CRISPRi vositachiligida Escherichia Coli-da ishlab chiqilgan yagona yo'naltiruvchi RNK bilan gen ifodasi darajasini sozlash mumkin bo'lgan nazorat

ANTRACT

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-katlama). Ushbu sgRNKlar, shuningdek, turli maqsadli DNK ketma-ketliklari bilan modulli tartibga solish imkonini berdi. Biz ushbu tizimni metabolik oqimni prognoz qilinadigan nisbatda violacein hosilalarini ishlab chiqarish va likopen ishlab chiqarishni optimallashtirish uchun qayta taqsimlash uchun qo'lladik. Ushbu tizim metabolik muhandislik va sintetik biologiyada oqimlarni optimallashtirish jarayonlarini tezlashtirishga yordam beradi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

KIRISH

II turdagi klasterli muntazam intervalgacha qisqa palindromik takrorlar (CRISPR)/CRISPR bilan bog'langan (Cas) tizimi CRISPR RNK (crRNA), trans-aktivlashtiruvchi CRISPR RNK (tracrRNA) va Cas9 oqsilidan tashkil topgan RNK tomonidan boshqariladigan DNK bo'linish tizimidir (1). ,2). Streptococcus pyogenes dan Cas9 o'zining yaxshi tavsiflangan xususiyatlari tufayli genom muhandisligida keng qo'llanilgan (3,4). SpCas9 oqsili, tracrRNK va crRNK kompleksi 5'-NGG-3' protospacer qo'shni motif (PAM) ishtirokida crRNKning 20 nukleotid (nt) bo'sh joy ketma-ketligini to'ldiruvchi maqsadli DNK protospaserini bog'laydi va ajratadi. ) ketma-ketligi (5,6). Tizimni soddalashtirish uchun crRNK va trakrRNK tetraloop deb ataladigan sun'iy bog'lovchi bilan birlashtirilgan kimerik yagona yo'naltiruvchi RNK (sgRNK) dan foydalanish mumkin (5). Bu ikkita alohida RNKni bitta RNK molekulasi bilan almashtirishga imkon beradi, bu esa tizimni yanada qulayroq qiladi. CRISPR-ga asoslangan tizimlardan biri, CRISPR interferensiyasi (CRISPRi), har bir endonukleaza domenidan ma'lum aminokislotalarni almashtirish orqali katalitik faol bo'lmagan Cas9 (dCas9) dan foydalanadi (7). Ushbu modifikatsiya ribonukleoprotein (RNP) kompleksini hosil qiladi, u maqsadli DNKni yo'naltiradi va bog'laydi va transkripsiya boshlanishi yoki cho'zilishini inhibe qilish uchun RNK polimeraza (RNAP) bilan aralashadi (7). CRISPR/Cas9 tizimining nokautidan farqli o'laroq, CRISPR induksiyali promotor ostida dCas9 yoki sgRNKni ifodalash orqali genlarni teskari nokaut qilish imkonini beradi, bu esa genlarni tartibga solishda ko'proq moslashuvchanlikni ta'minlaydi (7). CRISPRi tizimi maqsadli genlarni yuzlab marta samarali ravishda o'chirib qo'ydi (7,8). Maqsadga xos gen repressiyasi genom bo'ylab sgRNK hovuzidan foydalangan holda yuqori samarali fenotiplashni ta'minlaydi (9) yoki ishlab chiqilgan bakteriyalardagi uglerod oqimini maqsadli kimyoviy (10-12) tomon yo'naltiradi. Bundan tashqari, multipleks CRISPRi bir nechta sgRNKlarni barqaror ifodalash uchun turli xil usullardan foydalangan holda turli xostlarda namoyish etilgan, jumladan, uzun crRNK massivlari, toehold switch integratsiyasi va takrorlanmaydigan uzoq sgRNK massivlari (13-16). Bir vaqtning o'zida bir nechta genlarni inhibe qilishning ushbu usullari zaharli oraliq moddalarni kamaytirish yoki bakterial fermentatsiyadagi raqobatdosh yo'llarni blokirovka qilish kabi murakkabroq vazifalarni bajarish uchun ishlatilgan (13,16-19). Biroq, metabolik muhandislik uchun to'liq repressiya har doim ham istalmagan. O'sish va ishlab chiqarish yo'llari o'rtasida optimal ferment faolligiga erishish, hujayra ichidagi prekursor kontsentratsiyasini muvozanatlash va zaharli oraliq mahsulotlarning to'planishiga yo'l qo'ymaslik uchun gen ekspresyon darajalarini aniq nazorat qilish kerak (20-22). CRISPri ning repressiya samaradorligini yaratish uchun turli xil texnikalar ishlab chiqilgan. sgRNK va dCas9 oqsili miqdori yoki sgRNK tanlovi kabi bir qancha omillar manipulyatsiya qilingan. Induksiyalanuvchi promotor yordamida dCas9 ifodasini yoki ikkala dCas9 va sgRNA ifodasini boshqarish maqsadli gen ekspressiyasini mos ravishda 30-katta yoki 300-kattadan koʻproq tartibga soladi (23,24). Biroq, dCas9 kontsentratsiyasini modulyatsiya qilish turli protospacerlarda (23) nomuvofiq repressiya samaradorligiga olib kelishi mumkinligi kuzatildi. Mavjud induktiv promouterlarning cheklangan soni ko'p harakatlarga qaramay dizayn muammolarini keltirib chiqaradi (25). Yana bir strategiya ligandga xos RNK aptamerini sgRNKga kiritishdir, bu yerda kichik qarindosh molekula spacerni ochishi mumkin va shu bilan CRISPRi ni dozaga bog'liq boshqarish imkonini beradi (26). Agar mos ligand va aptamer jufti mavjud bo'lsa, ligandga xos sgRNK foydali bo'ladi. Transkripsiyani boshlash joyidan masofa va dCas9 ulanishining yo'nalishi ham CRISPRi samaradorligiga ta'sir qiladi (7). SgRNKni bog'lash joyi va transkripsiyani boshlash joyi orasidagi masofani sozlash metabolik muhandislikda yo'lni optimallashtirishi mumkin (17,27,28). Spacer va protospacer ketma-ketligi o'rtasidagi gibridlanish samaradorligi ham RNP kompleksini ulash samaradorligini o'zgartiradi (29-31). Shuning uchun, CRISPri samaradorligini diversifikatsiya qilish uchun bo'sh energiyani o'zgartirish uchun urug'lik hududidan tashqarida ishlab chiqilgan mos kelmasliklar kiritilgan (31,32). Biroq, sgRNKni loyihalash har bir yangi maqsadli ketma-ketlik uchun talab qilinadi va faqat mos kelmaslik orqali bo'sh energiyada sezilarli farqga erishish qiyin bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, maqsaddan tashqari bog'lanishning kuchayishi ehtimoli mavjud (33). Shunga qaramay, u maqsadli ketma-ketlikdan qat'i nazar, modulli tarzda bir nechta gen ifodalarini aniq repressiya qilish bilan cheklangan. Ushbu tadqiqotda biz sozlanishi mumkin bo'lgan CRISPRi tizimini ishlab chiqdik, bu gen ekspressiyasini yuqori aniqlik va bashorat qilish bilan tartibga soladi. Tetraloop va uning yonma-yon mintaqasiga mo‘ljallangan sgRNK kutubxonasini takroriy floresans asosida hujayra saralash orqali biz maqsadli DNK o‘zgartirilganda ham 45- barobargacha transkripsiyaviy repressiya samaradorligiga erishdik. Ushbu tizim metabolik yo'llarni optimallashtirish uchun istiqbolli vositani ta'minlab, xost genomini yoki sintetik yo'llarni manipulyatsiya qilmasdan metabolik oqimni oldindan aytib bo'ladigan qayta taqsimlash imkonini beradi.

