Bletilla Striataning potentsial anti-melanogen faol tarkibiy qismlarini aniqlash va aniqlash

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Xuan Vang1, Shuo Li1, Yue Vu1, Jirui Vang1, Shaojun Chen1 va Hongjiang Chen1,2*

Abstrakt

Fon:Bletilla striata an'anaviy xitoy tibbiyotida (TCM) terini oqartiruvchi ko'plab klassik formulalarning asosiy dorisidir va yaqinda kosmetika sanoatida keng qo'llaniladi. Biroq, uning faol moddalari hali ham aniq emas va uning tolali ildizlari samarali qo'llanilmaydi. Ushbu tadqiqotning maqsadi zebrafish modeli va molekulyar o'rnatish orqali uning potentsial anti-melanogen faol tarkibiy qismlarini aniqlash va aniqlashdir.

Usullari:Theantioksidantfaoliyat 2,{1}}difenil-1-pikrilgidrazil (DPPH) radikal tozalash faolligi, 2,2'-azino-bis-(3-etilbentiazolin-6-sulfon kislotasi) (ABTS) bilan baholandi. ) radikal tozalash faolligi va temirni kamaytirishantioksidantquvvat (FRAP) tahlili. Anti-melanogen faollik tomonidan baholanditirozinazainhibitivfaoliyatin vitro va zebrafishlarda melanin inhibitori. Kimyoviy profillar to'rt kutupli parvoz vaqti tandem massa spektrometriyasi (UPLC-Q-TOF-MS/MS) bilan birgalikda ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi orqali amalga oshirildi. Shu bilan birga, potentsial anti-melanogen faol tarkibiy qismlar molekulyar biriktirish orqali vaqtincha aniqlandi.

Natijalar:B. striata tolali ildizlarining (EFB) 95 foizli etanol ekstrakti eng kuchli DPPH, ABTS, FRAP va tirozinazni inhibe qiluvchi faollikka ega, IC50 5,94 mg/L, 11,69 mg/L, 6,92 mmol FeSO4/g, va mos ravishda 58,92 mg/l. Bundan tashqari, EFB va B. striata tuber (ETB) ning 95 foizli etanol ekstrakti dozaga bog'liq holda zebrafishembrionlarning melanin sintezini sezilarli darajada kamaytirdi. EFB va ETB dan 39 ta kimyoviy tarkib, shu jumladan 24 ta stilbenoidlar oldindan aniqlangan. Molekulyar o'rnatish shuni ko'rsatdiki, 83 (shu jumladan 60 ta stilbenoidlar) va 85 (70 ta stilbenoidlar) birikmalari tirozinaza va adenilat siklazaga nisbatan kuchliroq bog'lanishni ko'rsatdi.

Xulosa:Ushbu topilmalar farmatsevtika va kosmetika sanoatida terini oqartiruvchi tabiiy vositalar sifatida EFB va ETB dan foydalanish mantiqiy asoslarini qo'llab-quvvatladi.

Kalit so'zlar: Bletilla striata, Antioksidant, Anti-melanogen faollik, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Zebrafish, Molekulyar o'rnatish

Antioksidant uchun nojo'ya ta'sirlar va foydalarni aniqlash uchun bosing

Fon

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. Xitoy, Koreya va Yaponiya kabi Osiyoda keng tarqalgan otsu koʻp yillik oʻsimlik [1]. B. striataning quritilgan ildizi, shuningdek, Bayji nomi bilan ham tanilgan, birinchi marta Shennongning Materia Medica klassikasida qayd etilgan va Xitoyda ming yillar davomida an'anaviy xitoy tabobati (TCM) sifatida keng qo'llanilgan. Xitoy farmakopeyalarida uning gemostaz va og'riq qoldiruvchi ta'sirga ega ekanligini ta'kidlaydi, shuning uchun u gematemez, hemoptizi, travmatik qon ketish, oshqozon yarasi, shish va yorilgan terini davolashda keng qo'llanilgan [2, 3]. Farmakologik tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, B. striata yaralarni davolovchi [4, 5], yaraga qarshi [6, 7], gemostatik [8] kabi biologik faolliklarning keng spektriga ega.qarshi- yallig'lanish[9], antioksidant[10], antibakterial [11], grippga qarshi virusli [12], va qarishga qarshi [13]. Shu bilan birga, B. striata kimyoviy tarkibning turli sinflarini o'z ichiga oladi, shu jumladanpolisakkaridlar[14], bibenzillar, fenantrenlar, antrakinonlar,flavonoidlar, va 2-izobutilmalatlar [3, 15] va boshqalar.

