Sitral o'z ichiga olgan efir moylari potentsial tirozinaza ingibitorlari sifatida: bio-boshqariladigan fraksiyalash yondashuvi
Mar 19, 2022
Aloqa: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Annotatsiya:
Haddan tashqari melanin ishlab chiqarish jiddiy dermatologik kasalliklarga, shuningdek, kichik estetik muammolarni keltirib chiqaradi (ya'ni, sepkillar va quyosh lentigo). Tirozinazaning regulyatsiyasi bu kabi kasalliklarni davolashda keng tarqalgan yondashuv bo'lib, o'simlik ekstraktlari ko'pincha qimmatli manbalar ekanligi isbotlangan.tirozinazaingibitorlar. Citral (neral va geranial aralashmasi) anti-tirozinaz salohiyatini ko'rsatadigan muhim xushbo'y tarkibiy qismdir. U Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. va Verbenaofficinalis L. efir moylarida (EO) yuqori darajada konsentratsiyalangan. Biroq, faqat L. cubeba EO uchun tekshirilgan. potentsial terini oqartiruvchi vosita sifatida foydalaning. Bu ish in vitro baholayditirozinazaushbu EO'larning inhibitiv faolligi va bio-assayga yo'naltirilgan fraksiyalashdan foydalangan holda tadqiqotlar, ularning turli xil kimyoviy tarkibi EO komponentlari o'rtasidagi mumkin bo'lgan sinergetik, qo'shimchalar va/yoki raqobatbardosh o'zaro ta'sirlar orqali umumiy EO inhibitiv faoliyatga ta'sir qiladimi yoki yo'qmi. C. schoenanthus EO va M. officinalis EO ning inhibitiv faolligi, arzimas (plyus)-sitronellal miqdori bilan ularning sitral tarkibiga mos edi. Boshqa tomondan, L. cubeba va V. officinalis EOlarni inhibe qiladitirozinazaUlarda umumiy EO faoliyatiga hissa qo'shgan -myrcene borligi sababli sezilarli darajada ko'proq. Xuddi shunday kuzatuvlar M. officinalis EO uchun ham olib borildi, uning tarkibida yuqori (plyus)-sitronellal moddasi mavjud bo'lib, bu sitral faollikni oshiradi.
Kalit so‘zlar:tirozinazainhibisyon; efir moylari; sitral
cistanche oqartiruvchi funktsiyaga ega
Kirish
Tirozinazabir qancha bakteriyalar, zamburug'lar, o'simliklar, hayvonlar va odamlarda melanin pigmentlarining biosintezidagi asosiy ferment hisoblanadi. Odamlarda tirozinaza melanin biosintetik yo'lidagi tezlikni cheklovchi bosqichlarni katalizlaydi. Ushbu biosintez L-tirozin teaminokislotasidan melanin hosil bo'lishiga olib keladigan bir nechta fermentativ va kimyoviy reaktsiyalar bilan tavsiflanadi, tirozinaza mikofenolat va difenollar orqali o-dopakinonga gidroksillanishini katalizlaydi. Melanogenezda ishtirok etadigan boshqa fermentlar bo'lsa-da, faqat tirozinaza bilan katalizlangan reaktsiyalar o'z-o'zidan sodir bo'lolmaydi, qolgan bosqichlar esa fiziologik pH da ferment faolligisiz davom etishi mumkin [1]. Shu sababli, tirozinazni pastga regulyatsiya qilish ortiqcha melaninni kamaytirishning juda keng tarqalgan usuli hisoblanadi. ishlab chiqarish va tirozinaza ingibitorlarini terini oqartiruvchi vositalar sifatida qo'llash klinik va kosmetik jihatdan muhim ahamiyatga ega ekanligini ko'rsatdi [2].
Yevropa Ittifoqi bozorida,tirozinazaTerini oqartiruvchi vositalar sifatida qo'llaniladigan ingibitorlarni ikkita asosiy toifaga guruhlash mumkin: Evropa Ittifoqi kosmetik reglamenti bo'yicha taqiqlanganlar1223/2009 (ya'ni, gidroxinon va monobenzil efir gidroxinon) jiddiy yon ta'siri tufayli, ammo ular hali ham tibbiyotda giperpigmentatsiyani davolashda qo'llaniladi. nazorat va kosmetika mahsulotlarida foydalanishga ruxsat berilgan tirozinaz inhibitörleri (ya'ni, arbutin, aloezin, kojik kislota) [2,3]. Biroq, bu ikkinchi guruh hali ham potentsial ahamiyatli yon ta'siri bilan tavsiflanadi; kojik kislotasi bo'yicha klinik tadqiqotlar haqiqatan ham qo'llashdan keyin eritema, qichishish hissi va kontaktli ekzema holatlarini ta'kidladi. Shunga o'xshab, iste'molchilar xavfsizligi bo'yicha Evropa ilmiy qo'mitasi gidroxinonni chiqaradigan glikozid birikmasining potentsial gidrolizi tufayli arbutinalarni kosmetik tarkibiy qism bo'lgan [2] ishlatish bilan bog'liq xavotirlarni ko'tardi. Shuning uchun giperpigmentatsiyani davolash uchun yangi molekula shablonlari va/yoki bioaktiv birikmalarning aralashmalariga ehtiyoj bor.
O'simliklar terini oqartiruvchi vositalarning qimmatli manbalari bo'lib, tibbiy va kosmetik jihatdan eng ko'p qo'llaniladigan beshtadan uchtasi o'simlikka ixtisoslashgan metabolitlar (ya'ni, gidroxinon, -arbutin, aloezin) bo'lgan. Bugungi kunga kelib, fenolik birikmalar asosan potentsial sifatida o'rganilgantirozinazaingibitorlar va bularga flavonoidlar (masalan, quercetin [4]), stilbenlar (masalan, resveratrol [1]), fenilpropanoidlar (masalan, sinnamaldegid [5] va evgenol [6]) va fenolik kislotalar (masalan, anis kislotasi va benzoy kislotasi [7]). Forterpenoidlarga bo'lgan qiziqish ancha past bo'lgan va ular tirozinazaga qarshi vositalar sifatida nisbatan kam o'rganilgan.
