Insonning homila va perinatal amniotik suyuqlik ildiz hujayralaridan sekretom formulalarini keng qamrovli profillash

Iltimos, murojaat qilingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

Bundan tashqari, 5B va 6B-rasmlardagi shtrixli diagrammalardan ko'ra, sekretsiya qiluvchi hujayraning gipoksik oldindan shartlanishiga ko'ra o'ziga xos oqsil taqsimoti sezilarli. Bunday holda, to'liq ma'lumot uchun DAve va DCI to'plamining chegarasidan oshmaydigan oqsillar ham xabar qilingan. Homila gipoksik formulasida 60 kDa issiqlik zarbasi oqsili (HSPD1, 5B-rasm, chap panel) bilan boyitilgan sekretom natijalariga ega, perinatal hamkasbi esa yuqori darajada ifodalangan silliq mushak hujayralari kontraktil miyozinni tartibga soluvchi [52] engil polipeptid 9 (MYL9, rasm) 5B, o'ng panel). Homiladorlik bosqichlari o'rtasidagi farqning muhim ulushi ko'proq hAFSdagi gipoksiyaga bog'liq. EV; Gipoksik hujayra astarlanishidan olingan f-have-EV'lar Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Laminin Subunit -5 va -1(LAMA5 va LAMB1), Trombospondin{{17 kabi omillar bilan boyitilganligi aniqlandi. }} (THBS1, 6B-rasm, chap panel). Hipoksik p-hAFS-EVs tarkibida Ferritin og'ir zanjiri (FTH1), Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Annexin A6 (ANXA6), Rab GDP dissotsiatsiya inhibitori beta (GDI2) kabi iskala oqsillari va Thy mavjud edi. -1 membrana glikoproteini (THY1), neyropilin-1(NRP1) va matritsa metalloprotein 14 (MMP14, shakl 6B, oʻng panel).

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

Proteinlar f-hAFSda har bir tekshirilgan holatda kamida 2 chastota bilan topildi. EV va p-hAFS-EV'lar Vesciclepedia ma'lumotlar bazasi bilan taqqoslandi [53]. Kutilganidek, aniqlangan oqsillarning aksariyati (96 foiz) ilgari mos yozuvlar bazasida EV va ekzosomalarda tasvirlangan (rasm S3A).cistanche foydalariShu nuqtai nazardan, Gen Ontologiyasi (GO) boyitish tahlili FunRich [54] yordamida amalga oshirildi. Ma'lumotlar to'plamidagi GO atamalarining ko'pligi ularning biologik jarayonlardagi ishtiroki, molekulyar funktsiya va hujayra tarkibiy qismlariga ko'ra statistik jihatdan ortiqcha ifodalangan oqsil guruhlarini topish uchun ma'lumot bazasidagi tabiiy miqdori bilan taqqoslandi (bu oxirgi jihat uchun ma'lumotlar mavjud emas). ko'rsatilgan, lekin so'rov bo'yicha mavjud). Aniqlangan oqsillar bilan bog'liq molekulyar funktsiyalarning tahliliga kelsak, hAFS-CM fraktsiyalari hujayradan tashqari matritsa va sitoskeletning tarkibiy tarkibiy qismining boyitilganligini, sitoskeletal oqsillarni bog'lanishini va strukturaviy molekula faolligini ko'rsatdi (S2-rasm), hAFS-EVs esa strukturaviy boyitilgan. sitoskeleton va ribosomaning tarkibiy qismi, DNK va RNK bilan bog'lanish va GTPaz va chaperon bog'lovchi omillar (S3C-rasm).

Ham hAFS-CM, ham have-EVs uchun biologik jarayonlarni boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, homila va perinatal hAFS sekretom fraktsiyalarida modulyatsiyalangan oqsillarning aksariyati hujayra o'sishi/saqlanishi va oqsil almashinuviga tegishli (5C va 6C-rasm). hAFS-EVs ichida biz "hujayradan tashqari matritsaning tarkibiy tarkibiy qismlari" atamasi faqat gipoksik f-hAF-EVs bilan bog'liqligini payqadik; "kaltsiy ionlari bilan bog'lanish" va "tuzilmaviy molekulyar faollik" atamalari asosan gipoksik f-hAFS va p-hAFS namunalarida boyitilgan (S3B-rasm).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I va DCI (differensial ifoda ishonchi) I5I dan katta yoki unga teng filtrlardan o'tdi va differensial ifodalangan deb hisoblanadi; Xabar qilingan oqsillarning to'liq ro'yxati va batafsil parametrlari uchun S3-jadvalga qarang. (C) gipoksik oldindan shartlashtirgandan so'ng f-hAFS-EVs (chap panel) va p-hAFS-EVs (o'ng panel) da kamida 2 chastotasi bilan aniqlangan oqsillarni biologik jarayonlarni boyitish tahlili. FunRich vositasi asosida gen ontologiyasi atamalari har bir toifa uchun boyitilgan genlar foizini bildiruvchi chiziqli diagrammalarda ko‘rsatilgan (f-hAFS-EVsnormo uchun to‘q sariq chiziqlar, f-hAFS-EVShypo uchun qizil chiziqlar, p-hAFS uchun och yashil chiziqlar. -EVsnormo va p-hAFS-EVShypo uchun quyuq yashil chiziqlar). Bonferroni bilan faqat gen ontologiyasi atamalar tuzatilgan * p<0.05 are="">

Cistanche qarishga qarshi bo'lishi mumkin

2.6. Xomilaning sitokin va kimyokin profilini aniqlash va perinatalga qarshi CM va EV larning turli xil tarqalish modellarini aniqladi.

Biz ilgari f-hAFS-CMhypo ning shikastlangan yurak-qon tomir hujayralarida regenerativ qobiliyatini parakrin effektlar orqali tasdiqladik [34,35,49]. Bu erda f-hAFS-CMHypo ning sitokin va kemokin tarkibini mos keladigan p-hAFS hamkasbi bilan solishtirdik (7A-rasm, S4A-rasm va S4-jadval) va ba'zi kamsituvchi omillarni topdik.

ANGIOGENIN, hujayradan tashqari matritsali metalloproteinaza induktori (EMMPRIN), interleykin 8 (IL-8) va monositlar kemoatrakant oqsili-1 (MCP-1) faqat inf-hAFS-CMNypo bilan boyitilganligi aniqlandi va ular bo'lmagan. p-hAFS-CMhypoda aniqlangan. Insulinga o'xshash o'sish faktorini bog'lovchi oqsil 2 (IGFBP2) va osteopontin (OPN) f-hAFS-CMhypoda p-hAFS-CMHypo ga nisbatan 3.5-va 3.8- barobar (" p<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Xomilaga nisbatan perinatal bor-CM sitokin va kimyokin profilida differentsial ifodani ko'rsatgan bo'lsa-da, mos keladigan homila va perinatal EV hamkasblari kamroq ifoda profillariga ega bo'lsa-da, bir hil taqsimlangan (7B-rasm, S4B-rasm va S5-jadval). Shunga qaramay, ba'zi farqlarni baholash mumkin: DiPeptidil-Peptidaza IV (DPPIV), O'sish/farqlanish omili 15 (GDF-15) va IL-8 past bo'lsa-da, faqat f-hAFS-EVSHypo bilan ifodalangan. darajalar; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND va Vitamin D-bog'lovchi oqsil (VDBP) faqat p-hAFS-EVShypo-da topilgan, ammo kam miqdorda yana bir bor aniqlangan. Miyadan olingan neyrotrofik omil (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, insulinga oʻxshash oʻsish omili bogʻlovchi oqsil 3 (IGFBP3), IL{21}}a, MIF OPN, PTX3, stromal hosila omili{ kabi boshqa sitokinlar {23}} alfa (SDF-1a), f-hAFS-EVShypo va p-hAFS-EVSHvpo da topildi, PAI-1 va EMMPRIN yuqoriroq ifodalangan (7B-rasm)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 va SDF-lo homiladorlik davridan qat'i nazar, tegishli hAFS-CM bilan solishtirganda barcha gipoksik ega-EVlarda faqat boyitilgan. Bundan tashqari, p-hAFS-CMhypo doirasida EMMPRIN aniqlanmagan bo'lsa-da, u EV mos keladigan fraktsiyada boyitilganligi aniqlandi; aksincha, OPN f-have-CMhypo-da f-have-EVShypo-ga qaraganda ko'proq bo'lgan, shu bilan birga u mos keladigan p-hAFS sekretom fraktsiyalari orasida taqqoslangan. FGF-19,MIF va PTX3 homila va perinatal bor-CMda va tegishli hAFS-EVlarda xuddi shunday ifodalangan. PAI{16}} gipoksik sekretom fraksiyalari bilan yuqori darajada boyitilgan.