B. striata TCMdagi ko'plab terini oqartiruvchi klassik formulalarning asosiy dorisi [16] va u yaqinda kosmetika sanoatida keng qo'llanilmoqda [17]. Biroq, uning faol moddalari hali ham noaniq va hatto ba'zi tadqiqot natijalari bir-biriga zid edi. Masalan, Chenet al tomonidan berilgan tadqiqot natijalari. B. striata ning 95 foiz etanol ekstrakti tirozinazni inhibe qiluvchi faollikka ega ekanligini ko'rsatdi, uning suv ekstraktiga qaraganda 68,36 foiz in vitro [18], natijada Huang va boshqalar. B. striata suvi ekstraktining tirozinazadagi inhibitiv faolligi 95 foizli etanol ekstraktining in vitro darajasida 62 foizni inhibe qilish darajasidan kuchliroq ekanligini ko'rsatdi [19]. Luetal.[20]va Linghuetal[21] tomonidan olib borilgan tadqiqot natijalari shuni ko'rsatdiki, B. striataning suv va 95 foizli etanol ekstrakti, ayniqsa, uning xloroform fraksiyasi B16 hujayra o'sishini inhibe qilishi va konsentratsiyaga bog'liq holda apoptozni keltirib chiqarishi mumkin.

Tirozinazni inhibe qilish va melanoma hujayra liniyalarining in vitro sinovlari murakkab fiziologik sharoitlarni va sinov namunasining so'rilishini, metabolizmini, taqsimlanishini va chiqarilishini o'z ichiga olmaganligi sababli, ko'plab namunalar tirozinaz va melanoma hujayralariga nisbatan sezilarli inhibitiv faollikni ko'rsatdi. vitro, shunga qaramay, in vivo zaif samarali yoki hatto samarasiz ekanligini ko'rsatdi [22,23]. Glabridin kojik kislotadan 176 marta kuchliroq bo'lgan IC50 0.43mkmol/L bilan tirozinazni sezilarli darajada inhibe qiluvchi faollikni ko'rsatdi. Shunga qaramay, bu in vivo zebrafish pigmentatsiyasiga hech qanday inhibitiv ta'sir ko'rsatmadi [24].

Ayni paytda, B. striata tolali ildizlari (FB) B. striatatuber (TB) ni qayta ishlash jarayonida hosil bo'lgan yon mahsulot edi. Zamonaviy tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, FB tarkibida sil bilan o'xshash birikmalar va ko'proq fenolik moddalar mavjud [25]. Bundan tashqari, FB ekstraktining antibakterial [26], antioksidant va anti-tirozinaz faolligi sil kasalligi ekstraktiga qaraganda kuchliroq edi [25]. Biroq, FB resurslaridan samarali foydalanilmadi va qishloq xo'jaligi erlarida tashlab ketildi, bu esa FBresurslarning isrof qilinishiga va atrof-muhitning ifloslanishiga olib keldi [27].

Zebrafish (Danio rerio), kichik tropik chuchuk suv baliqlari, farmakologiya uchun rivojlanayotgan hayvonlar modelidir.

va in vivo toksikologiya tadqiqotlari, shu jumladan, arzon narxlardagi, qisqa hayot aylanishi, yuqori shaffoflik, parvarish qilish oson, yuqori hosildorlik va kamroq sinov namunalarini talab qilish kabi ko'plab afzalliklarga ega [28, 29]. Bundan tashqari, zebrafish yuzasida pigmentatsiya jarayonini oddiy kuzatish imkonini beruvchi melanin pigmentlariga ega va antimelanogenik tadqiqotlarda keng qo'llanilgan [28, 30].

Ushbu tadqiqotda biz zebrafish modelida qo'pol polisaxarid va sil va FB ning 95 foizli etanol ekstraktining antioksidant va tirozinaz inhibitiv faolligini in vitro va anti-melanogen faolligini solishtirdik. Shu bilan birga, potentsial anti-melanogen faol tarkibiy qismlar molekulyar biriktirish orqali vaqtinchalik aniqlandi. Sil kasalligi (ETB) va FB (EFB) ning 95% etanol ekstrakti sezilarli darajada antioksidant va anti-tirozinaz faolligiga ega va zebrafish embrionlarining melanin sintezini dozaga bog'liq ravishda kamaytirishi mumkinligini aniqladik. Shunday qilib, ETB va EFB farmatsevtika va kosmetika sanoatida tabiiy terini oqartiruvchi vositalar sifatida ishlatilishi mumkin.

Usullari

Kimyoviy moddalar va reagentlar

Tirozinaza, 3-(3,{2}}dihidroksifenil)-L-alanin(L-DOPA) va arbutin Aladdin reagent kompaniyasidan (Shanxay, Xitoy) sotib olingan.2,2-difenil{{8} }}pikrilgidrazil (DPPH), 2,2'-azino-bis-(3-etilbentiazolin-6-sulfon kislotasi) (ABTS),6-gidroksi-2,5,7 ,8-tetrametilkroman{21}}karboksilik kislota (Trolox) va 2,4,{24}}tris (2-piridil)-s-triazin (TPTZ) Sigma-Aldrichdan sotib olingan (Sent-Luis, MO, AQSH). Asetonitril va metanol (HPLC darajasi) Tedia (Fairfield, OH, AQSh) dan sotib olindi. Deionlashtirilgan suv Milli-Q suv tizimi (18,2 MŌ, Millipore, AQSh) tomonidan tayyorlangan.