Citral o'rganilgan anti-tirozinaz xususiyatlarga ega cheklangan miqdordagi terpenoid hosilalari qatoriga kiradi. Bu ikki izomer, cis- va trans-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (ya'ni, neral va geranial) aralashmasi bo'lib, ular blokirovka qilishlari isbotlangan. qo'ziqorinning in vitro fermentativ faolligitirozinaza[8]. Ichimliklar, oziq-ovqatlar va kosmetika mahsulotlarining hidli tarkibiy qismi sifatidagi ahamiyatiga qo'shimcha ravishda, sitral in vitro biologik faollikni, jumladan, qo'ziqorinlarga qarshi, bakteriyaga qarshi, antioksidant va yallig'lanishga qarshi ta'sirlarni ko'rsatdi [9-11]. Bundan tashqari, so'nggi tadqiqotlar sitral silliq mushaklarni bo'shashtiruvchi va mahalliy og'riqsizlantiruvchi vosita sifatida potentsial terapevtik ahamiyatga ega ekanligini ta'kidladi, chunki u traxeya, bachadon va aorta silliq mushaklarining bo'shashishiga yordam beradi va hayvonlar modellarida asab qo'zg'aluvchanligini inhibe qiladi [12-15].
Citral bir nechta botanika turlarining efir moylaridan (EO) olinadi, jumladan Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. va Verbena officinalis L. Mualliflarning eng yaxshisi uchun. bilim, faqat L. cubeba EO hasbeed uchun tergovtirozinazainhibitiv faoliyat [16]. Shu sababli, ushbu tadqiqot C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis va V.officinalis EO ning tirozinaz inhibitör faolligini turli xil kimyoviy birikmalarning umumiy EO inhibitiv faolligiga ta'sir qilish yoki yo'qligini baholash uchun in vitro kolorimetrik tahlil yordamida baholashga qaratilgan. ularning tarkibiy qismlari o'rtasidagi mumkin bo'lgan sinergetik, qo'shimcha va / yoki raqobatbardosh o'zaro ta'sirlar. Ushbu tadqiqot tirozinazning qo'ziqorin manbasiga qarshi EO inhibitör faolligiga hissa qo'shadigan EO tarkibiy qismlari va ularning enantiomerlarini har tomonlama baholash uchun abioassay asosidagi fraksiyalash usulidan foydalanadi, bu esa dastlabki skrining uchun yaxshi namunaviy tizimdir.tirozinazaingibitorlar [17].
2. Natijalar va muhokama
2.1. O'rganilayotgan efir moyining kimyoviy tarkibi va sitral tarkibi
Ko'rib chiqilgan biologik faollikka hissa qo'shadigan barcha potentsial EO komponentlarini har tomonlama tavsiflashga urinishimizda, tekshirilgan EOlar FID va MSni aniqlash bilan GC tomonidan tahlil qilindi. Barcha aniqlangan birikmalarning me'yorlashtirilgan nisbiy foiz ko'pligi (javob faktorlari [18,19] yordamida C13 ichki standartiga normallashtirilgan mutlaq maydonlardan hisoblangan) aniqlangan va EO kompozitsiyalarini solishtirish uchun ishlatilgan. 1-rasmda an'anaviy ustun bilan tahlil qilingan tekshirilgan EOlarning GC-MS profili ko'rsatilgan. 1-jadvalda har bir tekshirilgan EO uchun 0.1 dan yuqori bo'lgan normallashtirilgan foiz ko'pligini ko'rsatadigan birikmalar ro'yxati keltirilgan, shu bilan birga to'liq EO kimyoviy tarkibi Qo'shimcha materiallarda (S1-S5 jadvallari) xabar qilingan.
Barcha tekshirilgan EOlar neral (cis{0}},7-dimetil-2,6-oktadienal) va geranial (trans-3,{)ga boy. {5}}dimetil-2,6-oktadienal), ular eng koʻp uchraydigan birikmalardir. Teneral/geranial nisbat barcha tekshirilgan EO'larda juda o'xshash edi va 0.74 ± 0,05 ga to'g'ri keldi. C. schoenanthus va L. cubeba EO eng yuqori neral va geranial tarkibni ko'rsatadi, bu ularning butun EO tarkibining o'rtacha 60 foizini tashkil qiladi va bu V. officinalis EO va undan 1.5-baravar ko'p. uchta M. officinalis EO (ya'ni, Namuna 1, 2 va 3). Barcha EO'lar uchun umumiy bo'lgan qo'shimcha kislorodli birikmalar 6-metil{19}}gepten-1-bir, linalool va sitronellaldir. Ikkinchisi M. officinalis EO 1 dan boshqa tekshirilgan EO larga, jumladan M. officinalis EO2 va 3 ga qaraganda ancha ko‘p.
Uglevodorod fraktsiyasining ko'pligi turli EO.Mlarda sezilarli darajada farq qiladi. officinalis EO 1 tarkibida seskiterpen gidrokarbonlar sifatida faqat trans{1}}kariofillen va -gumulen mavjud bo‘lib, ular umumiy EO ning mos ravishda 2,7 va 0,13 foizini tashkil qiladi. C.schoenanthus EO M. officinalis EO 1 ga qaraganda bir oz boyroq uglevodorod fraktsiyasini taqdim etadi (ya'ni, 7,0 foiz), har ikkala monoterpenni (ya'ni, kamfen, sis{{1{{20) o'z ichiga oladi. }}}}otsimen, limonen, -pinen, trans{12}}otsimen, -tujen) va seskiterpenlar (ya'ni, trans{14}}kariofillen, -kadinen, d-kadinen, germakren D, -elemen) o'rtacha darajada miqdor. L. cubeba va V.officinalis EOlarida uglevodorod fraktsiyasi umumiy EOning 20 foizini tashkil qiladi va limonen eng koʻp tarqalgan birikma (yaʼni, mos ravishda 15,0 va 10,9 foiz), undan keyin -pinen, pinen. , sabinen, trans{24}}kariofillen, -mirsen, kamfen va -kopaen. Nihoyat, M.officinalis EO 2 va 3 eng yuqori uglevodorod fraktsiyasi bilan tavsiflanadi (jami EOning mos ravishda 38,8 va 31,8 foizi). Ikkala namunada ham uglevodorod fraktsiyasi asosan seskiterpenlarni, ya'ni trans{33}}kariofilin (mos ravishda 27,8 va 20,0 foiz) va -gumulenni (3,0 va 2,6 foiz) va asosan limonen bilan tavsiflangan monoterpen fraktsiyasini o'z ichiga oladi. mos ravishda 4,2 va 3,2 foiz).
