Kalretikulin etishmovchiligi ribosoma biogenezini buzadi va embrion buyrak rivojlanishining kechikishiga olib keladi.

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt

Nefrogenez hujayra o'sishi va differentsiatsiyasini boshqaradigan murakkab signal yo'llari bilan boshqariladi. Endoplazmatik retikulum chaperon kalretikulin (Calr) kaltsiyni saqlash va glikoproteinlarni katlamada o'zining funktsiyasi bilan mashhur. Uning rolibuyrakrivojlanishi haligacha tushunilmagan. Biz ushbu tadqiqotda Kalrning nefrogenezdagi asosiy roli haqida dalillar keltiramiz. Biz shuni ko'rsatamizki, Kalr tanqisligi buzilmagan nefrogen zonaning shakllanishining buzilishiga va nefrogenezning sekinlashishiga olib keladi, bu vergul shaklidagi va S shaklidagi jismlarning shakllanishining buzilishidan dalolat beradi. Proteomika va transkriptomik yondashuvlardan foydalanib, biz Wnt signalizatsiya qiluvchi asosiy oqsillarning o'zgarishiga qo'shimcha ravishda embrionbuyraklarKalrdan // ribosoma oqsillarini ifodalashda umumiy buzilishlarni ko'rsatdi, bu protein sintezi va nefrogenezdagi buzilishlarni aniqlaydi. CRISPR/cas9 vositachiligidagi nokaut Calr etishmovchiligi bir nechta ribosoma oqsillari va ribosoma biogenezidagi asosiy oqsillarning etishmasligi bilan bog'liqligini tasdiqladi. Bizning ma'lumotlarimiz Calr ifodasi va ribosoma biogenezi o'rtasidagi bevosita bog'liqlikni ta'kidlaydi.

Kirish

Buyrakorganogenez morfogenetik hodisalarning ketma-ketligi bilan tavsiflanadi, ular hujayra o'sishi va differentsiatsiyasi bilan bog'liq. Nefrogenez davrida UB va metanefrik mezenxima (MM) [1] oʻrtasidagi oʻzaro induksiya natijasi boʻlgan mezenxima-epitelial oʻtish (MET) va siydik yoʻllari kurtaklari (UB) shoxlanishi nefron hosil boʻlishining harakatlantiruvchi kuchi hisoblanadi. Ushbu jarayon davomida epiteliya differentsiatsiyasini va nefronning shakllanishini tashkil qilish uchun turli signal yo'llarining murakkab va o'zaro ta'siri zarur [1-3]. Ushbu jarayonning asosiy yo'llari orasida glia hosil bo'lgan neyrotrofik omil (Gdnf) Ret retseptorlari orqali signalizatsiya qilish siydik yo'llarining tomurcuklanması deb ataladigan jarayonda markaziy rol o'ynaydi. Ushbu signalizatsiyaning buzilishi ektopik ureter yoki sabab bo'lishi mumkinbuyraksignalizatsiya butunlay yo'q bo'lganda agenez [4]. Gdnf/Ret signalizatsiyasidan tashqari, kanonik Wnt/-katenin signalizatsiyasi ko'plab jihatlarni muvofiqlashtirishi ma'lum.buyrakMM va UB ichida rivojlanishi [5] va siydik yo'llarining kurtaklari va nefron progenitörlerinde kanonik Wnt signalizatsiyasini inhibe qiladi.buyrakagenezi [6]. Nefrogenez jarayonida transkripsiyani qayta dasturlashni ta'minlash xromatinning mavjudligiga bog'liq [7]. Biz genlarni o'chirishning epigenetik regulyatsiyasida ishtirok etishi ma'lum bo'lgan heterokromatin oqsillari rivojlanishning dastlabki bosqichida shoxlangan faollashtiruvchilar va inhibitorlar o'rtasidagi muvozanatni saqlash uchun ajralmas ekanligini ko'rsatdik [7].

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK FONKSIYASINI YAXSHILADI

Kalretikulin (Kalr) yuqori kaltsiyni bog'lash qobiliyatiga va past yaqinlikka ega bo'lgan endoplazmatik retikulumning (ER) bema'ni chaperoni bo'lib, ular Ca2 plyus ERga sekvestrlanishi va turli hujayra jarayonlari, shu jumladan signal uzatish, gen ekspressiyasi va oqsil savdosi uchun juda muhimdir. [8,9]. Kalrning kasalliklardagi rolini ko'rib chiqadigan mexanizmlar asosan Kalrning Ca2 plyus bog'lovchi C-terminal domenining Ca2 plyus xelatlanishiga va uning ochilgan oqsil reaktsiyasi (UPR)dagi roliga asoslangan [10,11]. UPR noto'g'ri qatlamlangan oqsillar bilan kurashda sitoprotektiv rol o'ynashi mumkin yoki hujayralarga zararli bo'lishi mumkin, chunki doimiy UPR signalizatsiyasi tufayli apoptoz. Garchi bir nechta tadqiqotlar transkripsiyani tartibga solish orqali Kalrning kasalliklardagi potentsial rolini ko'rib chiqqan bo'lsa-da, Kalrning ER chaperon funktsiyasi hujayra taqdiri uchun hal qiluvchi mexanizmlardan biri bo'lib qolmoqda [9,12]. Uzoq muddatli ER stressi va oqsilning noto'g'ri qatlamlanishi turli xil holatlarda namoyon bo'ladibuyrak kasalliklariglomerulopatiyalar, o'tkir kabibuyrak shikastlanishidiabetik nefropatiya,buyrakfibroz va surunkalibuyrak kasalligi[13,14]. Kalrning embrion rivojlanishidagi roli hali ham aniq emas. Kalr nokauti yurak rivojlanishining buzilishi tufayli E14.5 rivojlanish bosqichida embrionning o'limga olib keladi [15]. Kalr etishmovchiligining molekulyar mexanizmlarga ta'siribuyrakembrion rivojlanishi hali to'liq tushunilmagan. Ushbu tadqiqotda biz embrionning qiyosiy transkriptomik va proteomik tahlillarini o'tkazdikbuyrakuchta genotipdan Calr plus / plus, Calr plus // va Calr// va Kalr nokautining nefrogenezga va ribosoma oqsillari ifodasiga ta'sirini ta'kidladi.

Kalit so‘zlar:kalretikulin etishmovchiligi; nefrogenez; Ribosomal biogenez, Buyrak, Buyrak

2. Natijalar

2.1. Kalretikulinning nokauti buyrakning morfologik va gistologik anormalliklarida va buyrak shoxlanishining buzilishida natijalari

