Danegaptid TGF 1-Buyrakning proksimal tubula epitelial hujayralarida induktsiya qilingan zararni oldini oladi
Mar 12, 2022
Annotatsiya:Surunkalibuyrak kasalligi(CKD) bir qator qo'shma kasalliklar bilan bog'liq global sog'liqni saqlash muammosidir. So'nggi ma'lumotlar, KKHning asosiy patologiyasi bo'lgan tubulointerstitial fibrozning rivojlanishida adenozin trifosfat (ATP) ning yarim kanal vositachiligida ko'payishini ko'rsatadi. Bu erda biz danegaptidning quvurli epiteliyadagi kasallikning rivojlanishi bilan bog'liq bo'lgan oqsillarning ifodasi va funktsiyasidagi yarim kanal vositachiligidagi o'zgarishlarni blokirovka qilishga ta'sirini baholaymiz.buyrakhujayralar. Birlamchi inson proksimal tubula epitelial hujayralari (hPTECs) pro-fibrotik sitokin o'zgartiruvchi o'sish omilining (TGF 1) ± danegaptidning beta1 izoformasi bilan ishlov berildi. qRT-PCR va immunoblotting mRNK va oqsil ifodasini tasdiqladi, sitokin antikorlari majmuasi esa proinflamatuar va profibrotik sitokinlarning ekspressiyasini/sekretsiyasini baholadi. Karboksiflfloressein bo'yoqlarini qabul qilish va ATP biosensingi yarim kanal faolligini va ATP chiqarilishini o'lchadi, shu bilan birga, paracellular o'tkazuvchanligini baholash uchun transepitelial elektr qarshilik ishlatilgan. Danegaptid karboksifluoresein bo'yog'ini qabul qilishni va ATP chiqarilishini inkor etdi va naycha shikastlanishi bilan bog'liq protein o'zgarishlaridan himoyalangan. Cx43-vositalangan ATP chiqarilishini blokirovka qilish hujayra sikli inhibitörleri, adherentlar va qattiq birikma oqsillari ekspressiyasining qisman tiklanishi va paracellular o'tkazuvchanlikning pasayishi bilan parallel edi. Bundan tashqari, danegaptid TGF ni inhibe qilgan 1-asosiy adipokinlar, sitokinlar, kimyokinlar, o'sish omillari va interleykinlarning ekspressiyasi va sekretsiyasida o'zgarishlarga olib keldi. Ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, danegaptid bo'shliqlar modulatori va yarim kanal blokatori sifatida kelajakda CKDni davolashda potentsialga ega.
Kalit so‘zlar:danegaptid; konneksin; yarim kanal; ATP; surunkali buyrak kasalligi; yallig'lanish; fibroz; hPTEClar; TGF 1; buyrak, buyrak
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK KASALLIKLARINI SOZLADI
Kirish
Surunkalibuyrak kasalligi(CKD) yurak-qon tomir kasalliklari va morbidlik xavfi ortishi bilan bog'liq bo'lgan sog'liqni saqlash muammosi [1]. Dunyo aholisining 10 foiziga ta'sir qilishi taxmin qilinmoqda [2], xavf omillari orasida yosh, diabet, gipertoniya, dislipidemiya va semirish kiradi [3]. Kasallik proteinuriyaga qo'shimcha ravishda glomerulyar filtratsiya tezligining (GFR) pasayishi, glomeruloskleroz, quvurli atrofiya va tubulointerstitial fibroz (TIF) bilan tavsiflanadi, bu umumiy gistopatologik o'zgarishlardir [4]. Epiteliya barqarorligini yo'qotish, doimiy yallig'lanish va hujayradan tashqari matritsaning ko'payishi bilan yakunlanadi [5,6], TIF va rivojlangan CKDni davolash qondirilmagan klinik ehtiyojni ifodalaydi [3]. Shuning uchun shoshilinch terapevtik yondashuvlar talab qilinadi. O'zgartirilgan konneksin (Cx) ifodasi va funktsiyasi kasallikning turli shakllari ([7] da ko'rib chiqilganidek), shu jumladan CKD ([8,9] da ko'rib chiqilganidek) patologiyasida ishtirok etgan. Konneksinlar membrana bilan bog'langan oqsillar oilasi bo'lib, ular konneksonlar deb ataladigan geksamerik birikmalarga oligomerlanadi [10]. Qo'shni hujayralar bir-biriga to'g'ri kelganda, konneksonlar to'g'ridan-to'g'ri aloqa yo'nalishini ta'minlaydigan messenjer molekulalari almashinadigan bo'shliqlar, uzluksiz teshiklarni hosil qilish uchun joylashadi [10]. Bog'lanmagan holda konneksonlar yarim kanallarni hosil qiladi, ular orqali molekulalar, masalan, adenozin trifosfat (ATP) purinoreseptorlarni faollashtirish orqali qo'shni hujayralarga ta'sir qilish uchun mahalliy hujayradan tashqari bo'shliqqa chiqarilishi mumkin [11]. Purinergik P2X7 retseptorining (P2X7R) ifodasi yuqori tartibga solinadi.buyrakdiabet bilan og'rigan odamlarning tubulalaribuyrak kasalligi[12] va ikkalasida ham fibrozning rivojlanishiga katta ta'sir ko'rsatdibuyrak[13-17] va boshqa to'qimalar turlarida [18-21]. Ajablanarlisi shundaki, purinerjik signalizatsiyani nishonga olish katta e'tiborga sazovor bo'ldi. Biroq, bugungi kunga qadar, klinik sinovlar P2X7R antagonizmining ko'plab yallig'lanish sharoitlarida foydali ta'sirini ko'rsata olmadi, bu ta'sir, ehtimol, retseptor ichidagi genetik o'zgarishlar bilan bog'liq [22]. ATP chiqarilishining yuqori oqimiga yo'naltirish bu muammolarni chetlab o'tadi.
Dalillar konneksinlarning aberrant ifodasi va/yoki faolligini CKDning turli shakllari bilan bog'laydi [12,23-26]. Abed va boshqalarning dastlabki tadqiqotlari. bir tomonlama ureteral obstruktsiyasi (UUO) bo'lgan heterojen (Cx43 plus /-) sichqonlarda hujayradan tashqari matritsa (ECM) cho'kishi va yallig'lanishning pasayishi [27], Cx43-o'ziga xos mimetikasi esa GAP{{6} }, monositlarning yopishishini inhibe qilishga muvaffaq bo'ldi va reninga bog'liq CKD [25] ning renin transgeni (RenTG) sichqonchasi modelida kollagen I ifodasini to'xtatdi. Yaqinda biz proksimal tubulada ifodalangan asosiy konneksin izoformasi Cx43 diabetik nefropatiya bilan og'rigan shaxslardan ajratilgan biopsiya materialida ko'payishini aniqladik, bu kuzatuv TGFp{11}}birlamchi davolashda yarimkanal vositachiligida ATP chiqishi ortishi bilan parallel ravishda kuzatildi. proksimal tubula hujayralari [12]. Hujayradan tashqari ATP kontsentratsiyasining mahalliy o'sishi ta'sirini baholashda biz aberrant Cx vositachiligi P2X7R faollashuvi orqali yopishtiruvchi (masalan, E-kadherin) va qattiq (masalan, Zona Occludens) birikma komplekslarini demontaj qilishni boshlashini aniqladik. UUO [12] ning heterojen Cx43 plus /- sichqoncha modelida inkor etilgan ushbu effektlar Cx43 va quvurli shikastlanish o'rtasidagi aniq bog'liqlikni ko'rsatadi. Cx43 ning qisman ablatsiyasi konneksinlarning quvurli shikastlanishning fenotipik o'zgarishlarini boshlashdagi rolini tasdiqlagan bo'lsa-da, Cx43 yarim kanal blokatori peptidiga farmakologik aralashuv5 bu pasaygan Cx43 faolligining himoya tabiati yarim kanal vositachiligida ATP chiqarilishini inhibe qilishdan kelib chiqqanligini aniqladi. Mimetik peptidlardan yarim kanal faolligini blokirovka qilishning himoya xususiyatini ta'kidlash uchun foydalanish kasallikning boshqa modellarida, jumladan retinopatiya [28], neyroinflamasyon [29], glioma [30,31] va yoshga bog'liq makula nasli [32] muvaffaqiyatli qayd etilgan. 33]. Oxir oqibat, tadqiqotlar o'zgargan konneksin faolligini yallig'lanishning kuchayishi [34-36] va fibroz [37-40] bilan bog'laydi va yarim kanal va/yoki bo'shliqlar orqali aloqani (GJIC) barqarorlashtirish zarar boshlanishini kechiktirishi mumkinligini ko'rsatadi. shikastlanishning turli modellarida kuzatiladi. Shunday qilib, konneksin yarim kanallarini inhibe qilish yallig'lanishni kamaytirish uchun jozibali vositani ta'minlaydi va katta terapevtik qiziqish uyg'otadi.