Turli yillarda ishlab chiqarilgan L. cubeba, V. officinalis va C. schoenanthus Eosning uchta namunasi, shuningdek, turli ishlab chiqarishlardan M. officinalis EO ning uchta namunasi oʻrganildi. C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis va V. officinalisning GC-MS tahlillari turli ishlab chiqarish yillaridagi uchta namunaning kimyoviy tarkibida sezilarli sifat va miqdoriy farqlarni aniqlamadi. Bu optimal saqlash sharoitlari bilan bog'liq bo'lishi mumkin, ya'ni qorong'uda 4 ◦C haroratda sarg'ish shisha idishda bosh bo'shlig'i ahamiyatsiz. Boshqa tomondan, GC-MS tahlillari sitronellal va trans{{4} ko'pligida sezilarli farqlarni ko'rsatdi. }} karyofillen uchta tekshirilgan M. officinalis EO. M. officinalis EO 1, 2 va 3 da sitronellalar mos ravishda 19,6 foiz, 0,26 foiz va 0,31 foizga yetdi. Aksincha, yuqorida aytib o'tilganidek, trans{14}}kariofillen M. officinalis EO 2 va 3 da M. officinalis EO 1 ga qaraganda ancha ko'p. Bu natijalar Seidler-Lozykawska va boshq. Evropa botanika bog'laridan kelib chiqqan 22 tanlangan M. officinalis genotiplaridan olingan EOlarda sitral, sitronellal va trans{19}}kariofillen miqdoridagi sezilarli farqlarni ta'kidlagan [20].
Potensial bioaktiv ixtisoslashgan birikmalar (ya'ni, neral, geranial, limonen, -mirsen va sitronellal) ko'pligini aniq baholash uchun tashqi standart kalibrlash orqali haqiqiy miqdor o'tkazildi. 2 va 3-jadvallarda SIM-karta uchun ishlatiladigan diagnostik ionlar (m/z) ko'rsatilgan. Tekshirilayotgan marker birikmalarining MS miqdori, mos ravishda kalibrlash diapazoni, kalibrlash egri tenglamasi, korrelyatsiya qiymatlari va har bir tahlil qiluvchi moddaning regressiya standart xatosi va miqdorlashtirish natijalari bilan birga.
2.2. Qo'ziqorin tirozinazasiga qarshi o'rganilayotgan efir moylarining in vitro inhibitör faolligi
Yuqorida aytib o'tilganidek, C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba va V.officinalisning EO'lari tirozinazning qo'ziqorin manbasiga qarshi raqobatbardosh bo'lmagan inhibitiv faollik bilan tavsiflangan yuqori darajadagi sitralni taqdim etadi [8,16,21] . Ushbu tadqiqot in vitroni tekshirishga qaratilgantirozinazaUshbu EOlarning inhibitiv faolligi ularning faqat sitral tarkibiga bog'lanishi mumkinmi yoki EOlarning inhibitiv ta'siriga ta'sir qiluvchi boshqa bioaktiv birikmalar mavjudligini o'rganish uchun.
Qo'ziqorintirozinazaBu erda uning gumantirozinazaga yuqori o'xshashligi, nisbatan arzonligi va tayyor mavjudligi tufayli qabul qilingan, bu esa uni tirozinaz inhibitörlerini dastlabki skrining uchun yaxshi model tizimiga aylantiradi [17]. In vitroning aniqligitirozinazainhibisyon testi takrorlanuvchanlik (bir kunda besh marta fermentativ inhibisyon tahlilini o'tkazish orqali) va oraliq aniqlik (alti oy davomida har to'rt haftada besh marta fermentativ inhibisyon tahlilini takrorlash orqali) nuqtai nazaridan baholandi. 4-jadvalda ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan kojik kislota va L. cubeba EO bilan o'tkazilgan inhibisyon testlari uchun o'zgaruvchanlik koeffitsienti (CV) ko'rsatilgan. Natijalar qoniqarli bo'ldi, chunki rezyume hech qachon takrorlanuvchanlik uchun 7 foizdan va oraliq aniqlik uchun 10 foizdan oshmagan. 4-jadvalda ijobiy nazorat sifatida ishlatiladigan kojik kislota va L. cubeba EO bilan o'tkazilgan inhibisyon testlari uchun o'zgarish koeffitsienti ko'rsatilgan. Xuddi shunday aniqlik qiymatlari barcha sinovdan o'tgan EO uchun olingan.
Sitral kontsentratsiyasi-javob egri chizig'i reaktsiya aralashmasidagi kontsentratsiyasining funktsiyasi sifatida kuzatilgan inhibitiv faollikni chizish orqali o'rganildi. Barcha EOlar 166,7 µg/ml konsentratsiyada sinovdan o‘tkazildi, bu EO dan qat’i nazar, kontsentratsiyaga javob egri chiziqlilik diapazonida (y=0,3956x plyus 1,8094,R{{7}) natijada sitral kontsentratsiyani ta'minladi. },9951, regressiya xatosi: 2,08448, chiziqlilik diapazoni: 6,7–166,7 µg/ml) va reaksiya aralashmasida eruvchanlik muammosini keltirib chiqarmadi.