Sichqonlarda Kalrning genetik nokauti qorincha septal nuqsonlari tufayli erta embrion halokatiga olib keladi [15]. Calr nokauti ta'sir qiladimi yoki yo'qligini tekshirish uchunbuyrakrivojlanish, E13.5 bosqichidagi sichqon embrionlari Calr plus // homilador sichqonlardan tayyorlangan (1A-rasm). Calr// embrionlari Calr plus / plus va Calr plus // bilan solishtirganda sezilarli o'sish o'zgarishini ko'rsatdi va embrion rivojlanishida sezilarli buzilishlarni aniqladi. Embrionlarning yalpi morfologiyasi vabuyraklarCalr plus / plus va Calr-// sichqonlari bilan Calr// sichqonchalari o'rtasida katta anormallikni ko'rsatadigan kattalikdagi sezilarli pasayishlarni ko'rsatdi (1A-rasm). Calr nokautining ta'sirini ko'rsatish uchunbuyrakrivojlanishi va tuzilishi, rivojlanishning uch xil bosqichidagi embrionlar (E13.5, E14.5, E16.5) va uchta genotipdan (Calr plus / plus, Calr plus // va Calr//) qurbonlik qilingan vabuyraklarqo‘lga kiritildi. To'qimalarning bo'limlari turli xil rivojlanish bosqichlarini ko'rsatdibuyrak,Bu murakkab morfologik tuzilmalar orqali o'tadi, bu PAS va to'qimalar bo'limlarini HE-bo'yash bilan tasdiqlanadi.Buyraklarturli xil genotiplarga ega bo'lgan bir xil embrion bosqichidan turli xil rivojlanish darajasini ko'rsatdi (1B-rasm). Bundan tashqari, sezilarli farqlarbuyraktuzilmalar ayniqsa Calr // ni Calr plus / plus va Calr plus // bilan solishtirganda kuzatilgan. Bu farqlar nefrogenezning ilg'or bosqichlarida ham saqlanib qoladi (1B-rasm). Qo'ng'iroq qilish//buyraklarCalr plus / plus va Calr plus // bilan solishtirganda jiddiy buzilishlarni ko'rsating (1B-rasm). E13.5 bosqichida Calr hajmi //buyrakkichikroq bo'lgan va siydik yo'llari kurtaklari va ureter kurtaklari shoxlari soni sezilarli darajada past edi. Shunga o'xshash kuzatishlar E14.5 va E16.5 bosqichlarida o'tkazildi. Embrionning organ madaniyatibuyraklaruchta embrion genotipidan UB shoxlanishida jiddiy buzilishlar vabuyrako'sish. Vizual qilish uchunbuyraktuzilmalar, madaniy rudimentlar bazal membrana uchun marker sifatida laminin bilan va UBni ko'rish uchun Dolichos biflorus agglutinin (DBA) lektin bilan bo'yalgan.

Madaniyatli FL floresansining kombinatsiyalangan bo'yalishibuyrakRudiments Calr etishmovchiligi bilan birga keladigan sezilarli dallanish buzilishini ko'rsatdi va bu umumiy kechikishga olib keldi.buyrakishlab chiqish (2A,B-rasm). Izolyatsiya vaqtida qo'ng'iroq qiluvchi//buyrakrudimentlar 6–10 UB maslahatlarini koʻrsatdi, Calr plus / plus va Calr plus // rudimentlari esa 20–30 UB maslahatlarini koʻrsatdi. Calr plus / plus va Calr plus // madaniyatli rudimentlar madaniyat davrida (72 soat) an'anaviy tarzda rivojlandi va yaxshi tarvaqaylab ketgan UB (85 ± 9, n=6) ​​hamda turli xil ma'lum tuzilmalarni ko'rsatdi. vivo rivojlanayotgan buyrak. Madaniyatlibuyrakko'rsatilgan quvurli agregatlar,buyrakpufakchalar va qopqoq mezenximasi (2A,B-rasm). Aksincha, Calr// rudimentlari normal rivojlana olmadi va UB shoxlanishida sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi (15 ± 3 n=6) (2B-rasm).

2-rasm. Calr−/− sichqonchabuyrakrudimentlar o'sish va UB shoxlanishida jiddiy o'zgarishlarni ko'rsatadi. (A):BuyrakCalr plus / plus Calr plus /− va Calr−/− (E13.5) dan rudimentlar ajratilgan va uch kun davomida ex vivo ekilgan. Calr−/−buyrakrudimentlar o'sishning umumiy o'zgarishini va siydik yo'llari kurtaklari shoxlanishida sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi. (B): ning immunofluoresans bilan bo'yalishibuyrakuch kunlik madaniyatdan keyin rudiments. Rudimentlarning turli tuzilmalarini tasavvur qilish uchun laminin (qizil) va DBA lektinini (yashil) birgalikda bo'yash amalga oshirildi. Tarmoqlanish miqdorini aniqlash siydik yo'llari kurtaklari sonini hisoblash orqali erishildi. Miqdori xato chiziqlari bo'lgan chiziqli diagramma sifatida taqdim etiladi. Har bir satr filialning soni ± sd ni oltita madaniyatli rudimentdan ifodalaydi. Muhim farqlar: (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0,001.="" 2,5×="" 2,5×="" 2,5×="" int.="" j.="" mol.="" sci.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" 21.="" 2-rasm.="" kalrmí="" sichqonchaning="" buyragi="" rudimentlari="" o'sish="" va="" ub="" shoxlanishida="" jiddiy="" o'zgarishlarni="" ko'rsatadi.="">BuyrakCalr plus / plus Calr plus // va Calr / (E13.5) dan rudimentlar ajratilgan va uch kun davomida ex vivo ekilgan. Qo'ng'iroq qilish /buyrakrudimentlar o'sishning umumiy o'zgarishini va siydik yo'llari kurtaklari shoxlanishida sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi. (B): ning immunoflyuoresans bilan bo'yalishibuyrakuch kunlik madaniyatdan keyin rudiments. Rudimentlarning turli tuzilmalarini tasavvur qilish uchun laminin (qizil) va DBA lektinini (yashil) birgalikda bo'yash amalga oshirildi. Tarmoqlanish miqdorini aniqlash siydik yo'llari kurtaklari sonini hisoblash orqali erishildi. Miqdori xato chiziqlari bo'lgan chiziqli diagramma sifatida taqdim etiladi. Har bir satr filialning soni ± sd ni oltita madaniyatli rudimentdan ifodalaydi. Muhim farqlar: (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>

2.2. Kalr etishmovchiligi katta va muhim transkriptom o'zgarishlari bilan bog'liq

Morfologik va gistologik tekshiruvlar buzilishlarni ko'rsatdibuyrakCalr / sichqoncha embrionlarida Calr plus / plus va Calr plus // bilan solishtirganda rivojlanishi. Kalr nokauti nefrogenezning asosiy oqsillari va yo'llarining ifodalanishiga ta'sir qilganligini tekshirish uchun butun transkriptom tahlillari.buyrakrudimentlar uchta embrion genotipidan amalga oshirildi. Calr plus / plus, Calr plus // va Calr/ o'rtasidagi differentsial ifodalangan genlarni baholash uchunbuyraknamunalar, o'qish hisobiga asoslangan miqdoriy testlar bir nechta testlar uchun Benjamini-Xochberg moslamasi bilan Fisherning aniq testi yordamida amalga oshirildi. S1 va S2 qo'shimcha rasmlarida gen ifodalari o'rtasidagi qiyosiy tahlilning issiqlik xaritasi ko'rsatilgan.buyrakCalr plus / plus, Calr plus // va Calr / dan rudiments. Calr plyus/plus va Calr/ buyrak o'rtasidagi gen ekspressiyasining o'zgarishlari haqida to'liq ma'lumotga ega bo'lish uchun Calr plus/plus va Calr/ o'rtasidagi ifodaning o'zgartirilgan katlam o'zgarishi (FC) bilan MA-syujeti transformatsiyalanganning log2 ga yaratildi. barcha namunalardagi har bir gen uchun o'rtacha ifoda darajasi (3A-rasm, S1 qo'shimcha rasm). MA-syujeti Calr plyus / plyusda Calr / ga nisbatan differentsial tartibga solinadigan genlarni ko'rsatadi. Biologik jarayon bo'yicha tartibga solinadigan genlarning funktsional tasnifi Kalrda rivojlanish jarayonining o'zgarishini aniqladi.buyraklar(3B-rasm, S1 qo'shimcha jadvali). Tartibga solinadigan genlarning yo'l annotatsiyasini chuqurroq o'rganish ikkita asosiy jarayonning aberatsiyasini aniqladi: Wnt signalizatsiyasi va oqsillarning katlanishi, chunki tartibga solinadigan oqsillarning aksariyati ushbu ikkita asosiy yo'lda ishtirok etishi aniqlandi (3B-rasm). Ierarxik klasterlash va ifoda profillaridagi k-vositalarni klasterlash embrionni tasdiqladi.buyrakCalr plus / plus va Calr plus // transkriptomlari juda o'xshash, ammo Calr transkriptomlaridan sezilarli darajada farq qiladi / (3C-rasm, S1 va S2 qo'shimcha rasmlari).