Shakl 7. Homila va perinatal hAFS sekretom formulalarida sitokin va kimyokin profilini aniqlash. (A) Hipoksik homila-perinatal have-CM (f-hAFS-CMHypo va p-hAFS-CMHypo) ichida aniqlangan sitokinlar va kimokinlar ifodasi ixtiyoriy birlik [AU] tomonidan piksel zichligida xabar qilinadi. Qiymatlar mustaqil eksperimentlarning o'rtacha ± semmi sifatida ifodalangan va S4-jadvalda keltirilgan;*p=0.0485;**p=0.006.(B)Gipoksik homilada aniqlangan sitokin va kimokin tarkibi- perinatal hAFS-EVsga nisbatan (f-hAFS-EVSHypo va p-hAFS-EVSHypo) va ixtiyoriy birliklarda piksel zichligi bilan ifodalangan [AU].cistanche xolesterinQiymatlar n=3 ta mustaqil tajribaning oʻrtacha±semimi sifatida ifodalangan va S5-jadvalda keltirilgan. CST3: Sistatin C;EMMPRIN: Hujayradan tashqari matritsa metalloproteinaz induktori;FCFF-19: Fibroblast o'sish omili-19;IGFBP2:Insulinga o'xshash o'sish omili(IGF)bog'lovchi oqsil 2;IL-8:Interleykin -8;IL-17a:Interleykin-17a; MCP-1: Monotsitlar kemoatrakant oqsili-1;MIF:Makrofag migratsiyasini inhibe qiluvchi omil; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: Plazminogen faollashtiruvchi inhibitori-1; BDNF: Miyadan olingan neyrotrofik omil; DPPIV: Dipeptidil peptidaza IV; GDF-15:O'sishning farqlanish omili-15;IGFBP3:Insulinga o'xshash o'sish omili(IGF)bog'lovchi oqsil 3;SDF-1a: Stromal hosila omili-1 alfa; VDBP: Vitamin D-bog'lovchi oqsil.

2.7. Xomilalik va perinatal yo'l-transport vositalari o'zlarining yuklarida RNK ma'lumotlari bilan boyitilgan.

Kichik kodlanmagan RNKlar maqsadli hujayralarga EV parakrin ta'sirining asosiy regulyatorlari hisoblanganligi sababli [4,55], biz asosan f-hAFS-EVs va p-hAFS-EVs ichidagi mikroRNK (miRNK) tarkibiga RNK ketma-ketligi tahliliga e'tibor qaratdik. Kichik RNK profilini o'tkazish homila va perinatal hAFS-EVlarda miRNKning umumiy kichik RNK miqdori bilan solishtirganda (taxminan 35-36 foiz) boyitilganligini ko'rsatdi (8A-rasm). miRNK komponenti haqiqatan ham rRNK(***p) p < 0.0001)="" bilan="" birga="" ev="" formulalarida="" ham="" eng="" koʻp="" ifodalangan="" ikkita="" rnk="" turlaridan="" biri="" edi.="" quyidagi="" mirnklar="" tahlil="" qilingan="" ev="" namunalarida="" eng="" yuqori="" darajada="" boyitilgan:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,="" let-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" va="" mir-221-3p.="" shunisi="" e'tiborga="" loyiqki,="" homila="" va="" perinatal="" bo'lgan="" ev'lar="" bunday="" mirnklarning="" ko'p="" qismini="" o'rtoqlashdi="" (ya'ni,="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47}="" }}f-5p,="" let-7i{50}}p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" va="" mir-221-3p,="" shakl="" 7b).="" 15="" ta="" eng="" boyitilgan="" mirnk="" turlari="" har="" bir="" namunadagi="" umumiy="" mirnk="" tarkibining="" 60="" foizdan="" ortig'ini="" qamrab="" olgan.="" boshqa="" tomondan,="" vesikulyar="" mirnk="" tarkibining="" qolgan="" 30="" foizida="" 100="" ga="" yaqin="" mirnk="" topilgan="">

HAFS-EVs ichidagi miRNK tarkibini yanada tavsiflash uchun biz hAFS homiladorlik bosqichi yoki in vitro gipoksik hujayraning oldindan shartlanishi o'ziga xos miRNKlarning boyitilishiga ta'sir qilishi mumkinligini tekshirdik. Eng kuchli modulyatsiya homiladorlik bosqichlari o'rtasida topilgan, bu erda deyarli barcha modulyatsiyalangan miRNKlar perinatal hamkasbiga nisbatan f-hAFS-EVlarda boyitilgan (9A-rasm va 1-jadval). Gipoksik oldindan shartlash miRNK yukiga yumshoqroq ta'sir ko'rsatdi, holbuki bu taqqoslashda modulyatsiya ikkala yo'nalishda bo'lib, miRNKning ba'zilari gipoksik bilan boyitilgan, boshqalari esa normoksik nazorat sharoitida (9A-rasm).

Qo'shimcha tahlil sifatida biz har xil donorlar bo'yicha eng past o'zgaruvchanlikka ega bo'lgan tekshirilgan miRNKlarni aniqlashga va har ikkala tekshirilgan homiladorlik bosqichidan olingan EV'lar uchun madaniyatning oldindan shartlanishiga e'tibor qaratdik. Ushbu tahlil natijasida hosil bo'lgan miRNKlar yuqoridan past ifoda darajalarigacha bo'lgan (9B-rasm). hAFS-EVs yuklarining eng barqaror miRNK yadrosida f-hAFS-EVs va p-hAFS-EVs o'rtasida ba'zi umumiy miRNK aniqlandi (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR{9}}p yuqori darajada; miR-221-3p,miR-221-5p va miR-22-3p xiralik darajasida, 2-jadval).

Shakl 9. Homila va perinatal hAFS-EVlarda miRNKlarni differentsial boyitish tahlili. (A) HAFS-EV miRNA yukini homiladorlik bosqichiga (chap panel) va in vitro gipoksik sekretsion hujayralarni oldindan shartlashiga (o'ng panel) ko'ra differentsial boyitish uchun vulqon uchastkalari. miRNK tafsilotlari uchun 1-jadvalga qarang. (B) Yuqori (sariq nuqta) bo'yicha homila hAFS-EV (chap panel) va perinatal hAFS-EV (o'ng panel) ichidagi barqaror miRNKlarning o'zgaruvchanligi (X o'qi) va boyitish darajasi (Y o'qi) o'rtasidagi bog'liqlikning tarqalish grafigi), xira (yashil nuqta) va past (to'q binafsha nuqta) boyitish. miRNK tafsilotlari uchun 2-jadvalga qarang.RPM: millionga o'qish.