2-rasmda keltirilgan quti grafigi foizni ko'rsataditirozinazaHar bir EO uchun inhibisyon. L. cubeba, V. officinalis va C. schoenanthus EO uchun 2-rasmda ko‘rsatilgan natijalar 2020-sonli EO’larning qo‘ziqorin tirozinazasini inhibe qiluvchi faolligiga to‘g‘ri keladi, chunki dispersiya tahlili turli EO’lar o‘rtasida statistik jihatdan muhim farqlarni aniqlamadi. ishlab chiqarish yillari (p > 0,05). L. cubeba va C. schoenanthus EOlariga kelsak, bu natijalar GCMS miqdoriy tahlillari natijasida olingan natijalar bilan yaxshi mos keladi, bu esa turli ishlab chiqarish yillaridagi EOlarda deyarli bir xil sitral miqdorini aniqladi. V. officinalis EO ning 2020 partiyasi 2019 va 2018 yillardagi partiyalarga qaraganda bir oz ko‘proq sitral miqdorini o‘z ichiga oladi. Biroq, sitral konsentratsiya-javob egri chizig‘iga ko‘ra, 2020 partiyasidagi sitral ortiqcha tasodifiy fermentativ inhibisyonning statistik jihatdan sezilarli darajada yuqori foizini aniqlash uchun etarli emas. o'lchovlar bilan bog'liq xato. Qo'shimcha ma'lumot uchun Qo'shimcha materialdagi S1-rasmga qarang. Boshqa tomondan, dispersiya tahlili (ANOVA) va Tukey-Kramer post-xoktesti shuni ko'rsatdiki, turli ishlab chiqaruvchilar tomonidan taqdim etilgan uchta sinovdan o'tgan M. officinalis EO qo'ziqorinni inhibe qilgan.tirozinazaturli darajada, ular keyingi paragraflarda batafsil tavsiflanadi. Eng katta inhibitiv faoliyat L.cubeba, M. officinalis 1 va V. officinalis EO'larida kuzatildi, ular 59 ± 6 foiz, 55 ± 7 foiz va 52 ± 6 foizni inhibe qildi.tirozinazafaolligi, mos ravishda, 166,7 mkg/ml konsentratsiyada sinovdan o'tkazilganda. Enzim inhibitiv faolligi 42 ± 5 foiz, 40 ± 5 foiz va 38 ± 6 bo'lgan C. schoenanthus va M.officinalis 2 va 3 ning EO'lari uchun statistik ahamiyatga ega (p < 0.05)="" pastroq="" faollik="" kuzatildi.="" mos="" ravishda="" foiz.="" 5-jadvalda="" har="" bir="" tekshirilayotgan="" ingibitor="" (ya’ni,="" eo,="" yagona="" birikmalar="" va="" kojik="" kislota)="" uchun="" berilgan="" eksperimental="" sharoitlarda="" (ic50)="" ferment="" faolligini="" ikki="" baravar="" kamaytirgan="" inhibitor="" konsentratsiyasi="" keltirilgan.="" barcha="" eo="" qo'ziqorin="" tirozinazasini="" samarali="" ravishda="" inhibe="" qildi="" va="" ijobiy="" nazorat="" sifatida="" ishlatilgan="" kojikatsiddan="" o'rtacha="" 100-barabar="" pastroq="" bo'lgan="" inhibitiv="" faollikni="">
2.3. 3-rasmda keltirilgan gistogrammada eksperimental o'lchangan enzimatik tormozlanishlar foizi neral va geranial (yig'indisi, ya'ni sitral) bo'lsa, kutilgan qiymatlar bilan taqqoslanadi. faqat tekshirilayotgan EOdagi faol birikmalar. Ushbu qiymatlar sitral konsentratsiya-javob egri chizig'idan interpolyatsiya orqali o'lchandi. Ta'kidlab o'tilganidek, C. schoenanthus, M. officinalis 2 va M. officinalis 3 sitral tarkibiga mos keladigan inhibitiv faollikni namoyon etgan, L. cubeba, M. officinalis 1 va V. officinalis EO qo'ziqorinni inhibe qilgan. tirozinaz kutilganidan ko'proq darajada. Sitral faolligiga hissa qo'shadigan qo'shimcha birikmalarni aniqlash uchun bio-boshqariladigan yondashuv qabul qilindi. L. cubeba, M. officinalis 1 va V. officinalis EO ning kislorodli va uglevodorodli fraksiyalari flesh-xromatografiya usulida ajratib olingan va ularning qo‘ziqorini uchun alohida tekshirilgan.tirozinazainhibitiv faoliyat. Fitokimologik fraktsiyalar qo'ziqorin tirozinazini inhibe qiluvchi faoliyati uchun sinovdan o'tkazildi. Fraksiyalarning fitokimik fraksiyalari 166,7 mkg/ml tegishli EO ni sinovdan o‘tkazishda hosil bo‘lgan konsentratsiya bilan bir xil konsentratsiyada sinovdan o‘tkazildi (3.2-bo‘limdagi Materiallar va usullar bo‘limiga qarang). 6-jadvalda neral, geranial, sitronellal, limonen, va fraksiyalangan EOlarning kislorodli va uglevodorodli fraktsiyalarida -mirsen.