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK INFEKTSIONINI YAXSHILADI

Bizning transkriptom tahlili ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, Kalrning nokauti asosiy oqsillarni ifodalashda o'zgarishlar bilan birga bo'lgan.buyrakWnt signalizatsiyasidagi asosiy oqsillar bilan bir qatorda rivojlanish (3C va 4A-rasmlar, S2 qo'shimcha jadvali) va ko'p sonli nefrogen genlar pastga regulyatsiya qilingan yoki Calrda aniqlanmagan.buyrakrudimentlar (3C-rasm, 4A-rasm). Boshqalar qatorida, ilgari nefrogenezning turli bosqichlarida ishlashi haqida xabar berilgan Six1 va Six2 kabi transkripsiya omillari Kalr// embrion buyragida sezilarli darajada pasaygan. Osr1 ekspressiyasi Eya1, Pax2, Six2, Sall1 va GDNF uchun zarur bo'lgan genlardan biridir va bu genning ifodasi Calr / da deyarli yo'q edi. Wnt signalizatsiyasi va nefrogen kalit genlarning o'zgarishining ta'sirini o'rganish uchunbuyrakKalr nokaut sichqonlarida rivojlanishi, embrion rivojlanishining markerlari bilan immunofluoresans bo'yashbuyrakE14.5 bosqichida embrionlardan bo'laklar. Bo'yash Calrda tekshirilgan genlarning o'zgarishini aniq tasdiqladi / (4B-rasm). Bundan tashqari, Calr plus / plus va Calr plus // bilan solishtirganda, Calr /buyrakaniq nefrogen zonaga ega emas (4B-rasm), binoni bilan tasdiqlanadi va bu jiddiy buzilishlarni tasdiqlaydi.buyrakKalr/embrionlarda rivojlanish.

2.3. Qiyosiy proteomik tahlillar Calr / embrion buyrak proteomasida sezilarli o'zgarishlarni aniqladi

Morfologik va gistologik tahlillar shuni ko'rsatdiki, Kalrning cheklanishi embrion rivojlanishi uchun muammoli.buyrak. Kalrning rolini tushunish uchunbuyrakembrion rivojlanishi, embrionda keng proteom tahlillari o'tkazildibuyraklarikkita strategiyadan foydalanish. Birinchi tajribalarda biz embrionni solishtirish uchun 2D-gel elektroforezidan foydalandikbuyrakCalr plus / plus va Calr plus // E13.5 bosqichidagi sichqon embrionlaridan proteomalar. 2D naqsh Calr plus proteomasida sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi //buyraklar(p < 0.05)="" (qo'shimcha="" rasm="" s3a).="" differensial="" ravishda="" ko'p="" bo'lgan="" oqsillarni="" identifikatsiyalash="" stress="" yo'llari="" va="" rnk="" metabolizmida="" ishtirok="" etadigan="" oqsillarni="" ifodalashda="" calr="" plus="" embrionda="" o'zgarishlarni="">buyrak(Qo'shimcha rasm S3B, C). Calr plus // va Calrmí / dagi proteom o'zgarishini Calr plus / plus bilan solishtirganda yaxshiroq o'rganish uchunbuyrak, biz massa spektrometriyasiga asoslangan proteom profilini amalga oshirdik (5-rasm, S3-S8 qo'shimcha jadvallari). Bir-biriga o'xshash tahlil genotiplar o'rtasida oqsilni aniqlashning yuqori takrorlanishini ko'rsatdi (5A-rasm). Statistik tahlil Calr plyus / plyusga nisbatan Kalrmí / (5A-rasm, S3 va S4 qo'shimcha jadvallari, S4A qo'shimcha rasm), Calr plyus // va Calr/ (5A-rasm, S5 qo'shimcha jadvallari va S5 va qo'shimcha jadvallar) o'rtasida protein ifodasida sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi. S6, qo'shimcha rasm S4B) va Calr plus / plus vs. Calr plus // (5A-rasm, S7 va S8 qo'shimcha jadvallari, S4C qo'shimcha rasm). Immunofluoresans bo'yash Kalrda Kalrning nokautini tasdiqladi //buyraklar. Bundan tashqari, biz Calr / dagi ikkita pastga regulyatsiya qilingan oqsillar uchun proteomik topilmalarni tasdiqladik: Kalbindin 1 (Calb -1) va Superoksid dismutaza 1 (Sod1). Sod1 holatida ham proteomik, ham transkriptomik ma'lumotlar Sod1 ning Calrí // embrionda nokautini aniqladi.buyrakva immunofluoresans bilan bo'yash Calr / embrionda Sod1 etishmovchiligini tasdiqladi.buyrak(5B-rasm). Sod1 antioksidant metalloenzim bo'lib, hujayra katalazalari tomonidan keyinchalik detoksifikatsiya qilish uchun erkin superoksid radikallarini vodorod periksga aylantirish orqali reaktiv kislorod turlarini (ROS) detoksifikatsiya qilishda muhim rol o'ynaydi va shu bilan toksiklikni oldini oladi. Kalb-1 distal konvolyut kanalchada (DCT) asosiy hujayra ichidagi kaltsiyni bog'lovchi oqsil bo'lib, hujayralararo Ca2 plyus reabsorbtsiyasida asosiy rol o'ynaydi. Hujayra ichidagi Ca2 plyus bufer va Ca2 plyus tranzit oqsil sifatida Kalb-1 Ca2 plyusni hujayra ichidagi Ca2 plyus - konsentratsiyasida sezilarli o'zgarishlarsiz apikaldan bazolateral tomonga o'tkazadi. Kalr nokauti va ikkala oqsilning ifodalanishidagi o'zgarishlar o'rtasidagi bog'liqlik aniq emas va qo'shimcha tekshirishni talab qiladi.

Shakl 3. Kalretikulin nokaut sichqonlarining qiyosiy gen ekspresyon tahlili. (A): Calr plyus / plus sichqonlarida Calr / ga nisbatan keng miqyosli yuqori va pastga regulyatsiya qilingan genlarni ko'rsatadigan MA syujeti. Qatlam o'zgarishining miqdoriy testlari (normalangan log-transformatsiyalangan o'qishlar soniga asoslangan) Benjamini-Xochberg tuzatish (p < 0.05)="" bilan="" fisherning="" aniq="" testi="" yordamida="" amalga="" oshirildi="" va="" ahamiyatsiz="" genlar="" kulrang="" rangda="" ifodalanadi.="" ma="" syujeti="" calr="" plus="" plus="" vs.="" calr="" da="" differentsial="" ifodalangan="" genlarni="" ko'rsatish="" uchun="" ishlatiladi.="" (b):="" calrda="" pastga="" regulyatsiya="" qilingan="" genlarning="" biologik="" jarayonlarini="" taqsimlash="" calr="" plus="" plus="" -="" bilan="" solishtirganda.="" aniqlangan="" genlarning="" tasnifi="" david="" bioinformatika="" vositasi="" yordamida="" amalga="" oshirildi.="" gen="" belgisi="" gen="" ontologiyasi="" izohlarini,="" masalan,="" biologik="" jarayonlarni="" tasniflash="" uchun="" ishlatilgan.="" (c):="" yuqori="" genlarni="" boyitish="" tahlili="" uchta="" genotip="" (calr="" plus="" plus,="" calr="" plus="" va="" calr="" o'rtasida="" sezilarli="" darajada="" tartibga="" solinishi="" aniqlandi.="" qiyosiy="" tahlil="" issiqlik="" xaritasi="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Gen ontologiyasi tasnifi va oqsil-oqsil o'zaro ta'siri tarmoq tahlillari