MATERIALLAR VA USULLAR

Bakterial shtammlar, plazmidlar va reagentlar

Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan Escherichia coli shtammlari va plazmidlari S1 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan primerlar S2 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. Klonlash protseduralari qo'shimcha usullarda tasvirlangan. Maqsadli genlar va ularning CRISPR tizimi uchun maqsadli DNK ketma-ketliklari S3 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. Mach1-T1R umumiy klonlash uchun ishlatilgan. Kutubxona NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB) yordamida qurilgan. Plazmidlar va shtammlarni yaratish uchun muntazam kulturalar Luria-Bertani (LB) bulonida yoki tegishli antibiotiklar (34 g/ml xloramfenikol, 50 g/ml spektinomitsin) bo'lgan LB agar plastinkasida 37°C da o'tkazildi. PCR Q5® High-Fidelity DNK Polimerase (NEB) yordamida amalga oshirildi. Plazmidlar va PCR mahsulotlari GeneAll® Exprep™ Plazmid SV to'plami va Gel SV to'plami (GeneAll Biotechnology) yordamida tozalandi. sgRNK mutantlarining repressiya samaradorligi Kecha davomida madaniyat muhiti 0.05 ning OD600 ga yangilandi va u 0,6 va 0,8 orasidagi qiymatga yetguncha inkubatsiya qilindi. Keyin madaniyat muhiti 20 ng/ml aTc bilan 0,05 OD600 ga suyultirildi va 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Bitta koloniyaning floresansi Hidex Sense mikroplata o'quvchi (Hidex) yordamida 575 nm/616 nm da o'lchandi va OD600 qiymati Jenway 7300 spektrofotometri (Jenway) yordamida aniqlandi. Nisbiy floresans OD600 qiymati bo'yicha floresans birliklari sifatida hisoblab chiqilgan, kompyuter uchun qiymat 100% qilib belgilangan.

Cistanche tubulosa ta'siri - ich qotishini davolash

sgRNA kutubxonasi skriningi

Yuqorida tavsiflangan bir xil madaniy usul ishlatilgan. Madaniyat muhiti [hujayra] ga suyultirildi<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

RNK ekstraktsiyasi

Jami RNK RNeasy Mini Kit (Qiagen) yordamida faqat sgRNK miqdorini aniqlash uchun miRNeasy Mini Kit (Qiagen) yordamida, RNAprotect Bakteriya Reagenti (Qiagen) bilan ishlov berilgandan so'ng va -80◦C haroratda saqlanganida ajratilgan. Ekstraksiya jarayonida RNase-Free DNase Set (Qiagen) yordamida ustunda DNK hazm qilish amalga oshirildi. DNKning ifloslanishi teskari transkripsiyasiz PCR orqali tekshirildi. Har bir namunaning konsentratsiyasi va tozaligi NanoDrop One (Thermo Scientific) yordamida aniqlandi va sifati LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer) da DNK 5K/RNK/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) yordamida baholandi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

RT-qPCR tahlili

RT-qPCR uchun primerlar laboratoriya zaxirasidan olingan yoki Primer3Plus vositasi (34) yordamida ishlab chiqilgan va S4 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. CysG geni barcha RT-qPCR tajribalari uchun mos yozuvlar gen (35) sifatida ishlatilgan. Shablonni 107 nusxa/l dan 10−1 nusxa/l gacha 10-katta suyultirish orqali standart egri chiziq hosil qilindi. Miqdorni aniqlash chegarasi sigmasimon funktsiyaga nusxa ko'chirish raqami va ijobiy kuchaytirish tezligini moslashtirish va 95% musbat nusxa raqami qiymatini hisoblash orqali aniqlandi. Chiziqli dinamik diapazon qayta hisoblangan Cq o'zgarishi 35% dan kam bo'lgan eng past nusxa raqami sifatida aniqlandi. 30 dan yuqori Cq qiymatlari yoki shablon bo'lmagan nazoratda kuchaytirilmaganlar tasdiqlandi. Standart egri chiziq ma'lumotlari S5 qo'shimcha jadvalida va S1 qo'shimcha rasmda mavjud. Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB) bilan 10 l RT-qPCR reaktsiyasida jami 2,5 ng umumiy RNK ishlatilgan. RT-PCR quyidagi bosqichlar bilan StepOnePlus™ RealTime PCR tizimida (Applied Biosystems) uch nusxada amalga oshirildi: (i) teskari transkripsiya 55°C da 10 daqiqa, keyin 95°C da 1 daqiqa davomida denaturatsiya; (ii) 95 ° C da 10 s va 60 ° C da 1 daqiqa davomida 40 ta termal aylanish; (iii) 95◦C da 15 s va 60◦C da 1 daqiqa davomida erish egri chizigʻini tahlil qilish, keyin 0,3◦C/min tezlikda 60◦C dan 95◦C gacha boʻlgan rampa. RNKning nisbiy miqdori delta-deltaCt usuli (36) yordamida aniqlandi va StepOnePlus™ Software (Applied Biosystems) yordamida tahlil qilindi.

RNK ketma-ketligi (RNK-seq) va ma'lumotlarni tahlil qilish

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{0}}.92 FPKM (Fragments per Kilobase transkript boshiga million xaritalangan oʻqish) asosida. Differensial ravishda ifodalangan genlar 1,5 (log2-ga asoslangan) va 0,01 (q-qiymati) chegarasidan olingan.

Proviolacein va prodeoksiviolacein ishlab chiqarish va namuna olish

Violacein va prodeoksiviolacein ishlab chiqarish uchun quyidagi vosita tarkibi ishlatilgan: 10,7 g/l K2HPO4, 5,2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}},2 g/l xamirturush ekstrakti va 1{{20}} g/l glyukoza. Bir kechada kultura muhiti OD600 ning 0.1 darajasiga yangilandi va OD600 0,6 va 0,8 ga yetguncha yetishtirildi. Keyin madaniyat muhiti 0,1 OD600 ga suyultirildi va 500 ng / ml aTc, 0,05 mM IPTG va 0,1 g / l L-triptofan bilan yakuniy 5 ml hajmgacha qo'shildi. 300 l madaniy muhit namunasi olindi va HPLC tahlili uchun hujayra pelletini olish uchun 14 000 aylanish tezligida 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi va RNK ekstraktsiyasi uchun 300 l madaniy muhit namunasi olindi.

HPLC tahlili

Violacein biosintetik yo'lini tahlil qilish uchun hujayra pelleti {0}}hajmli metanolda qayta suspenziya qilindi, 5 daqiqa davomida ultratovushga o'tkazildi, santrifüj qilindi va 0.22-m neylon filtr orqali filtrlandi. HPLC tahlili Poroshell 120 EC-C18, 4,6 × 150 mm, 4 m ustun (Agilent) bilan (42) usulga amal qildi. Ikki mobil faza, DDWda 0,1% chumoli kislotasi bo'lgan A va asetonitrilda 0,1% chumoli kislotasi bo'lgan B, quyidagi gradient profili bilan 0,6 ml / min oqim tezligida ishlatilgan: 1,5 daqiqa davomida 95% A, 95 dan ramping A. 4 daqiqa davomida % dan 2% gacha, 2 daqiqa davomida 2% A ni ushlab turish, 30 soniya davomida A ni 2% dan 95% gacha oshirish va 95% A ni 10 daqiqa davomida saqlash. Namunalar PDA detektori yordamida aniqlandi va HPLC maydoni violacein uchun 600 nm va prodeoksiviolacein uchun 610 nm da aniqlandi.

Likopen ishlab chiqarish va namuna olish

Likopen ishlab chiqarish uchun quyidagi vosita tarkibi ishlatilgan: 13,56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0,1 ml 1 M CaCl2 va 4 g/l glyukoza (22). 27 g/ml xloramfenikol va 50 g/ml spektinomitsin ishlatilgan. Bir kechada kultura muhiti OD6{26}}0 dan 0.1 ga, yakuniy hajmi 5 ml ga yangilandi. OD6{35}}0 0,5 dan 0,6 gacha yetganda, aTc 500 ng/ml yakuniy konsentratsiyaga qo‘shildi va OD600 0,9 va 1 gacha yetganda, IPTG 0,02 mM yakuniy konsentratsiyaga qo‘shildi. Likopen ma'lumotnomada (22) ta'riflanganidek, aseton yordamida ekstraksiya qilingan. Likopen konsentratsiyasi standart egri chiziq yordamida Jenway 7300 spektrofotometri yordamida 475 nm da absorbansdan olingan. RNK ekstraktsiyasi uchun 300 l madaniy muhitdan namuna olindi.

Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi

NATIJALAR VA MUHOKAMA

SgRNKdagi mutatsiyalarning CRISPR tizimining repressiya samaradorligiga ta'siri

CRISPRi tizimi dCas9-sgRNA-DNK uchlamchi kompleksi bir-biriga kuchli bog'langanda gen ifodasini bostirishi mumkin. Biz CRISPRi tizimining repressiya samaradorligini RNP kompleks shakllanishini modulyatsiya qilish orqali ma'lum darajaga o'zgartirish mumkinligini taxmin qildik. CRISPR tizimining repressiya samaradorligini miqdoriy baholash uchun biz S. pyogenes dan dCas9 anhidrotetratsiklin (aTc) tomonidan qo'zg'atilgan va ikkala reportyor gen (mCherry) va sgRNK variantlari konstitutsiyaviy ravishda ifodalangan genetik sxemaga asoslangan floresan hisobot tizimini ishlab chiqdik (rasm) 1A). Muhitga aTc qo'shilgach, dCas9-sgRNA- DNK uchlamchi kompleksi reportyor genning transkripsiyasini bloklaydi va floresans darajasi CRISPR tizimining repressiya samaradorligini teskari ko'rsatadi. sgRNK jami 96 ta nukleotidni (nts) o'z ichiga oladi. Spacer hududi (birinchi 20 nt) maqsadli DNK ketma-ketligi bilan bog'lanadi, qolgan 76 nt esa kompleks shakllanishi va barqarorligiga hissa qo'shadi. Spacer mintaqasidagi nomuvofiqliklar o'ziga xoslikni yo'qotishi va CRISPR-ga asoslangan tizimda maqsaddan tashqari ta'sirlarni kuchaytirishi mumkinligi sababli (33,43), ishlab chiqilishi mumkin bo'lgan sgRNKning maksimal uzunligi 76 nts ni tashkil qiladi. Bunday holda, kutubxona hajmi 476 (taxminan 1045) olinishi kerak, lekin uni qurish uchun juda katta. Shunday qilib, sgRNKda aniq pozitsiyalarni aniqlash orqali kutubxona hajmini qisqartirish talab etiladi. Biz birinchi navbatda har bir mintaqadagi sgRNK mutatsiyalari CRISPR tizimidagi repressiyaga qanday ta'sir qilishini tekshirdik. Oldingi tadqiqot shuni ko'rsatdiki, 1-poyadagi (sg mut01 va sg mut02) mutatsiyalar Cas9 nukleaza faolligining sezilarli pasayishiga olib keldi, 2-poyadagi (sg mut03) yoki 3-poyali halqadagi (sg) mutatsiyalar. mut04) uning faoliyatiga ta'sir qilmadi (44). Ildiz-qovuzoq 1 mintaqasi va takroriy, tetraloop, takrorlashga qarshi va ildiz-pastga 2 hududlaridagi mutatsiyalarni o'z ichiga olgan qayta tiklangan sgRNK (sg mut05) ham nukleaza faolligini pasaytirdi (44). Biroq, CRISPRi tizimida barcha besh sgRNA varianti yovvoyi turdagi sgRNK (sg WT) bilan solishtirganda repressiya samaradorligiga juda oz ta'sir ko'rsatdi, har bir variant bo'sh joysiz musbat nazorat bilan solishtirganda 2-4% floresans darajasini ko'rsatdi ( sg PC) (1B-rasm). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, dCas9-sgRNA kompleksining shakllanishi CRISPR/Cas9 tizimidan farqli o'laroq, CRISPRi tizimidagi stend-loop 1 mintaqasida ketma-ketlikni o'zgartirishga nisbatan kam sezgir. Kompleksning barqarorligi bilan bog'liq bo'lgan hududlarni olib tashlash, ifodani bir necha darajalarda nazorat qilish uchun boshlang'ich nuqta bo'lishi mumkinligini taxmin qildik. Shu maqsadda biz bog‘lovchi, 2-poyasi va 3-poyasi-pastagiga ega bo‘lmagan kesilgan sgRNK (sg trcSL1) ni yaratdik. Bu kesilgan sgRNK minimal miqdordagi komponentlarga ega va CRISPRda nukleaza faolligini sezilarli darajada kamaytirishi ko‘rsatilgan. Cas9 tizimi (5,44). CRISPRi tizimida sinovdan o'tkazilganda, bu nuqsonli mutant sg PC bilan solishtirganda 8% floresans darajasini ko'rsatdi, bu u hali ham dCas9 bilan bog'lanishi va uchlik kompleks barqarorligi pasaygan taqdirda ham ma'lum darajada qiziqish genini bostirishi mumkinligini ko'rsatdi (1B-rasm). RNP kompleksining strukturaviy tahlili shuni ko'rsatadiki, sgRNKning bog'lovchi, 2-poyasi va 3-poyasi-loop hududlari dCas9 ning yadroviy domeni bilan o'zaro ta'siri orqali kompleksni barqarorlashtirish uchun javobgardir, bu esa indelning sezilarli darajada pasayishiga olib keladi. CRISPR/Cas9 tizimidagi samaradorlik (44). Aksincha, takrorlash: takrorlanishga qarshi mintaqa va sgRNKning 1-poyasi asosan dCas9 ning tanib olish va PAM o'zaro ta'sir qiluvchi domenlari bilan o'zaro ta'sir qiladi va CRISPR/Cas9 tizimidagi indel samaradorligiga sezilarli ta'sir ko'rsatmaydi (44). Ushbu natija sg trcSL1 CRISPR/Cas9 tizimidagi nukleaza faolligini sezilarli darajada kamaytirgani va CRISPRi tizimidagi bog'lanish yaqinligiga ozgina ta'sir qilgani haqidagi kuzatishni qo'llab-quvvatlaydi.

Shakl 1. Tizimning tuzilishi va sgRNK mutatsiyasining repressiya samaradorligiga ta'siri. (A) Repressiya samaradorligini aniqlash uchun ikkita plazmid tizimi. P15A kelib chiqishi bo'lgan bitta plazmid aTc-induktsiyali promotor ostida dCas9 genini va konstitutsiyaviy promouter ostida mCherry genini o'z ichiga oladi. CloDF13 kelib chiqishi bo'lgan boshqa plazmid konstitutsiyaviy promouter ostida yovvoyi turdagi yoki mutant sgRNKni o'z ichiga oladi. (B) Har bir sgRNA mutantining nisbiy floresansi (sg mut01 ∼ sg mut05 va sg trcSL1) va sg WT sg PC bilan solishtirganda. +1 dan + 20 gacha boʻlgan mCherry geniga bogʻlovchi ajratuvchi ketma-ketlikdir. sg PC: musbat nazorat sifatida spacersiz sgRNA, sg WT: yovvoyi turdagi sgRNK. Xato satrlari standart ogʻishni bildiradi (n=3). P-qiymatlari juftlashtirilmagan t-testi bilan aniqlandi. ns: muhim emas, **P< 0.01

Ko'p darajali ifoda boshqaruvi uchun murakkab shakllanish samaradorligini o'zgartirish