Danegaptid ((2S, 4R)-1-(2-aminoatsil)-4-benzamidopirrolidin2-karboksilik kislota), ZP1609 yoki GAP-134 nomi bilan ham tanilgan, kichik rotigaptiddan olingan dipeptid (AAP10, ZP123). Dastlab antiaritmik vosita sifatida ishlab chiqilgan [41], u Cx43 [42] bilan o'zaro ta'sir qiladi va kuchli bo'shliq birikmasi modifikatori sifatida ishlaydi [43]. Murakkab himoya va anti-aritmik xususiyatlarni namoyish etdi va ilgari yurak ishemik-reperfuzion shikastlanishlarining klinikadan oldingi modellarida sezilarli ta'sir ko'rsatdi [44,45]. 2-bosqich inson klinik sinovlari, afsuski, yakuniy nuqtaga [46] javob bermagan bo'lsa-da, boshqa guruhlarning tadqiqotlari boshqa to'qimalar turlari va kasallikning modellarida danegaptidning terapevtik salohiyatini o'rgandi [41,47-49]. Bundan tashqari, uning yarim kanal faolligini modulyatsiya qilishdagi roli haqida kam narsa ma'lum bo'lsa-da, danegaptid C6 glioma hujayralarida yarim kanal vositachiligida bo'yoqlarni qabul qilishni kamaytiradi [43]. Shunga qaramay, ushbu birikmaning boshqa to'qimalar turlarida yarim kanal vositachiligida ATP chiqarilishini bloklashdagi roli tasdiqlanishi kerak.
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK EKSIZLIGINI YAXSHILADI
Joriy tadqiqotda danegaptidning birlamchi TGF 1-davolangan inson proksimal tubula epitelial hujayralarida (hPTEC) konneksin vositachiligida yarimkanal ATP chiqarilishini inkor etishda samaradorligi tekshirildi, uning rivojlanishi bilan bog'liq bo'lgan ifoda va funktsional o'zgarishlarga qarshi himoya rolini aniqlashdan oldin. tubulointerstitial fibroz. Ekspressiya (qRT-PCR, immunotsitokimyo, immunoblotting, antikor massivlari) va funktsiyadagi o'zgarishlarni (ATP biosensatsiyasi, bo'yoqlarni qabul qilish, transepitelial elektr qarshiligi, antikor massivlari) aniqlash usullaridan foydalangan holda, bizning topilmalarimiz danegaptidning nanomolyar kontsentratsiyasi Cx yarim kanalini blokirovka qilishini ko'rsatadi. ozod qilish va qisman susaytirishi TGF 1-hujayra sikli oqsillari (masalan, p16, p21, siklin D1) va reno-himoya omillari (masalan, Klotho) ifodasidagi oʻzgarishlarni keltirib chiqaradi. Bundan tashqari, danegaptid naycha shikastlanishida tez-tez kuzatiladigan o'zgarishlarni kamaytiradi, shu jumladan adherens birikmalarini demontaj qilish (jumladan, E-kaderin yo'qolishi) va qattiq birikmalar (shu jumladan zona okkludens 1 (ZO-1) va klaudin 2 yo'qolishi). Muhimi, proteom profili massivi danegaptidning asosiy hujayradan tashqari matritsa oqsillari, adipokinlar, kimyokinlar va TGF 1 tomonidan qo'zg'atilgan o'sish omillarining ifodasi va sekretsiyasidagi o'zgarishlarni tiklash qobiliyatini ko'rsatdi. Shunday qilib, bizning in vitro ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, danegaptid (50-100n) ) birlamchi hPTEClarda yarim kanal vositachiligida ATP chiqarilishini muvaffaqiyatli bloklashi va kechki bosqichdagi CKDda kuzatilganidek, yallig'lanish va fibroz bilan bog'liq o'zgarishlardan qisman himoya qilishi mumkin.
2. Natijalar
2.1. Danegaptid quvurli epiteliya hujayralarining hayotiyligiga ta'sir qilmaydiOdambuyrak2 (HK2) hujayra 48 soat davomida past glyukozada (5 mM) o'stirildi, bir kechada qon zardobida och qoldiriladi va keyinchalik TGF 1 (10 ng / ml) [12,24] ± danegaptid (50) ning optimal konsentratsiyasi bilan davolanadi. nM–1 µM) 48 soat davomida (1A-rasm, n=3). 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) tahlili TGF 1 (101,9 ± 11,7 foiz) ham yo‘qligini tasdiqladi. na danegaptidning o'zi hujayra hayotiyligini (95,2 ± 7 foiz (50 nM), 103 ± 5,7 foiz (100 nM) va 96,6 ± 5,3 foiz (1 mM)) nazorat qiluvchilarga nisbatan o'zgartirdi. TGF 1-davolangan hujayralar danegaptid (104,1 ± 2,2 foiz (50 nM), 93,4 ± 1,6 foiz (100 nM) va 89,3 ± 3,7 foiz (1 mM)) bilan birgalikda inkubatsiya qilinganida hech qanday ta'sir kuzatilmadi. Ushbu ma'lumotlarni tasdiqlash uchun kristalli binafsha rang (CV) va laktat dehidrogenaza (LDH) tahlili o'tkazildi. TGF 1-davolangan hujayralardagi LDH ajralishi nazorat elementlari bilan taqqoslangan (109,3 ± 11,3 foiz) va danegaptid bilan birgalikda inkubatsiya qo‘shimcha ta’sir ko‘rsatmagan (106,4 ± 11,6 foiz (50 nM), 113,9 ± 15,6 foiz (100 n)). va 113,2 ± 4,3 foiz (1 µM)). Kutilganidek, danegaptidning o'zi nazorat qiluvchilarga nisbatan LDH chiqarilishini sezilarli darajada o'zgartirmadi (104,4 ± 4,3 foiz (50 nM), 95,3 ± 4,7 foiz (100 nM) va 92,6 ± 3,3 foiz (1 mkM)). Kristal binafsha rang yordamida hujayralarni bo'yash ushbu ma'lumotlarni qayta ko'rib chiqdi, TGF 1 (10 ng/ml; 96,9 ± 7,3 foiz) va TGF 1 va danegaptid (50 nM–1 mkM) uchun ma'lumotlar nazorat bilan solishtirish mumkin (98,2 ± 0,9 nM) (98,2 ± 0,9 M%). , 97,5 ± 1,8 foiz (100 nM) va 85,8 ± 5,3 foiz (1 mkM) Nihoyat, danegaptidning o‘zi kristall binafsha rangga bo‘yalganini o‘zgartirmagan (98,3 ± 2,5 foiz (50 nM), 99,6 ± 2,7 foiz (109 nM) va 109 ± 8 nM). Boshqaruvning 2,2 foizi (1 mkM)) Ushbu ma'lumotlardan kelib chiqib, keyingi tadqiqotlar uchun 50–100 nM konsentratsiya tanlangan.