3. Munozara

Odam amniotik suyuqligining tashlab yuborilgan qoldiq namunalari regenerativ tibbiyot va to'qimalar muhandisligida istiqbolli potentsialga ega stromal hujayralarning qimmatli manbai sifatida aniqlandi. Ularni izolyatsiya qilish bilan bog'liq axloqiy tashvishlar minimaldir, chunki ularni odatiy prenatal skrining amniyosentez namunalaridan, homiladorlikning II trimestrida (homilalik hAFS) yoki III trimestrda rejalashtirilgan C-bo'limida klinik chiqindilar sifatida tashlangan amniotik suyuqlikdan olish mumkin. protseduralar (perinatal hAFS). So'nggi yillarda hAFS eksperimental kasallik modellaridan olingan dalda beruvchi dalillarni hisobga olgan holda inson to'qimalarini tiklash va qayta tiklash uchun potentsial terapevtik vositalar sifatida taklif qilindi. Qizig'i shundaki, ular homila-neonatal nevrologik kasalliklarning utero terapiyasi uchun ham taklif qilingan; Haqiqatan ham, preklinik tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, intra-amniotik etkazib berish orqali prenatal ravishda qo'llaniladigan hAFS miyelomeningotselning kalamush modelida parakrin faolligi orqali homiladorlik paytida orqa miyani himoya qiladi [56-58] va eksperimental kemiruvchilar gastroshizisida ochiq ichakning shikastlanishini kamaytiradi [59] ]. Tarjima nuqtai nazaridan, bachadonda hAFS transplantatsiyasi ularning sekretomini (hAFS-CM yoki hAFS-EVs) eng mos keladigan preparatini yuborish bilan almashtirilishi mumkin.cistanche deserticola yon ta'siriUshbu strategiya kanonik hujayra terapiyasi cheklovlarini (ya'ni, ko'p vaqt talab qiluvchi in vitro hujayra kengayishi) bartaraf etish orqali homiladorlik davrida tezkor va o'z vaqtida aralashuvga imkon beradi va shu bilan birga tayyor va foydalanishga tayyor farmatsevtika formulalarini taqdim etadi.

Kamroq invaziv prenatal diagnostika usullarining yaqinda rivojlanishi yaqin kelajakda amniyosentez protseduralarining kamayishiga olib kelishi mumkin, bu esa perinatal hAFSni yanada qulayroq variant sifatida targ'ib qiladi. Shunga qaramay, xomilalik hAFS rivojlanish jihatidan ko'proq etuk bo'lmaganligi sababli, ular yanada samarali parakrin potentsialga ega bo'lishi mumkin. Ushbu stsenariy doirasida biz bu erda homila va perinatal c-KITt hAFSni solishtirdik va ularning sekretom fraktsiyalarini profillashga e'tibor qaratdik. Biz ularning parakrin qobiliyatining mumkin bo'lgan klinik tarjimasi uchun e'tiborga olinishi kerak bo'lgan tegishli farqlarni ta'kidladik.

Oldingi mustaqil tadqiqotlar bilan kelishilgan holda, biz homiladorlik bosqichi heterojen hAFS morfologiyasiga va ularning mezenximal antigen profiliga ta'sir qilmaganligini ko'rsatamiz [25,26]. Keyin biz kanonik stromal immunofenotipdan tashqari hujayra sekretsiyasi va parakrin faolligiga ta'sir qilish ehtimoli ko'proq parametrlarni baholadik. Ayniqsa, suyak iligi mezenximasining progenitatorlarida CD146-musbat, yuqori CD107a subpopulyatsiyasining mavjudligi yaqinda ajoyib modulyatsiya va terapevtik parakrin faolligi bilan bog'liqligi ko'rsatildi [47]. Bu erda biz homila va perinatal hAFS bu molekulyar belgi bilan kuchli xarakterlanishini aniqladik, bu ularning sekretsiya kuchini tegishli translyatsion ta'sir bilan qo'llab-quvvatlaydi. Bundan tashqari, homila hAFS samarasiz aerob metabolizmi bilan tavsiflanadi, etuk perinatallarda esa kislorod iste'moli va ATP sintezi yuqori bo'lgan. Bu erta tug'ilgan chaqaloqlarning kindik ichakchasidagi stromal hujayralariga o'xshash II trimestrdagi hAFS ning yanada etuk bo'lmagan metabolik profilini ko'rsatishi mumkin [60].

Parakrin potentsialni qo'zg'atish uchun hAFS 24 soat davomida zardobsiz gipoksik astarlanishga duchor bo'ldi, bu strategiya biz homila hujayralari uchun ilgari muvaffaqiyatli ishlab chiqilgan [34,35,37] va bu erda biz birinchi marta ularning perinatal hamkasbini tekshirdik. Gipoksiya ostida homila va perinatal hAFSni oldindan tayyorlash ularning sekretom kontsentratsiyasi va chiqarilgan EVs miqdorining oshishiga ijobiy tendentsiyaga olib keldi, holbuki homiladorlik bosqichi hujayra sekretomining hosildorligiga, shuningdek, EV morfologiyasi va hajmining taqsimlanishiga hech qanday ta'sir ko'rsatmadi.

Shunisi e'tiborga loyiqki, hAFS parakrin yukining tavsifi biz baholagan turli shartlarga ko'ra ba'zi o'ziga xos farqlarni aniqladi. Xomilalik hAFS sekretomining proteomik profili homiladorlik bosqichiga va hujayra gipoksiyasining oldindan shartlanishiga asoslangan omillarning aniq taqsimlanishini aniqladi. Bu shuni ko'rsatadiki, hAFS parakrin potentsiali homiladorlikning Ⅱ dan Ⅲ trimestridagi etilish davrida aniq o'ziga xoslikka ega bo'lishi mumkin, bu o'z navbatida in vitroda sekretsiya hujayralarini rag'batlantirish orqali modulyatsiya qilinishi mumkin. HAFS-CM va hAFS-EV-larning biologik jarayonlarini boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, modulyatsiyalangan oqsillarning aksariyati hujayra o'sishi/saqlanishi va oqsil metabolizmiga mos kelishi mumkin, shu bilan birga hujayraning foydali parakrin ta'sirini qo'llab-quvvatlaydi. Xususan, gipoksik xomilalik hAFS umumiy sekretomi HSPD1 (HSP60) issiqlik zarbasi oqsili bilan boyitilganligi aniqlandi, bu diabetik sichqon terisi shikastlanishi modelida yaralarni davolashni qo'llab-quvvatlashi va M2 fenotipiga makrofaglarni pro-rezolyutsiyani rag'batlantirishi ko'rsatilgan [61] . Xuddi shunday, hipoksik homila hAFS-EVs neyrogenezni rag'batlantiruvchi omillar (HSPG2 [62], hujayraning o'zini yangilashi, miya va yurak-qon tomir rivojlanishi (LAMA5 [63] va LAMB1 [64] va migratsiya (THBS1 [2]) uchun boyitilgan. Proteoglikan. AGRN homila hAFS ning gipoksik astarlanishidan keyin ham EVlarda topilgan.Cistanche dozasi redditBizning topilmalarimiz yallig'lanish va gipoksik instruktiv stimullar ostida AGRNning mezenximal stromal hujayralar proteomasida ko'tarilganligi haqidagi oldingi dalillarga mos keladi [65]. AGRN, shuningdek, immun sinaps signalizatsiyasida ishtirok etishi va neonatal sichqonchaning yurak regeneratsiyasiga mos kelishi [67] bilan ko'rsatilgan, bu esa rivojlanishda yosh homila hAFSning regenerativ parakrin ta'sirga aniq moyilligini qo'llab-quvvatlaydi. Bundan tashqari, homila hAFS gipoksik oldindan shartlarga ko'proq javob berishi tasdiqlandi, chunki ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 va MCP{4}} sitokin[68] kabi qon tomir regenerativ samaradorligini bashorat qiluvchilarni boyitish bilan ko'rsatilgan. ularning shartli muhiti. Bu miokard infarkti, orqa oyoq-qo'l ishemiyasi va ishemik fassiokutan qopqoqning klinikadan oldingi kemiruvchi modellarida endogen neo-arteriogenezni kuchaytirishda homila hAFS-CM ning parakrin kuchini tasdiqlaydi [34,{10}}]Bundan tashqari, homila hAFS umumiy sekretom perinatal bilan solishtirganda IGFBP2 va OPN bilan sezilarli darajada boyitilganligi aniqlandi, bu esa aniqroq hal qiluvchi va qarishga qarshi modulyatsiya profilini taklif qiladi[72-75]. Perinatal bor-CM, parakrin omillarda kamroq kuchaygan bo'lsa-da, xuddi shunday tarzda CST3 [76,77] va MIF [78] kabi neyrotrofik va immunomodulyatsion omillar bilan to'ldirildi.

