2-bob: Buyrak kanalchali peroksizomalari buyrakning normal faoliyati uchun ajratiladi

Qo'shimcha ma'lumot uchun. aloqatina.xiang@wecistanche.com

Munozara

ZSD bilan og'rigan bemorlarda proksimal kanalchada peroksizomalarning ko'pligi va buyrak anomaliyalari mavjudligi peroksisomalarning muhim rolini aniq ko'rsatmoqda.buyrak. Bundan tashqari, bir nechta peroksisomal fermentlarning buyraklarga xos ifodasi buyrak peroksizomalari boshqa to'qimalardagidan qisman farq qiladigan biologik funktsiyalarga ega bo'lishi mumkin degan fikrni tasdiqladi (15). Ushbu gipotezalarni tekshirish uchun biz tekshirdikbuyrak funktsiyasiperoksizomalardan mahrum sichqonlardabuyrak tubulasi. Peroksisomalarning rolini o'rganish uchun ishlatiladigan turli xil sichqoncha modellari orasida biz peroksisoma shakllanishi uchun zarur bo'lgan PEX5 peroksisoma biogenez omilini kodlovchi Pex5 ning shartli genetik inaktivatsiyasiga imkon beruvchi sichqonchani tanladik. Bu model tanlandi, chunki (i)Pex{2}}null sichqonlari ZSD(11) bilan kasallangan bemorlarda kuzatilganlarni eslatuvchi bir nechta biokimyoviy va funksional anomaliyalarni namoyish etadi va (i) Pex5 toʻqimalariga xos ablasyonli sichqon modellarining keng spektri tahlil qilingan (16), bu bizga buyrak kanalchalarida peroksisomal etishmovchilikning funktsional oqibatlarini boshqa to'qimalarda kuzatilganlar bilan solishtirish imkonini beradi. Baes va boshqalar tomonidan ko'rsatilgandek, Pex{7}}null sichqonlarida intrauterin o'sishning kechikishi, miyaning noto'g'ri shakllanishi va og'ir gipotoniya namoyon bo'lgan va hayotning dastlabki 72 soati ichida vafot etgan (11). Biokimyoviy tahlillar ZSD ning bir nechta belgilarini, jumladan, jigar va miyada plazmalojenlarning kamayishi va VLCFA plazma darajasining kuchli oshishini aniqladi. Pex{10}} null sichqonlarining buyragida P0,5 da kortikal buyrak kistalari topilmadi, ammo glomeruliyalarning intrauterin etukligida kechikish kuzatildi. Kaltsiy oksalat konlarining mavjudligi tekshirilmagan.