O'simliklarni yig'ish va olish tartibi

B. striata Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, Xitoy) dan yig'ilgan. Voucher namunalari Zhejiang farmatsevtika kolleji gerbariysiga saqlangan (Kirish raqami 190615). Butun o'simlik ildiz va tolali ildizlarga bo'lingan. Keyinchalik, ular mayda bo'laklarga bo'lingan va mos ravishda vakuumli muzlatish bilan quritilgan.

Quritilgan va changlangan namunalar (TB va FB) uch marta (har safar 1,5 soat) 95 foiz etanol bilan qayta oqim bilan ekstraksiya qilingan. Ekstrakt What man filtr qog'ozi (No1) yordamida filtrlangan. Filtrni 50 daraja haroratda aylanadigan evaporatatorda (Hei-VAP, Heidolph, Germaniya) konsentratsiyalangan va keyin vakuumli quritgichda quritilgan. TB (ETB) va FB (EFB) ning etanol ekstraktsiyasi mos ravishda 5,21 va 6,53 foizni tashkil etdi. Dreglar 80 graduslik suvda 4 soat davomida disperslangan va etanol bilan cho'ktirilgan xom polisaxaridni ajratib olish uchun ishlatilgan [31]. Sil (PTB) va FB (PFB) ning polisaxarid hosildorligi mos ravishda 14,75 va 6,45 foizni tashkil etdi.

cistanche ekstrakti

Kimyoviy tahlil

Kimyoviy tahlil to'rt kutupli parvoz vaqti tandem massa spektrometriyasi (UPLC-Q-TOF-MS/MS) bilan birlashtirilgan o'ta yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida o'tkazildi. Xromatografik ajratish Waters Acquity UPLC temida (Waters Corp., Milford, MA, AQSh) WatersBEH Shield RP C18 ustuni (100×2,1 mm, 1,7 mkm) at3{ bilan amalga oshirildi. {43}} daraja. Mobil faza suvda (A) va asetonitrilda (B) 0,1 foizli formik kislotadan iborat bo'lib, chiziqli gradient bilan: 0-3min, 5-16 foiz B; 3–8 min, 16–30 foiz B; 8–10 min, 30–35 foiz B; 10-15 min, 35-55 foiz B; 15-18 min, 55-80 foiz B;18-19 min, 80-5 foiz B; 19-20 min, 5 foiz B. Oqim tezligi 0,3 ml/min, inyeksiya hajmi esa 2 mkL edi.

TOF-MS/MS tajribalari anelektrospray ionizatsiyasi (ESI) bilan jihozlangan AB SCEIX Triple TOF 5600 massa spektrometriyasi (AB SCIEX, Foster Siti, CA, AQSh) yordamida amalga oshirildi. MSni aniqlash manfiy ionlash usulida o'tkazildi. Parametrlar quyidagicha o'rnatildi: manba va desolvatsiya harorati mos ravishda 100 daraja va 450 daraja; desolvatsiya gazining oqimi soatiga 900 l; kapillyar kuchlanish 2kV; konusning kuchlanishi 40 V edi; to'qnashuv energiyasi 22 eV edi; va to'liq skanerlash spektrlari 100 dan 2000 Da gacha bo'lgan.

Antioksidant tahlillari DPPH radikallarini tozalash faoliyati

DPPH radikallarini tozalash faoliyati Ali va boshqalarga muvofiq aniqlandi. biroz oʻzgartirishlar bilan [32].Qisqacha, 5{3}} mkl sinov namunasi eritmasi 150 mkLDPPH etanol eritmasi (0,2 mM) bilan 96-quduq plastinkalarida aralashtirildi va 30 daqiqa davomida qorongʻi joyda saqlangan. . 517 nm (A1) da aralashmaning yutilishi mikroplastinkali spektrofotometr (Thermo Fisher Scientific, Amerika) yordamida baholandi. DPPHetanol eritmasi bilan aralashtirilgan sinov namunasisiz bo'sh eritma ijobiy guruh (A0) sifatida belgilandi. Sinov namunasi bilan aralashtirilgan DPPHsiz bo'sh eritma bo'sh guruh (A2) sifatida o'rnatildi. Barcha tajribalar uch nusxada amalga oshirildi. DPPH radikalini tozalash darajasi quyidagi formula bo'yicha hisoblanadi:

DPPH radikalini tozalash darajasi (foiz ) {0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 foiz.