Shakl 1. Danegaptid TGF 1-qo'zg'atilgan yarim kanal vositasida bo'yoqlarni qabul qilishning ko'payishini oldini oladi. Panelda (A), odambuyrak2 (HK2) hujayra past glyukoza (5 mM) ± TGF 1 (1 0 ng/mL) ± danegaptid (5 0, 100 va 1000 nM)da 48 soat davomida o'stirildi va hujayra hayotiyligi baholandi. Natijalar o'rtacha ± SEM (n=3) sifatida taqdim etiladi. TGF 1 (10 ng/ml ± danegaptid (50-1000 nM)) bilan inkubatsiya 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{ 19}}difeniltetrazolium bromid (MTT) ni qabul qilish, laktat dehidrogenaza (LDH) ajralib chiqishi yoki kristalli binafsha (CV) bo'yalishi. (B) va (C) panellarda karboksifloressein bo'yoqlarini qabul qilish HK2 hujayralari va inson proksimal tubula epitelial hujayralarida (hPTEC) yarim kanal faolligini baholash uchun ishlatilgan, bo'yoq yuklanish darajasi ochilish bilan to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir. Hujayralar 48 soat davomida past glyukoza (5 mM) ± TGF 1 (10 ng / ml) ± danegaptid (50 yoki 100 nM) da o'stirildi. Danegaptid TGF 1-karboksifluoresein bo'yoqlarini HK2 hujayralarida (panel (B)) va hPTEClarda (panel (C)) o'zlashtirishning ko'payishini oldini oldi. Nazorat hujayralarida minimal bo'yoq yuklanishi sodir bo'ldi, TGF 1 bilan ishlov berilgan hujayralarda bo'yoq yuklanishi sezilarli darajada oshdi. Danegaptid (50 yoki 100 nM) qo'shilishi bo'yoqning o'zlashtirilishini kamaytirdi va FL floresansi intensivligini nazorat darajasiga qaytardi. Intensivlik past glyukoza nazorati bilan solishtirganda foiz sifatida ifodalanadi va 3 ta alohida tajribani ifodalaydi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM (n=3) sifatida taqdim etilgan, asosiy ahamiyati ko'rsatilgan (** p < 0,01,="" ***="" p="">< 0,001;="" bir="" tomonlama="" anova="" va="" tukeyning="" keyingi="">
2.2. Danegaptid TGFni bloklaydi 1- Naychali epiteliya hujayralarida hemikanal vositachiligida bo'yoqlarning so'rilishidagi o'zgarishlarBiz ilgari TGF 1 proksimal tubula epitelial hujayralaridan Cx{1}}vositalangan yarimkanal faolligini va ATP chiqarilishini oshirishini ko'rsatdik [24]. Danegaptid HK2 xujayralari va asosiy hPTEClarda hemikanallar orqali TGF 1-induktsiyalangan bo'yoqlarni qabul qilishni inkor eta oladimi yoki yo'qligini aniqlash uchun karboksiflfloresen bo'yoqni qabul qilish tahlili ishlatilgan. Kutilganidek, TGF 1 (1{24}} ng/ml) HK2 hujayralarida bo‘yoq so‘rilishini 354,9 ± 32,6 foizgacha oshirdi, shu bilan birga danegaptid (5{39}} nM va 100 nM) bilan birgalikda inkubatsiya sezilarli darajada to‘xtadi. mos ravishda 165,5 ± 17,9 foiz va 147,6 ± 18,1 foizga javob (1B-rasm; p 0,001 dan kam yoki unga teng, n=4). Danegaptidning o'zi bo'yoqning qabul qilinishini o'zgartirmadi. Birlamchi hPTEClarda (nazoratning 310,8 ± 38,6 foizi) karboksiflfloresein bo'yoqlarini qabul qilish TGF 1 (10 ng/ml) ga oshdi, bu javob nazoratga nisbatan danegaptidning birgalikda inkubatsiyasi (100 nM; 145 ± 19,7 foiz) tomonidan qisman inkor etildi. (1C-rasm; p 0,01 dan kichik yoki teng, n=4).
2.3. Danegaptid TGFni inkor etadi 1-HK2 hujayralarida induktsiyalangan hemikanal vositachiligida ATP chiqishiDanegaptid (5{{10}}–100 nM) TGF 1 (10 ng/mL) tufayli ATP ajralishini oldini oladimi yoki yo'qligini aniqlash uchun HK2 hujayralaridagi yarim kanallardan biz ATP biosensingidan foydalandik [24,50]. TGF 1 (10 ng/ml) ATP chiqarilishini 0,33 ± 0,11 mkM dan 3,60 ± {{4{43}}}gacha oshirdi. },29 mkM (2A,B,E-rasm; p 0,001 dan kam yoki unga teng), 50 nM (1,90 ± 0,26 mkM; p 0,01 dan kam yoki teng) danegaptid tomonidan qisman inkor etilgan effekt ) va 100 nM (0,79 ± 0,19 µM; p 0,001 dan kam yoki unga teng) (2D,E, n=3-rasm, oltita takror/namuna raqami). Danegaptidning o'zi ATP chiqarilishiga ta'sir qilmadi (2C, E-rasm), ATP darajalari nazorat bilan solishtirganda 0,35 ± 0,10 µM (50 nM) va 0,31 ± 0,09 µM (100 nM) da qayd etilgan (2E-rasm).
2.4. Danegaptid TGFni qaytaradi 1-Hujayra sikli oqsillari va hPTEClarda reno-himoya belgisidagi induktsiyalangan o'zgarishlarDanegaptid umumiy hujayra siklini va reno-himoya belgilarining yarim kanal vositachiligida tartibga solinishini inkor eta oladimi yoki yo'qligini aniqlash uchun hPTEClar TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptid (100 nM) bilan inkubatsiya qilindi. 12 soat va qPCR tahlili orqali baholangan nomzod gen mRNKning ifodasi. TGF bilan ishlov berilgan hPTEClarga danegaptid qo'shilishi {6}}p16 ifodasini 358,8 ± 21,1 foizdan 193 ± 18,5 foizgacha, p21 ifodasini 221,8 ± 12,9 foizdan 142,2 ± 6,2 foizdan 142,2 ± 6,2 foizgacha va D 2.2 ± 7.2 foizdan D ifodasini qaytardi. foizdan 132,9 ± 15,0 foizgacha (3-rasm; p 0,001 dan kam yoki unga teng, n=3). Bundan tashqari, danegaptid Klothodagi pasayishni qisman 43,3 ± 3,8 foizdan 59,9 ± 11,7 foizgacha qaytardi (3-rasm, n=3).
2.5. Danegaptid TGFni tiklaydi 1-HPTEClarda adherens va qattiq birikma oqsillari va paracellular o'tkazuvchanlikdagi vositachi o'zgarishlarInbuyrakE-kaderin (ECAD) vositachiligida hujayra yopishishning kamayishi epiteliyadan mezenximaga qisman transformatsiya bilan bog'liq bo'lgan intervalgacha fenotip bilan yakunlanadigan bir qator hodisalarni boshlaydi. Boshlash ikkala yopishtiruvchi va qattiq birikma komplekslarini demontaj qilishni osonlashtiradi, natijada yopishqoqlikning yo'qolishi, hujayralararo aloqaning pasayishi va epiteliya oqishi bilan yakunlanadi [12,24,51]. Danegaptidning TGF 1-adderentligi va qattiq birikma oqsillaridagi vositachilik oʻzgarishlarini inkor etishi mumkinligini aniqlash uchun hPTEClar TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptid (10{{41) bilan inkubatsiya qilindi. }} nM) 48 soat davomida va nomzod oqsillarning ifodasi baholandi. Danegaptide qisman tiklangan E-kaderin ifodasini 33,3 ± 3,3 foizdan 89 ± 7,6 foizgacha, N-kaderin (NCAD) ifodasini 224,4 ± 29,6 foizdan 161,9 ± 27,4 foizgacha va vimentin ifodasini 212,3 ± 3,8 foizdan (± 3,8 foiz ± 3,8 foizgacha) qisman tikladi. 4A-rasm; p 0 dan kichik yoki teng.001, p 0,01 dan kichik yoki teng va p Mos ravishda 0,001 dan kichik yoki teng; n {{43} }). -katenin ifodasi yarim kanal blokatori tomonidan 149,2 ± 11,2 foizdan (faqat TGF 1) 151,6 ± 16,8 foizgacha (TGF 1 plyus danegaptid, 4B-rasm; p=NS, n=3) o'zgarmagan. Danegaptidning qattiq birikma oqsillariga ta'sirini baholash gap-junction modulyatori klaudin-2 ifodasini nazoratning 44,5 ± 5 foizdan 74,6 ± 5 foizigacha va ZO-1 27,8 ± 11,3 foizgacha qisman tiklaganligini tasdiqladi. nazorat elementlariga nisbatan foizdan 52,8 ± 5,4 foizgacha (4B-rasm; p 0,05 dan kam yoki unga teng, n=3). Transepitelial elektr qarshiligini o'rganuvchi tadqiqotlar TGF 1 (10 ng/ml) bilan ko'rilgan qattiq birikma oqsillarining kamayishi transepitelial qarshilikning 57,33 ± 1.86 Ō·sm2 dan 10 ± 1,53 Ō gacha yo'qolishi bilan parallel ekanligini tasdiqladi. sm2 (p 0,001 dan kichik yoki unga teng, n=3). Bu oqishning ortishi danegaptid (36 ± 2,08 Ō·sm2) bilan birgalikda inkubatsiya qilish orqali qisman tuzatildi (4C-rasm; p 0,001 dan kam yoki unga teng, n=3).