Tetraloop - bu CRISPR-Cas9 tizimidagi crRNK va tracrRNKni bog'laydigan sun'iy bog'lovchi (5). dCas9, crRNK va tracrRNK dan tashkil topgan uchlamchi kompleksning kristall tuzilishi tetraloop va uning 5 va 3 yon tomonlari dCas9 bilan kam aloqada ekanligini ko'rsatdi (44). Shu bilan birga, takroriy takrorlash: takrorlashga qarshi va 1-stem-loop mintaqalari funktsional kompleks uchun juda muhimdir (44). U dCas9 bilan to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sir qilmaganligi sababli, tetraloop va uning yon tomonlari sgRNKga qo'shimcha oqsillarni jalb qilish uchun aptamer ketma-ketliklarini kiritish kabi qo'shimcha komponentlar bilan sgRNKni yaratish uchun potentsial saytlar sifatida o'rganilgan (45,46). Ushbu mintaqadagi mutatsiyalar kompleksni to'liq buzmasdan sgRNA va dCas9 o'rtasidagi bog'lanish yaqinligini diversifikatsiya qilishi mumkin. sgRNA va dCas9 oʻrtasidagi kompleks hosil boʻlish samaradorligini yanada pasaytirish uchun shablon sifatida sg trcSL1 yordamida 12- mer tasodifiy kutubxona (4 nt tetraloop mintaqasi va mos ravishda 4 nt 5 va 3 yonbosh mintaqa) qurilgan (2A-rasm). ). Biz sg WT (to'liq repressiv holat) va sg PC (repressiv bo'lmagan holat) o'rtasidagi repressiya samaradorligini qamrab oluvchi turli sgRNK mutantlarini olish uchun ikki bosqichli saralash strategiyasini qo'lladik. Biz asl kutubxonani turli floresans intensivlik diapazonlariga ega bo'lgan kichikroq kutubxonalarga ajratdik va keyin kichikroq kutubxonadan har bir sgRNA variantining floresansini alohida aniqladik. Oqim sitometriyasi yordamida olingan asl kutubxonaning floresan taqsimoti sg PC bilan deyarli bir xil edi (2B-rasm). Biroq, ketma-ket uchta tartiblash bosqichidan so'ng, har bir kutubxona (yuqori, o'rta va past) sg PC bilan solishtirganda mos ravishda 63%, 24% va 14% o'rtacha floresans darajalariga ega edi (2B-rasm). Ushbu kichik kutubxonalardan 82 ta koloniya ajratilgan, floresans darajasi 8% dan 104% gacha (2C-rasm). Ushbu natijalar mutatsiyaga uchragan tetraloop va uning sgRNKning yon tomonlari turli repressiya samaradorligi uchun dCas9 va sgRNA o'rtasidagi bog'lanish yaqinligini modulyatsiya qilishi mumkinligini ko'rsatadi. teskari transkripsiya miqdoriy PCR (RT-qPCR) 10 sgRNK mutantlarining (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, qo‘shimcha jadval S6) sg WT va sg PC o‘rtasida turli floresans signallari bilan tahlili 82 sgRNK koloniyalari darajasining ortib borayotganini ko‘rsatdi. , bu bizning CRISPRi tizimimiz transkripsiya darajasida gen ifodasini nazorat qilishini ko'rsatadi (qo'shimcha S2 rasm). Bizning sozlanishi mumkin bo'lgan CRISPRi tizimi dCas9 yoki sgRNK miqdorini o'zgartirmasdan, repressiya samaradorligini aniq sozlash imkonini beruvchi 45-kattagacha repressiya nazoratiga erisha oladigan, ishlab chiqilgan sgRNKlardan foydalanadi. Bizning tizimimizning muhim afzalligi shundaki, u qo'shimcha klonlash zarur bo'lsa ham, kutilmagan oqibatlarga olib kelmasdan, ma'lum sgRNK variantlari orqali repressiya samaradorligini aniq sozlashi mumkin. Bundan tashqari, o'sish egri chizig'i bizning tizimimizga sezilarli uyali yuk yuklamasligini ko'rsatadi (Qo'shimcha rasm S3). Bundan tashqari, turli darajadagi repressiya samaradorligiga ega bo'lgan uchta sg trcSL1 variantidagi RNK-Seq, sg WTda o'zgartirilgan 262 gendan farqli o'laroq, 51 dan 83 gacha genlarning ifodasi o'zgarganligini ko'rsatdi (Qo'shimcha rasm S4). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, sg trcSL1 variantlari an'anaviy CRISPRi tizimiga qaraganda kamroq maqsadli ta'sirga ega. Metabolik yo'llarni optimallashtirish ko'pincha bir nechta genlarni manipulyatsiya qilishni o'z ichiga olgan metabolik muhandislik dasturlarida ayniqsa dolzarbdir. Salbiy nojo'ya ta'sirlarni keltirib chiqarmasdan, gen ifodasini nozik sozlash qobiliyati optimallashtirish jarayonini sezilarli darajada tezlashtirishi va tizimning umumiy samaradorligi va unumdorligini oshirishi mumkin.

Shakl 2. sgRNK kutubxonasining tuzilishi va kutubxonaning skriningi. (A) ushbu tadqiqotda foydalanilgan sgRNK iskala. 12-SgRNA kutubxonasini olish uchun tetraloop va uning yonma-yon ketma-ketligi sg trcSL1 dan tasodifiy mutatsiyaga uchraydi. (B) saralashdan oldin (chapda) va keyin (o'ngda) oqim sitometriyasidan olingan floresans taqsimoti. Har bir tarqatishda 100,000 katak mavjud. (C) (B) dan olingan yagona koloniyalarning floresansi. Xato satrlari standart og'ish (n=2)ni bildiradi.

dCas9 va sgRNK miqdorining repressiya samaradorligiga ta'siri

dCas9 yoki sgRNA miqdorini modulyatsiya qilish CRISPRi tizimining repressiya samaradorligini o'zgartirishi mumkinligi sababli (23,24), dCas9 va sgRNA miqdorining repressiya samaradorligiga ta'sirini o'rganish kerak. Biz o'nta sgRNA mutantlari (sg trcSL1c1-sg trcSL1c10) yordamida dCas9 va sgRNA miqdorini o'zgartirish orqali turli sharoitlarda tizimimizning ishlashini sinab ko'rdik. dCas9 ifodasi uchun induktorning uch xil konsentratsiyasi (20, 100 va 500 ng/ml) ishlatilgan. 20 ng/ml induktor ishlatilganda dCas9 mRNK darajasi bilan solishtirganda, u yana 15- marta (100 ng/ml) va 22- barobar (500 ng/ml) ga oshdi (Qoʻshimcha rasm S5A ). dCas9 ning haddan tashqari ifodalanishi haqida xavotirlar mavjud, chunki dCas9 ning yuqori darajasi hujayralar uchun zaharli bo'lishi mumkin (47,48) yoki ba'zan (49). Biroq, turli induktor konsentrasiyalarida o'sish egri chizig'iga ko'ra, 500 ng/ml gacha aTc ishlatilganda o'sish sur'ati 10% dan kamroqqa kamaydi (Qo'shimcha rasm S6). Bu dCas9 miqdori sinovdan o'tgan sharoitlarda E. coli ga toksik ta'sir ko'rsatmaganligini ko'rsatadi. Turli xil miqdordagi dCas9 ifodalanganda repressiya samaradorligi biroz o'zgardi (3A-rasm). Avvalgi tadqiqotga muvofiq, CRISPRi tizimi [aTc] da maksimal repressiya samaradorligiga erishdi.< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Shakl 3. Sozlanishi mumkin bo'lgan CRISPRi tizimining xarakteristikasi va modulligi. (A) Turli aTc konsentrasiyalari (20, 100 va 500 ng/ml) ostida nisbiy floresans. (B) Turli promotorlar ostida nisbiy floresans (J23100 va UPJ23119). (C) Turli protospacerlar ostida nisbiy floresans. X o'qi mCherry ning nisbiy floresansini bildiradi va y o'qi lacI33-mCherry (qizil) va araC{9}}mCherry (ko'k) nisbiy floresansini bildiradi. mCherry (56) oxiriga 5-lacI va araC dan 33 bp qoʻshimcha ketma-ketliklar qoʻshildi. (D) 12-merning erkin energiyasi va nisbiy flüoresans. Chiziqli chiziqlar 95% bashorat qilish oralig'ini va qattiq chiziqlar regressiya chizig'ini ko'rsatadi. mFold yordamida sg trcSL1c2 ning dG qiymatini olish mumkin emas edi va shuning uchun tahlildan chiqarib tashlandi. (A–D) Barcha xato satrlari standart ogʻish (n=3)ni bildiradi.