ABTS radikallarini tozalash faoliyati

ABTS radikalini tozalash qobiliyati Ali va boshqalar tomonidan tasvirlangan usul yordamida o'lchandi. [32]. Qisqacha aytganda, 7 mMABST suvli eritmasi 1: 1 (v/v) nisbatda 2,45 mM kaliy persulfat bilan aralashtirildi va ABST plyus stok eritmasini olish uchun qorong'i joyda 16 soat davomida inkubatsiya qilindi. 734nm da (0.72±0.2) ning absorbansini sozlash uchun stok eritmasi fosfat tamponlangan tuz (PBS) bilan suyultirildi. Turli konsentratsiyadagi 20 mkl sinov namunalari 180 mkl ABTS plyus eritmasi bilan yaxshilab aralashtirildi. Reaktiv aralashmalar qorong'i joyda 5 daqiqa ushlab turildi va keyin absorbans (B1) 734 nm da o'lchandi. Sinov namunasi va ABST plyussiz aralashmalarning absorbsiyasi mos ravishda B va B sifatida o'rnatildi. Barcha tajribalar uch nusxada amalga oshirildi. ABTS radikallarini tozalash tezligi quyidagi formula bo'yicha hisoblanadi:

ABTS radikalini tozalash darajasi (foiz ) {0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 foiz.

Temirni kamaytiradigan antioksidant quvvat tahlili (FRAP)

Temir temirning kamaytiruvchi faolligi Kosakowska va boshqalar tomonidan aniqlangan. [33]. 300mM asetat buferi, 10mM TPTZ (2,4,6-tris ({6}}piridil)-s-triazin) va 20mM FeCl3 (v/v/v) aralashtirildi. 10:1:1 nisbatda ishchi reagent tayyorlandi. Har bir sinov namunasining 100 mkl eritmasi 100 mkL TPTZ ishchi reaktivi bilan aralashtiriladi, 37 daraja haroratda 20 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va absorbans 593 nm da aniqlandi. Shu bilan birga, kalibrlash egri chizig'ini tayyorlash uchun 0-1000ug/ml konsentratsiya oralig'ida bir qator FeSO4 standart eritmalari ishlatilgan. Temirni kamaytirish qobiliyati intensiv Fe2 plyus -TPTZ ko'k kompleksini shakllantirishda hisoblangan. Natijalar Fe2 va antioksidant quvvati (mmol FeSO4/g ekstrakt) sifatida ifodalangan.

Tirozinazni inhibe qiluvchi faollik

Tirozinazni inhibe qiluvchi faollik spektrofotometrik usul bilan L-DOPA substrat sifatida aniqlandi [34].Qisqacha aytganda, turli konsentratsiyadagi 50 mkl namuna eritmalari 96- quduqda 50 mkl tirozinaza (200 birlik/ml, erigan pH 6,8 fosfat tampon) bilan aralashtirildi. plitalar va 25 daraja haroratda 15 daqiqa davomida inkübe qilinadi. Keyin reaktsiya L-DOPA (50 mkl) qo'shilishi bilan boshlandi. 25 gradusda 30 daqiqa inkubatsiyadan so'ng, 490 nm (Aa) da absorbans ko'p qirrali osmon mikroplastinkali spektrofotometri (ThermoFisher Scientific, Amerika) yordamida aniqlandi. Xuddi shunday, tirozinazsiz (Ab) namunali quduqlarning va fermenti bo'lgan, ammo namunasiz (Ab) nazorat quduqlarining absorbsiyasi bir vaqtning o'zida aniqlandi. Tirozinazni inhibe qiluvchi faolligi quyidagi tenglama bo'yicha hisoblanadi:

Tirozinazni inhibe qilish darajasi (foiz)=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 foiz.

IC50 GraphPad Prism tenglamasi yordamida quyidagi tarzda hisoblab chiqilgan:

Y=min plyus (maks − min)/1 plyus 10(x−logIC50)×Tepalik qiyalik

X inhibitor konsentratsiyasini ifodalagan; Y inhibisyon ma'lumotlarini (foiz) ularning minimal (min) va maksimal (maksimal) qiymatlari bilan ifodaladi; Tepalik yonbag'irligi qiyalik omilidir.

Cistanche tirozinaza faolligini inhibe qiladi.

Zebra baliqlarida melaninni inhibe qiladi

Yovvoyi tipdagi AB toifali zebrafish (Hanter Bio-Technology, Inc., Xanchjou, Chjejiang viloyati tomonidan taqdim etilgan) baliq suvida saqlanadi (0, 2% deionlangan suvda lahzali okean tuzi, pH 6,9–7,2, o'tkazuvchanlik 48{) {18}}–510 mS/sm, qattiqligi 53,7–71,6 mg/L CaCO3) 14/10 soat yorug‘lik/qorong‘i fotoperiodda 28±0,5 daraja doimiy haroratda va kuniga ikki marta jonli sho‘r qisqichbaqalar bilan boqiladi. Zebrafishembriyolar tabiiy yumurtlamadan olingan va 30 daqiqa ichida to'plangan. Zebrafish tahlili Laboratoriya hayvonlarini parvarish qilishni baholash va akkreditatsiya qilish assotsiatsiyasi (AAALAC) tomonidan akkreditatsiya qilingan. Ushbu tadqiqot Hunter Biotechnology, Inc.dagi IACUC (Hayvonlarga g'amxo'rlik va foydalanish instituti qo'mitasi) tomonidan tasdiqlangan va IACUC tasdiqlash raqami 001458 edi.