Cistanche o'tining foydalari bilan tanishish uchun shu yerni bosing

cKOm sichqonlarida buyrak kanalchalarida peroksisomal biogenezning ablatsiyasi hech qanday asosiy feno-tipga olib kelmadi, faqat chaqaloq cKOm sichqonlarida KW va BW kamayishi va kattalar cKOm sichqonlarida KW/BW nisbatining pasayishi bundan mustasno. cKOf sichqonlarida, flokslangan Pex5 allelining to'liqsiz kesilishi va Pex5 deletsiyasining buyrak transkriptomasi va metabolomiga nisbatan engilroq ta'siri buyrak tubulalarida ba'zi qoldiq peroksizomalar qolishi mumkinligini ko'rsatdi. Biroq,jinsiy aloqabuyrakdagi peroksisomal funktsiyalarning o'ziga xosligini ham inkor etib bo'lmaydi. Biz cKOm sichqonlarining buyraklarida KW yoki KW / BW nisbatining pastligini tushuntirishi mumkin bo'lgan muhim morfologik farqni topmadik. Biroq, proksimal hujayra kengligining qisqarish tendentsiyasi bu farqning mumkin bo'lgan sababi bo'lishi mumkin. Muhimi shundaki, ionlar, suv, aminokislotalar, organik anionlar va kationlar, fosfat, urat va megalin vositachiligida transepitelial tashishda ishtirok etuvchi oqsillarni kodlovchi transkriptlarning ifoda darajalaridagi sezilarli o'zgarishlarga qaramay, buyrak gomeostatik funktsiyasi cKOm sichqonlarida saqlanib qoldi. gand endositik yo'l. Shunisi e'tiborga loyiqki, pastga regulyatsiya qilingan transkriptlarning aksariyati proksimal kanalchada ifodalangan tashuvchilarni kodlagan, yuqori regulyatsiya qilingan transkriptlarning aksariyati nefronning distal qismlarida ifodalangan tashuvchilarni kodlagan. Masalan, Nkcc2, Clc-Kb, Ncc va ENaC transkriptlarining ortib borayotgan ifodasi postproksimal natriy reabsorbtsiyasida kompensatsion yuqori regulyatsiyani taklif qildi. Buyrak transkriptomasi va metabolomini kompleks tahlil qilish hujayra metabolizmi, lipid membrana tarkibi va redoks gomeostazi bilan bog'liq bo'lgan turli xil hujayra yo'llarida chuqur o'zgarishlarni aniqladi. cKOm sichqonlarining buyraklarida transkriptomning taxminan 8 foizi va aniqlangan metabolitlarning taxminan 24 foizi Ctrl sichqonlari bilan solishtirganda turli darajalarni ko'rsatdi. Kutilganidek, ushbu transkriptlar va metabolitlarning aksariyati peroksisomal funktsiya bilan bog'liq edi. Peroksizomalarda sintez qilinadigan efir fosfolipid plazmalogenlari ko'pligida keskin pasayish kuzatildi (cKOm sichqonlarida ~ 67 foiz va cKOf sichqonlarida ~ 50 foiz, barcha aniqlangan plazmalojen turlarining vaznsiz yig'indisi). Plazmalogenlar hujayra membranasining asosiy fosfolipidlari bo'lib, ko'payib borayotgan funktsiyalarga ega, jumladan membrana yaxlitligi, hujayra signalizatsiyasi va antioksidant himoya. Buyrakda plazmalogenlar umumiy fosfolipidlarning taxminan 20 foizini tashkil qiladi (17), bu shuni ko'rsatadiki, fosfolipid tarkibining kamida 10 foizi cKOm va cKOf sichqonlarining buyraklarida tegishli nazorat guruhidan farq qiladi. Plazmalogenlarning kamayishi potentsial ravishda tuzilish jihatidan o'xshash fosfatidiletanolaminlar (PE) va fosfatidilxolinlar (PC) ko'pligi bilan qoplandi, ular cKOm va cKOf sichqonlarining buyraklarida sezilarli boyitishni ko'rsatdi. Shunisi e'tiborga loyiqki, ZSD bilan og'rigan bemorlarning buyraklarida PE va shaxsiy kompyuterlarning shunga o'xshash kompensatsion o'sishi kuzatilgan (17).

Proksimal tubulaning metabolizmi asosan yog 'kislotalarining oksidlanishiga bog'liq bo'lib, u mitoxondriyalarda ham, peroksisomalarda ham hosil bo'lgan yuqori ROS avlodi bilan tavsiflanadi. cKO sichqonlarida yog 'kislotalarining parchalanishi/biosintezi bilan bog'liq yo'llar sezilarli darajada yuqori tartibga solingan, bu esa ushbu substratlardan mitoxondriyal energiya ishlab chiqarishning kompensatsion kuchayishini ko'rsatishi mumkin. Peroksisomalarning asosiy funktsiyalaridan biri ROSni detoksifikatsiya qilish bo'lganligi sababli, biz peroksisoma biogenezining ablatsiyasini induktsiya qilishini taxmin qildik.oksidlovchi stresscKO sichqonlarining buyraklarida. Biroq, molekulyar tahlillar antioksidant qobiliyati va oksidlovchi stressning biomarkerlaridagi o'zgarishlarni aniqlamadi. HFD bilan bog'liq muammo, siydik hajmining engil ko'payishi va cKOm sichqonlarida kaltsiy va uratning siydik bilan chiqishi bundan mustasno, funktsional fenotipda o'zgarishlarga olib kelmadi. Integratsiyalashgan transkriptom va metabolom tahlili glutation yo'lini peroksisomalar bo'lmagan buyrak proksimal tubula hujayralarida umumiy antioksidant quvvatni saqlash uchun mumkin bo'lgan kompensatsion mexanizm sifatida aniqlashga imkon berdi.