Vulqon uchastkalari va doiraviy diagramma tahlillari shuni ko'rsatdiki, Kalr ifodasining o'zgarishi embrionda global o'zgarishlarga olib keladi.buyrakproteoma (Qo'shimcha rasm S4). Embrion bilan bog'liq biologik mexanizmlar haqida ko'proq ma'lumot olish uchunbuyrakCalr / sichqonlarda rivojlanish o'zgarishi, biz DAVID bioinformatikasini UniProt va GenBank ma'lumotlar bazalarida topilgan oqsillarning taxminiy funktsiyasi haqidagi ma'lumotlar bilan birlashtirdik. Aniqlangan oqsillarni biologik jarayonlardagi ishtiroki bo'yicha tasniflash natijasida to'qqizta yuqori darajada ifodalangan toifalar bilan yigirma toifa hosil bo'ldi (Qo'shimcha rasm S4D). Asosiy toifalardan biri rivojlanish jarayoni bo'lib, 1000 dan ortiq aniqlangan oqsillar ushbu guruhga tegishli. Protein-oqsil o'zaro ta'siri deyarli barcha biologik jarayonlarning asosiy mexanizmlari bo'lganligi sababli, rivojlanish, mumkin bo'lgan oqsil-oqsil o'zaro ta'siri haqida ma'lumot olish va Calr plus // va Calr/ embriondagi tartibga solinadigan oqsillarni bog'laydigan yo'lni tartibga solish.buyrakKalr tanqisligi sharoitida buzilgan jarayonlar haqida muhim ma'lumot berishi mumkin. Shu maqsadda biz STRING 11.0 (http://string.embl.de, 2021-yil 24-martda ochilgan) yordamida tartibga solinadigan oqsillar orasidagi oʻzaro taʼsir tarmoqlarini oʻrgandik. Faqat Calr plus / plus va Calr plus // da ifodalangan oqsillarni keyingi tahlil qilish RNK ​​metabolizmi va oksidlovchi fosforillanish bo'lgan ikkita asosiy jarayonda ishtirok etadigan oqsillardan ikkita kuchli o'zaro ta'sir tugunlarini aniqladi (Qo'shimcha rasm S5A). Bu Calr / embrion ekanligini ko'rsatadibuyrakRNK-metabolizmidagi anormallik va energiya tanqisligidan aziyat chekishi mumkin. Calr plus/plus va Calr plus //-da ortiqcha ifodalangan oqsillar o'rtasidagi o'zaro ta'sir tarmoqlarini Calr/ bilan solishtirganda o'rganish bizning taxminlarimizni qat'iy tasdiqlaydi, chunki tarmoqlar uchta kuchli o'zaro ta'sir tugunlarini ko'rsatadi. Tugunlarning ikkitasida RNK metabolizmi va oksidlovchi fosforillanishda ishtirok etadigan oqsillar to'plangan, uchinchi tugun esa ribosoma oqsillarini o'z ichiga oladi va ribosoma shakllanishi va oqsil almashinuvining buzilishini aniqladi (Qo'shimcha rasm S5B). Ribosomal oqsillarni sinchiklab tekshirish katta va kichik ribosoma bo'linmalaridan oqsillarning sezilarli o'zgarishini ko'rsatdi va bu ribosoma biogenezi va oqsil sintezida jiddiy buzilishlarni aniqladi (6A-D-rasm).

2.5. Kalr nokauti natijasida ribosoma oqsili ifodasi o'zgaradi 

Transkriptomik va proteomik ma'lumotlarni tahlil qilish Calr / sichqon embrionida ribosoma oqsillarining ifodalanishida sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi.buyraklar. Western blot tahlili va embrionning MS miqdorini aniqlashbuyrakuchta genotipdan olingan protein ekstraktlari Rps10, Rps19 va Rps26 ning sezilarli darajada pasayishini tasdiqladi.buyraklar(7A-rasm) va Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17 va Rps19 (Qo'shimcha rasm S6A,B) Calr/ . Bundan tashqari, embrionning bo'yalishibuyrakbo'limlar ribosoma oqsillarini ifodalashdagi o'zgarishlar darajasini tasdiqladi; Kalr/embrionda Rps10 yoki Rps6 aniqlanmadibuyrakbo'limlar (7B-rasm). Calr nokauti va ribosoma oqsili ifodasi o'rtasidagi bog'liqlikni o'rganish uchun biz MDCKda in vitro Calr nokaut modelini yaratdik.buyrakCRISPR/cas9 endonukleaz tizimidan foydalangan holda tubula hujayralari. Western blot tahlillari MDCK hujayralarida Calr ekspressiyasining dozaga bog'liq bo'lgan pastga regulyatsiyasini tasdiqladi va Rps10 va Rps19 oqsillarini kodlovchi 40S ribosoma bo'linmalarining sezilarli darajada kamayganligini ko'rsatdi, bu ribosoma biogenezida buzilishni aniqladi. Bundan tashqari, oqsil sintezi uchun muhim komponentlarning ifodasi, masalan, cho'zilish, eEIF5a boshlash omili Calr nokautli MDCK hujayralarida sezilarli darajada kamayganligini aniqladi (7C-rasm). Kalr nokauti sezilarli morfologik, proteomik va transkriptomik o'zgarishlar bilan birga keldi. Bizning in vivo va in vitro tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, bu aberatsiyalar ribosoma biogenezida sezilarli pasayish bilan birga bo'lgan. Kalr nokautida ribosoma oqsili ifodasining pasayishibuyrakembrion bosqichlari bilan chegaralanib qolmagan, balki kattalardan olingan hujayralarda ham namoyon bo'lishi mumkin edibuyraklar, Kalrning ribosoma biogenezidagi potentsial rolini ochib beradi.

Shakl 7. Kalr tanqisligi ribosoma oqsili ifodalanishida pastga regulyatsiya bilan bog'liq. (A): Calr plus / plus, Calr plus // va Calr // embriondan olingan protein ekstraktlarida Rps10, Rps19 va Rps26 ribosoma oqsillarining Western blot tahlillaribuyraklar. Embrion buyraklar uch xil homilador Calr plus /- sichqonlaridan olingan. Genotiplashdan so'ng, bir ona va genotipdagi embrionlar birgalikda guruhlangan va ularning embrionlaribuyrakprotein ekstraktlari birlashtirildi. Proteinni baholashdan so'ng, har bir tekshirilgan oqsil uchun Western blot tahlillari uch nusxada o'tkazildi. Namunalarni qiyosiy tahlil qilish uchun bir tomonlama ANOVA ishlatilgan. Natijalar kamida uchta mustaqil tajribadan olingan o'rtacha ± sd sifatida taqdim etiladi. Farqlar p < 0.05="" boʻlganda="" statistik="" ahamiyatga="" ega="" deb="" hisoblandi.="" (b):="" 20×="" kattalashtirish="" bilan="" calr="" plus/plus="" va="" calrmí="" mbrion="" buyrak="" to‘qimalari="" bo‘limlarida="" rps10="" va="" rps6="" ga="" qarshi="" immunoffloresans="" bilan="" bo‘yash.="" (c):="" mdck="" hujayralaridan="" oqsil="" ekstraktining="" western="" blot="" tahlili="" (chapda)="" va="" mdck="" hujayralarida="" kalr="" nokautidan="" keyin="" mrnk="" miqdorini="" aniqlash="" (o'ngda).="" kalr="" ikki="" xil="" sgrnaga="" ega="" crispr/cas9="" tizimi="" yordamida="" nokautga="" uchradi.="" western="" blots="" calr,="" gapdh,="" rps10,="" rps19="" va="" eif5a="" antikorlari="" bilan="" tekshirildi.="" sgcalr{11}}="" namunasidagi="" calr="" va="" rps10="" mrnk="" miqdorini="" aniqlash="" qpcr="" yordamida="" amalga="" oshirildi.="" crispr/cas9="" tizimidan="" foydalangan="" holda="" calrni="" pastga="" regulyatsiya="" qilish="" calr="" etishmovchiligi="" va="" ribosoma="" oqsili="" ekspressiyasidagi="" o'zgarishlar="" o'rtasidagi="" bog'liqlikni="" aniqladi.="" muhim="" farqlar:="" (**)="" p=""><0,01, (***)="" p=""><0,001, (****)="" p=""><>