Embrionlar urug'lantirilgandan keyingi 6 soat (hpf) bosqichida har bir ekstrakt oltita konsentratsiyada (10, 30, 62,5,125, 250 va 500 mg/L) 72 soat davomida maksimal halokatli kontsentratsiyani (MNLC) baholash uchun davolandi. ). Natijada, barcha ekstraktning MNLClari 62,50 mg/L dan ortiq edi. 10 embrion 6-quduqqa joylashtirildi va 6 hpf dan 54 hpf gacha (48 soatlik ta'sir qilish) 10 va 30 mg/L konsentratsiyalarda sinovdan o'tgan namunalarga ta'sir qildi. ). Oddiy va ijobiy nazorat sifatida mos ravishda DMSO (0,05 foiz, v/v) andarbutin (10 va 30 mg/L) ishlatilgan.

Sinxronlashtirilgan embrionlar raqamli kamera (VertA1, Xitoy) bilan jihozlangan stereomikroskop (SZX7, Olympus, Yaponiya) ostida yig'ildi va kuzatildi. Zebrafishpigmentatsiya zonalari bilan bevosita bog'liq bo'lgan melanin to'planishi GNUImage Manipulyatsiya dasturi (GIMP 2.10.2 versiyasi) yordamida hisoblab chiqilgan va salbiy nazoratga nisbatan foiz sifatida ifodalangan (melanin to'planishi 100 foiz) [28, 30].

Molekulyar docking tadqiqoti

Adabiyotda B. striatadan ajratilgan 158 ta birikma [2], shu jumladan 19 glikozid, 28 bibenzil, 19 fenan-tren, 18 bifenantren, 23 dihidrofenantren, 5 antosiyanin, 11 steroid, 8 triterpeninolik kislota, va 10 ta boshqa birikmalar ligand sifatida ishlatilgan. 3D tuzilmalar ChemBio3D tomonidan chizilgan va MM2 va Autodock Tools yordamida optimallashtirilgan. Tirozinaza (PDBID: 5M8N) va adenilat siklaza (PDB ID: 5IV3) ning 3D kristalli tuzilishi RCSB Protein ma'lumotlar bankidan (www.rcsb.org/pdb/home/home.do) olingan. Barcha suv molekulalari va hetero atomlar Chimera va MGL Tools yordamida kristall tuzilmalardan olib tashlandi. Nihoyat, Autodock

Vina retseptorlari oqsilini kichik molekula ligandlari bilan bog'lash uchun ishlatilgan. Asl ligand mimozin va LRE1 [35] ga ko'ra, retseptorlar protein o'rnatish joyining parametrlari mos ravishda -36,700, 7,034, -19,104 va - 17,467, - 22,807, 2,786 deb o'rnatildi. Yuqori hisoblash aniqligiga erishish uchun har bir retseptor uchun 20 ta toʻliqlik parametrlari yaratildi va eng yuqori yaqinlikka ega boʻlgan konformatsiya yakuniy oʻrnatish konformatsiyasi sifatida tanlandi va Pymol2.3 da ingl. Shu bilan birga, asl mimozin va LRE1 ligandlari ijobiy nazorat sifatida qabul qilindi [36].

Silico ADMET bashoratida

B. striatadan olingan eng yaxshi 3 ta hit tirozinaza va adenilat siklaza bilan yaxshiroq bog'lanish qobiliyatiga ega bo'lib, ADMET tahlilidan o'tkazildi. Schrodingersuite-dagi QikProp ularning fizik xususiyatlarini va dori bilan bog'liq xususiyatlarini, jumladan molekulyar og'irlik (MW), taxmin qilingan oktanol/suv bo'linish koeffitsienti (QPlogPo/w), bashorat qilingan suvda eruvchanligi (QPlogS), bashorat qilingan aniq kako-2 hujayrasini hisoblash uchun ishlatilgan. ichak-qon to'sig'i (QPPCaco) uchun o'tkazuvchanlik, bashorat qilingan miya/qon bo'linish koeffitsienti (QPlogBB), bashorat qilingan teri o'tkazuvchanligi (QPlogKp), HERGK plyus kanallarini blokirovka qilish uchun bashorat qilingan IC50 (QPlog HERG) va bashorat qilingan inson orallabsorbtsiyasi. Xususiyatlar Lipin-skining beshlik qoidasi va adabiyotlar asosida baholandi [37, 38].