2.6. Danegaptid TGF ni oldini oladi 1-hPTEClarda hujayradan tashqari matritsa oqsillarining yuqori regulyatsiyasiShakllanish va degradatsiya o'rtasidagi nomutanosiblik tufayli ECMning to'planishi KKDning asosiy belgisidir. Ushbu jarayonda TGF 1 ning roli yaxshi aniqlangan [52] va bu o'zgarishlarni qanday inkor etishni tushunish kasallikning rivojlanishiga aniq ta'sir ko'rsatadi. Danegaptidning TGF 1-ECM oqsillari ekspressiyasidagi o'zgarishlarni keltirib chiqaradigan ta'sirini o'rganish uchun hPTEClar past glyukozada (5 mM) 48 soat davomida o'stirildi, bir kechada qon zardobida och qoldiriladi va TGF 1 (1{{) bilan davolanadi. 28}} ng/ml) ± danegaptid (100 nM) 48 soat davomida. Nazorat bilan solishtirganda, TGF 1 kollagen I (334,6 ± 30,14 foiz), kollagen IV (354,5 ± 16,9 foiz), fibronektin (301,7 ± 50,4 foiz) va laminin (324,8 ± 50,4 foiz) va laminin (324,8 ± 50,4 foiz) ECM oqsillari ifodasini oshirdi. B; p 0,001 dan kichik yoki unga teng, n=3). Danegaptid bilan birgalikda inkubatsiya bu o'zgarishlarni sezilarli darajada susaytirdi va ifodani 180,7 ± 27,3 foizga (kollagen I), 164 ± 6,9 foizga (kollagen IV), 161,3 ± 4 foizga (fibronektin) va 149 ± 20,4 foizga (lamsinin) ga qaytardi. dan yoki 0,001 ga teng; har bir holatda n=3). Danegaptid (100 nM) shuningdek, integrin bilan bog'langan kinaz 1 (ILK1) da TGF 1 (10 ng/mL) tomonidan qo'zg'atilgan o'zgarishlarni 378,9 ± 16,8 foizdan 251,8 ± 33 foizga kamaytirdi (p 0,001 dan kam yoki minimal ta'sir ko'rsatdi) matritsa metalloproteinaza 3 (MMP3) bo'yicha, danegaptid bilan birgalikda inkubatsiya qilinganida, ifodani faqat sitokin bilan 185,3 ± 19,6 foizdan 147,1 ± 12,2 foizgacha kamaytiradi (5B-rasm)
2.7. Danegaptid TGFni kamaytiradi 1-HPTEClardan adipokinlar, kimyokinlar, o'sish omillari va interleykinlar ifodasida yuzaga kelgan o'zgarishlar
Yallig'lanish reaktsiyasi proksimal kanalchalarda va uning atrofida bir nechta hujayra turlarining faollashishini va ko'plab yallig'lanish belgilarining sekretsiyasini o'z ichiga oladi. Xususan, eruvchan kimokinlar, sitokinlar va o'sish omillari infiltratsiya qiluvchi immunitet hujayralarini jalb qiladi va faollashtiradi va rezident fibroblastlarni rag'batlantiradi. Ushbu hujayralarning barqaror faollashuvi tubulointerstitial fibrozga vositachilik qiladi. Biz proteom profiler massividan danegaptid TGF 1-proinflamatuar vositachilarning ifodasi va sekretsiyasidagi o'zgarishlarni induktsiya qilishini aniqlash uchun foydalandik. Birlamchi mehmonxonalar yuqorida ta'riflanganidek ekilgan va 48 soat davomida TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (100 nM) bilan ishlov berilgan. Lizatdagi (6-rasm) va supernatantdagi (7-rasm) o'zgarishlar ro'yxati asosiy funktsiya bo'yicha guruhlangan 31 ta nomzod oqsil uchun berilgan.
3. Munozara
2017 yilda KKHning global kasallanish darajasi 697,5 million holatni tashkil etdi va bu holat butun dunyo bo'ylab o'limning 12-etakchi sababi sifatida aniqlandi [53]. Bugungi kunga kelib, oxirgi bosqich uchun davolovchi terapevtik variantlar mavjud emasbuyrak kasalligi(ESRD). Bundan tashqari, dializda omon qolish darajasi past va global tanqisligi bilanbuyrakDonorlar uchun KKH rivojlanishining oldini oladigan va bemorning hayot sifatini yaxshilaydigan terapiyani ishlab chiqish zarurati mavjud. CKDda proksimal tubuladagi yallig'lanishning qanchalik tez sodir bo'lishini belgilaydi.buyrakmuvaffaqiyatsiz bo'ladi. Ko'p hujayra turlarining faollashishiga hissa qo'shgan holda, u qisman konneksin vositachiligidagi hujayralar o'rtasidagi aloqani o'z ichiga oladi [9]. Konneksinlar geksamerik konneksonlarga oligomerizatsiya qilish qobiliyati orqali to'g'ridan-to'g'ri va mahalliy parakrin vositachiligidagi hujayra aloqasini osonlashtiradi. Qo'shni hujayralar bir-biriga to'g'ri kelganda, konneksonlar bo'shliq birikmalarini hosil qilish uchun joylashadilar [10]. Ushbu uzluksiz kanallar ma'lumot uzatish uchun to'g'ridan-to'g'ri yo'lni ta'minlaydi, bu hujayralarga ma'lum bir chastotaga kirishga va faoliyatni sinxronlashtirishga imkon beradi. Odatda fiziologik sharoitda ochiladigan bo'shliq o'tish joylaridan farqli o'laroq, yarim kanallar deb ham ataladigan ajratilmagan konneksiyalar shikastlanishga javoban ochiq bo'lish ehtimoli past va ochiqdir [10]. Yarimkanal faolligining o'zgarishi ko'plab kasalliklarning patofiziologiyasi bilan bog'liq bo'lib, o'zgartirilgan hujayralar o'rtasidagi aloqani qarishning kuchayishi [54], yallig'lanish [34,55,56] va fibroz bilan bog'laydigan dalillar [18-21]. O'z laboratoriyamizdan olingan ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, proksimal tubuladagi (Cx43) ustun konneksin izoformasi rivojlangan CKDda yuqori tartibga solinadi va TGF 1 ning yuqori darajalari va fibroz va yallig'lanishning og'irligi bilan bog'liqdir [24]. Bundan tashqari, bu o'zgartirilgan ifoda hujayralararo aloqaning yo'qolishiga olib keladi, bu yarimkanal vositachiligida ATP chiqarilishining ko'payishi va tubulalarning erta shikastlanishini ko'rsatadigan o'zgarishlar bilan birga keladi. Binobarin, Cx{20}vositalangan yarimkanalli ATP chiqarilishini blokirovka qilish, CKD bilan og'rigan odamlarda yuzaga keladigan kechki bosqichdagi zararni davolash uchun maqbul maqsad bo'lishi mumkin.