Sozlanishi CRISPRi tizimining modulligi

Maqsadli DNK uchun ma'lum bir ifoda darajasini saqlab qolish uchun o'ziga xos sgRNA variantlaridan foydalanish yondashuvimiz modulli tizim sifatida foydalanish imkoniyatiga ega. Turli protospacerlarni nishonga olish uchun sozlanishi mumkin bo'lgan CRISPRi tizimining maqsadga muvofiqligini ko'rsatish uchun biz lacI va araC dan 33 bps ketma-ketlikni qo'shish orqali ikkita sintez genini (lacI{0}}mCherry va araC{1}}mCherry) yaratdik. mCherry ning 5 -oxirigacha (56). E. coli BL21(DE3) genomi (GenBank: CP001509.3) lacI33- mCherry uchun protospacer ketma-ketligining ikki nusxasini va araC33-mCherry uchun bir nusxasini o‘z ichiga oladi. Biroq, bu xromosomalar ketma-ketligi PAM ketma-ketligiga ega emas va shuning uchun ularni dCas{11}}sgRNA kompleksi (43) maqsad qilib bo'lmaydi. SiRNKlar har bir protospacerga mo'ljallangan bo'lsa, repressiya samaradorligi lacI33, araC33 va mCherry dan barcha protospacerlar uchun doimiy ravishda saqlanib turdi (3C-rasm). Ushbu topilmalar bizning sozlanishi mumkin bo'lgan CRISPRi tizimimiz protospacer ketma-ketligidan qat'i nazar, ma'lum bir darajada gen ekspressiyasini samarali boshqarishi mumkinligini ko'rsatadi. RNP kompleksining shakllanishi va repressiya samaradorligi o'rtasidagi kuzatilgan munosabatlarning potentsial tushuntirishlaridan biri kompleks hosil bo'lganda erkin energiyaning o'zgarishidir. Sun'iy tetraloop bog'lovchisi va uning yon tomonlarida ikkita A: U va G: C Uotson-Krik tayanch juftligi va A: G Uotson-Krik bo'lmagan asosiy juftlik mavjud (44). CrRNK va tracrRNKning bog'lanishi kompleks hosil bo'lishi uchun juda muhim bo'lganligi sababli, tetraloopga qaratilgan mutatsiyalar dCas9 va sgRNA o'rtasidagi bog'lanish yaqinligiga ta'sir qiladi. Bu yaqinlikni chegaralangan va chegaralanmagan holatlar orasidagi erkin energiya farqidan hisoblash mumkin. Biroq, chegaralangan holatlarning erkin energiyasini hisoblash qiyin (57). Chegaralangan davlatning umumiy tuzilishi va barqarorligi o'zgarmaydi, deb o'yladik, chunki kutubxonadan saralangan sgRNKlar uning funktsiyasini to'liq buzmagan. Bundan tashqari, tetraloop va uning yon tomonlari dCas9 (44) bilan kam aloqa qiladi. Shu sababli, dCas9 va sgRNK o'rtasidagi bog'lanish yaqinligi asosan tetraloopning ikkilamchi strukturasining barqarorligi va uning yonma-yon ketma-ketligidan ta'sirlanadi. Ushbu g'oyaga asoslanib, biz qolip (58) yordamida tetraloopning erkin energiyasini va uning yonma-yon ketma-ketligini hisobladik. Mutatsiyalar tufayli buklanishning erkin energiyasidagi farq mutatsiyaga uchragan va yovvoyi tipdagi ketma-ketliklarning erkin energiyasi o'rtasidagi farq sifatida aniqlanadi. Uni mutantlarning katlanmasining erkin energiyasidan to'g'ridan-to'g'ri hisoblash mumkin edi, chunki yovvoyi turdagi katlama energiyasi doimiy -4,3 kkal/mol. Katlamaning erkin energiyasi ortishi bilan floresans signali ortdi (3D-rasm). Tetraloop o'z ichiga olgan hududning katlama energiyasi 0 kkal / mol ga yaqin yoki undan past bo'lganda repressiya samaradorligi eng yuqori bo'ldi va katlama energiyasi 0 kkal / mol dan oshib ketganda chiziqli ravishda kamaydi. Ushbu kuzatish shuni ko'rsatadiki, dCas9 va sgRNA o'rtasidagi kompleks hosil bo'lish samaradorligi tetraloop mintaqasining ikkilamchi tuzilishi bilan belgilanadi, bu bizning tizimimizning modulligini tushuntirishga yordam beradi. Kutubxonadagi turli 12-mer ketma-ketliklari boʻlgan qoʻshimcha 85 sgRNKning repressiya samaradorligi bu munosabatni yanada tasdiqlash uchun oʻlchandi. Shuningdek, u sg trcSL1 variantlarida kuzatilgan korrelyatsiyani ko'rsatdi (3D-rasm va qo'shimcha jadval S7), bu tetraloop bog'lovchisi RNP kompleksini shakllantirishda hal qiluvchi rol o'ynashini va bu mintaqadagi mutatsiyalar CRISPR tizimining samaradorligiga ta'sir qilishi mumkinligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, bu munosabat istalgan repressiya samaradorligi bilan sgRNK variantlarini kompyuter asosida loyihalash imkoniyatini ko'rsatadi.

E. coli da violaceinning biosintetik yo'lida oqimni qayta taqsimlash uchun sozlanishi CRISPRi tizimini qo'llash

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-katta) standart egri chiziqlardan hisoblanganda boshqa genlarga nisbatan. Aksincha, violacein yo'lidagi boshqa tartibga solinmagan fermentlarning ifodasi (vioA, vioB va vioE) o'zgarishsiz qoldi. Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, bizning tizimimiz yo'ldagi boshqa genlarga ta'sir qilmasdan alohida genlarning ifodasini maqsad qilib qo'yishi va modulyatsiya qilishi mumkin. PV va PDV ni to'g'ridan-to'g'ri miqdoriy aniqlash HPLC tahlili uchun tijoratda mavjud bo'lgan standartlar yo'qligi sababli mumkin emas edi. Shunday qilib, biz HPLC tepalik maydonidan foydalangan holda titrlarni ixtiyoriy birliklarda o'lchadik. Mahsulot titri induksiyadan keyin 8 soatda maksimal darajaga yetdi va keyin asta-sekin pasaydi (Qo'shimcha rasm S8), ehtimol mahsulotning noma'lum mexanizm bilan xromoviridans kabi boshqa yon mahsulotlarga aylanishi tufayli (42,64). HPLC spektrida kuzatilgan kichik cho'qqilar qo'shimcha kichik yon mahsulotlar mavjudligini ko'rsatdi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, har bir mahsulot titrining o'zboshimchalik birliklarida logarifmini violacein biosintetik yo'lida ishtirok etadigan har bir genning promotor kuchining chiziqli birikmalari orqali taxmin qilish mumkin (42). Ushbu log-chiziqli regressiya modeli bizning tizimimizda ham amal qildi va ko'paygan vioD transkriptlari PV ishlab chiqarishning ortishi bilan bog'liq edi (4B-rasm). Ma'lumki, violacein biosintetik yo'lida ishtirok etuvchi har bir genning promotorini yoki 5 -UTRsini ishlab chiqish oqimni qayta taqsimlash va yo'lni optimallashtirish imkonini berdi (65,66). Bizning tizimimiz qisqa va bir bosqichli usullar bilan yig'ilishi mumkin bo'lgan sintetik sgRNKlar yordamida yo'lda ishtirok etadigan promotorlarni manipulyatsiya qilmasdan transkripsiyani boshqarishni tasvirlaydigan muqobil usul sifatida ishlashi mumkin. Sozlanishi mumkin bo'lgan CRISPRi tizimi orqali skrining o'tkazish xost shtammlari yoki gen kassetalarini to'g'ridan-to'g'ri manipulyatsiya qilishdan oldin prognoz qilinadigan oqim bilan yo'lni qayta yo'naltirishga imkon beradi va bu jarayonni tezlashtiradi.

Likopen ishlab chiqaruvchi E. coli dagi uglerod oqimini muvozanatlash uchun sozlanishi CRISPRi tizimini qo'llash

Metabolik muhandislikda qimmatli birikmalarni samarali ishlab chiqarish uglerod oqimini muvozanatlashni talab qiladi. Metileritrit 4-fosfat (MEP) yoʻli metabolik yoʻl boʻlib, u izoprenoid qurilish bloklari, dimetilallil pirofosfat va izopentenilat (izopentenilfat, 686) ishlab chiqarish uchun piruvat va glitseraldegid 3-fosfat (GAP) kabi oddiy prekursorlardan foydalanadi. . Bu molekulalar geranil pirofosfatni sintez qiladi, u farnezil pirofosfatga (FPP) aylanadi (67,68). Kuchli antioksidant xususiyatlarga ega va turli sohalarda qo'llaniladigan yuqori baholangan karotenoid bo'lgan likopen (69), FPP dan crtE, crtB va crtI dan bir qator fermentativ reaktsiyalar orqali sintezlanadi (4C-rasm) (22,70). GAP prekursori nafaqat MEP yo'li uchun, balki glikoliz yo'li uchun ham muhimdir (22). Glikoliz yo‘lida glitseraldegid{11}}fosfatdehidrogenaza (GAPDH) ni kodlaydigan gapA genining ekspressiyasining kamayishi GAP hovuzini ko‘paytirish orqali likopen ishlab chiqarishni kuchaytirishi ko‘rsatilgan (22). Shu sababli, biz gapA ni beshta variant bilan, jumladan, uchta sg trcSL1 variantini (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 va sg trcSL1c6) maqsad qilib oldik, ular turli repressiya samaradorligini, sg PC va sg WTni ko'rsatdi. Biroq, gapA muhim gen bo'lib, uni butunlay yiqitib bo'lmaydi (71,72). sg WT yordamida an'anaviy CRISPRi yordamida gapA ni bostirishga urinishlar tet promouter ostida dcas9 ning past oqishi bilan ham muvaffaqiyatsiz bo'ldi (73). Boshqa tomondan, sozlanishi mumkin bo'lgan CRISPRi tizimi yordamida gapA geni ifodasining ko'p darajali repressiyasiga o'sish nuqsonisiz erishildi va natijada gapA genini to'liq ifodalovchi shtamm bilan solishtirganda likopen ishlab chiqarishda sg trcSL1c6 bilan 2,7-ko'paydi. 15 soat etishtirilgandan keyin (4D-rasm va qo'shimcha S9-rasm). GapA genining tabiiy ifodalanishining atigi 10% glikoliz yoʻlidagi quyi oqimdagi metabolitlarda, masalan, 2-fosfogliserat va 3-fosfogliseratda sezilarli oʻzgarishsiz GAP koʻpayishiga olib keladi. 22). Umuman olganda, ushbu natijalar sozlanishi mumkin bo'lgan CRISPRi xromosoma muhandisligisiz bir necha darajalarda gen ifodasini aniq bostirishi mumkinligini ko'rsatadi.