Pex5 ning xomilalik jigarda (12), oshqozon osti bezi hujayralarida (18) va markaziy asab tizimining turli xil hujayralarida (16-da ko'rib chiqilgan) shartli ravishda yo'q qilinishi o'zgaruvchan, lekin asosan jiddiy organlarga xos funktsional buzilishlarni keltirib chiqaradi. Buyrakda bunday bo'lmagan. Ushbu tadqiqotda biz peroksisomalar etishmasligi bilan kurashishga imkon beradigan bir nechta ichki buyrak mexanizmlarini aniqladik. Buyrak yuqori qon perfuziyasini ko'rsatadigan organ bo'lganligi sababli, buyrak peroksisomalar bo'lmaganda buyrak ishlab chiqarmaydigan, ammo buyrakning normal ishlashi uchun zarur bo'lgan metabolitlarning kamida bir qismining ekstrarenal kelib chiqishi boshqa imkoniyatdir. Umuman olganda, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, buyrak naychali peroksisomalar normal buyrak funktsiyasi uchun zarurdir va ZSD bilan og'rigan bemorlarning buyraklaridagi patofiziologik o'zgarishlar buyrakdan tashqari kelib chiqadi.

Usullari

Hayvonlar. Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre sichqonlarini yaratish uchun ishlatiladigan protseduralar avvalroq tasvirlangan (13). Ushbu tadqiqotda foydalanilgan 3 ta sichqoncha liniyasi C57BL/6J sichqonchasining genetik fonida yetishtirilgan inbred shtammlardir (Jekson Laboratoriyasi). Barcha tajribalardan oldin sichqonlar 12-soatlik yorug‘lik/12-soatlik qorong‘u aylanish davriga moslashtirildi. Barcha tajribalar ZT3 sirkadiyalik vaqtida amalga oshirildi (ZT{10}}chiroq yoqilgan vaqt, ZT12 esa chiroq o'chirilgan vaqt).

Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 uch transgenli erkak yoki urg‘ochi sichqonlar (cKOm va cKOf deb ataladi) va Pex5l/a sichqonlari (Ctrl yoki Ctrl deb ataladi) ishlatilgan. Yangi tug'ilgan chaqaloqlarda Pex5 rekombinatsiyasi homilador urg'ochi sichqonlarning 14-homiladorlik kunidan boshlab 2 hafta davomida ichimlik suviga 0,2 foiz DOX va 2 foiz saxaroza qo'shilishi bilan amalga oshirildi. Voyaga etgan sichqonlarda Pex5 rekombinatsiyasi uchun 8-haftalik sichqonlarning ichimlik suviga DOX va saxaroza qo‘shildi. Buyrak tuzilishi va funksiyasi 4-haftalik chaqaloq sichqonlari yoki 14-haftalik kattalar sichqonlarida DOX bilan davolash tugaganidan keyin 4 hafta o‘tgach baholandi. 3 haftalik sutdan ajratilgandan so'ng, sichqonlar 4,2 foiz yog' (Sniff past yog'li nazorat dietasi) yoki eslatib o'tilganda, 4 hafta davomida 20,7 foiz yog' (asosan LCFA) bo'lgan mos keladigan HFD bilan standart nazorat dietasi bilan oziqlangan.

Metabolik hujayralar va qon va siydik kimyosi. Sichqonlar alohida metabolik kataklarga joylashtirilgan (Tecniplast). Siydik to'plash 3-kunlik moslashuv davridan keyin amalga oshirildi. Siydik va qon kimyosi yuqorida tavsiflanganidek tahlil qilindi (19).Plazma va siydik tarkibi Laboratoire Central de Chimie Clinique, Center Hospitalier Universitaire Vaudoise universiteti kasalxonasida (Lozanna, Shveytsariya) o'lchandi.