L. cubeba va V. officinalis EOlariga kelsak, kislorodli va uglevodorod fraksiyalari har xil darajada bo‘lsa-da, qo‘ziqorin tirozinazasini inhibe qilgan. Kislorodli fraksiyalarning faolligi (mos ravishda 53 ± 3 foiz va 44 ± 5) EOsanti-oksidning katta qismini tashkil qiladi.tirozinazapotentsial va tegishli sitral tarkibiga mos edi, bu sitral faolligiga hissa qo'shadigan birikmalar uglevodorod fraktsiyalariga tegishli ekanligini ko'rsatadi. L. cubeba va V. officinalis EO ning uglevodorod fraktsiyalari juda o'xshash kimyoviy tarkibga ega. Limonen (mos ravishda 68,4 va 50,3 foiz), trans{5}}kariofilin (mos ravishda 12,0 va 7,8 foiz), -pinen (mos ravishda 1,7 va 7,5 foiz), -pinen (mos ravishda 2,5 va 12,9 foiz), sabinen (mos ravishda 2,7 va 3,8 foiz) va -mirsen (mos ravishda 2,0 va 2,4 foiz) ikkala fraksiyada ham eng ko‘p uchraydigan birikmalar bo‘lib, bir-biriga o‘xshash miqdorda mavjud. V. officinalis EO uglerod fraktsiyasida ustunlik qiluvchi -pinen va -pinen.
The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>Har ikkala EOda 99 foiz), limonen (L. cubeba va V. officinalis EO da mos ravishda 97 va 94 foiz) va sabinen (har ikkala EOda 87 foiz), -pinen ((-)- uchun esa har xil enantiomerik ortiqchalik kuzatilgan. enantiomer: L. cubebaEOda 38 foiz va V. officinalis EOda 73 foiz) va -pinen ((-)-enantiomer: L. cubeba EOda 67 foiz va V. officinalis EOda 88 foiz). Ikkala EOda (-)-limonen butun fraksiyaning 50 foizidan ko'prog'ini tashkil qiladi. Biroq, oldingi tadkikotlar qo'ziqorin tirozinazasining yuqori ko'pligi tufayli inhibitiv faollik haqida xabar bergan bo'lsa-da, [22,23], (-)-limonen bu erda tirozinaza inhibitiv faolligini ko'rsatmadi. Shunga o'xshash natijalar ( plus )-limonen, rasemik aralashma va (-)-trans{24}}kariofillen, (±)- -pinen va (±){26}}pinen birikmalari uchun olingan. . Sabinene sinovdan o'tkazilmadi, chunki uning ahamiyatsiz qo'ziqorin borligi allaqachon isbotlangantirozinazainhibitiv ta'sir qiladi [8]. Oldingi topilmalar [8] bilan kelishilgan holda, mirsen qo'ziqorin tirozinaza faolligini kamaytirdi. 166,7 mkg/ml L. cubeba va V. officinalis EOlarda kuzatilgan konsentratsiyada sinovdan o‘tkazilganda, -mirsen faolligi, agar sitral yagona faol birikma bo‘lsa va eksperimental natijalar bo‘lsa, EOlarning kutilgan inhibitiv ta'siri o‘rtasidagi farqni yo‘qotdi. Matsuura va boshqalarning kuzatishlaridan farqli o'laroq. [8], -myrcene sitraldan ko'ra kuchliroq qo'ziqorin tirozinaz inhibitori ekanligini isbotladi, chunki uning IC50 darajasi deyarli o'n baravar past edi (13,3 µg/ml ga nisbatan 121,8 µg/ml). Bu farq ishlatilgan turli substratlarga bog'liq bo'lishi mumkin; Matsuura va boshqalar. faqat qo'ziqorin tirozinaz difenolaza faolligini o'rgandilar, chunki ular L-DOPA dan substrat sifatida foydalanganlar, bu ishda esa L-tirozin ishlatilgan. Hozirgi topilmalar shuni ko'rsatadiki, -mirsen qo'ziqorin tirozinaza monofenolaza faolligini difenolazadan ko'ra samaraliroq inhibe qiladi.
M. officinalis EO 1 kichik uglevodorod fraktsiyasini ko'rsatadi, bu umumiy miqdorning 3% dan kamrog'ini tashkil qiladi va tirozinazni inhibe qiluvchi faollikka ega emas. Biroq, M. officinalisEO 1 kislorodli fraktsiyasi qo'ziqorin tirozinazasini uning sitral tarkibidan kutilganidan ko'ra ko'proq darajada inhibe qildi (3-rasm). Bu fraksiya neral va geranialga qo'shimcha ravishda sezilarli miqdorda sitronellalni o'z ichiga oladi va chiral tahlil sitronellalning yuqori antiomerik tozaligini (plyus) enantiomer (98,3 foiz) foydasiga aniqladi. Mustaqil ravishda sinovdan o'tkazilganda, 166,7 mkg/ml konsentratsiyada (plyus )-sitronellal qo'ziqorin tirozinazni arzimas darajada inhibe qildi, garchi uning faolligi sitral bilan birgalikda tekshirilganda sezilarli darajada yaxshilangan. Ushbu natijalar qo'ziqorin foizlarida kuzatilgan farqlarni tushuntirishi mumkintirozinazaturli M. officinalis EOlarda inhibisyon. M.officinalis EO 2 va 3 juda kam sitronellal tarkibiga ega, bu ularning inhibitiv faolligi M. officinalis EO 1 dan sezilarli darajada past bo'lishining sababi bo'lishi mumkin.
3. Materiallar va usullar
3.1. Reaktivlar
Dimetil sulfoksid (DMSO), Agaricus bisporus (JE Lange)Imbachdan qo'ziqorin tirozinazasi, L-tirozin, kojik kislota, sitral, sitronellal, -mirsen, ( plus )-limonen, (-)-limonen, (±)-limonen, ( ±)- , va pinen Merck Life Science Srl (Milan, Italiya) dan sotib olingan. Litsea cubeba, Verbena officinalis va Cymbopogon schoenanthus EO'lar Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Italiya) tomonidan yetkazib berildi. Har biri uchun turli yillardagi uchta partiya (ya'ni, 2020, 2019, 2018) sinovdan o'tkazildi. Melissa officinalis EO ning uchta namunasi tekshirildi; biri Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), biri ErboristeriaMagentina Srl tomonidan taqdim etilgan, oxirgisi esa mahalliy do'kondan sotib olingan va SpecchiasolS.rl (Bussolengo, Italiya) dan olingan. Matnda mualliflar Melissaofficinalis ning turli EOlarini mos ravishda M. officinalis EO 1, 2 va 3 deb atashadi. Taqdim etilgan EOlar Yevropa farmakopeyasi [24] da tavsiflangan protseduralar asosida olingan. Melissa officinalis va Verbena officinalis EOlar navbati bilan barglar va o'simliklarning havo qismlaridan gidrodistillash yo'li bilan ishlab chiqarilgan; xuddi shunday, Litsea cubeba va Cymbopogon schoenanthus EO'lar mos ravishda yangi mevalar va yangi havo qismlarini bug'da distillash orqali olingan. Har bir EO tegishli ishlab chiqaruvchi tomonidan sotib olingan/ta'minlangan zahoti, har bir saqlash yili va uning qo'ziqorin tirozinaz inhibitör faolligini o'rganishdan oldin GC-MS tomonidan alohida tahlil qilingan.