Jami hAFS-CM bilan solishtirganda, homila va perinatal-gipoksik EV hamkasblari asosan pufakchalar bo'limida boyitilgan tomirlarni qayta qurish vositachisi EMMPRIN [79] bundan mustasno, sitokinlar va kimyokinlarning kam ifodalanganligini ko'rsatdi. Homiladagi hAFS-EVs[34,37] ning ilgari xabar qilingan kardio-aktiv va pro-regenerativ profili bu erda ularning kardioprotektiv IL-8 [80] va GDF-15 eksklyuziv ifodasi dalillari bilan tasdiqlangan. endogen kattalardagi hipokampal neyrogenezni qo'zg'atuvchi asosiy parakrin omil [81,82], shuningdek, antratsiklin keltirib chiqaradigan kardiotoksiklikka qarshi [78]. Ham homila, ham perinatal hAFS-EVlar progenitor/o'zak hujayra savdosi regulyatori SDF-1 [83-85] uchun o'xshash ifodani ko'rsatdi. Proteomik tahlil gipoksik perinatal hAFS-EVlarda NRP1 [86] va MP14[87] kabi angiogenez bilan bog'liq oqsillarning ko'payishini xabar qildi; Bunday ogohlantiruvchi profil skelet mushaklari ishemik shikastlanishining klinikgacha bo'lgan sichqoncha modelida Ⅲ trimester hAFS ning endotelial regenerativ xususiyatlari bo'yicha oldingi natijalarni tushuntirishi mumkin, ammo ularning hAFS-CM ning tegishli homilaga qaraganda kamroq pro-angiogenik ekanligi isbotlangan. Shunisi e'tiborga loyiqki, BDNF neyron o'sish omili homila va perinatal EV yuklarida ham topilgan, ammo kam miqdorda bo'lsa ham, bu neyronlarning omon qolishi va neyrorivojlanish jarayonlarida hAFS-EVs uchun taxminiy neyrotrofik faollikni ko'rsatadi, shuningdek, inson suyagi tomonidan chiqariladigan hujayradan tashqari pufakchalar uchun ham kuzatilgan. ilik va kindik qoni-MSC[8889]. Gipoksik stimulyatsiyaga uchragan homila va perinatal hAFS ning ikkala sekretom formulalari yurakdagi M2 makrofaglarining qutblanishida ham ishtirok etgan va kardioprotektiv ta'sir ko'rsatadigan endotelial faollashuvni osonlashtiruvchi PAI-1 bilan boyitilganligini ko'rsatdi. va anti-fibrotik salohiyat [91].

MikroRNKlar (miRNKlar) ildiz hujayralari va mezenximal stromal hujayra-EV parakrin faolligining hal qiluvchi regulyatorlari sifatida keng ko'rib chiqilgan [92,93]. Bu erda biz hAFS-EVs ichidagi 15 ta eng boyitilgan miRNK turlari har bir namunadagi umumiy miRNK tarkibining 60 foizdan ortig'ini qamrab olishini aniqladik. Ushbu miRNKlar mezenximal stromal hujayra-EVlarning molekulyar yukini tavsiflaydi (-7a-5p [4,95]), qon tomirlarining regeneratsiyasiga ta'sir qilish va fibrozni inhibe qilish orqali miyokard ishemiyasidan himoya qiladi. -7b-5p, let-7f-5p, miR-21-5p va miR-155-5p [96,97]), targ'ib qilish keratinotsitlar funktsiyasini tartibga solish orqali yarani davolash (miR-16-5p [98]) va oldingi miya ishemiyasidan keyin neyronlarning o'limiga qarshi turish (miR-29a-3p [99,100]). Boshqa tomondan, vesikulyar miRNK tarkibining qolgan 30 foizida 1000 ga yaqin miRNK topilgan. Bunday muvozanatsiz taqsimlanish avvalgi tadqiqotlarga mos keladi [4] va asosan boyitilgan miRNKlarni hAFS-EVlarning asosiy biologik faolligi uchun taxminiy hisoblanganlar sifatida ta'kidlaydi. Qizig'i shundaki, homila va perinatal hAFS-EV'lar 15 miRNKning ko'p qismini bo'lishdi. Shunisi e'tiborga loyiqki, biz homilaning hAFS-EV'lari va perinatallari turli boyitish darajalarida juda barqaror miRNKlar to'plamini o'z ichiga olganligini ham kuzatdik. Bunday dalillar hAFS-EVlarda qPCR tajribalarida ichki mos yozuvlar nazorati sifatida foydalanish uchun keng doiradagi "uy xo'jaligi" nomzodlarini taklif qilishi mumkin. Bundan tashqari, bunday barqaror miRNKlarning izchil kichik to'plami (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) homiladorlikning ikki bosqichi oʻrtasida taqsimlanadi va asosan boyitilgan 15 ta davr bilan bir-biriga toʻgʻri keladi, bu esa yanada doimiy xatti-harakatni va ishonchli oldindan hal qiluvchi molekulyar imzoni koʻrsatadi([96,{{45] }}]). Shunisi e'tiborga loyiqki, yaqinda bunday o'ziga xos yadro tarkibiga kiradigan bir nechta nomzodlar II trimestr amniotik suyuqlikdan olingan mezenximal stromal hujayralardan (miR-29a-3p va miR{{) olingan neyroprotektiv EV'larda mos yozuvlar miRNKlar sifatida xabar qilingan. 49}}b[95]). Shunga qaramay, biz homiladorlik yoshi miRNK yukini gipoksik oldindan shartlashdan ko'ra ko'proq modulyatsiya qilishi mumkinligini ham payqadik. III trimestrdagi homila hAFS dan olingan rivojlanish jihatidan ko'proq balog'atga etmagan EV'lar embrion ildiz hujayralarining hayotiyligini (miR-302-3p [101]), hujayra proliferatsiyasini va suyak iligi stromal hujayralarining (miR) osteogenik differentsiatsiyasini qo'llab-quvvatlash uchun ilgari ko'rsatilgan miRNKlar bilan boyitilgan. -217 [102]), shu bilan birga oʻsimtani bostirish potentsialiga ega (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

Bizning natijalarimizga asoslanib, bu erda biz homila va perinatal hAFS regenerativ tibbiyotda foydalanish uchun jozibali parakrin manbalar bo'lishi mumkinligini tasdiqlaymiz. Ularning fenotipi va sekretor faolligi o'xshash bo'lsa-da, biz ularning sekretom formulalaridagi ba'zi o'ziga xos jihatlarni ularning kelajakdagi terapevtik tarjimasi uchun foydali tushuncha sifatida ta'kidladik.