Elektron mikroskopiya. Buyrak namunalari taxminan 1 mm³ bo'laklarga bo'linib, xona haroratida (RT) 2 soat davomida fosfat tamponida (PB, 0.1 M pH7.4) (MilliporeSigma) 2,5 foiz glutaraldegid eritmasida (EMS) mahkamlandi. Keyin ular PB buferida 3 marta, har biri 5 daqiqadan yuvildi va keyin RTda 2 soat davomida PBda 1,5 foiz kaliy ferrosiyanid (MilliporeSigma) bilan 1 foizli osmiy tetroksid (EMS) yangi aralashmasi bilan postfikslandi. Keyin namunalar distillangan suvda 3 marta yuvildi va aseton eritmasida (MilliporeSigma) darajali konsentratsiyalarda (30 foiz 90 daqiqa; 70 foiz 90 daqiqa; 100 foiz 120 daqiqa; 100 foiz 240 daqiqa) suvsizlandi. Shundan so'ng epon qatronida (MilliporeSigma) gradusli konsentratsiyalarda (Epon/aseton [1/3; v/v] 4 soat; Epon/aseton [3/1; h/v] 4 soat, Epon/aseton [1) infiltratsiyasi kuzatildi. /1;v/v] 8 soat; Epon/aseton [1/1; v/v] 24 soat) va nihoyat 48 soat davomida 60 daraja pechda polimerizatsiya. 50 nm ultra yupqa bo'laklar Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH) da kesildi va polistirol plyonkasi (MilliporeSigma) bilan qoplangan 2 × 1 mm (EMS) mis tirqish panjarasiga olindi. Bo'limlar 10 daqiqa davomida H, O 2 foizli uranil asetat (MilliporeSigma) bilan bo'yalgan, H, O bilan bir necha marta, keyin Reynolds qo'rg'oshin sitrati bilan 10 daqiqa davomida yuvilgan va H, O bilan bir necha marta yuvilgan.

Stereologiya. Stereologiyani tahlil qilish uchun 80 tezlashuv kuchlanishida transmissiya elektron mikroskopi (Philips CM100, Thermo Fisher Scientific) bilan tizimli bir xil tasodifiy tanlab olishdan foydalangan holda, sichqonchaning 3 ta buyrak korteksi bo'lagi tahlil qilindi, piksel o'lchami 4,08 nm bo'lgan namuna uchun 15 mikrografiya. TVIPS TemCam-F416 raqamli kamerasi (TVIPS GmbH) bilan kV.

Transkriptomik tahlil. Barcha ketma-ketlik maʼlumotlari NIH Gene Expression Omnibus (kirish raqami GSE179202) orqali hammaga ochiq. RNK-Seq kutubxonalari Nikolaeva va boshqalarda tasvirlanganidek 200 ng umumiy buyrak RNKsi yordamida tayyorlangan. (19). Illumina TruSeq SR Cluster Kit v4 reaktivlari ishlatilgan. Sekvensiya ma'lumotlari Mus musculus yordamida qayta ishlandi. GRCm38.86 gen izohi, Statistik tahlil R da amalga oshirildi (versiya 3.4.0). Kam sonli transkriptlar kamida 1 ta namunada million boshiga 1 hisob (CPM) qoidasiga muvofiq filtrlangan. Kutubxona o'lchamlari TMM normalizatsiyasi yordamida masshtablangan va voom (20) yordamida log-CPMga aylantirilgan. Asosiy komponent tahlili takroriy namunalar o'rtasida kichik o'zgaruvchanlikni ko'rsatdi. cKO va Ctrl sichqonlari orasidagi differentsial ifoda limma (21) yordamida 1 F testida hisoblab chiqilgan. P qiymatlari ta'riflanganidek (22) FDR qiymatlariga, erkaklar va ayollardagi barcha transkriptlarning natijalari yoki tanlangan tashuvchilar natijalari yoki faqat erkaklardagi peroksisomal bilan bog'liq transkriptlardan foydalangan holda bir nechta taqqoslashlarni hisobga olish uchun o'zgartirildi. FDR bilan transkriptlar<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

Metabolomik tahlil. Muzlatilgan buyrak namunalaridagi metabolitlar ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi-tandem massa spektroskopiyasi yordamida aniqlandi va AUC (Metabolon Inc) yordamida miqdori aniqlandi. Xom qiymatlar logga aylantirildi va xom maydonlarni hisoblash nuqtai nazaridan normallashtirildi. Ikki tomonlama ANOVA kontrast testlari ikkala jinsdagi cKO va Ctrl sichqonlari o'rtasida sezilarli darajada farq qiladigan biokimyoviy moddalarni aniqlash uchun ishlatilgan. P qiymatlari tavsiflanganidek (22) FDR qiymatlari va FDR bilan metabolitlarni ko'p taqqoslash uchun o'zgartirildi.<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