Danegaptid kichik terapevtik peptid bo'lib, u yaqin vaqtgacha jarohatlarning ko'plab modellarida, jumladan ishemiya [43,44] va retinopatiya [49]da bo'shliq birikmasini tiklash qobiliyatida ishlatilgan. Danegaptid C6 glioma hujayralarida yarim kanal faolligini va bo'yoqlarni qabul qilishni bloklashi ko'rsatilgan [43]; ammo, yarimkanal vositachiligida ATP chiqarilishini blokirovka qilishda birikmaning roli tasdiqlanishi kerak va danegaptidning jarohatlanganlarga ta'siri haligacha baholanmagan.buyraktubulalar. Joriy tadqiqotda biz danegaptid TGF 1-induktsiyasi natijasida inson proksimal tubula epitelial hujayralarida ATP chiqarilishini bloklashi haqida ishonchli dalillar keltirdik. Bundan tashqari, TGF ni tiklagan birikma 1-yallig'lanish va fibroz bilan bog'liq bo'lgan oqsillarni ifodalash va sekretsiyasida o'zgarishlarni keltirib chiqardi. CKDda tubulointerstitial fibroz turli morfologik va fenotipik o'zgarishlarga javoban rivojlanadi, shu jumladan epiteliyadan mezenximaga o'tish (EMT), yallig'lanish hujayralari infiltratsiyasi, fibroblast faollashuvi va hujayradan tashqari matritsaning (ECM) qayta tuzilishi [57]. So'nggi ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, hujayrali qarish surunkali kasallikning rivojlanishida asosiy rol o'ynashi mumkinbuyrak kasalligi[58], EMT bilan bog'liq qarish bilan, yallig'lanishga qarshi sekretom va hujayradan tashqari matritsa cho'kmasi [59-62]. Qarish xromatin tuzilishi, gen transkripsiyasi va oqsil sekretsiyasi bilan bog'liq o'zgarishlar bilan proliferativ o'sishning qaytarilmas to'xtatilishini anglatadi [63,64]. Shunday qilib, qarigan hujayralar siklinga bog'liq kinaz (CDK) inhibitörlerinin (CKI) ko'payishi, jumladan p21Cip1 (p21) va p16Ink4a (p16) va reno-himoya qiluvchi Klotho [65-68] ning o'zgartirilgan ifodasini ko'rsatishi ma'lum. Joriy tadqiqotda CDK ingibitorlari p16, p21 va siklin D1 ning mRNK ifodasi TGF 1-davolangan quvurli epiteliya hujayralarida sezilarli darajada oshdi, shu bilan birga reno-himoya qiluvchi qarishga qarshi Klotho oqsili nazorat bilan solishtirganda kamaygan ifodasini ko'rsatdi. Qizig'i shundaki, hujayralar danegaptid bilan birgalikda inkubatsiya qilinganida p16, p21 va siklin D1 ifodasi yaxshilandi. Ushbu kuzatishning ahamiyati ko'plab in vivo tadqiqotlar [69,70] tomonidan qo'llab-quvvatlanadi, shu jumladan p16 INK4a ikki marta nokautli sichqoncha modelidagi so'nggi ishlar. Kengaytirilgan interstitsial yallig'lanish va fibrozni ko'rsatish uchun UUO bilan qo'zg'atilganda, bu sichqonlar yovvoyi turdagi hayvonlarga nisbatan apoptoz, qarish, TGF 1/Smad signalizatsiya darajasini pasaytirish va yallig'lanish hujayralari infiltratsiyasini kamaytirishni ko'rsatdi [70]. Bundan tashqari, UUO modelidan ajratilgan proksimal tubula hujayralari p21 ning ortib borayotgan darajasini ko'rsatdi, uning bostirilishi odatda EMT bilan bog'liq bo'lgan belgilarning kamayishi bilan parallel bo'ladi [71,72]. Hujayraning qarishi va EMT induksiyasi bilan bevosita aloqasi allaqachon o'rnatilgan [73].
E-kaderin vositachiligida hujayra yopishishning yo'qolishi EMT ning boshlang'ich tetikleyicisidir, N-kaderinning bir vaqtning o'zida ko'payishi (kaderin kaliti) bilan birga, adherens birikmasini demontaj qilish va odatda fibroblast fenotipi bilan bog'liq bo'lgan oqsillarni olish bilan birga keladi, masalan. , vimentin va fibroblastga xos protein [74]. Inbuyrak, quvurli shikastlanish qisman, agar to'liq bo'lmasa, EMTga xos bo'lgan bir qator morfologik va fenotipik o'zgarishlarni keltirib chiqarishi yaxshi tasdiqlangan. Bizning yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, glyukoza TGF 1 vositachiligida yopishqoqlik (ECAD, NCAD, -katenin) va qattiq birikma (ZO -1) oqsil ifodasidagi o'zgarishlarni tartibga solish orqali yopishtiruvchi moddalarni demontaj qilish va qattiq birikma kompleksida o'zgarishlarni keltirib chiqardi. Bundan tashqari, in vitro gidrolizlanmaydigan ATP proksimalida E-kaderin ekspressiyasini pasaytiradi.buyrakhujayralar, ularning yo'qolishi hujayralararo bog'lanish kuchlarining kamayishi bilan parallel bo'lgan, ipning yorilishi va sitoskeletal remodelingning kamayishi [51]. P2X7R vositachiligida effektlar heterojen Cx43 plus /- UUO modelida qaytarildi [12]. Ushbu topilmalarga asoslanib, danegaptidning samaradorligi asosiy epiteliya (ECAD, -katenin, ZO -1, klaudin 2) va mezenximal (NCAD, vimentin) o'zgarishini oldini olishda yarim kanal vositachiligida ATP chiqarilishini blokirovka qilish uchun himoya rolini ta'kidlaydi. oqsillar, ularning oqibatlari terapevtik qiziqish uyg'otadi.
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK OG'RIG'INI YANGILAYDI
E-kaderinning sitoplazmatik dumi -katenin bilan bog'langanda yopishtiruvchi birikma yig'iladi, bu sitoskeletal tarmoqqa ulanishda vositachilik qiladi va hujayra qutbliligi va arxitekturasini ta'minlaydi [75]. Hujayra polaritesini saqlashdagi roliga qaramay, bu birikmalarning demontaj qilinishi Wnt oqsillari yoki boshqa yuqori oqim regulyatorlari, masalan, integrin bilan bog'langan kinaz (ILK) tomonidan faollashtirilganda sitozolga -kateninni chiqarishga imkon beradi. va hujayraga xos ta'sirlarni tartibga soladi. Integrin bilan bog'langan kinaz hujayra ichidagi serin/treonin-protein kinaz bo'lib, hujayra yopishishi, omon qolishi, proliferatsiyasi va hujayradan tashqari matritsa (ECM) cho'kmasini tartibga solishda asosiy rol o'ynaydi [76]. Muhimi, ILK ni inhibe qilish susayadibuyrakCKD ning bir nechta modellarida fibroz [77]. Joriy tadqiqotda TGF 1-induktsiyasi natijasida ILK1 ifodasining oshishi hujayralar danegaptid bilan birgalikda inkubatsiya qilinganida qisman tiklandi, bu ta'sir -katenin ifodasi va ECM bilan bog'liq oqsillarning pasayishiga parallel edi. Qizig'i shundaki, danegaptid TGF 1-katenin ifodasining ortishiga sezilarli darajada o'zgartira olmagan bo'lsa-da, shuni ta'kidlash kerakki, ifodadagi o'zgarishlarning yo'qligi uning hujayra ichidagi funktsiyasining yo'qligini aks ettirmaydi. Kanonik Wnt yo'li -kateninning yadroviy translokatsiyasini va maqsadli genlarni T hujayra omili/limfoid kuchaytiruvchi omillar (TCF/LEF) deb nomlangan transkripsiya omillari guruhi orqali faollashtirishni o'z ichiga oladi [78]. Odatda, Wnt/-katenin signalizatsiyasi jim bo'ladi, ammo surunkali kasalliklarning turli xil modellarida jarohatlardan keyin qayta faollashadi.buyrak kasalligi[79,80]. Bundan tashqari, aberrant Wnt/-katenin signalizatsiyasi qarishning boshlanishi bilan yuqori darajada bog'liq bo'lib, bu ta'sir kanonik Wnt yo'lining salbiy regulyatori rolini o'ynaydigan qarishga qarshi protein Klothoning ekspressiyasini yo'qotishiga parallel [81] va joriy tadqiqot TGF 1-davolangan hujayralarda pasaytirildi (3-rasm). Binobarin, Wnt/-katenin signalining uzluksiz faollashishi ikkalasida ham fibrozning rivojlanishi bilan bog'liq.buyrakva boshqa to'qimalar turlari [79,82,83]. Yadroga ko'chirilgandan so'ng, -katenin transkripsiya omili SNAIL va MMP7 matritsa metalloproteinazasining ko'payishi bilan bog'liq. Qizig'i shundaki, bu hodisalar transkripsiyaviy repressiya va E-kaderinning hujayradan tashqari domen membranasini to'kishi bilan bog'liq bo'lib, ikkinchisi erkin -kateninning sitoplazmatik hovuzining ko'payishini ko'radi [84]. Shunga ko'ra, Wnt signalizatsiyasi shikastlanish sharoitida EMTning asosiy faollashtiruvchisi hisoblanadi [85]. Bundan tashqari, Wnt/-katenin signalizatsiyasi fibronektin, FSP1, Snail1, MMP7 va siklin D1ni o'z ichiga olgan ko'plab genlarning ifodalanishiga yordam beradigan dalillar bilan, bu signal kaskadining susayishi yaxshilanganligi bilan bog'liqligi ajablanarli emas.buyrak funktsiyasi, EMT [86] kamayadi va yallig'lanish [87] va fibroz [80,88] kamayadi. Binobarin, u qisman TGF 1-bu tadqiqotda kuzatilgan hujayradan tashqari matritsa oqsillari (5-rasm), yallig'lanishga qarshi sitokinlar va kimyokinlarning ko'payishi va sekretsiyasini keltirib chiqarishi mumkin (6 va 7-rasmlar). Yallig'lanishga qarshi molekulalarning ECM cho'kishi va sekretsiyasi ko'payishi tubulointerstitial fibrozning o'ziga xos belgilaridir, turli xil hujayralar, shu jumladan.buyrakQuvursimon epiteliya hujayralari ko'p sonli omillarni ajratib olishi ma'lum bo'lib, ular birgalikda CKD bilan bog'liq sekretor fenotip (CASP) sifatida aniqlanadi. Ko'p sonli molekulalar, jumladan, interleykinlar, hujayradan tashqari matritsa oqsillari va kimokinlar bilan tavsiflangan ushbu CASP qarilik bilan bog'liq sekretor fenotip (SASP) bilan ajoyib o'xshashliklarga ega, CASP tarkibiy qismlari tubulointerstitial fibroz patologiyasi bilan kuchli bog'langan [89]. Yallig'lanishga olib keladigan bu omillar qo'shni sog'lom hujayralarga parakrin tarzda ta'sir ko'rsatadi va shu bilan CKDda fibrozning rivojlanishiga yordam beradi. CASP bilan bog'liq bo'lgan ko'plab omillar fibrozni keltirib chiqarishi ma'lumbuyrak(masalan, TGF, interleykin (IL)-1 va interleykin (IL)-6), bu yallig'lanish signalizatsiya oraliq moddalarining yuqori oqimiga yo'naltirish KKDni davolash uchun samarali alternativ strategiya bo'lishi mumkin. Proteom profil massividan foydalanib, TGF 1±danegaptid bilan ishlov berilgan hujayralardagi hujayra supernatanti asosiy yallig'lanish oqsillariga qarshi ko'tarilgan antikorlar bilan oldindan so'rilgan hujayra membranasida inkubatsiya qilindi. 6 va 7-rasmlarda ta'kidlanganidek, hujayralarning TGF 1 va danegaptid bilan birgalikda inkubatsiyasi bir qator nomzod oqsillarning ekspressiyasi va sekretsiyasini tikladi, ularning rolibuyrak kasalligizararli (o'simta nekrozi omili-alfa, interleykin 1-alfa, interferon-gamma) yoki himoya (gepatotsitlar o'sish omili) sifatida yaxshi tasdiqlangan. Bundan tashqari, CKDda eruvchan kimokinlar, adezyon molekulalari va o'sish omillari shikastlanganda yallig'lanish va fibrozni vositachilik qilish uchun infiltratsiya qiluvchi immun hujayralar va rezident fibroblastlarni jalb qiladi va faollashtiradi.buyrak. Bizning massiv ma'lumotlarimiz shuni tasdiqlaydiki, Cx43 modulyatsiyasi va quvurli epiteliya hujayralarida yarim kanal vositachiligida ATP chiqarilishini blokirovka qilish ko'plab yallig'lanish vositachilari, jumladan, kemokinlar, monositlar kimyoviy-atraksion oqsili (MCP1) va faollashuvda tartibga solinadigan normal T sekretsiyasini qisman yoki to'liq inkor etadi. Hujayra ifodalangan va yashiringan (RANTES), ikkalasi ham monotsitlarni jalb qilishda ishtirok etadi. Inson va eksperimental jihatdan yuqoribuyrak kasalliklari, MCP1 sekretsiyasi interleykin-1, o'simta nekrozi omili-alfa [90] va interferon-gamma [91] tomonidan tetiklanadi, ularning barchasi bizning modelimizda TGF 1 tomonidan qo'zg'atilgan, ammo danegaptid bilan birgalikda qo'llanilganda bloklanadi. Bundan tashqari, danegaptid hujayralararo hujayra yopishish molekulasi (ICAM1) [92], granulotsit-makrofag koloniyasini stimulyatsiya qiluvchi omil (GM-CSF) [93] va epiteliya-neytrofilni faollashtiruvchi peptidning TGF 1-induktsiyasini oldini olish uchun ham kuzatilgan. (ENA78) [94]. Birgalikda, bular CKD ning rivojlanishi va boshqa asosiy patogen oqsillar, jumladan dipeptidil peptidaza 4 (DPPIV) [95] va qon tomir endotelial o'sish omili (VEGF) [96] bilan bog'langan va potentsial terapevtik maqsadlar sifatida aniqlangan. Ushbu kuzatuvlarga qaramay, massiv tahlili 48 soatda bir qator oqsillarni aniqladi, bu erda TGF 1- tomonidan tartibga solinishi yarim kanal vositachiligida ATP chiqarilishidan mustaqil bo'lib chiqdi. Hujayra lizatidagi FLT3 ligandining ifodalanishidan ko'rinib turibdiki, danegaptid TGF 1-to'liq hujayra ifodasidagi o'zgarishlarni sezilarli darajada o'zgartira olmadi. FLT3 ligand dastlab membrana bilan bog'langan oqsil sifatida sintezlanadi, u eruvchan o'sish omiliga aylanishi uchun parchalanishi kerak. TGF 1-davolangan hujayralarda hujayra lizatidagi nazorat bilan solishtirganda membrana bilan bog'langan FLT3L ning ko'payishi kuzatildi, bu javob hujayralar danegaptid bilan birgalikda inkubatsiya qilinganida ta'sirlanmadi. FLT3L ning proteolitik bo'linishi va chiqarilishida ishtirok etadigan ferment haqida juda kam narsa ma'lum bo'lsa-da, Horiuchi va boshqalar tomonidan olib borilgan tadqiqot. FLT3L ning to'kilishi va membranadan ajralib chiqishi metalloproteazaga bog'liqligini va fibroblastlardagi bu ta'sir TNF-konvertatsiya qiluvchi fermentga (TACE) bog'liqligini ko'rsatdi [97]. Biz faqat taxmin qilishimiz mumkin bo'lsa-da, Cx vositachiligida ATP chiqarilishini blokirovka qilish FLT3 membranasini to'kish uchun zarur bo'lgan oqsil(lar)ning faolligini susaytirishi mumkin va shuning uchun FLT3L chiqarilmaganda, supernatantdagi FLT3L darajalari. TGF 1 va danegaptid bilan ishlov berilgan hujayralarda TGF 1-bilan ishlov berilgan nazorat elementlariga nisbatan sezilarli darajada kamroq. Qizig'i shundaki, danegaptid FLT3L hujayra lizatining TGF 1-induktsiyasi natijasida paydo bo'lgan ko'payishini qaytarmagan bo'lsa-da, oqsilning ajralib chiqadigan shakliga ta'sir qilgan.