3.2. In vitro tirozinazni inhibe qiluvchi tahlil
ThetirozinazaEO va izolyatsiya qilingan birikmalarning inhibitiv faolligi in vitroda Zengh va boshqalar tomonidan optimallashtirilgan kolorimetrik o'qishga asoslangan ferment tahlili yordamida tekshirildi. [25], ozgina o'zgartirishlar bilan. Zengh va boshqalar tomonidan optimallashtirilgan kolorimetrik o'qishga asoslangan ferment tahlili yordamida EO'larning tirozinazni inhibe qiluvchi faolligi, shuningdek, ularning tegishli uglevodorod va kislorodli fraktsiyalari va sof birikmalari vitrozada tekshirildi. [25], engil o'zgartirishlar bilan: tahlil xona haroratida vatirozinazaInhibisyon 20 minutdan keyin emas, balki 6 daqiqadan so'ng inkubatsiyadan keyin nazorat va namunaning absorbsiyasini hisobga olgan holda o'lchandi, bu enzimatik reaksiyaning chiziqli qismi ostida ishlaydi, bu esa aniqroq inhibisyon natijalarini beradi [26,27]. Ushbu tadqiqot uchun Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach qo'ziqorini tirozinaz tanlangan. Substrat sifatida L-tirozin ishlatilgan, ya'ni tirozinaza monofenolaza va difenolaza faolligi farqlanmasdan umumiy tirozinazni inhibe qiluvchi faolligi tekshirilgan. 475 nm da fotometrik o'lchovlar Thermo-spektronik Genesys6 da amalga oshirilgan va ijobiy nazorat inhibitori sifatida kojik kislota ishlatilgan. Tekshirilayotgan potentsial inhibitorlarning eritmalari (EO, EO izolyatsiya qilingan fraktsiyalar, EO individual birikmalari va kojikatsid) DMSOda tayyorlangan. 7-jadvalda har bir tekshirilgan potentsial inhibitor uchun sinovdan o'tgan konsentratsiyalar ko'rsatilgan. Qo'ziqorintirozinaza200 U/ml (27,9 mkg/ml) eritma natriy fosfat tamponida (pH 6,8) tayyorlandi va 9 ml lik alikvotlar -18 ◦C haroratda saqlangan va tajribalar oldidan eritilgan. Tirozin eritmasi 0,1 mg/ml natriy fosfat tamponida (pH 6,8) tayyorlangan va har kuni yangilangan. Reaksiya aralashmasi komponentlari flakonga quyidagi tartibda joylashtirildi: 1 ml qo'ziqorin tirozinaz eritmasi 200 U/mL; 1 ml natriy fosfat bufer eritmasi; 10 µL EO/bitta funt/kojik kislota eritmasi; va nihoyat, 1 ml tirozin eritmasi 0,1 mg/ml. Reaksiya aralashmasidagi yakuniy DMSO ulushi 0,3 foizni tashkil etdi. Tahlil EO komponentlarini atrofdagi muhitga yo'qotmaslik va ularning reaktsiya aralashmasi ustidagi bosh bo'shlig'iga chiqishini minimallashtirish uchun muhrlangan 4 ml flakonda o'tkazildi. Reaksiya aralashmasi termostatik suv hammomida 25 ◦C da 6 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, 475 nm da absorbans qayd etildi, chunki bu to'lqin uzunligi dopaxromni aniqlashga imkon beradi. Tirozinaza faolligining 100 foiziga mos keladigan absorbans EO/individual birikma/kojik kislota eritmasini 10 µL sof DMSO bilan almashtirish orqali o‘lchandi. Bo‘sh eritmalar quyidagicha tayyorlangan: 2 ml natriy fosfat bufer eritmasi, 10 mL EO/individual birikma / kojik kislota / DMSO eritmasi va 1 ml tirozin eritmasi 0,1 mg / ml. Tirozinaza inhibisyonining foizi quyidagi tenglama bo'yicha o'lchandi: foiz Inhibisyon=∆A (Nazorat) − ∆A (Namuna) / ∆A (Nazorat) × 100,∆A (Nazorat) yoki (Namuna) {{ 33}} A475 (Boshqaruv) yoki (Namuna) − A475 (Boshqaruv bo‘sh) yoki (Namuna bo‘sh).
3.3. Flash ustunli xromatografiya
EO fraksiyalash UV va ELSD detektorlari bilan jihozlangan Sepachrom (Rho, Milan, Italiya) tomonidan PuriFlash450 flesh ustunli xromatografiya tizimida amalga oshirildi. Fraksiyalangan EO miqdori: 900,0 mg. Statsionar faza: sferik silikagel zarralari, 50 mkm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Statsionar) Sepachromdan olingan; mobil faza: neft (A) va etil asetat (B); oqim tezligi 25 ml/min. Chiziqli gradient elyusiyasi 20 daqiqa davomida A ning 100% dan 80% gacha va B ning 20% gacha qabul qilindi.