Molekulyar dinamikani simulyatsiya qilish

Simulyatsiya qilingan biologik muhitda ligand-oqsil kompleksining barqarorligi va dinamik tebranishlarini o'rganish va joylashtirish natijalarini yanada tasdiqlash uchun molekulyar dinamikani (MD) simulyatsiyasi uchun ligand sifatida blestrin D (75) birikmalari tanlandi. molekulyar ulanish natijasi. Blestrin D ning tirozinaz va adenilat siklaza bilan kompleksi MD simulyatsiyasi amalga oshirildi va TIP3P suv rejimidan foydalangan holda 100 ns davomida ishladi. Simulyatsiya davri davomida oqsil barqarorligini tekshirish uchun protein magistral atomlarining boshlang'ich tuzilishga nisbatan ildiz o'rtacha kvadrat og'ish (RMSD) qiymatlari hisoblab chiqilgan [39].

Natijalar

Kimyoviy tarkibi

ETB va EFB ning odatiy tayanch tepalik xromatogrammalari 1-rasmda ko'rsatilgan. Tarkibni aniqlash uchun PeakView dasturi ishlatilgan. Molekulyar formula 10ppm massa xatosi ichida aniq tayinlangan. ChemSpider va Massbank kabi adabiyotlar va erkin kimyoviy tuzilma ma'lumotlar bazasiga muvofiq komponentlarni aniqlash uchun aniq molekulyar og'irlik va fragmentlar ishlatilgan. Natijada, EFB va ETB dan 39 ta kimyoviy tarkib, jumladan, 24 ta stilbenoidlar (bibenzillar, fenantrenlar va ularning hosilalari), 6 ta glikozidlar, 4 ta fenolik kislotalar, 3 ta xinonlar, 1 ta steroid va 1 ta boshqa birikmalar aniqlandi. Shu bilan birga, ularning nisbiy yarim miqdoriy aniqlashi olingan ion xromatogrammalari [40] yordamida MS rejimida har bir birikmaning eng yuqori maydonlarini oʻlchash yoʻli bilan amalga oshirildi. Identifikatsiyaning batafsil maʼlumotlari va ularning nisbiy tarkibi (issiqlik xaritasi taʼkidlanganicha, rang qanchalik toʻq boʻlsa, rang shunchalik yuqori boʻladi). kontsentratsiyasi) 1-jadvalda jamlangan.

Antioksidant qobiliyati

Ma'lumki, ultrabinafsha A (UVA) nurlanishi reaktiv kislorod turlarini (ROS) ishlab chiqarishni qo'zg'atishi va teri hujayralarida haddan tashqari melanogenezga vositachilik qilishi mumkin. Tabiiy polifenol ROS hosil bo'lishining ingibitorlari edi va o'simlik ekstraktlarining anti-melanogen faolligi uchun javobgar bo'lishi mumkin [41] , 42]. Shunday qilib, ushbu tadqiqotda antioksidant salohiyat DPPH, ABTS radikallarini tozalash faolligi va FRAPassay orqali baholandi. Natijalar (2-jadval va 2-rasm) EFB (IC{6}}.94mg/L) PTB (IC50=548.24 mg/L) bilan solishtirganda in vitro sharoitida eng kuchli DPPHradikal tozalash faolligiga ega ekanligini koʻrsatdi. , PFB (IC50=285,81 mg/L) va ETB (IC50=65,25mg/L). Xuddi shunday tendentsiya ABTS va FRAP tahlillarida ham kuzatildi. Sil va PB ning 95% etanolik ekstraktlari in vitro ularning xom polisaxaridlariga qaraganda kuchliroq antioksidant faollikka ega edi. Bundan tashqari, EFB ETB ga qaraganda kuchliroq antioksidant faollikni namoyish etadi, bu avvalgi tadqiqot natijalariga mos keladi [25].

Tirozinazni inhibe qiluvchi faollik

Tirozinaza melaninbiosintez yo'lida tezlikni cheklovchi asosiy ferment bo'lib, melanogenezga qarshi ta'sirga ega tabiiy mahsulotlarning potentsialini aniqlash uchun keng qo'llanilgan [43]. Natijalar (3-rasm) ko'rsatdiki, ETB va EPB in vitro PTB va PPBga qaraganda kuchliroq tirozinaz inhibitör faolligiga ega, bu avvalgi tadqiqot natijalariga mos keladi [25]. EFB ETB(IC50=75.44mg/L) va musbat birikma arbutin(IC{) ga qaraganda IC50=58.92mg/L bilan dozaga bogʻliq (20 va 200 mg/L oraligʻida) kuchliroq tirozinazni inhibe qilish faolligini koʻrsatdi. {11}}.02 mg/L).

Zebra baliqlarida melaninni inhibe qiladi

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{0}}.05), bu avtomobilning 0,05% DMSO zebrafish embrionlarida melanin ishlab chiqarishga ta'sir qilmaganligini ko'rsatadi. Biroq, sinovdan o'tgan namunalar va arbutinga 48 soat davomida ta'sir qilgandan so'ng, zebrafish embriyosida PFB 10 mg / L guruhidan tashqari, turli darajada melanin cho'kishi (3B, 4-rasmlar) namoyon bo'ldi. ETB 10 mg/L (78,38 foiz) va 30 mg/L (64,72 foiz) guruhlarida melaninning nisbiy miqdori PTB 10 mg/L (93,06 foiz) va 30 mg/l (82,02 foiz) guruhlardagidan sezilarli darajada past bo‘lganligi seziladi.<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Molekulyar ulanish

Tirozinaza melanin biosintezidagi tezlikni cheklovchi fermentdir: tirozinning 3,4-dihidroksi-fenilalanin (DOPA) ga gidroksillanishi va DOPA todopakinonning oksidlanishi. Shu sababli, tirozinaza melanogenez inhibitörlerinin rivojlanishi uchun muhim maqsad sifatida qabul qilingan [44]. Bundan tashqari, adenilatsiklaza cAMP tomonidan qo'zg'atilgan melanogenezning asosiy fermentidir. Melanotropin alfa polipeptidining (-MSH) MC1R retseptorlari bilan bog'lanishi adenilat siklaza faollashishiga, cAMP darajasining oshishiga, tirozinaza genining yuqori tartibga solinadigan ekspressiyasiga va keyinchalik melanin sintezini oshirishga olib keldi [45]. Shuning uchun biz avval B. striatadan [2], tirozinaz va adenilat siklazadan ajratilgan 158 ta birikmani molekulyar docking tadqiqotini oʻtkazdik. O'rganilayotgan ligandlarning tirozinaza va adenilatsiklaza bilan bog'lanish energiyasi S1-jadvalda jamlangan. 83 (jumladan, 6{43}} stilbenoid) va 85 (70 ta stilbenoidlar bilan birga) birikmalar tirozinaz va adenilatsiklazaga kuchliroq bog'lanish xususiyatiga ega bo'lib, ular mimozin (− 6,4 kkal/mol) va LRE1 85 ligandlari bilan solishtirilsa. /mol). 1,8-bis(p-gidroksibenzil)-4-metoksifenantren-2,7-diol (56), blestrin D (75) va 2,7-digidroksi -1,6-bis(p-gidroksibenzil)-4-met-oksi-9,10-dihidrofenantren (93) tirozinaza tomon eng yuqori uchta ligand bo‘lib, bog‘lanish energiyasiga ega edi. -10,2,10,0 va 9,7kkal/mol, mos ravishda. Blestrin D(75), blestrin B (73) va 3,3'-digidroksi{51}}metoksi-2,5',6-tris(p-gidroksibenzil) bibenzil (42) adenilatsiklaza tomon bog'lanish hosilasi mos ravishda - 12,1, - 11,9 va - 11,6 kkal/mol bo'lgan yuqori uchta ligand edi. Ularning nazariy bog'lanish yaqinliklari va ligand-aminokislotalar o'zaro ta'siri 3-jadvalda keltirilgan.

Shuni ta'kidlash kerakki, blestrin D (75), bifenantren birikmasi tirozinaza va adenilatsiklazaning bog'lovchi cho'ntagiga kiradi (5-rasm) va ikkala tirozinaza va denilatsiklazaga sezilarli darajada bog'lanishni ko'rsatdi. Van der Walls o'zaro ta'siri umumiy energiya o'zaro ta'siriga hissa qo'shadi, shu bilan birga gidroksil guruhi aminokislota qoldiqlari bilan vodorod aloqalarini hosil qiladi, mos ravishda Glu 451, Arg114 tirozinaz va Val 167 adenilat siklaza (3-jadval va S1-rasm, shuningdek, muhim bog'lanish xususiyatlari). aminokislota qoldiqlari Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 va Gln236 bilan 6 ta vodorod bog'larini hosil qilish orqali tirozinaza tomon.

Silico ADMET bashoratida

Bir nechta muhim parametrlarning bashorat qilingan qiymatlari va ularning qabul qilinadigan diapazoni 4-jadvalda jamlangan. QPlogS dan tashqari 3,3′,5-trimetoksibibenzil, blestrin B va blestrin D va QPlogBBof 3,3′,{{6} }trimetoksibibenzil, eng yaxshi uchta hitning boshqa barcha hisoblangan ADMET xususiyatlari kutilgan diapazonlar ichida edi, shu bilan birga, barcha eng yaxshi uchta hitning QPlog HERG ko'rsatkichi -5 dan past bo'lgan, bu ularning inson foydalanishi uchun dorivor salohiyati ekanligini ko'rsatadi. Tirozinaza va adenilatsiklaza uchun barcha eng yaxshi uchta hitning QPlog Kp ko'rsatkichi 3,3',{10}}trimetoksibibenzildan tashqari, qulay diapazonda bo'lib, bu birikmalarning teriga osongina kirib borishini ko'rsatadi.