3. Munozara

ThebuyraklarTarmoqli morfogenez orqali rivojlanadi, bu jarayon murakkab o'sish va differentsiatsiya jarayonlarini o'z ichiga oladi va yangi paydo bo'lgan mezenxima bo'limidagi atrofdagi hujayralardan keladigan signallar tomonidan boshqariladi [16]. O'tgan yillar davomida bir nechta asosiy genlar va yo'llarbuyrakrivojlanishi aniqlangan. Trofik omillar, xususan, GDNF, suyak morfogenetik oqsillari (BMP) va fibroblast o'sish omillari (FGF) ishtirok etadi.buyrako'sish va farqlash. Ular UB tarvaqaylab ketgan morfogenezda, shuningdek, embrionda nefrogen mezenximani saqlash va farqlashda ishtirok etadigan signalizatsiyani boshqaradi.buyrak[17]. Kalr nokauti yurakning disfunktsiyali rivojlanishi tufayli embrionning o'limiga olib keladi [15]. Oddiy kardiyomiyositlarda sitoplazmik Ca2 plyus kontsentratsiyasining ortishi yurak miofibrillogenezini qo'zg'atish uchun talab qilinadi. Ca2 plyus kontsentratsiyasidagi bu ajralmas o'zgarish Kalrga bog'liq va Kalr tanqisligi sharoitida yo'q [18]. Nefrogenezda ER chaperon va kaltsiyni bog'lovchi protein Calrning funktsional roli hali o'rganilmagan. Kalrning embriondagi potentsial rolini o'rganish uchunbuyrakKalr etishmovchiligining rivojlanishi va nefrogenezga ta'siri, biz qiyosiy transkriptomik va proteomik tahlilni o'tkazdik. Umuman olganda, Kalr etishmovchiligi buyraklar rivojlanishining sekinlashishiga va transkriptoma va proteomalarning ahamiyatsiz o'zgarishiga olib keldi. Bundan tashqari, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, Kalr etishmovchiligi nefrogenez yo'llarida jiddiy buzilishlarni keltirib chiqardi, chunki Wnt signalizatsiya kalit oqsillarining (masalan, Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq va Kremen2) sezilarli ifoda o'zgarishlari aniqlandi. Uterus kurtaklari epiteliysi va metanefrik mezenxima o'rtasidagi induktiv signalizatsiya asosan Wnt teskari aloqa signali bilan tartibga solinadi [19,20]. Kalr uyali kaltsiy gomeostazining asosiy qismi bo'lsa-da, u bir vaqtning o'zida hujayra signalizatsiyasi va gen ekspressiyasida ishtirok etadigan glikoproteinlar va oqsillarni katlama va tashish uchun muhim ER chaperondir [21]. Kalrning nokauti oqsil qatlamlarining buzilishiga va translyatsion mexanizmning buzilishiga olib keladigan ER stressiga olib kelishi mumkin. Bu gomozigotli sichqonlarda buyrak rivojlanishida kuzatilgan sekinlashuvni tushuntirishi mumkin.

Bizning ma'lumotlarimiz tomonidan ta'kidlangan hayratlanarli va qiziqarli jihatlardan biri bu ribosoma oqsillari ifodasini o'zgartirishdir. Biz 40S va 60S ribosoma bo'linmalarining bir nechta oqsillarining deyarli to'liq yo'qolishini ko'rsatdik. Bundan tashqari, bizning in vitro tajribalarimiz Kalrning regulyatsiyasi va ribosoma oqsilining ifodalanishining buzilishi o'rtasidagi bog'liqlikni tasdiqladi. Ribosoma biogenezi yaxshi tashkil etilgan va qattiq tartibga solinadi. Yangi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ribosoma nafaqat normal hujayra fiziologiyasida, balki stimullarga reaktsiyada va kasalliklarning patogenezida ham muhim rol o'ynaydi. Bundan tashqari, ribosoma biogenezi hujayra o'sishini nazorat qiladi va ribosomalardagi proliferatsiya va o'zgarishlar hujayra proliferatsiyasi, hujayra siklini to'xtatish, apoptoz va patologik namoyon bo'lish aberatsiyasida aks etadi [22,23].

Ribosoma biogenezidagi rolidan tashqari, ribosoma oqsillari turli xil qo'shimcha ribosoma funktsiyalarini bajarishi aniqlangan, masalan, hujayra o'sishi va ko'payishi, DNKni ta'mirlash, hujayraning differentsiatsiyasi va rivojlanishi [24-31]. Ribosomal oqsil funktsiyalarining buzilishi gematologik va metabolik kasalliklar bilan bog'liq bo'lib, yurak-qon tomir kasalliklari va saratonga olib kelishi mumkin [32-36]. Ribosomal oqsillarni kodlovchi genlarning mutatsiyasi eritropoez anomaliyasi bilan bog'liq bo'lib, bu klinik sindromlarga olib keladi, masalan, Diamond-Blackfan anemiyasi (DBA) [37] va 5q-sindromi [38]. RPS10 mutatsiyalari Diamond-Blackfan anemiyasi bilan bog'liq va bu bemorlarning 30 foizida taqa yoki sigmasimon bez mavjud.buyraklar[39]. Qizig'i shundaki, Diamond-Blackfan bilan og'rigan bemorlarda miyelodisplastik sindromni rivojlanish ehtimoli yuqori bo'lib, bu Calr geni ekson 9 mutatsiyasi bilan bog'liq [40-42]. Translatsiya mexanizmining bunday qayta tuzilishi rivojlanish jarayonida katta aberatsiyalarni keltirib chiqaradi va nafaqat urogenital, balki qon aylanish va reproduktiv tizimlarga ham ta'sir qiladi, natijada kalretikulin etishmovchiligi tufayli embrion o'limga olib keladi. Bizning ma'lumotlarimiz Kalr / embrionda bezovta qiluvchi ribosoma biogenezini aniqladibuyrakva protein biogenezida Kalrning muhim rolini ta'kidladi. Kalr tanqisligi va ribosoma oqsili ekspressiyasi o'zgarishi o'rtasidagi munosabatlarni yaxshiroq tushunish Kalrning ribosoma biogenezi va embrionga qanday ta'sir qilishini tushunish uchun yangi tushunchalar beradi, deb hisoblaymiz.buyrakrivojlantirish va organlar rivojlanishini boshqaradigan jarayonlarga yangi qarashlarga imkon beradi.