Shakl 4. Violacein biosintetik yo'li uchun sozlanishi CRISPRi tizimini qo'llash. (A) Violacein biosintetik yo'li va plazmid konstruktsiyasi. Violacein ishlab chiqarish uchun mas'ul bo'lgan beshta gen (vioA, vioB, vioC, vioD va vioE) dCas{1}}ekspressiv plazmidga klonlangan. To'rtta asosiy mahsulot (violacein, proviolacein, deoksiviolacein va prodeoksiviolacein) ishlab chiqariladi. vioC uchun sg WT va vioD uchun beshta sg trcSL1 varianti (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 va sg trcSL1c9) turli repressiya samaradorligini ko‘rsatib, boshqa plamidlarga klonlandi. Trp: L-triptofan, V: violacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoksiviolacein, DV: deoksiviolatsein, PDVA: protodeoksiviolacein kislotasi, PVA: protoviolacein kislotasi. (B) vioD transkriptlari, mCherry floresansi va PDV va PV titri o'rtasidagi bog'liqlik. X o'qi RT-qPCR dan olingan nisbiy vioD RNKni, chapdagi y o'qi 3-rasmdagi nisbiy mCherry floresansini ko'rsatadi va o'ngdagi y o'qi HPLC maydonining nisbatini ko'rsatadi. Eng yuqori vioD RNK qiymatiga ega bo'lgan namunalar normallashtirish uchun 100% ga o'rnatildi. (C) Likopenning biosintetik yo'li va plazmid tuzilishi. Likopen ishlab chiqarish uchun mas'ul bo'lgan uchta gen (crtE, crtB, crtI) dCas{20}}ekspressiv plazmidga klonlangan. gapA sg trcSL1 variantlari (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) bilan nishonlangan va sg PC boshqa plazmidga klonlangan. Glc: glyukoza, GAP: glitseraldegid 3-fosfat, 1,3-BPG: 1,3-bifosfogliserat, DMAPP: dimetilallil pirofosfat, IPP: izopentenil pirofosfat, FPP: far. (D) gapA transkriptlari, mCherry floresansi va likopen ishlab chiqarish o'rtasidagi bog'liqlik. X o'qi RT-qPCR dan olingan nisbiy bo'shliq RNKni ko'rsatadi, chapdagi y o'qi 3-rasmdagi nisbiy mCherry floresansini ko'rsatadi va o'ngdagi y o'qi likopenning titrini ko'rsatadi. (B, D) Barcha xato satrlari standart og'ishni ko'rsatadi (n=3).

XULOSA

Biz sozlanishi mumkin bo'lgan CRISPRi tizimini ishlab chiqdik, u gen ifodasini kerakli darajada aniq nazorat qila oladi. Tetraloop va uning yonbosh mintaqasini mutatsiyalash orqali turli protospaser ketma-ketliklariga qaratilgan sintetik sgRNKlar genni ma'lum darajada tartibga solishi mumkin. Biz ushbu tizimni prognoz qilinadigan nisbatda indol hosilalarini ishlab chiqarish uchun violacein biosintetik yo'liga qiziqishning metabolik oqimini yo'naltirish uchun muvaffaqiyatli qo'lladik. Bundan tashqari, biz sozlanishi mumkin boʻlgan CRISPRi dan foydalanish likopen ishlab chiqarishni 2.7-baravar oshirishga olib kelganini koʻrsatdik, bu boshqa qimmatli birikmalar ishlab chiqarishni yaxshilash uchun tizimimizning koʻp qirraliligini taʼkidladi. Ushbu tizim promouterni yoki 5-UTR ketma-ketligini almashtirish kabi xost genetik ma'lumotlarini doimiy manipulyatsiya qilishdan oldin oqimni optimallashtirish jarayonlarini tezlashtiradi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

ADABIYOTLAR

1. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvat, P. va Siksnis, V. (2011) Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas tizimi ichak tayoqchasida immunitetni ta'minlaydi. Nuklein kislotalari Res., 39, 9275-9282.

2. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvat, P. va Siksnis, V. (2012) Cas{2}}crRNK ribonukleoprotein kompleksi bakteriyalarda adaptiv immunitet uchun o'ziga xos DNK parchalanishiga vositachilik qiladi. Proc. Natl. akad. Sci. AQSh, 109, E2579–E2586.

3. Kong, L., Ran, FA, Koks, D., Lin, S., Barretto, R., Xabib, N., Xsu, PD, Vu, X., Jiang, V., Marraffini, LA va boshqalar. . (2013) CRISPR/Cas tizimlaridan foydalangan holda multipleks genom muhandisligi. Fan, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Xsu, PD, Rayt, J., Agarvala, V., Skott, DA va Chjan, F. (2013) CRISPR-Cas9 tizimidan foydalangan holda genom muhandisligi. Nat. Protok., 8, 2281–2308.

5. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA va Charpentier, E. (2012) Moslashuvchan bakterial immunitetda dasturlashtiriladigan dual-RNK-boshqaruvchi DNK endonukleaza. Fan, 337, 816–821.

6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A. va Jinek, M. (2014) Cas9 endonukleaz tomonidan PAMga bog'liq maqsadli DNKni tanib olishning strukturaviy asoslari. Tabiat, 513, 569–573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Vaysman, JS, Arkin, AP va Lim, WA (2013) CRISPRni gen ekspressiyasini ketma-ketlikka xos nazorat qilish uchun RNK tomonidan boshqariladigan platforma sifatida o'zgartirish. Hujayra, 152, 1173–1183.

8. Larson, MH, Gilbert, LA, Vang, X., Lim, WA, Weissman, JS va Qi, LS (2013) CRISPR aralashuvi (CRISPRi) gen ekspressiyasini ketma-ketlikka xos nazorat qilish uchun. Nat. Protok., 8, 2180–2196.

9. McGlincy, NJ, Meacham, ZA, Reynaud, KK, Myuller, R., Baum, R. va Ingoliya, NT (2021) Genom miqyosidagi CRISPR shovqin qo'llanma kutubxonasi xamirturushda keng qamrovli fenotipik profil yaratish imkonini beradi. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yun, J. va Woo, HM (2018) homo-butirat ishlab chiqarish uchun Corynebacterium glutamicumning CRISPR aralashuvi vositasida metabolik muhandisligi. Biotexnologiya. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto, S., Jensen, JV, Wendisch, VF va Lu, TK (2016) CRISPR aralashuvi (CRISPRi) bilan Corynebacterium glutamicum metabolik muhandislik. ACS Synth. Biol., 5, 375–385.

12. Chjan, GQ, Ren, XN, Liang, XH, Vang, YQ, Feng, DX, Chjan, YJ, Xian, M. va Zou, HB (2021) Aminokislotalarning mikrobial ishlab chiqarilishini yaxshilash: an'anaviy yondashuvlardan so'nggi tendentsiyalargacha. Biotexnologiya. Bioproc. E, 26, 708–727.

13. Kim, SK, Seong, W., Han, GH, Lee, DH and Lee, SG (2017) Escherichia colidagi metabolik oqimni qayta yo'naltirish uchun endogen raqobatdosh yo'l genlarining CRISPR interferentsiyasiga asoslangan multipleks repressiyasi. Mikrob. Hujayra fakti, 16, 188.

14. Ellis, NA, Kim, B., Tung, J. va Machner, MP (2021) Legionella pneumophila virulentligi genini so'roq qilish uchun multipleks CRISPR aralashuv vositasi. Kommun. Biol., 4, 157.