3.4. Tahlil qilish shartlari
EO eritmalari va ularning tegishli fraksiyalari siklogeksanatda 5.0 mg/ml konsentratsiyada tayyorlangan va GC-MS tomonidan tahlil qilingan. Tsitral, sitronellal, -mirsen va limonen har bir EO va tegishli ajratilgan fraktsiyalarda tashqi standart kalibrlash usuli yordamida miqdori aniqlandi. Tegishli kalibrlash darajalari insikloheksan tayyorlandi va GC-MS tomonidan tahlil qilindi. Tridekan (C13) 1.0 mg/ml tahlil qiluvchi signallarni normallashtirish uchun ichki standart sifatida ishlatilgan. 2-jadvalda har bir miqdoriy birikma uchun ko'rib chiqilgan konsentratsiya oralig'i jamlangan.
GC-MS tahlillari Agilent 6890 N GC va ChemStation Version E bilan jihozlangan 5975 MSD va ulangan Gerstel MPS-2 ko‘p maqsadli namuna oluvchi (Mülheim an der Ruhr, Germaniya) yordamida amalga oshirildi. 02.02.1431 ma'lumotlarni qayta ishlash tizimi (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, AQSH). GC shartlari: injektor harorati: 250 ◦C; in'ektsiya rejimi: bo'linish; nisbat: 1/20; tashuvchi gaz: geliy; doimiy oqim tezligi: 1 ml / min; ustunlar: Mega5 (95 foiz polidimetilsiloksan, 5 foiz fenil) df 0,25 mkm, doimiy oqim 0,25 mm, uzunligi 25 m, MEGA (Legnano, Italiya). Harorat dasturi: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C(5 min). MSD shartlari: EI rejimida ishlaydigan MS (70 eV); skanerlash diapazoni: 35 dan 350 amugacha; yashash vaqti 40 ms; ion manbai harorati: 230 ◦C; to'rt kutupli harorat: 150 ◦C; uzatish liniyasi harorati: 280 ◦C. EO markerlari ularning C{32}}C25 uglevodorod aralashmasi bilan hisoblangan chiziqli ushlab turish indekslarini (IT) va ularning massa spektrlarini haqiqiy namunalar yoki sotuvda mavjud boʻlgan masspektral kutubxonalar bilan solishtirish orqali aniqlandi (Adams, 2007). EO xiral tahlillari 2,3-di-O-metil-6-Ot-butildimetilsilil- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 mkm, to'g'ridan-to'g'ri DCda bir xil tahlil shartlarini qabul qilish orqali amalga oshirildi. MEGA dan 0,25 mm, uzunligi 25 m. Harorat dasturlari: 40 ◦C(1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).
Xuddi shu asbobda GC-FID tahlillari o'tkazildi. GC shartlari: injektor harorati: 250 ◦C; in'ektsiya rejimi: bo'linish; nisbat: 1/20; tashuvchi gaz: vodorod; oqim tezligi: 1 ml/min. Harorat dasturlari: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).
4. Xulosalar
Ushbu tadqiqotning maqsadi (1) in vitromoshroomni har tomonlama tekshirish editirozinazaCymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis va Verbena officinalis EOlarning inhibitiv faoliyati va (2) ularning biologik faolligi faqat sitral tarkibiga bog'liqligini yoki tekshirilayotgan biologik faollikka hissa qo'shadigan qo'shimcha bioaktiv monoterpenlar mavjudligini aniqlash uchun. bioassay-boshqaruv fraksiyalash yondashuvi. Ushbu tadqiqot L. cubeba va V. officinalis EO'larida -mirsen oz miqdorda bo'lishiga qaramay, EO inhibitör faolligiga hissa qo'shishini aniqladi va u sitralga nisbatan ko'proq inhibitiv kuchga ega ekanligi ko'rsatilgan. Ikkinchi asosiy topilma (plyus) - sitronellal sitral qo'ziqorinni kuchaytirditirozinazatormozlovchi kuch, potentsial visinerjistik o'zaro ta'sir, chunki u o'z-o'zidan faollik ko'rsatmaydi. Oxirgi topilma nima uchun arzimas (plyus)-sitronellal miqdorini o'z ichiga olgan M. officinalis EO'larda inhibitiv faollik ularning sitral tarkibiga mos kelishini, aksincha M. officinalis EO uchun nisbatan yuqori (plyus)-sitronellal ko'pligini tushuntirdi. Garchi mirsen va sitral va sitronellal va sitral o'rtasidagi o'zaro ta'sirlarning turini aniq aniqlash va bu EO'lar va individual birikmalarning inson organizmiga inhibitiv faolligini baholash uchun hali ham keyingi tadqiqotlar talab etiladi.tirozinaza, ushbu tadqiqot natijalari EO yoki boyitilgan EO aralashmalarini oqilona loyihalashda yordam berishi mumkin, bu ularning biologik samaradorligini oshiradi va giperpigmentatsiyani davolashda yordamchi vosita sifatida potentsialini oshiradi.