4. Materiallar va usullar

4.1.Odamning amniotik suyuqlikning ildiz hujayralarini izolyatsiyasi va in vitro madaniyati

Inson amniotik suyuqlik ildiz hujayralari (hAFS) Ⅱ trimestrda amniyosentez (homilalik hAFS, f-hAFS) yoki Ⅲ trimestrda rejalashtirilgan sezaryen tug'ish paytida klinik chiqindilar sifatida muntazam prenatal skrining orqali to'plangan amniotik suyuqlik (AF) qoldiq namunalaridan ajratilgan. (perinatal hAFS, p-hAFS) Prenatal diagnostika va perinatal tibbiyot bo'limida, IRCCS San Martino kasalxonasida, IRCCS Istituto Gaslini kasalxonasida homila va perinatal tibbiy va jarrohlik bo'limida va inson genetikasi laboratoriyasida (Jenova, Italiya). Barcha donorlardan mahalliy axloqiy qoʻmita ruxsati (PR428REG2015 protokoli) va Xelsinki deklaratsiyasi koʻrsatmalariga muvofiq xabardor qilingan yozma rozilik olindi. II trimestrdagi homila AF namunalari o'rtacha yoshi 37,42±0,32 yosh (n=15 36-dan 41 yoshgacha) bo'lgan donor donorlardan olingan;Ⅲ trimestrdagi perinatal AF namunalari quyidagilardan olingan: o'rtacha yoshi 34,25±1,31 yosh (n=10 26- dan 42 yoshgacha) bo'lgan donor ayollar. Homila va perinatal hAFS normal karyotip uchun tasdiqlangan va c-KIT ifodasi (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bolonya, Italiya) uchun immunomagnit saralash orqali biriktirilgan AF mezenximal stroma hujayralaridan ajratilgan namunalardan olingan [16].Cistanche ekstraktining foydalaric-KIT* hAFS 15% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italiya), 18% Chang B va 2% Chang C Medium (Irvine Scientific) bilan Minimal Essential Medium (MEM)-alfada yetishtirildi. , Santa Ana, CA, AQSh) 1 foiz L-glutamin va 1 foiz penitsillin/streptomitsin (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italiya), inkubatorda 37 daraja haroratda 5 foiz CO2 va 20 foiz Oz atmosferasida va yetishtirilgan. ularning sekretomini ajratish uchun ishlatishdan oldin in vitro 5 o'tishgacha.

4.2.HAFS metabolizmini biokimyoviy baholash

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) hujayralar har bir tajriba uchun ishlatilgan. Bazal nafas olishni baholash uchun hAFS 0.03 mg/ml digitonin bilan 10 daqiqa davomida o'tkazuvchanlikka ega bo'ldi va fosfat tampon tuzida (PBS) to'xtatildi. Yo'lni rag'batlantirish uchun 10 mM piruvat va 5 mM malat yoki 20 mM suksinat qo'shildi. -mos ravishda I, II va IV komplekslar yoki Ⅱ va IV komplekslar tomonidan tuzilgan yo'llar [60].

Glutamin, uzun zanjirli yog 'kislotasi oksidlanishi va glyukozaning nafas olishiga nisbiy hissasini baholash uchun digitonin o'tkazuvchanligidan so'ng hujayralar o'sish muhitida va 4 umM BPTES, 4 uM Etomoxir va 4 uM UK5{{22} }99 mos ravishda glutaminaza, karnitin palmitoil-transferaza 1A (CPT1A) yoki mitoxondrial piruvat tashuvchisi (MPC) ni inhibe qilish uchun qo'shilgan. Fi-F.ATP sintaza (ATP sintaza) faolligi yuqori sezgir lusiferin/lusiferaza usuli bilan ATP ishlab chiqarishni o'lchash yo'li bilan aniqlandi. Tahlillar 37 daraja haroratda 2 daqiqa davomida o'tkazildi va ma'lumotlar har 3{29}} soniyada yig'ildi. Tajribalarning birinchi to‘plamida 1{38}} darajali hujayralar 50mM KCl,1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0,6mMouabain,1mM P1P5-Di o‘z ichiga olgan muhitda 1{49}} daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. (adenozin-5')penta-fosfat, 0,040 mg/ml ampitsillin va 10mM Tris-HCl pH7,4. Keyinchalik, ATP sintezi nafas olish substratlari (10 mM piruvat plyus 5 mM malat yoki 20 mM suksinat) va 0,1 mM ADP qo'shilishi bilan amalga oshirildi. Reaksiya lyuminometrda (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milan, Italiya) ATP standart eritmalarida (Roche, Bazel, Shveytsariya) CLSII (Roche, Bazel, Shveytsariya) lusiferin/lusiferaza ATP bioluminesans tahlili to'plami yordamida o'lchandi. Kalibrlash uchun 42}}/M ishlatilgan. Ikkinchi tajribalar majmuasida ATP sintezi 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir yoki 4 uM UK5099 ishtirokida baholandi. metabolizm inhibitori va ATP sintezi 0,1 mM ADP bilan indüklendi. OxPhos (oksidlovchi fosforillanish) samaradorligi (P/O nisbati) ishlab chiqarilgan ATP konsentratsiyasi va nafas olish substrati va ADP ishtirokida iste'mol qilingan kislorod miqdori o'rtasidagi nisbat sifatida hisoblab chiqilgan. Kislorod iste'moli to'liq energiya ishlab chiqarishga bag'ishlangan bo'lsa, P/O nisbati piruvat plyus malat yoki suksinat qo'shilgandan keyin mos ravishda taxminan 2,5 va 1,5 bo'lishi kerak [48] Anaerob glikolizning hAFS metabolizmiga qo'shgan hissasini baholash uchun glyukoza va laktat kontsentratsiyasi baholandi. o'sish muhitida. Glyukoza iste'moli geksokinaza (HK) va glyukoza-6-fosfatdehidrogenaza (G6PD) ulanish tizimi tomonidan NADP 340 nm da pasaytirilgandan so'ng baholandi. Tahlil muhitida 100 mM Tris-HCl, pH7,4, 2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IU geksokinaza va 2 IU glyukoza{69}}fosfat dehidrogenaza mavjud edi. Laktatning chiqarilishi NAD plyus 340 nm ning kamayishidan keyin tekshirildi. Tahlil vositasida 100 mM Tris-HCl (pH8), 5 mM NAD plus va 1 IU/ml laktat dehidrogenaza mavjud edi. Namunalar 4 ug tozalangan laktat dehidrogenaza qo'shilishidan oldin va keyin tahlil qilindi. Ikkala holatda ham ma'lumotlar hujayra soniga normallashtirildi va mos ravishda mM glyukoza / 10 daraja hujayralar yoki chiqarilgan mM laktat / 10 daraja hujayralar sifatida ifodalandi [107].