4. Materiallar va usullar

4.1. Hayvonlar

Bir xil C57BL/6J genetik kelib chiqishiga ega bo'lgan kalretikulin geterozigotali (Calr plus //) va yovvoyi tipdagi (Calr plus/plus) sichqonlar Alberta universiteti professori Marek Michalakdan, Edmonton, Alberta, Kanadadan olingan. Sichqonlar maxsus patogensiz yashash sharoitida ko'paytirildi va Michalak va boshqalarda ilgari tasvirlanganidek genotiplangan. [15]. Bizning tadqiqotimiz uchun homilador Calr plus // sichqonlari embrion rivojlanishining turli bosqichlarida qurbon qilindi (embrion kunlari 13,5: E13,5; 14,5: E14,5; va 16,5: E16,5), embrionlar yig'ib olindi vabuyraklarajratildi. Genotiplash uchun embrion dumining bir qismi ishlatilgan. Thebuyraklarkeyinchalik gistokimyoviy bo'yash yoki transkriptomik yoki proteomik tahlil uchun tayyorlangan. Barcha eksperimental protseduralar nemis hayvonlarni parvarish qilish va etika qonunchiligiga (NIH standartlari) muvofiq amalga oshirildi va Germaniyaning Göttingen tibbiyot markazining mahalliy axloq qo'mitasi tomonidan ma'qullandi (33.14-42502-04-11/0598).

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK OG'RIG'INI YANGILAYDI

4.2. Gistokimyoviy bo'yash

Embrionni gistologik bo'yash uchunbuyraklar, kesilganbuyraklarUlar bir kechada 4 foizli tamponlangan formaldegid eritmasida mahkamlangan va keyinchalik kerosin bloklariga solingan. Parafin o'rnatilgan bo'laklar deparafinizatsiya qilingan va regidratlangan va ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq gematoksilin Gill III eritmasi va eozin Y eritmasi (Merck, Darmshtadt, Germaniya) bilan bo'yalgan.

4.3. Embrion buyrakning Ex-Vivo organ madaniyati

Ex vivo organ madaniyati Davies va boshqalarga ko'ra amalga oshirildi [43]. Homilador sichqonlar embrion rivojlanishining E13.5 bosqichida qurbon qilindi, embrionlar yig'ib olindi vabuyraklarajratildi. Genotiplashdan keyin 6buyrakHar bir genotipdan (Calr plus/plus , Calr plus // va Calr/ ) olingan rudimentlar 0,4 mkM teshik oʻlchamli (24 quduq, BD Falcon) shaffof PET membranasiga qoʻyilgan. Membrana 400 mkl bo'lgan 24 quduqli plastinkaning bir qudug'iga joylashtirildibuyrakmadaniy muhit (KCM, DMEM, 10 foiz inaktivatsiyalangan FCS). Bu imkon berdibuyrakmuhitni cho'ktirmasdan aloqa qilish. Bunday sharoitda uni saqlab qolish mumkin edibuyrakkamida 144 soat davomida 37 ◦C va 5 foiz CO2 da yetishtiriladi.

4.4. Madaniy buyraklarni immunofluoresans bo'yash va buyrak bo'limlarini immunohistologik tahlil qilish

Embrionbuyraklar72 soat davomida ex vivo yetishtirildi, so'ngrabuyrakrudimentlar sovuq metanolda t 20 ◦C da 30 daqiqa davomida mahkamlangan. Fiksatsiya bosqichidan keyin PBS da har biri 5 daqiqadan iborat bo'lgan 3 ta yuvish bosqichi o'tkazildi. Birlamchi antikor quyon monoklonal anti-laminin antikori (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) PBSda suyultirildi va bir kechada 4 ◦C da inkubatsiya qilindi. Madaniyatlibuyrakrudimentlar PBSda 4 soat davomida yuvildi va ikkilamchi antikor (Molecular Probes Alexa Fluor 555 echkiga qarshi quyon IgG (1:500)) 4 ◦C da kechasi qo'shildi. UB lektin Dolichos biflflorus agglutinin (DBA) yordamida kamida 3 soat davomida bo'yalgan. Inkubatsiyadan so'ng,buyraklar3 soat davomida PBS da yuvilgan va mikroskopik tahlil uchun ko'milgan. Parafinlangan va regidratlangan embrionni immuno-bo'yashbuyrakbir nechta oqsillarni ifodalash va taqsimlashni aniqlash uchun bo'limlar o'tkazildi. Bo'limlar oziq-ovqat bug'ida 25 daqiqa davomida oldindan qizdirilgan antigen olish eritmasi (1,8 mkM limon kislotasi va 8,2 mkM natriy sitrat) bilan ishlov berildi. Bo'limlar birlamchi antikorlar bilan 1 soat davomida PBSda 10% echki zardobi bilan bloklandi, bir kechada 4 ◦C da inkubatsiya qilindi (Quyidagi asosiy antikorlar ishlatilgan: quyon monoklonal anti-kalbindin-1, anti-Wt1, anti- Six2, anti-Pax2, anti-Calr (Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya), quyon monoklonal anti-Rps6, antiRps10 (Invitrogen) va quyon monoklonal anti-Sod1 antikorlari (Abnova, Taypey, Tayvan).Birlamchi antikorlar flüoresans bilan aniqlangan. etiketli ikkilamchi antikorlar (Molecular Probes Alexa Fluor 555 echki sichqonchaga qarshi IgG antikori va Alexa Fluor 555 echki quyonga qarshi IgG) xona haroratida 1 soat davomida. Salbiy nazorat uchun to‘qima bo‘limlari faqat ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi. Slaydlar o‘rnatildi. yadrolarni bo'yash uchun DAPI bilan Vectashield o'rnatish muhitida qoplamalar bilan (Vector Laboratories, Burlingame, CA, AQSh).

4.5. Hujayra madaniyati

Madin-Darbi itibuyrak(MDCK) hujayralar American Type Culture Collection (ATCC) dan olingan va Dulbecco's Modifified Eagle's Medium (DMEM), 10 foiz homila sigir zardobida (FBS), 1 foiz penitsillin/streptomitsin va 1 foiz L-glutamin 37 ◦C da ko'paytirilgan. 5 foiz CO{6}}atmosferada. Hujayralar T25 kolbalarida yetishtiriladi va haftada ikki marta bo'linadi. Hujayra o'tishi uchun MDCK hujayrasi hujayra tuzilishini o'zgartirmaslik uchun qisqa vaqt davomida tripsinlangan.

4.6. Nokaut hujayralarining paydo bo'lishi

Canis lupus turlari uchun Calr (XM8622117) sgRNK ketma-ketligi BlueHeronBio (Origene, Herford, Germaniya) onlayn vositasi yordamida ishlab chiqilgan. 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 sgRNA ketma-ketligi pLenti-Cas-Guide plazmidiga (Addgene plazmidlari №3931646) BamHI va BsmBI cheklash fermentlari bilan kiritilib, pLenti-Cas-sekansiyani yaratish uchun keyinchalik tasdiqlangan{7}}Casquen. MDCK hujayralarida Karlni nokaut qilish uchun pLenti-Cas9-Calr vaqtinchalik transfeksiyasi amalga oshirildi. Transfeksiyadan bir kun oldin 200,{11}} hujayra/ml MEM muhiti bo‘lgan 6 ta quduq plastinkasiga ekilgan. Transfeksiyadan oldin madaniy muhit FCSsiz Opti-MEM muhitiga almashtirildi. Hujayralarni transfeksiya qilish uchun Lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, AQSH) ishlatilgan. Lipofektamin plazmid DNK aralashmasi o'qituvchining protokoli asosida OptiMEM bilan tayyorlangan. 6 quduqli plastinka transfeksiyasi uchun 250 mkL Opti-MEM muhitiga 4 mkg plazmid DNK alohida qo'shildi va xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, DNK aralashmasi Lipofektamin 2000 aralashmasiga qo'shildi va hujayralarga qo'shilishidan oldin 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Transfeksiya muvaffaqiyati Western blot yordamida baholandi.