Ma'lumotnomalar
1. Pillaiyar, T.; Manikkam, M.; Namasivayam, V. Teri oqartiruvchi vositalar: tirozinaz inhibitörlerinin dorivor kimyosi istiqboli.J. Ferment. Inhib. Med. Kimyo. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]
2. Desmedt, B.; Kursel, P.; De Beer, JO; Rojers, V.; Grosber, M.; Dekonink, E.; De Paepe, K. Terini oqartiruvchi vositalarning umumiy ko'rinishi Yevropadagi noqonuniy kosmetika bozori haqida tushuncha. J. Evr. akad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]
3. Desmedt, B.; Van Xok, E.; Rojers, V.; Kursel, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Shubhali noqonuniy terini oqartiruvchi kosmetikaning xarakteristikasi. J. Pharm. Biomed. Analiz. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]
4. Kubo, I.; Ikuyo, KH za'faron gulidan olingan flavonollar: tirozinaz inhibitiv faolligi va inhibisyon mexanizmi. J. Agrik. Oziq-ovqat kimyosi.1999, 47, 4121–4125. [CrossRef]
5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Xsu, J.-CC; Shix, Y.; Chou, S.-TT Cinnamomum cassia efir moyining kimyoviy tarkibi va tirozinaza inhibitiv faolligi. Bot. Stud. 2013, 54, 2–8. [CrossRef]
6. Garsiya-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garsiya-Molina, F.; Garsiya-Ruiz, Pensilvanya; Garsia-Kanovas, F. Tirozinaz onorto-almashtirilgan fenollarning ta'siri: jigarrang va melanogenezga mumkin bo'lgan ta'sir. J. Agrik. Oziq-ovqat kimyosi. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]
7. Kubo, I.; Kinst-Xori, I. Ziradan tirozinaz inhibitörleri. J. Agrik. Oziq-ovqat kimyosi. 1998, 46, 5338–5341. [CrossRef]
8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Tsitrus efir moylarining tirozinaz inhibitiv faolligi. J. Agrik. Oziq-ovqat kimyosi. 2006,54, 2309–2313. [CrossRef]
9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdi, C.; Khunkitti, W. Akne nazorati uchun ishlatiladigan efir moylarining in vitro bioaktivligi. Int. J. Aromather. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]
10. Bouzenna, X.; Xfaid, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Sitralning biologik xususiyatlari va uning IEC-6 hujayralarida aspirin keltirib chiqaradigan sitotoksiklikka qarshi potentsial himoya ta'siri. Biomed. Farmakoter. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]
11. Li, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; Yo'q, YH; Yuk, DY; Hong, JT RAW264.7 hujayralarida iNOS ifodasini va NF-kB faollashuvini bostirish orqali sitralning NO ishlab chiqarishga inhibitiv ta'siri. Ark. Farm. Res. 2008, 31, 342–349. [CrossRef]
12. Karvalyu, PMM; Makedo, CAF; Ribeyro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA;Barbosa, R. Lippia alba (Mill.) NE Jigarrang efir moyi va uning asosiy tarkibiy qismlari, sitral va limonenning kalamushlarning trakeal silliq mushaklariga ta'siri. Biotexnologiya. Rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]
13. Pereyra-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Kosta, RHSd; Monteyro, A.B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. Lippia alba efir moyi va uning asosiy tarkibiy qismlari, sitral va limonenning kalamushlarning izolyatsiya qilingan bachadonida tokolitik faolligi. Kimyo. Biol. O'zaro ta'sir qilish. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]
14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereyra-Gonsalves, A.; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Kardoso, JH; Barbosa, R. Lippia alba efir moyi va uning asosiy tarkibiy qismi bo'lgan sitralning izolyatsiya qilingan aortaning kontraktilligiga vasorelaxant ta'siri. Biomed. Farmakoter. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]
15. Sousa, DG; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreyra-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Kardoso, JH; Barbosa, R. Lippia alba efir moyi va uning asosiy tarkibiy qismi bo'lgan sitral kalamush siyatik nervlarining qo'zg'aluvchanligini bloklaydi. Braz. J. Med.Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]
16. Xuang, X.-V.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Xitoydan Litsea cubeba mevalaridan olingan efir moyining potentsial kosmetik qo'llanilishi. J. Essent. Yog 'res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]
17. Zolgadri, S.; Bahromiy, A.; Hasan Xon, MT; Munoz-Munoz, J.; Garsiya-Molina, F.; Garsiya-Kanovas, F.; Saboury, AA Tirozinaz inhibitörleri bo'yicha keng qamrovli sharh. J. Enzim. Inhib. Med. Kimyo. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]
18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Kosta, R.; Rubiolo, P. Efir moylarining miqdoriy tahlili: murakkab vazifa. Fragr lazzati. J. 2008, 23, 382–391. [CrossRef]
19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Kordero, C.; Bicchi, C. Efir moylari va uchuvchi moddalar: namuna tayyorlash va tahlil qilish. Sharh. Flavour Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [CrossRef]
20. Seidler-Lozykovska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. Ushbu tanlangan limon balzamining (Melissa officinalis L.) genotiplarining morfologik va kimyoviy belgilarining o'zgaruvchanligini baholash. Sanoat ekinlari ishlab chiqarish. 2013, 49, 515–520. [CrossRef]
21. Kubo, I.; Kinst-Xori, I. Zaytun moyi lazzat birikmalarining tirozinaz inhibitiv faolligi. J. Agrik. Oziq-ovqat kimyosi. 1999, 47, 4574–4578.[CrossRef] [PubMed]
22. Fiokko, D.; Arciuli, M.; Arena, deputat; Benvenuti, S.; Gallon, A. Kimyoviy tarkibi va turli xil efir moylarining anti-melanogen salohiyati. Fragr lazzati. J. 2016, 31, 255–261. [CrossRef]
23. Xu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Limon efir moyining in vitro qo'ziqorin tirozinaza faolligiga inhibitiv ta'siri. Mod. Oziq-ovqat fanlari. Technol. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]
24. Yevropa Kengashi. Yevropa farmakopeyasi, 10-nashr; Yevropa Kengashi: Strasburg, Fransiya, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.
25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Vang, M. Cudrania tricuspidata novdalarida tirozinaz inhibitörlerinin xarakteristikasi va ularning tuzilishi-faoliyat munosabatlarini o'rganish. Fitoterapiya 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]
26. Uilyams, KP; Skott, JE Enzim tahlilining yuqori o'tkazuvchanlik skrining uchun dizayni. Yuqori o'tkazuvchanlik skriningida. Molekulyar biologiyada metodlar (usullar va protokollar); Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press: Klifton, NJ, AQSh, 2009; 565-jild, bet. 107–126.
27. Bruks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smit, MC; Weidner, JR HTS uchun fermentativ tahlil asoslari. Tahlil bo'yicha qo'llanmada; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds.; Eli Lilly & Company va Tarjima fanlarini rivojlantirish milliy markazi: Bethesda, MD, AQSh, 2004 yil