4.3.Oqim sitometriyasi hAFSning xarakteristikasi

Yuz ming (105) xomilalik va p-hAFS hujayralari ajratildi va sichqonchaning insonga qarshi CD107a-Alexa Fluor 647-va insonga qarshi CD146-FITC- bilan inkubatsiya qilindi. konjugatsiyalangan antikorlar (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italiya). Hujayra apoptozi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq FITC Annexin V apoptozni aniqlash to'plami (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italiya) yordamida baholandi. Voqealar FACS Diva dasturiy ta'minoti (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milan, Italiya) bilan jihozlangan BD Bioscience FACS Aria II saralovchi va analizatorida olingan. Ma'lumotlar FlowJo V9.0 dasturi (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milan) yordamida tahlil qilingan. , Italiya). 4.4.Senessensiyani bo'yash

Standart in vitro sharoitda 5-o‘tishgacha yetishtirilgan hAFS ning qarish fenotipi Senescence-Galaktosidaza binoni to‘plami (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, AQSH) bilan baholandi: f-qo‘l p-hAFS 1x Fiksativ eritmasi bilan 70 foizli mahkamlangan. ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq, bir kechada 37 daraja haroratda SA{6}}gal uchun bo'yalgan. Qarish hodisalari Leica DMil mikroskopida (Leica Acquire dasturi V3.4.4, Leica Microsystems, Milan, Italiya bilan jihozlangan) olingan va har bir maydondagi jami hujayralardagi SA{11}}gal-musbat hujayralar foizi sifatida baholangan.

4.5. HAFS sekretom fraksiyalarini ajratish va kontsentratsiyasi

f-hAFS va p-hAFS 24 soat davomida zardobsiz muhitda (SF) 1 foizli O2 gipoksiyaga qarshi 20 foizli O2 normoksiya (nazorat)da o'stirildi, ikkinchisi asosiy havola sifatida ishlatilgan. Oldin xabar berganimizdek, bu oldindan shartlash strategiyasi bio-faol parakrin omillarning chiqarilishini kuchaytirish uchun ishlatilgan [34,35,37,49]. hAFS 24 soat davomida zardobsiz (SF) muhitda (yuqori glyukozali Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle Medium, DMEM, 1% L-glutamin va 1% penitsillin/streptomitsin bilan Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monzax, Italiya) yetishtirildi. (37 daraja haroratda 20 foiz O2 va 5 foiz CO2) yoki gipoksik (CellXpert C170i va Galaxy 48R CO2 inkubatorlarida 37 darajada 1 foiz O2 va 5 foiz CO2, Eppendorf, Milan, Italiya) sharoitlari.

f-hAFS-CM va p-hAFS-CM to'plangan va hujayra qoldiqlarini olib tashlash uchun 4 gradusda 3{40}}0x g da 10 daqiqa va 2000 × g 20 daqiqa davomida santrifüj qilingan; hAFS-CM 3 kDa selektiv chegaraga ega ultrafiltratsiya membranalari yordamida (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmshtadt, Germaniya) 4 darajada 3000× g 90 daqiqa davomida konsentratsiyalangan va keyin 4 da konsentratsiyalangan. daraja 3000× g da 30 daqiqa. hAFS-EV'lar hAFS-CM dan ketma-ket ultratsentrifugalash orqali ajratilgan va konsentratsiyalangan. Qisqacha aytganda, hAFS-CM yig'ildi va hujayra qoldiqlarini olib tashlash uchun 4 daraja 300 × g da 10 daqiqa va 2000 x g 20 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Keyin supernatant 40 daqiqa davomida 10000 × g da qayta ishlandi. Pellet tashlab yuborildi va supernatant Beckman Coulterning SW55Ti tebranish chelakli santrifüj rotorlari yordamida Optima L-90K (Bekmann Kulter, Milan, Italiya) da 120 daqiqa davomida 10000×g da ultratsentrifugalash orqali qayta ishlandi. Heterojen hAFS-EV'larni o'z ichiga olgan granula PBS da 120 daqiqa davomida 100,000 × g da yakuniy santrifüjlash bilan yuvildi va keyin 0,22 um gözenek filtri membranasi bilan filtrlangan PBSda qayta suspenziya qilindi. hAFS-CM va hAFS-EVs yuzasida oqsil kontsentratsiyasi BiCinchoninic Acid (BCA) tahlili (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italiya) yordamida o'lchandi. Namunalar hAFS-CM va hAFS-EVs hosildorligini ug eritma/10 daraja ishlab chiqaruvchi hujayralar nuqtai nazaridan baholash uchun 570 nm da Gen5 Microplate Reader qurilmasida olindi.

4.6. Transmissiya elektron mikroskopiya va nanozarrachalarni kuzatish tahlili orqali hAFS-EVlarning tavsifi

Transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) tahlili Hitachi TEM mikroskopida amalga oshirildi (HT7800 seriyasi, Hitachi High Technologies, Monza, Italiya). Raqamli tasvirlar Mega view 3 kamerasi va Radius dasturi (EMSIS, Muenster, Germaniya) yordamida olingan. f-hAFS va p-hAFS hAFS to'liq muhiti bilan 1:1 nisbatda suyultirilgan 3,7 foizli paraformaldegid (PA) eritmasida fiksatsiya qilindi, 0.1 M kakodilat tamponida yuvildi va keyin darhol xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. 2,5 foiz glutaraldegidni o'z ichiga olgan 0,1 M kakodilat buferi (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, AQSh). Hujayralar granulalari lh uchun osmiy tetroksidda va 1% uranil asetat eritmasida 1 soat davomida mahkamlangan. Namunalar gradusli etanol seriyasi orqali 24 soat davomida 42 daraja va 48 soat 60 daraja suvsizlandi va epoksi qatroniga (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Germaniya) singdirildi. Ultra yupqa bo'laklar (50 nm) Leica Ultracut mikrotomi (Leica Microsystems, Milan, Italiya) bilan kesilgan va 50% etanol eritmasida 5% uranil asetat bilan bo'yalgan. f-hAFS-EVs va p-hAFS-EV'lar 20 uL PBS eritmasida qayta suspenziya qilindi va 0,1 M fosfat tampon eritmasida (pH7.4) teng hajmdagi 2 foiz paraformaldegid qo'shilishi bilan o'rnatildi. Keyin EV'lar 10 daqiqa davomida formvar-uglerod bilan qoplangan mis to'rlarga adsorbsiya qilindi, panjaralarni parafilmga 5 mkL tomchilarda suzib tashladi. Keyinchalik, yopishgan EV'li panjaralar PBSda yuvilgan va xona haroratida 5 daqiqa davomida 2 foizli uranil asetat eritmasi bilan salbiy bo'yalgan. Bo'yalgan panjaralar yaxshi saqlanishi uchun 2,5 foizli metiltsellyuloza ichiga solingan va tekshirishdan oldin havoda quritilgan. hAFS-EVs morfometriya tahlili 40.000× g kattalashtirishda tasodifiy olingan 10 ta mikrografda o'lchandi. Hajmi Radius dasturining (EMSIS, Muenster Germaniya) o'lchov dialog oynasiga o'rnatilgan ixtiyoriy chiziq funktsiyasi yordamida hisoblab chiqilgan. HAFS-EVs o'lchamlari taqsimotini tasavvur qilish uchun natijalar tarqalish nuqta grafigi va chastota taqsimoti sifatida chizilgan, bunda har bir o'lcham o'rtacha qiymat va diapazon uchun chiziqlar bilan birga nuqta sifatida ifodalanadi.