Birgalikda transkriptome-metabolom tahlili. MetaboAnalyst 5.0 veb-saytidagi (24) Qo'shma yo'llarni tahlil qilish moduli yordamida genlarni ifodalash va metabolomik tadqiqotlar natijasida olingan natijalarni birlashtirgan metabolik yo'lning integratsiyalashgan tahlili o'tkazildi. Metabolitlarning birikma nomi va transkriptlarning rasmiy gen belgisi sezilarli darajada ko'proq yoki kamroq (FDR)<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

Bo'yoqlar. 5 mkm qalinlikdagi ko'ndalang buyrak bo'laklarida global buyrak tuzilishi, kaltsiy oksalat konlari yoki neytral lipid cho'kmasining bo'yashlari amalga oshirildi. Neytral lipidlarni bo'yashdan tashqari, sichqonlar behushlik qilindi va ularning chap buyragi to'qimalarni yig'ishdan oldin qorin aortasi orqali 4 foizli paraformaldegid eritmasi bilan perfuziya qilindi. Buyrakning global tuzilishini tahlil qilish uchun parafinga o'rnatilgan buyrak bo'laklari deparafinizatsiya qilindi, regidratatsiya qilindi, H&E bilan bo'yaldi, suvsizlandi va ROTI Histokitt (Carl Roth GmbH) ga o'rnatildi. Neytral lipidlar OCT birikmasiga (Tissue-Tek) kiritilgan buyrak bo'laklarida Oil Red O eritmasi yordamida bo'yalgan. Kaltsiy oksalat konlari Pizzolato (25) tomonidan tasvirlangan usulga muvofiq bo'yalgan. Qisqacha aytganda, parafinga singdirilgan buyrak bo'laklari parafinsizlashtirildi va regidratatsiya qilindi, so'ngra 1: 1 nisbatda 5 foizli kumush nitrat va 30 foiz vodorod periks eritmasiga botirildi va 30 daqiqa davomida 60 Vt lampochka ostida joylashtirildi. Slaydlar distillangan suvda yaxshilab yuvilgan va yadroviy tez qizil (MilliporeSigma) bilan bo'yalgan, keyin o'rnatishdan oldin suvsizlangan.ROTI Histokitt. Kaltsiy oksalatli nefropatiya qo'zg'atuvchi dieta (1,5 foiz kaltsiy va 1,5 foiz gidroksiprolin 3 hafta davomida standart chovga aralashtirilgan) bilan davolangan sichqonning bo'ylama buyrak bo'laklari buyraklardagi kaltsiy oksalat konlarini ijobiy nazorat qilish vazifasini o'tadi. Natijalar Zeiss AxioScan.Z1 Slide Scanner yordamida 100 × yoki 200 × original kattalashtirishda tahlil qilindi.

ELISA va Trolox tahlili.4-HNE Abcam (ab238538) dan Lipid Peroksidlanish (4-HNE) Assay Kit yordamida o'lchandi. Jami va ferment bo'lmagan antioksidant imkoniyatlar Abcam (ab65329) dan Trolox tahlil to'plami bilan baholandi.

Statistika. Barcha ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi. Statistik testlar va ahamiyatlilik chegarasi rasm afsonalarida yoki tegishli usullar bo'limlarida tasvirlangan. Statistik tahlil R paketlari yoki GraphPad Prism dasturining 8.2.1 versiyasi yordamida amalga oshirildi. Barcha t-testlar 2 quyruqli edi.

O'qishni tasdiqlash. Hayvonlar bilan o'tkazilgan barcha tajribalar hayvonlarni parvarish qilish bo'yicha Shveytsariyaning hayvonlarni parvarish qilish bo'yicha ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi, ular hayvonlarni parvarish qilish milliy institutlari ko'rsatmalariga mos keladi va Shveytsariya kantonal (Kanton de Vod) va federal veterinariya organlari (DF uchun 31827 ruxsatnoma) tomonidan tasdiqlangan (Direction generale) de P'agriculture, de la viticulture et des affairs vetérinaires, Epalinges, Shveytsariya).

Oldin nashr etilgan: Ushbu ishning bir qismi Amerika Nefrologiya Jamiyatining 2021 yilgi yillik yig'ilishiga tezis sifatida taqdim etilgan (2021 yil 4-noyabr.https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021) /program-abstract.aspx?controlId=3605774).