4.7. Transkriptoma tahlili

Transkriptoma tadqiqotlari uchun 3 ta homilador Calr plus // sichqonlari ishlatilgan. Embrionlar (8-10 / homilador sichqonlar) yig'ib olindi vabuyraklarizolyatsiya qilingan edi. Genotiplashdan keyin,buyraklarbir xil genotip va bir onadan olinganlar birlashtirildi va RNK ekstraktsiyasi uchun qayta ishlandi. Jami RNKlar Calr plus / plus, Calr plus // va Calr / embriondan ajratilgan.buyraklarishlab chiqaruvchining tavsiyalariga muvofiq Trizol (Invitrogen) usuli yordamida. Keyin namunalar DNK kontaminatsiyasini olib tashlash uchun DNKaz I (Sigma) bilan ishlov berildi. RNK sifati Agilent 21{{10}}0 Bioanalizator (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AQSH) mikrosuyuqlik elektroforezi yordamida aniqlandi. Tartiblash uchun RNK namunalari ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq (Illumina, San-Diego, CA, AQSh) "TruSeq RNK namunasini tayyorlash to'plami" yordamida tayyorlangan. HiSeq 2000 (Illumina, San-Diego, CA, AQSH) yordamida bitta oʻqish (5{28}} bp) ketma-ketligi amalga oshirildi. Ketma-ketliklar STAR hizalamasidan foydalangan holda Muskullus genomiga mos yozuvlar ketma-ketligiga moslashtirildi (Ensembl genome assembly 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly. html, 2021-yil 24-martda kirish) dasturiy ta'minot (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbor, AQSH) (versiya 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, 2021-yil 24-martda foydalanilgan) [44] 50 ta baza ichida 2 ta mos kelmaslik imkonini beradi. Noyob hitlarni filtrlash va hisoblash uchun SAMtools to'plami (0.1.18-versiya) va HTSeq (versiya 0.6.1p1) ishlatilgan [45,46]. Nomzod genlari kamida 2-katta o'zgarish va FDR tomonidan to'g'rilangan p-qiymati <0,05 ga="" filtrlangan.="" gen="" izohi="" ensembl="" v78="" dan="" (www.ensembl.org,="" 2019-yil="" 1-martda="" kirilgan)="" biomart="" paketi="" (2.24.0="" versiyasi)="" [47]="" dan="" mus="" muscullus="" yordamida="" amalga="" oshirildi.="" nomzod="" genlar="" uchun="" go="" boyitish="" tahlili="" standart="" parametrlar="" yordamida="" goseq="" paketi="" (1.2-versiya)="" [48]="" bilan="">

4.8. Buyrak lizisi, oqsil ekstraktsiyasi va ikki o'lchovli gel elektroforez (2-DE)

2D gel elektroforezi uchun 6 homilador Calr plus // urg'ochi (8-10 embrion / ayol) embrionlari ishlatilgan. 2D gel elektroforezi (2-DE) uchun protein ekstraktsiyasi uchunbuyraklarembrionlarning bir xil bosqichida va bir xil genotipdan va urg'ochi (8-10 embrion / homilador ayol) birlashtirilib, lizis buferi (9,5 M karbamid, 2 foiz CHAPS (w/v), 2 foiz amfolitlar (w) bilan buzildi. / v), 1 foiz DTT) va vortekslangan. Lizis tamponini qo'shgandan so'ng, namunalar 4 ◦C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Hujayra qoldiqlarini olib tashlash uchun santrifüjlash 13,000×g va 4 ◦C da 30 daqiqa davomida amalga oshirildi. Maksimal tozalikka erishish uchun supernatant qo'shimcha 30 daqiqa davomida 13,000×g va 4 ◦C haroratda yangidan rifuga qilindi. Supernatantlar yig'ildi va granulalar tashlandi va olingan namunalar darhol foydalanildi yoki ishlatilgunga qadar -80 ◦C da saqlangan. Tuzning ifloslanishini kamaytirish va oqsillarni boyitish uchun Wessel va Flügge [49] bo'yicha metanol-xloroform cho'kmasi amalga oshirildi. Pelet quritilgan va lizis tamponida eritilgan. Umumiy oqsil kontsentratsiyasi Bredfordga ko'ra Bio-Rad oqsil tahlili (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh) yordamida aniqlangan. Standart sifatida BSA (Sigma, Steinheim, Germaniya) ishlatilgan. Eksperimental takrorlanuvchanlikni kafolatlash uchun biz har biridan uch nusxali jellar yaratdikbuyrakbasseyn. 2D oqsillarni ajratish yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi [50]. 2-DE jellari ishlab chiqaruvchi koʻrsatmalariga rioya qilgan holda Flamingo lyuminestsent jeli (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSH) bilan boʻyalgan. Bo'yashdan keyin jellar Fuji FLA-5100 skanerida 50 mkm ruxsatda skanerdan o'tkazildi. Raqamli tasvirlar Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunshveyg, Germaniya) yordamida tahlil qilindi. Proteinni ko'rish uchun 2-DE jellari qo'shimcha ravishda bir kechada kolloid Coomassie ko'k, Roti-Blue (Rot, Karlsrue, Germaniya) bilan bo'yalgan.

4.9. Mass-spektrometrik tahlil va oqsillarni aniqlash

Jellardan sezilarli darajada tartibga solingan dog'lar chiqarildi va Dihazi va boshqalar tomonidan ilgari tasvirlanganidek, jel ichidagi triptik hazm qilish va peptid ekstraktsiyasi amalga oshirildi. [51]. Qisqacha aytganda, gel dog'lari ikki marta 25 mM ammoniy bikarbonatda (amBic) va bir marta suvda yuvildi, 100% asetonitril (ACN) bilan 15 daqiqa davomida qisqartirildi va SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) 20–30 daqiqa. Barcha olib tashlangan dog'lar 12,5 ng/mkL sekvensiya darajasidagi tripsin (Roche Molecular Biochemicals, Bazel, CH) bilan 25 mM amBic ichida 37 ◦C da bir kechada inkubatsiya qilindi. Peptid ekstraktsiyasi birinchi navbatda 50% ACN/1% trifluoroasetik kislota (TFA) va keyin 100% ACN yordamida ikki marta amalga oshirildi. Barcha ekstraktlar birlashtirildi va SpeedVac yordamida tovush hajmi qisqartirildi. Triptik peptidlar nanofflow ESI Z-spreyi bilan jihozlangan Q-TOF Ultima Global massa spektrometri (Micromass, Manchester, Buyuk Britaniya) yordamida massa spektrometrik ketma-ketlikka duchor qilindi. Protein identifikatsiyasi Mascot qidiruvi bilan MSDB va Swissprot ma'lumotlar bazalariga nisbatan peptid massa bardoshliligi va 0,5 Da bo'laklarga chidamliligi yordamida amalga oshirildi.

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK EKSIZLIGINI YAXSHILADI

4.10. Protein ekstraktsiyasi, SDS-PAGE, jel-triptik hazm qilish va massa spektrometrik tahlillarida

Kalr/da oqsil o‘zgarishini massa spektrometrik miqdoriy aniqlash uchun.buyrak, bir xil genotip va bir onadan olingan namunalar birlashtirildi. Etarli hovuzlarni yaratish va biologik va eksperimental replikatsiyani ta'minlash uchun biz 6 ta homilador Cal plus // 8-10 embrion/sichqonchadan foydalandik. Embrionbuyraklaruchta genotipdan embrionlardan yig'ib olindi va yuqorida tavsiflanganidek, lizis buferi yordamida protein ekstraktsiyasi amalga oshirildi. Protein ekstraktlari SDS-PAGE bilan ajratildi, jellar Coomassie Blue bilan bo'yalgan, har bir chiziq kesilgan va teng o'lchamdagi 2 0 tilimga kesilgan va bo'laklar tripsin bilan jel ichidagi hazm qilingan. Mass-spektrometrik tahlil uchun namunalar o'z-o'zidan o'ralgan teskari fazali C18 old ustunida boyitilgan (0,15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11} }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germaniya) va analitik teskari faza-C18 ustunida ajratilgan (0.075 mm ID × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 mkm, Dr. Maisch) 300 nl minda 5–35 foiz asetonitril/0,1 foiz chumoli kislotasi (v:v) dan iborat 30 daqiqalik chiziqli gradient yordamida-1). Eluent FlexIon nanoSpray manbasi bilan jihozlangan va ma'lumotlarga bog'liq yig'ish usuli yordamida Excalibur 2.4 dasturi ostida ishlaydigan Q Exactive gibrid kvadrupol/orbitrap massa spektrometrida (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Germaniya) tahlil qilindi. Har bir eksperimental sikl quyidagi shaklda edi: 350–1600 m/z diapazon boʻylab bitta toʻliq MS skanerlash 70 rezolyutsiyada, 000 FWHM va AGC maqsadi 106 va maksimal toʻldirish vaqti 60 msda olingan. . 2 × 104 intensivlik chegarasidan 2 dan 5 gacha bo'lgan zaryad holatining 12 ta eng ko'p tarqalgan peptid prekursorlari keyin 2,0 FWHM izolyatsiya kengligida ketma-ket izolyatsiya qilingan, 25 foizli to'qnashuv energiyasini normallashtirilganda azot bilan parchalangan va natijada olingan mahsulot. 17,500 FWHM piksellar sonida qayd etilgan va AGC maqsadi 2 × 105 va maksimal to'ldirish vaqti 60 ms edi. Tanlangan prekursor m/z qiymatlari keyingi 15 soniya davomida chiqarib tashlandi. Har bir namuna uchun ikkita texnik nusxa olindi. Peaklistlar Raw2MSMS v1.17 dasturiy ta'minotidan foydalangan holda xom ma'lumotlardan olingan (Maks Plank Biokimyo instituti, Martinsried, Germaniya). Protein identifikatsiyasiga MASCOT 2.5.1 dasturi (Matrixscience, London, Buyuk Britaniya) yordamida erishildi. Proteinlar UniProtKB sichqonchani yo'naltiruvchi proteome v2017.09 (16930 ta protein yozuvi) va laboratoriyamizda odatda aniqlangan 51 ta ifloslantiruvchi moddalar to'plamiga qarshi aniqlandi. Qidiruv ferment sifatida tripsin va sistein blokirovka qiluvchi vosita sifatida yodoasetamid yordamida amalga oshirildi. Ikkitagacha o'tkazib yuborilgan triptik parchalanish va o'zgaruvchan modifikatsiya sifatida metionin oksidlanishiga ruxsat berildi. Qidiruv toleranslari prekursor massasi uchun 10 ppm va fragment massalari uchun 0,05 Da ga o'rnatildi va ESI-QUAD-TOF asbob turi sifatida belgilandi. Scaffold dasturining 4.8.9 versiyasi (Proteome Software Inc., Portlend, OR, AQSH) MS/MS asosidagi peptid va oqsil identifikatsiyalarini tekshirish uchun ishlatilgan. Peptid identifikatsiyalari, agar ular Percolator algoritmi tomonidan 95,0 foizdan yuqori ehtimollik bilan o'rnatilishi mumkin bo'lsa, qabul qilinadi. Protein identifikatorlari ishonchli tarzda aniqlangan kamida 2 peptidda soxta kashfiyot tezligi 1 foizga qisqartirildi. O'xshash peptidlarni o'z ichiga olgan va bundan tashqari, faqat MS/MS tahlili asosida farqlana olmaydigan protein xitlari parsimonlik tamoyillarini qondirish uchun guruhlangan. Muhim peptid dalillariga ega bo'lgan oqsillar klasterlarga guruhlangan. Proteinning ko'pligi barcha replikatsiyalar o'rtasida umumiy yig'indilarni normallashtirishdan so'ng, ularning Spektral soni bo'yicha baholandi.

4.11. Western Blot tahlili

Western blot tahlillari Towbin va boshqalarga ko'ra amalga oshirildi. [52]. Teng miqdorda oqsillar (5{11}}–75 mkg) poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) bilan ajratilgan va nitroselüloza membranalariga o‘tkazilgan (Amersham Pharmacia Biotech, Bukingemshire, Buyuk Britaniya). Membranalar TBST tamponida (20 mM Tris-HCl, pH 7.4 150 mM NaCl 0,1 foiz Tween 20) 5 foizli yog‘siz quruq sutda bloklangan va birlamchi antikorlar (anti-Calr, anti-Calr) bilan inkubatsiya qilingan. -Rps10, anti-Rps19, anti-Rps26 va anti-eIF5A) kechada 4 ◦C da. Protein tasmalarini ko'rish uchun floresan yorliqli ikkilamchi antikorlar ishlatilgan. Proteinning teng yuklanishini tasdiqlash uchun dog'lar anti-Actb yoki anti-GAPDH antikorlari bilan ishlov berildi (Sigma, Taufkirchen, Germaniya).

4.12. Bioinformatika

Aniqlangan oqsillarni asosan ma'lum va taxmin qilingan funktsiyalari bo'yicha tasniflash DAVID bioinformatikasi yordamida amalga oshirildi (http://david.abcc. ncifcrf.gov, 2019 yil 21 fevralda kirish) [53,54]. Gen belgilaridan gen ontologiyasi (GO) annotatsiyalarini (biologik jarayonlar va molekulyar funktsiyalar) tekshirish va tasniflash uchun foydalanilgan. Aniqlangan oqsillarning ma'lum va prognoz qilingan oqsil-oqsil o'zaro ta'sirining tarmoq tahlili STRING (O'zaro ta'sir qiluvchi genlar/oqsillarni qidirish uchun qidiruv vositasi) [55] yordamida amalga oshirildi.

4.13. Statistik tahlil

{0}}DE uchun raqamli tasvirlar tahlil qilindi va jellar boʻylab nuqta moslashuvi oʻtkazildi va Delta2D 3.4 (Decodon, Braunshveyg, Germaniya) yordamida normallashtirish amalga oshirildi. Delta2D har bir aniqlangan nuqta uchun "spot sifati" qiymatini hisoblab chiqadi. Bu qiymat nuqta "ideal" 3D Gauss qo'ng'irog'i shaklini qanchalik yaqin ifodalashini ko'rsatadi. O'rtacha nuqta hajmi nisbatiga asoslanib, taqqoslangan namunalar orasida nisbiy ifodasi kamida 2- marta (o'sish yoki pasayish) uch marta o'zgargan dog'lar muhim deb topildi. Proteinni tartibga solishning ahamiyatini tahlil qilish uchun Student's t-testi o'tkazildi va statistik ahamiyatga ega bo'lgan P qiymatlari 0.05 dan kichik deb qabul qilindi. Barcha dog'lar ImageJ dasturi yordamida aniqlangan. Ma'lumotlar GraphPad Prism dasturiy ta'minot to'plami, 8-versiya (San-Diego, CA, AQSh) yordamida tuzilgan. Dastur grafik taqdimot va tahlil qilish uchun Student's t-distribution yoki bir tomonlama ANOVA tomonidan ishlatilgan. Natijalar kamida uchta mustaqil tajribadan olingan o'rtacha ± sd sifatida taqdim etiladi. Farqlar p <0,05 bo'lganda="" statistik="" jihatdan="" ahamiyatli="" deb="" hisoblanadi.="" uterer="" kurtak="" uchlari="" va="" nefronlar="" qo'lda="" hisoblangan="" va="" ma'lumotlar="" graphpad="" prism="" dasturiy="" ta'minot="" to'plami,="" 8-versiya="" bilan="">