f-hAFS-EVs va p-hAFS-EV'lar 10 darajali hujayralar tomonidan chiqarilgan zarrachalarni baholash uchun Nanopartikullarni kuzatish tahlili (NTA) tomonidan ham tahlil qilindi. hAFS-EV'lar PBS eritmasida 1:100 nisbatda suyultirildi va har biri 60 soniyalik kamida 3 ta turli kadrlarni yozib olgan NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, Buyuk Britaniya) da olindi. Har bir namunaning uchta turli xil xaridlari dasturiy ta'minotdagi "Batch Process" opsiyasi yordamida tahlil qilindi. 4.7.LC-MS/MS hAFS-CM va hAFS-EVs tahlili 4.7.1.Eritma ichidagi hazm qilish

Proteomik tahlil hAFS-CM va hAFS ning 3 ta biologik nusxasida o'tkazildi. Normoksik yoki gipoksik oldindan shartlashdan so'ng f-hAFS va p-hAFS dan olingan EV'lar (n=24 xil shartlar).hAFS-CM va hAFS-EVs namunalari 0.1M NHCO3 pH 7.9 da to'xtatildi va RapigestIM bilan ishlov berildi. SF reaktivi (Waters Co, Milford, MA, AQSh) yakuniy konsentratsiyasida 0,25 foiz (w/v). Olingan suspenziyalar 1{19}}0 daraja 2{{40}} daqiqa davomida aralashtirib inkubatsiya qilindi. Ovqat hazm qilish har bir namunaga Sequencing Grade Modified Tripsin (Promega Inc, Madison, WI, AQSH) ferment/substrat nisbati 1:50 (w/w) 37 daraja haroratda 0,1 M NH4HCO3 pH7,9 da qo‘shilishi orqali amalga oshirildi. 10 foiz CHSCN bilan bufer. Ertalab qo'shimcha tripsin alikvoti (1:100 w/w) qo'shildi va hazm qilish 4 soat davom etdi. Bundan tashqari, 0,5 foizli trifloroasetik kislota (TFA) Gigma-Aldrich Inc., Sent-Luis, MO, AQSh) qo'shilishi fermentativ reaktsiyani to'xtatdi va keyingi 37 daraja 45 daqiqa davomida inkubatsiya RapiGest kislotasi gidrolizini yakunladi[108]. Suv bilan aralashmaydigan parchalanish mahsulotlari 10 daqiqa davomida 13.000 aylanish tezligida sentrifugalash orqali olib tashlandi. Nihoyat, triptik hazm qilish aralashmalari ishlab chiqaruvchi protokoliga muvofiq PierceTM C-18 spin ustunlari (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italiya) yordamida tuzsizlantirildi va 0,1 foizli chumoli kislotasida (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, AQSH) suvda (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, AQSh) 0,1 ug/mkl konsentratsiyada.

4.7.2.Suyuqlik xromatografiyasi

Tripsin hazm qilingan aralashmalar nano-suyuqlik xromatografik tizimidan tashkil topgan platforma yordamida tahlil qilindi, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D tizimi (Eksigent, AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, AQSh) tuzoq-elut rejimida tuzilgan, yuqori aniqlikdagi massa spektrometri bilan birlashtirilgan. Qisqacha aytganda, namunalar (0,8 ug AOK qilingan) avval peptid tuzoqqa yuklangan (200 um × 500 um ChromXP C18- CL,3 um,120 A) va izokratik rejimda ishlaydigan yuklash nasosi bilan 0,1 foizli chumoli kislotasi bilan suvda 10 daqiqa davomida 3 mkl/min oqimda yuviladi. O'n portli klapanning avtomatik o'zgarishi, so'ngra tutilgan aralashmani nano-teskari fazali ustunda (75 um × 15 sm ChromXP C18-CL,3 um,120 A) 150 daqiqalik gradient B gradienti orqali elutsiya qildi. (elyuent A, suvda 0,1 foiz chumoli kislota; elyuent B, asetonitrilda 0,1 foiz chumoli kislotasi) 300 nL/min oqim tezligida. Chuqur gradient quyidagicha edi: 5-10 foizdan 3 minut, 10-40 foiz quti 130 minut, 40-95 foiz quti — 10 daqiqa va 95 foiz B darajasida 7 daqiqa ushlab turish. 4.7.3.Mass-spektrometriya

MS/MS tahlillari nanospray ion manbai bilan jihozlangan LTQ-OrbitrapXL massa spektrometrida (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italiya) amalga oshirildi. Spray kapillyar kuchlanishi 1,7 kV ga o'rnatildi va ion uzatish kapillyar harorati 220 darajada ushlab turildi. Toʻliq MS spektrlari 400-1600 m/z diapazonda musbat ion rejimida, 60000 rezolyutsiya kuchi (yarim maksimalda toʻliq kenglik) va skanerlash tezligi 2 spektr/s bilan qayd etilgan. Bu bosqichdan soʻng MS/MSning toʻliq spektridan tanlangan eng yaxshi besh ion boʻyicha maʼlumotlarga bogʻliq holda ketma-ket hosil boʻlgan beshta past aniqlikdagi MS/MS hodisasi kuzatildi (toʻqnashuv energiyasining 35 foizida), 0,5 daqiqalik dinamik istisnodan foydalangan holda. MS/MS tahlili. Mass-spektrometr skanerlash funktsiyalari va yuqori samarali suyuq xromatografiya erituvchi gradientlari Xcalibur ma'lumotlar tizimining 1.4 versiyasi (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italiya) tomonidan nazorat qilindi.

4.7.4.Proteomik ma'lumotlarni qayta ishlash va ma'lumotlarni qazib olish

Barcha yaratilgan ma'lumotlar Thermo Scientific Proteome Discoverer dasturining 2.1 versiyasida joylashgan Sequest HT qidiruv tizimi yordamida qidirildi. Eksperimental MS/MS spektrlari 2-yanvarda yuklab olingan Uniprot Homo Sapiens proteom maʼlumotlar bazasini (74600 yozuv) kremniy hazm qilish natijasida olingan nazariy massa spektrlari bilan taqqoslash orqali triptik peptidlar ketma-ketligi bilan bogʻlangan. 020 (www.uniprot.org, 10 2-mart021-da ochilgan). Peptidlar ketma-ketligini va tegishli oqsillarni aniqlash uchun quyidagi mezonlar ishlatilgan: ferment sifatida tripsin, peptid uchun uchta o'tkazib yuborilgan bo'linish, prekursor ionlari uchun ± 50 ppm massa bardoshlik va fragment ionlari uchun ± 0,8 Da. Perkolator tugunidan maqsadli aldash strategiyasi bilan maksimal deltaCN 0,05 ni hisobga olgan holda Peptid Spektr Match (PSM) darajasida q-qiymatlari asosida 0,01 (qat'iy) yakuniy noto'g'ri kashfiyot tezligini (FDR) berish uchun foydalanilgan [109]. Faqat oltita aminokislotadan iborat minimal peptid uzunligi va birinchi darajali peptidlar ko'rib chiqildi. Proteinlarni guruhlash va qat'iy parsimonlik tamoyillari qo'llanildi. MS ma'lumotlari ProteomeXchange Konsortsiumiga PRIDE [10]hamkorlar ombori (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, 2021-yil 10-martda kirish) orqali saqlangan SEQUEST algoritmidan olingan 48 ta oqsil normallashtirildi. , va yorliqsiz solishtirilgan. Bu maqsadda protein uchun aniqlangan barcha spektrlarning o'rtacha qiymatiga mos keladigan peptid spektrining o'rtacha moslashuvi (aPSM) [111,112] dan foydalangan holda ichki algoritm, ya'ni, ko'p o'lchovli algoritm oqsil xaritasi (MAProMa) ishlatilgan. , uning nisbiy ko'pligiga, har bir tahlil qilingan holatda. Chuqur ravishda differentsial ifodalangan oqsillarni tanlash uchun kichik guruhlar (homila uchun ham, perinatal-hAFS-CM va hAFS-EVs uchun ham, shuningdek, gipoksik hujayralarni oldindan rag'batlantirishni hisobga olgan holda) ikkita MAProMada 0,4 va 5 chegarasini qo'llash orqali juftlik bilan taqqoslandi. mos ravishda DAve (differensial o'rtacha) va DCI (differensial ishonch indeksi) indekslari. Protein ifodasidagi o'zgarishlarni baholovchi DAve (XY)/(X＋Y)/0,5, differensial ifoda ishonchini baholovchi DCI esa (X plus Y)×(XY)/2 X va Y sifatida belgilangan. atamalar ikki taqqoslangan namunada berilgan oqsilning PSM ni ifodalaydi. Bundan tashqari, har bir tekshirilgan holatdan olingan o'rtacha protein ro'yxatlari chiziqli diskriminant tahlili (LDA) va eng katta F nisbati (4,5 dan katta yoki unga teng) va eng kichik p-qiymati (Kam yoki teng) bo'lgan oqsillarga duchor bo'ldi. 0.001) JMP 15.2 dasturiy ta'minotidan foydalangan holda Uord usuli va Evklidning masofa o'lchovini qo'llagan holda ierarxik klasterlash orqali saqlangan va qayta ishlandi. Xususan, F nisbati o'rtacha xato kvadratiga bo'lingan modelning o'rtacha kvadratini ifodalaydi, p-qiymati esa, agar haqiqatda aholi guruhi o'rtasida farq bo'lmasa, hisoblangan qiymatdan kattaroq F qiymatini olish ehtimolini ko'rsatdi. 4.8. HAFS-CM va have-EV'larning sitokin va kimyokin profili