15. Siu, KH va Chen, V. (2019) Dasturlashtiriladigan CRISPR-Cas9 funksiyasi uchun riboregulatsiyalangan oyoq barmoqli gRNK. Nat. Kimyo. Biol., 15, 217–220.

16. Reis, AC, Halper, SM, Vezeau, GE, Cetnar, DP, Hossain, A., Clauer, PR va Salis, HM (2019) Takrorlanmaydigan qo'shimcha uzun sgRNK massivlari yordamida bir nechta bakterial genlarni bir vaqtda repressiya qilish. Nat. Biotechnol., 37, 1294–1301.

17. Tian, ​​T., Kang, JW, Kang, A. va Li, TS (2019) Escherichia coli da izopentenol ishlab chiqarish uchun CRISPRi vositachiligidagi repressiya orqali metabolik oqimni kombinatsion multipleks orqali yo'naltirish. ACS Synth. Biol., 8, 391–402.

18. Gauttam, R., Seibold, GM, Myuller, P., Weil, T., Weiss, T., Handrik, R. va Eikmanns, BJ (2019) Corynebacterium glutamicumda bir nechta genlarni nishonga olish uchun oddiy dual-inducible CRISPR interferentsiya tizimi. Plazmid, 103, 25-35.

19. Yao, L., Cengic, I., Anfelt, J. va Hudson, EP (2016) CRISPRi yordamida siyanobakteriyalarda bir nechta gen repressiyasi. Acs Synth. Biol., 5, 207–212.

20. Lim, HG, Noh, MH, Jeong, JH, Park, S. va Jung, GY (2016) Escherichia coli dagi glitserindan gidroksipropion kislota ishlab chiqarish yo'lini 3- optimal qayta muvozanatlash. ACS Synth. Biol., 5, 1247–1255.

21. Yang, Y., Lin, Y., Li, L., Linhardt, RJ va Yan, Y. (2015) Tabiiy mahsulotlarning yaxshilangan biosintezi uchun sintetik antisens RNKlar orqali malonil-KoA metabolizmini tartibga solish. Metab. Ing., 29, 217–226.

22. Jung, J., Lim, JH, Kim, SY, Im, DK, Seok, JY, Li, SV, Oh, MK and Jung, GY (2016) Gap A ifodasini nozik nazorat qilish orqali izoprenoidlarni ishlab chiqarish uchun aniq prekursorlarni muvozanatlash. Escherichia coli. Metab. Ing., 38, 401–408.

23. Li, XT, Jun, Y., Erickstad, MJ, Brown, SD, Parks, A., Court, DL va Jun, S. (2016) tCRISPRi: sozlanishi va qaytariladigan, gen ifodasini bir bosqichli nazorat qilish. Sci. Rep., 6, 39076.

24. Fontana, J., Dong, C., Xem, JY, Zalatan, JG va Carothers, JM (2018) sgRNKlarning tartibga solingan ifodasi E. coli da CRISPRi sozlaydi. Biotexnologiya. J., 13, e1800069.

25. Kim, NM, Sinnott, RW va Sandoval, NR (2020) Model bo'lmagan bakteriyalarda transkripsiya faktoriga asoslangan biosensorlar va induksiyali tizimlar: hozirgi taraqqiyot va kelajak yo'nalishlari. Curr. Fikr. Biotexnol., 64, 39-46.

26. Kundert, K., Lukas, JE, Watters, KE, Fellmann, C., Ng, AH, Heineike, BM, Fitzsimmons, CM, Oakes, BL, Qu, J., Prasad, N. va boshqalar. (2019) CRISPR-Cas9 ni ligand bilan faollashtirilgan va ligand bilan o'chirilgan sgRNKlar bilan nazorat qilish. Nat. Kommun., 10, 2127.

27. Ferreyra, R., Skrekas, C., Xedin, A., Sanches, BJ, Siewers, V., Nielsen, J. va Devid, F. (2019) dCas9-asosidagi tartibga solish orqali xamirturushdagi markaziy uglerod almashinuvini model yordamida nozik sozlash. ACS Synth. Biol., 8, 2457–2463.

28. Su, T., Guo, Q., Zheng, Y., Liang, Q., Vang, Q. va Qi, Q. (2019) Escherichia coli'da 5-aminolevulin kislota ishlab chiqarishni ko'paytirish uchun CRISPRi yordamida hemBni nozik sozlash. Old. Microbiol., 10, 1731.

29. Chjen, T., Xou, Y., Chjan, P., Chjan, Z., Xu, Y., Chjan, L., Niu, L., Yang, Y., Liang, D., Yi, F. . va boshqalar. (2017) Yagona qo'llanma RNK o'ziga xosligini profillash mos kelmaslik sezgir yadro ketma-ketligini ochib beradi. Sci. Rep., 7, 40638.

30. Jiang, V., Bikard, D., Koks, D., Chjan, F. va Marraffini, LA (2013) CRISPR-Cas tizimlaridan foydalangan holda bakterial genomlarning RNK tomonidan boshqariladigan tahriri. Nat. Biotexnologiya,

31, 233–239. 31. van Gestel, J., Hawkins, JS, Todor, X. va Gross, CA (2021) CRISPRi nomuvofiqligi uchun qo'llanma RNKni loyihalash uchun hisoblash quvur liniyasi. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins, JS, Silvis, MR, Koo, BM, Peters, JM, Osadnik, H., Jost, M., Hearne, CC, Weissman, JS, Todor, H. va Gross, CA (2020) Mismatch-CRISPRi Escherichia coli va Bacillus subtilisdagi muhim genlarning o'zgaruvchan ifoda-fitness munosabatlarini ochib beradi. Hujayra tizimi, 11, 523–535.

33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gaskoign, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Kosta, MR va Martin, SE (2019) Ko'p genlarni nishonga olish va mos kelmaslik tolerantligi genom tahlilini chalkashtirib yuborishi mumkin. keng birlashtirilgan CRISPR ekranlari. Genom Biol., 20, 21.

34. Rozen, S. va Skaletskiy, H. (2000) Umumiy foydalanuvchilar va biolog dasturchilar uchun WWW da Primer3. Usullari Mol. Biol., 132, 365–386.

35. Chjou, K., Chjou, L., Lim, Q., Zou, R., Stefanopulos, G. va Too, HP (2011) Kantitativ PCR orqali Escherichia coli ning proteinning haddan tashqari ko'payishiga transkripsiyaviy javoblarini miqdoriy aniqlash uchun yangi mos yozuvlar genlari. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak, KJ va Schmittgen, TD (2001) Haqiqiy vaqtda miqdoriy PCR va 2 (-Delta Delta C (T)) usuli yordamida nisbiy gen ifodasi ma'lumotlarini tahlil qilish. Metods, 25, 402–408.

37. Endryu, S. (2010) FastQC: Yuqori oʻtkazuvchanlik ketma-ketligi maʼlumotlari uchun sifat nazorati vositasi. v0.11.9 nashr.

38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. va Salzberg, SL (2009) Inson genomiga qisqa DNK ketma-ketligini o'ta tezkor va xotirada samarali moslashtirish. Genom Biol., 10, R25.

39. Danecek, P., Bonfild, JK, Liddl, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Kin, T., Makkarti, SA, Davies, RM va boshqalar. (2021) O'n ikki yillik SAMtools va BCFtools. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell, C., Uilyams, BA, Pertea, G., Mortazavi, A., Kvan, G., van Baren, MJ, Salzberg, SL, Wold, BJ va Pachter, L. (2010) Transkriptni yig'ish va RNK-Seq tomonidan miqdorini aniqlash hujayralar differentsiatsiyasi paytida annotatsiya qilinmagan transkriptlarni va izoformani almashtirishni ko'rsatadi. Nat. Biotechnol., 28, 511–515.

41. Trapnell, C., Hendrickson, DG, Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, JL va Pachter, L. (2013) RNK-seq bilan transkript rezolyutsiyasida gen regulyatsiyasining differentsial tahlili. Nat. Biotexnol., 31, 46-53.

42. Li, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ va Dueber, JE (2013) Yuqori o'tkazuvchanlik tahlili bo'lmaganda ko'p fermentli yo'lni ifodalash darajasida optimallashtirish. Nuklein kislotalari Res., 41, 10668-10678.

43. Xsu, PD, Skott, DA, Vaynshteyn, JA, Ran, FA, Konermann, S., Agarvala, V., Li, Y., Fine, EJ, Vu, X., Shalem, O. va boshqalar. (2013) RNK tomonidan boshqariladigan Cas9 nukleazalarining o'ziga xosligini maqsad qilgan DNK. Nat. Biotechnol., 31, 827-832.