Kengaytirilgan glikatsiyaning yakuniy mahsuloti uchun eruvchan retseptor (RAGE) yallig'lanish va oksidlovchi stressning potentsial biomarkeridir [98]. U ilg'or glikatsiyaning yakuniy mahsulotlarini membrana bilan bog'langan RAGE va RAGE bilan bog'liq zararli ta'sirlarga bog'lanishiga yo'l qo'ymaydigan aldov retseptorlari sifatida ishlaydi. Joriy tadqiqotda biz TGF 1 bilan sRAGE sekretsiyasining 70 foizga oshganini kuzatdik, bu ta'sir danegaptid tomonidan nazorat qilish uchun tiklanadi. sRAGE funktsional va ajralib chiqqanda ta'sir ko'rsatishga qodir. Danegaptidning ushbu sekretsiyani sezilarli darajada inkor etish potentsiali aniq terapevtik qiziqish uyg'otadi. Qizig'i shundaki, biz TGF 1 ± danegaptid bilan 48 soatda RAGE lizatining o'sishini kuzatmadik. Ushbu tajribalar insonning asosiy proksimal tubula hujayralarida o'tkazilgan bo'lsa-da, bizning modelimiz cheklovlari hujayra, vaqt va kontsentratsiyaga bog'liq bo'lishi mumkin. Binobarin, danegaptidning ta'sir qilish mexanizmini yaxshiroq tushunish zarur bo'lsa-da, ushbu tadqiqot natijalari TGF 1-yallig'lanish belgilaridagi o'zgarishlarni induktsiya qilish uchun danegaptidni qo'llashning afzalliklari haqida muhim dastlabki dalillarni beradi. yarim kanal vositachiligida ATP chiqishi. Biz in vitro ma'lumotlarimiz tubulointerstitial fibrozni keltirib chiqaradigan multifaktorial hodisalarning minimalistik modelini taqdim etishini tan olamiz va bu yangi topilmalarni in vivo vaziyatga o'tkazishda ehtiyot bo'lishni tavsiya qilamiz, ayniqsa jarohatning boshqa turlari va modellari bo'yicha tadqiqotlar o'zgaruvchan ta'sirlarni ko'rsatdi. [41,44,46–49]. Ushbu yarim kanallarning selektivligini va surunkali shikastlanishning klinikgacha bo'lgan modellarida preparatning qobiliyatini aniqlash uchun odamlar klinik sinovlarida samaradorlikni tekshirish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi.
4. Materiallar va usullar
4.1. Materiallar
Klonal odambuyrak2 (HK2) epiteliya hujayralari va birlamchi inson proksimal tubula epitelial hujayralari (hPTECs) American Type Culture Collection (ATCC) (LGC standartlari) dan sotib olindi. To'qimachilik madaniyati materiallari Invitrogen (Paisley, Buyuk Britaniya) dan sotib olindi. Immobilon-FL PVDF membranasi Millipore (Uotford, Buyuk Britaniya) dan edi va Odyssey blokirovka qiluvchi bufer va ikkilamchi FL floresan antikorlari LI-COR (Kembrij, Buyuk Britaniya) dan sotib olindi. E-kaderin, N-kaderin, ILK1, MMP-3, -katenin, vimentin va ZO-1 uchun antikorlar Cell Signaling Technologies (Hertfordshire, Buyuk Britaniya) dan olingan, Klaudin-2, laminin, kollagen I va kollagen IV antikorlari ABCAM (Kembrij, Buyuk Britaniya) dan olingan. Fibronektin antikori Santa Kruzdan (Santa Kruz, CA, AQSh) sotib olingan. Rekombinant hTGF 1 boshqa barcha umumiy kimyoviy moddalar kabi Sigma (Poole, Buyuk Britaniya) dan olingan. Danegaptide Zealand Pharmaceuticals tomonidan taqdim etilgan. ATP biosensorlari Sarissa Biomedical Ltd. (Koventri, Buyuk Britaniya) va un idishlari WPI (Hertfordshire, Buyuk Britaniya) dan edi. Transwell filtrlari Korningdan (Nottingemshire, Buyuk Britaniya) sotib olingan. Proteome Profiler Human Cytokin Array Kit R&D Systems kompaniyasidan (Oksfordshir, Buyuk Britaniya) edi.
4.2. To'qimalar madaniyati
Birlamchi inson proksimal tubula epitelial hujayralari (hPTECs) abuyrakATCC dan epitelial hujayrali bazal muhit, 0,5 foiz homila buzoq zardobi (FCS wt/vol, triiodotironin (10 nM), rhEGF (10 ng/ml), gidrokortizon gemisuksinat (100 ng/ml), rhInsulin (5 µg/ml), epinefrin (1 mkM), transferrin (5 µg/ml) va L-alanil-glutamin (2,4 mM), 37 ◦C da 5 foiz CO2 bilan namlangan atmosferada. Hujayralar bir kechada namlangan. Davolashdan oldin sarum ochligi Insonbuyrak2 (HK2) hujayralar (18-30-o'tishlar) Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Hams F12 muhitida o'stirildi, 10% og'irlik / volt, glutamin (2 mmol / L) va epiteliya o'sish omili (EGF) bilan to'ldiriladi ( 5 ng/ml), namlangan atmosferada 37 ◦C da 5 foiz CO2 bilan. HK2 xujayralari inson papillomavirusi 16 (HPV-16) E6/E7 genlarining transduksiyasi orqali abadiylashtirildi va mikoplazmadan holi edi. Barcha tajribalarda hujayralar past glyukozali DMEM/F12 (5 mmol/L) ga 48 soat davomida ekilgan va davolashdan oldin bir kechada sarum och qolgan.
4.3. MTT tahlili, baholash uchun yuqorida aytib o'tilganidek, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) tahlili o'tkazildi. danegaptidning hujayra proliferatsiyasiga sitotoksik ta'siri [99]. HK2 xujayralari 96-quduq plastinkalariga ekilgan va past glyukozali DMEM/F12 (5 mM) da 48 soat davomida, tun davomida qon zardobidagi ochlikdan oldin ekilgan va keyin TGF 1 (10 ng/ml) bilan 48 soat davomida stimulyatsiya qilingan. ) ± danegaptid (50-1000 nM). Formazan ishlab chiqarishning kolorimetrik o'lchovi tirik hujayralar soniga to'g'ri keldi.
4.4. Laktat dehidrogenaza tahliliPlazma membranasining shikastlanishi natijasida laktat dehidrogenaza (LDH) ning ommaviy axborot vositalariga chiqishi odatda hujayra o'limi yoki sitotoksikligini baholash uchun ishlatiladi. HK2 xujayralari 96-quduq plitalariga ekilgan va tungi sarum ochlikdan oldin 48 soat davomida past glyukozali DMEM/F12 (5 mM) da ekilgan. Keyin hujayralar TGF 1 (10 ng / ml) ± danegaptid (50-1000 nM) bilan 48 soat davomida rag'batlantirildi. LDH sitotoksisitesini tahlil qilish to'plami II (Abcam) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq LDH miqdorini aniqlash uchun ishlatilgan.
4.5. Kristal binafsha rang tahliliUshbu oddiy tahlil ko'p quduqli idishlarga yopishtirilgan hujayralarning nisbiy zichligini o'lchash uchun ishlatiladi. Kristall binafsha rang DNKni bo'yadi va uni eritib bo'lgandan keyin kolorimetrik tarzda aniqlash mumkin. HK2 xujayralari 12-quduq plastinkalariga ekilgan va past glyukozali DMEM/F12 (5 mM) da 48 soat davomida, tun davomida qon zardobida och qolishdan oldin ekilgan va keyin TGF 1 (1{{16) bilan 48 soat davomida stimulyatsiya qilingan. }} ng/mL) ± danegaptid (50-1000 nM). Tahlil ilgari tasvirlangan [99]. Qisqacha aytganda, hujayralar paraformaldegid yordamida 10 daqiqa davomida o'rnatildi, fosfat tamponli tuz (PBS) bilan yuvildi va xona haroratida (RT) 0,1 foizli kristalli binafsha eritmasida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Yana bir necha yuvishdan so'ng, dog '1 foizli SDS yordamida eritildi va absorbans plastinka o'quvchi bilan o'lchandi.