F-hAFS va p-hAFS tomonidan gipoksik oldindan shartlashdan so'ng olingan hAFS-CM va have-EV'larning sitokin va kemokin profili Proteome ProfilerTM Human XL Cytokin Array to'plami (R&D System, Minneapolis, MN, AQSh) orqali baholandi. ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalari. Yigirma ug hAFS-CM va hAFS-EVs namunalari ishlatilgan. Membran tasvirlari Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, Buyuk Britaniya) tomonidan olingan. Maxsus sitokin/ximokin tarkibi ImageJ dasturidan foydalangan holda har bir aniqlanadigan sitokin uchun musbat piksel intensivligini (ixtiyoriy birlik yordamida) miqdoriy aniqlash orqali baholandi (https saytida mavjud: //imagej.nih.gov/ij/, 2021-yil 10-martda kirilgan [13]). 4.9.HAFS-EVlardan RNK ekstraktsiyasi va Keyingi

Generation Sequencing

RNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Milan, Italiya) bilan f-hAFS-EVs va p-have-EV'lardan ajratilgan. RNK yaxlitligi va hajmi taqsimoti 6 dan 150 nukleotid (nt) gacha bo'lgan kichik RNK tarkibini baholash uchun kichik kodlanmagan RNK chipiga ega Agilent Small RNK Kit yordamida baholandi. Qubit mikroRNK tahlil to'plami (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italiya) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda mikroRNK (miRNK) miqdorini aniqlash uchun ishlatilgan. miRNK ketma-ketlik kutubxonalari QIAseq miRNA kutubxonasi to'plami (Qiagen, Milan, Italiya) yordamida 18,5 ng izolyatsiyalangan miRNKlardan kirish sifatida va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda tayyorlangan va kuchaytirilgan. Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape yordamida TapeStation (Agilent Technologies, Foster Siti, CA, AQSH) tomonidan sifat tekshiruvi va miqdorini aniqlashdan so'ng kutubxonalar birlashtirildi. Birlashtirilgan kutubxonalar “Sequencing Library qPCR Quantification” qoʻllanmasiga (Illumina Inc, San-Diego, CA, AQSH) amal qilgan holda real vaqt rejimida qPCR orqali sifat nazorati uchun baholandi va High Output Hit v2.5(75 sikl) yordamida Illumina NextSeq platformasi tomonidan ketma-ketlashtirildi. Illumina Inc, San-Diego, CA, AQSh). Asosiy qo'ng'iroq standart Illumina NextSeq500 ish jarayoni bilan amalga oshirildi.

4.10. miRNK ketma-ketligining bioinformatik ma'lumotlar tahlili

Fastq fayllari dastlab Cutadapt [114] yordamida 3' adapter va past sifatli bazalarni kesish orqali qayta ishlandi. Kesishdan so'ng, kiritish ketma-ketliklari va UMI ketma-ketliklari aniqlandi. Adapter ketma-ketligisiz o'qishlar, 16 bp dan kam kiritish ketma-ketligi bilan o'qishlar va 10 bp dan kam UMI ketma-ketliklari bilan o'qishlar bekor qilindi. Qo'shish ketma-ketligiga izoh berish uchun o'qishlar Bowtie yordamida GRCh38 inson genomi yig'ilishiga moslashtirildi [15]Har bir namuna uchun ma'lum bir miRNKga tayinlangan barcha o'qishlar hisoblandi va noyob molekulalarni hisoblash uchun bog'langan UMIlar yig'ildi. Ikkilamchi tahlil oqilona so'rov bo'yicha mavjud bo'lgan maxsus R skriptlar tomonidan amalga oshirildi. Differensial boyitish tahlili Limma [116] va EdgeR Bioconductor paketlari [117] yordamida amalga oshirildi.

4.11. Statistik tahlillar

Natijalar kamida uchta(n{0}}) mustaqil eksperimentning oʻrtacha ±semisi sifatida taqdim etiladi. Taqqoslashlar bir tomonlama ANOVA, so'ngra posthoc Tukeyning ko'p taqqoslash testi yoki Student t-testi bilan chizilgan. Tahlillar Graph-Pad Prism Version 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, 2021-yil 10-martda ochilgan) yordamida statistik ahamiyati * p da oʻrnatildi.<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

Xulosa qilib aytganda, homila va perinatal hAFS fenotipik jihatdan taqqoslanadigan sekretor quvvati va hajmi va taqsimlanishi bo'yicha EV boyitish bilan ekvivalentligi aniqlandi; ammo ularning sekretom profilidagi ba'zi farqlarni qadrlash mumkin. Xususan, xomilalik hAFS ning rivojlanishda etuk bo'lmagan profilini ularning aniqroq provaskulogen, pro-regenerativ va yoshartiruvchi sekretom bilan ta'minlangan sekretom formulalari bilan takrorlash mumkin. Biroq, perinatal hAFS homila hAFSga o'xshash endotelial hujayralar migratsiyasi, immun-modulyatsion, yallig'lanishga qarshi va neyrotrofik potentsial bilan bog'liq omillarni ifodalash orqali tegishli parakrin profilini saqlab qoladi. Ushbu topilmalar jarohatlar bilan bog'liq va yallig'lanish / ishemik kasalliklarning kelajakdagi parakrin terapiyasini qo'llab-quvvatlovchi foydali tushunchalar berishi mumkin. Shuning uchun homila yoki perinatal hAFS ni eng ideal hujayra manbai sifatida tanlash maxsus klinik stsenariyni hisobga olgan holda baholanishi kerak.

Ushbu maqola Int.dan olingan. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms