGTR1, TGF-, SMAD2/3 va pSMAD2/3) bilan 4 ◦C da inkubatsiya qilindi. Antikorlar bilan inkubatsiya qilingan membranalar 0,1 foizli Tween 20 bilan Tris-buferli sho'r suv yordamida yaxshilab yuvildi va xona haroratida 2 soat davomida ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. Barcha membranalar yaxshilangan kimilyuminesans (LAS{24}}s; GE Healthcare, Chicago, IL, AQSH) tomonidan ishlab chiqilgan. Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan antikorlar haqidagi ma'lumotlarni S2-jadvalda topish mumkin.

4.10. Statistik tahlil

Natijalar o'rtacha ± SD va p-qiymatlari sifatida taqdim etiladi<0.05 mean="" it="" is="" statistically="" significant.="" the="" kruskal–wallis="" test="" was="" used="" to="" validate="" the="" differences="" among="" the="" groups,="" and="" the="" mann–whitney="" u="" test="" was="" used="" in="" the="" spss="" ver.="" 22="" software="" (ibm="" corporation;="" ny,="" armonk,="" usa)="" completed="" post="" hoc="" comparisons.="" means="" denoted="" by="" a="" different="" letter="" indicate="" significant="" differences="" between="">

5. Xulosalar

Xulosa qilib aytish mumkinki, AT1R SHRlarda ko'tarildi va signal yo'li TGF va SMAD2 yoki 3 ni oshirdi, bu esa EMTni keltirib chiqardi. ECE yoki DK signal yo'lini pasaytirdi va EMTni pasaytirdi. Shuning uchun ECE yoki DK mezenximal hujayra belgilarini kamaytirdi, masalan, vimentin va -SMA, fibrotik to'qimalarning ifodasi.buyrak, va siydik albumin/kreatinin nisbati va EMTni susaytiradi. Bundan tashqari,buyrakfibrozning tiklanishiga olib keldibuyrak funktsiyasi(7-rasm).