4.6. Western BlottingHK2 hujayralari va hPTEClardan sitozolik oqsilni tayyorlash, ularni SDS gel elektroforezi bilan ajratish va Immobilon-FL PVDF membranalariga o'tkazish ilgari tasvirlangan [12]. Membranalar Odyssey blokirovka qiluvchi bufer (LI-COR) yordamida bloklandi va keyin bir kechada E-kaderin (1:1000), N-kaderin (1:1000), klodin-2 (1:500), ZO ga qarshi antikorlar bilan tekshirildi. -1 (1:1000), kollagen I (1:1000), kollagen IV (1:2000), fibronektin (1:2000), laminin (1:500), ILK1 (1:500), -katenin (1:2000), vimentin (1:500) va MMP3 (1:500). Tarmoqlar OdysseyFC yordamida vizuallashtirildi va ImageStudio (v5.2, LI-COR, Linkoln, NE, AQSh) yordamida yarim miqdori aniqlandi.
4.7. Transepitelyal qarshilikHK2 xujayralari (6 × 104 hujayra/ml) Transvel filtrlariga (diametri 12 mm, teshik hajmi 0,4 mkM; Korning, NY, AQSh) ekilgan va past glyukozali DMEM/F12 (5 mM) da ekilgan. 48 soat, zardobda bir kechada och qoldi va keyinchalik 48 soat davomida TGF 1 (10 ng / ml) ± danegaptid (100 nM) bilan rag'batlantirildi. Transepitelial elektr qarshiligi (TER) EVOM apparati (World Precision Instruments, Sarasota, FL, AQSh) yordamida o'lchandi. Har bir qarshilik ko'rsatkichidan faqat vosita bilan quduqdan o'lchangan bo'sh qarshilik olib tashlandi.
4.8. Bo'yoqlarni qabul qilish bo'yicha tadqiqotlarHK2 xujayralari va hPTEC'lar florodishlarga (diametri 22 mm) ekilgan va 48 soat davomida past glyukozali DMEM / F12 (5 mmol / L) da ekilgan. Bir kechada sarum ochligidan so'ng, hujayralar 48 soat davomida TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (50-100 nM) bilan inkubatsiya qilindi. Keyingi bosqichlar uchun NaCl (137 mM), KCl (5,4 mM), MgSO4 (0,8 mM), Na2HPO4 (0,3 mM), KH2PO4 (0,4 mM), NaHCO3 (4,2 mM) dan tashkil topgan muvozanatli tuz eritmasi (BSS, pH 7,0) ), HEPES (10 mM) va glyukoza (5 mM) ishlatilgan. Bo'yoqning so'rilishini induktsiya qilish uchun hujayralar Ca2 plyussiz BSS (nol CaCl2 plyus EGTA (1 mM)) va karboksiflfloressein (200 mM) bilan 10 daqiqa davomida, so'ngra Ca2 plyus o'z ichiga olgan BSS (1,3 mM) da 5 daqiqa davomida ta'sir qilindi. plyus karboksifluoresein (200 mkM). Keyin idishlar Ca2 plus o'z ichiga olgan BSS (12 ml) bilan yuvildi. Tasvirlar Cool Snap HQ CCD kamerasi (Roper Scientific, Gottingen, Germaniya) va Metamorph dasturi (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, Buyuk Britaniya) yordamida olingan. ImageJ bo'yoqni qabul qilish miqdorini aniqlash uchun ishlatilgan, bu erda har bir hujayra atrofida qiziqish hududi (ROI) chizilgan (taxminan 10-15 hujayra / idish) va o'rtacha piksel intensivligi o'lchangan. Har bir ROIdan fon floresansi qiymati ayirildi.
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK DIALIZINI YANGILAYDI
4.9. ATP biosensingATP biosensorlari (Sarissa Biomedical, Koventri, Buyuk Britaniya) yuqorida aytib o'tilganidek, bir vaqtning o'zida ikki tomonlama qayd qiluvchi amperometrik sozlashda ishlatilgan [12]. O'ziga xos bo'lmagan elektro-aktiv artefaktlarni hisobga olish uchun null biosensor ishlatilgan va ATP izidan chiqarilgan. Glitserin (2 mM) ATPni aniqlashni yoqish uchun barcha ro'yxatga olish echimlariga kiritilgan. HK2 xujayralari tungi sarum ochlikdan oldin 48 soat davomida past glyukozali DMEM / F12 (5 mmol / L) da shisha qoplamalarga (diametri 10 mm) ekilgan. Keyin hujayralar TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (100 nM) bilan 48 soat davomida inkubatsiya qilindi. Qopqoqlar 6 ml/min (37 ◦C) da perfuziyalangan Ca2 plyus o'z ichiga olgan BSS ni o'z ichiga olgan kameraga o'tkazildi va iqlimga moslashish uchun 10 daqiqaga qoldirildi. ATP va null biosensorlari egilib, tushirildi, shunda elektrod uyali monoqatlamga parallel ravishda yotadi. Barqaror boshlang'ich chiziq paydo bo'lgandan so'ng, Ca2 plus bo'lmagan BSS perfuziyasi yarim kanal ochilishini rag'batlantirdi. ATP chiqarilgandan so'ng, yarim kanallarni yopish uchun Ca2 plyus o'z ichiga olgan BSS ishlatilgan, so'ngra ATP (10 mM) kalibrlash eritmasi. Yozuvlar Spike (v8.03) dasturi yordamida Micro CED (Mark2) interfeysi bilan 4 Gts chastotada olingan.
4.10. Yallig'lanishga qarshi antikorlar to'plami,Yallig'lanishga qarshi antikorlar majmuasi (RnD Systems) 31 ta yallig'lanish belgilarining TGF tomonidan qo'zg'atilgan 1-regulyatsiyasini baholadi. Massiv ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilish orqali amalga oshirildi. Qisqacha aytganda, hPTEC'lar 48 soat davomida past glyukozali DMEM/F12 (5 mM) da, bir kecha-kunduz sarum ochligidan oldin o'stirildi va keyin TGF 1 (10 ng / ml) ± danegaptid (100 nM) bilan 48 soat davomida stimulyatsiya qilindi. Hujayra lizatlari va supernatant to'plangan va tutilish antikorlari bilan ikki nusxada aniqlangan oldindan bloklangan membranalar bilan bir kechada inkubatsiya qilingan. 800 CW FL floresan streptavidin/biotinillangan kokteyl aralashmasi Odyssey FC yordamida ifodalangan oqsil/antikor komplekslarini vizualizatsiya qilish uchun ishlatilgan va ImageStudio (v5.2, LI-COR) yordamida yarim miqdoriy aniqlangan.
4.11. Miqdoriy real vaqtda PCRRNK RNeasy mini to'plami (QIAGEN) yordamida ekstraksiya qilingan va teskari transkripsiya qilingan (Invitrogen). Haqiqiy vaqtda PCR (SYBR GreenER, Invitrogen) StepOne Plus asbobi (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, AQSH) yordamida amalga oshirildi. cDNK ifodasi ketma-ket suyultirilgan cDNKning standart egri chizig'i bilan solishtirish orqali olingan. The following primers were used: p16 (forward: CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, reverse: GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (forward: AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, reverse: TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), cyclin D1 (forward: TCTACACCGACAACTCCATCCG, reverse: TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG), Klotho (forward: CCTCCTTTACCTGAAAATCAGCC, reverse CAGGTCGGTAAACTGAGACAGAG) va GAPDH (oldinga: GTCTC CTCTGACTTCAACAGCG, teskari: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA). Eritma egri chizig'ini tahlil qilish primerning o'ziga xosligini tasdiqladi va potentsial ifloslanishni tekshirdi.
4.12. TahlilBarcha tajribalar uchun past glyukoza nazorati (5 mM) 100 foizga normallashtirildi va boshqa barcha shartlar ularning tegishli nazorati bilan solishtirildi. Statistik tahlil Tukeyning ko'p taqqoslashdan keyingi testi bilan bir tomonlama ANOVA testi yordamida amalga oshirildi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi, n namuna raqamini bildiradi. 0,05 dan kam yoki unga teng p-qiymati statistik ahamiyatga ega.