44. Nishimasu, H., Ran, F., Xsu, P., Konermann, S., Shehata, S., Dohmae, N., Ishitani, R., Chjan, F. va Nureki, O. (2014) Qo'llanma RNK va maqsadli DNK bilan kompleksda Cas9 ning kristall tuzilishi. Hujayra, 156, 935–949.

45. Fu, Y., Rocha, PP, Luo, VM, Raviram, R., Deng, Y., Mazzoni, EO va Skok, JA (2016) CRISPR-dCas9 va sgRNA iskalalari sunʼiy yoʻldosh ketma-ketligini ikki rangli jonli tasvirga olish imkonini beradi. va takroriy boyitilgan individual lokuslar. Nat. Kommun., 7, 11707.

46. ​​Xosravi, S., Schindele, P., Gladilin, E., Dunemann, F., Rutten, T., Puchta, X. va Houben, A. (2020) Aptamerlarni qo'llash o'simlik telomerlarining CRISPR asosidagi jonli tasvirini yaxshilaydi. Old. O'simlikshunoslik, 11, 1254.

47. Nielsen, AA va Voigt, CA (2014) Xostni tartibga solish tarmoqlari bilan interfeysga ega bo'lgan ko'p kirishli CRISPR/Cas genetik sxemalari. Mol. Sist. Biol., 10, 763.

48. Li, YJ, Hoynes-O'Konnor, A., Leong, MC va Moon, TS (2016) 44, 2462-2473 bilan bakterial gen ifodasini dasturlashtiriladigan nazorat qilish.

49. Vigouroux, A., Oldewurtel, E., Cui, L., Bikard, D. va van Tiffelen, S. (2018) dCas9 ning transkripsiyani blokirovka qilish qobiliyatini sozlash bakterial genlarni mustahkam, shovqinsiz nokaut qilish imkonini beradi. Mol. Sist. Biol., 14, e7899.

50. Chjan, Y., Shang, X., Lai, S., Chjan, G., Liang, Y. va Ven, T. (2012) Corynebacterium glutamicumda induktorlarni qabul qilishni osonlashtirish orqali arabinoza-induktsiyali ekspressiya tizimini ishlab chiqish va qo'llash. Ilova. Atrof. Microbiol., 78, 5831-5838.

51. Tompson, M.G., Sedaghatyan, N., Barajas, JF, Wehrs, M., Beyli, CB, Kaplan, N., Hillson, NJ, Muxopadyay, A. va Keasling, JD (2018) Nusxalar sonini oshiradigan pSC101 kelib chiqishidagi yangi mutatsiyalarni ajratish va tavsiflash. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Frik, PM, Link, T., Gatgens, J., Sonntag, C., Otto, M., Bott, M. va Polen, T. (2020) Gluconobacter oxydans sirka kislotasi bakteriyasi uchun sozlanishi L-arabinoza-induksiyali ifoda plazmidi. Ilova. Mikrobiol. Biotechnol., 104, 9267–9282.

53. Nguyen, TT, Nguyen, NH, Kim, Y., Kim, JR va Park, S. (2021) Pseudomonas denitrificansdagi 3-gidroksipropionik dehidrogenazning induksiyalanuvchi promotor tizimining in vivo tavsifi. Biotechnol Bioproc E, 26, 612-620.

54. Makkarti, NS, Graham, AE, Studena, L. va Ledesma-Amaro, R. (2020) Genlarni tahrirlash va transkripsiyani tartibga solish uchun ko'p qirrali CRISPR texnologiyalari. Nat. Kommun., 11, 1281.

55. Yan, Q. va Fong, SS (2017) Escherichia coli da UP element ketma-ketligi bilan birlashtirilgan konstitutsiyaviy promouterlar yordamida in vitro transkripsiyaviy bog'lanish effektlari va shovqinlarni o'rganish. J. Biol. Ing., 11, 33.

56. Seo, SW, Yang, JS, Kim, I., Yang, J., Min, BE, Kim, S. va Jung, GY (2013) Prokaryotik tarjima samaradorligini nazorat qilish uchun mRNK tarjimasini boshlash mintaqasining prognozli dizayni. Metab. Ing., 15, 67–74. 57. Kappel, K., Jarmoskaite, I., Vaidyanathan, PP, Greenleaf, WJ, Herschlag, D. va Das, R. (2019) RNK-oqsil bilan bog'lanish yaqinligini bashorat qilishning ko'r-ko'rona sinovlari. Proc. Natl. akad. Sci. AQSh, 116, 8336–8341.

58. Zuker, M. (2003) Nuklein kislotalarning katlanishi va gibridlanishni bashorat qilish uchun Mfold veb-server. Nuklein kislotalari Res., 31, 3406-3415.

59. Xiong, B., Chju, Y., Tian, ​​D., Jiang, S., Fan, X., Ma, Q., Vu, H. va Xie, X. (2021) Escherichia coli da l-triptofanni samarali ishlab chiqarish uchun markaziy uglerod almashinuvining oqimini qayta taqsimlash. Biotexnologiya. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao, R., Li, J., Feng, L., Chjan, X. va Xu, H. (2019) (13) Glitserindan atsetol ishlab chiqarishni yaxshilash uchun Escherichia coli ning metabolik oqimi tahliliga asoslangan metabolik muhandislik. Biotexnologiya. Bioyoqilg‘i, 12, 29.

61. Duran, N. va Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: farmakologik va sanoat istiqbollarini ko'rib chiqish. Krit. Rev. Microbiol., 27, 201-222.

62. Balibar, CJ va Walsh, CT (2006) Chromobacterium violaceum dan VioA-E fermentlari tomonidan L-triptofandan violaceinning in vitro biosintezi. Biokimyo, 45, 15444–15457.

63. Gvon, DA, Seok, JY, Jung, GY va Li, JW (2021) Violacein ishlab chiqarish uchun biosensor yordamida adaptiv laboratoriya evolyutsiyasi. Int. J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanches, C., Brana, AF, Mendez, C. va Salas, JA (2006) Violacein biosintetik yo'lini qayta baholash va uning indolokarbazol biosintezi bilan aloqasi. Kimyo. Bio. Chem., 7, 1231-1240.

65. Jones, JA, Vernacchio, VR, Lachance, DM, Lebovich, M., Fu, L., Shirke, AN, Schultz, VL, Cress, B., Linhardt, RJ and Koffas, MA (2015) ePathOptimize: a Metabolik yo'llarni transkripsiyaviy muvozanatlash uchun kombinatsion yondashuv. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Chjan, Y., Chen, X., Chjan, Y., Yin, X., Chjou, C. va Vang, Y. (2021) E. coli da violaceinlarning samarali mahsuldorligi uchun biosintetik genlar klasterining bevosita RBS muhandisligi. Mikrob. Hujayra fakti, 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) Izoprenoid prekursor biosintezining mevalonat bo'lmagan yo'li. J. Biol. Chem., 282, 21573–21577.

68. Rohmer, M. (1999) Bakteriyalar, suv o'tlari va yuqori o'simliklarda izoprenoid biosintezi uchun mevalonatdan mustaqil yo'lning kashfiyoti. Nat. Prod. Rep., 16, 565–574.

69. Muller, L., Karis-Veyrat, C., Lou, G. va Bom, V. (2016) Likopen va uning yurak-qon tomir kasalliklarining oldini olishda antioksidant roli - tanqidiy sharh. Krit. Rev. Food Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Freyzer, PD va Misawa, N. (1998) Candida utilis oziq-ovqat xamirturushida likopen, beta-karotin va astaksantin karotinoidlarini ishlab chiqarish. Ilova. Atrof. Microbiol., 64, 1226-1229.

71. Goodall, ECA, Robinson, A., Johnston, IG, Jabbari, S., Turner, KA, Cunningham, AF, Lund, PA, Cole, JA and Henderson, IR (2018) Escherichia coli K{ ning asosiy genomi {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba, T., Ara, T., Xasegava, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL va Mori, H. (2006) Escherichia coli K-12 in-frame, bir genli nokaut mutantlarining qurilishi: Keio kolleksiyasi. Mol. Sist. Biol., 2, 2006.0008.

73. Bertram, R. va Xillen, V. (2008) Prokaryotik genlarni tartibga solish va ifodalashda Tet repressorini qo'llash. Mikrob. Biotexnol., 1, 2–16.