Molekulyar dinamik simulyatsiya

RMSD syujeti shuni ko'rsatdiki, protein-ligand kompleksining RMSD qiymatlari butun simulyatsiya davri davomida sezilarli darajada o'zgarmadi. Blestrin D ning tirozinaza va ade-nilat siklaza kompleksi bilan RMSD qiymatlari (6A-rasm) mos ravishda 1,5 dan 2,8 A gacha va 2, 0 dan 3,6 A gacha bo'lgan darajada aniqlandi. Har bir qoldiq simulyatsiyasining moslashuvchanligini aks ettiruvchi TheRMSF qiymati. RMSF qiymatlari yuqori bo'lgan qoldiqlar ular yanada moslashuvchan ekanligini ko'rsatdi (6B-rasm). Loop mintaqalaridagi aminokislotalar qoldiqlarining RMSF qiymatlari juda o'zgaruvchanligi aniqlandi. Shu bilan birga, faol sayt qoldiqlari Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 va Arg230in tirozinaz va Val167, Leu102, Phe45, Lys95 va Leu16te adenylase kabi kichik RMSF qiymatini (1.{13}}Å dan kam) saqlab qolgan. bog'lovchi cho'ntaklar barqaror saqlanganligini ko'rsatadi. Blestrin D ning tirozinaza va adenilatsiklaza bilan molekulyar o'zaro ta'siri 7-rasmda ko'rsatilgan.

Bog'lanish erkin energiyalari molekulyar mexanika tomonidan umumlashtirilgan tug'ilgan sirt maydoni (MM-GBSA) usuli bilan hisoblab chiqilgan [39]. Blestrin D ning tirozinaz va adenilattsiklaza bilan bog'lanishining taxminiy erkin energiyasi mos ravishda -96,94kkal/mol va -139,69kkal/mol bo'lib, bu bog'lanish o'zaro ta'sirlari o'z-o'zidan sodir bo'lganligini bildiradi (5-jadval). Bundan tashqari, ligandlarni bog'lashni qo'llab-quvvatlovchi hissa qutbsiz solvatsiya o'zaro ta'siri, van der Waals va elektrostatik ta'sir edi.

Shuni ta'kidlash kerakki, EFB tarkibidagi kimyoviy komponentlarning turlari va tarkibi INETBga qaraganda ko'proq edi. EFBdagi barcha aniqlangan birikmalarning eng yuqori joylari ETBdagidan taxminan ikki baravar ko'p edi. Mili-tarin EFBand ETB ikkalasida ham eng ko'p uchraydigan birikmalar bo'lib, u sezilarli antioksidant, yallig'lanishga qarshi va neyroprotektiv faollikka ega va Xitoy Farmakopeyasi 2020 nashrida B. striata sifatini nazorat qilish uchun kimyoviy markerlar sifatida tanlangan [46]. EFBda harbiy kuchlarning nisbiy tepalik maydoni (38,39 × 106) ETB (30,48 × 106) dan biroz yuqoriroq edi. Gastrodin - bu tirozinazni sezilarli darajada inhibe qiluvchi va radikallarni tozalash ta'sirini ko'rsatadigan Gastrodia elata kabi ko'plab xitoy o'simlik dori-darmonlarida taniqli birikma [30]. EFBdagi gastrodinning nisbiy tepalik maydoni (1,43 × 106) bu inETB (2,17 × 106) dan biroz pastroq edi.

Sil va PB ning 95% etanolik ekstraktlari in vitro ularning xom polisak-xaridlariga qaraganda kuchli antioksidlanish faolligiga ega edi. Bundan tashqari, EFB ETBga qaraganda kuchli antioksidant faollikni namoyish etadi, bu avvalgi tadqiqot natijalariga mos keladi [25]. Bu hodisa EFB tarkibida militarin va stilbenoidlar (tabiiy o'simlik polifenollari) kabi yuqori darajadagi antioksidant birikmalarni o'z ichiga olganligi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Masalan, 4,8,4′,8′-tetrametoksi-[1,1′-bifenantren]-2,7,2′,7′-tetrol, toʻrtta fenol gidroksil guruhiga ega bifenantrenning nisbiy tepalik maydoni, FBda 9,15×106, 0,01×106 dyuym TB edi.

Ushbu tadqiqotda PPB va PTB dozaga bog'liq holda ozgina tirozinazni inhibe qilish faolligini ko'rsatdi. Biroq, u PB ning suvli ekstraktida (PPB ni o'z ichiga oladi) hech qanday faollik aniqlanmaganligini ko'rsatdi [25]. Ushbu hodisa turli xil namunalarni tayyorlash bilan bog'liq bo'lishi mumkin. PB ning suvli ekstrakti Jiang tajribasida [25] atetirozinazni inhibe qiluvchi faolligini baholash uchun ishlatilgan, shu bilan birga, ushbu tadqiqotda suvli ekstrakt xom polisaxaridni olish uchun etanol bilan cho'ktirildi.

Yaqinda zebrafish modeli in vivo jonli ravishda anti-melanogenez ta'sirini baholashda keng qo'llaniladi [47, 48]. Ijobiy nazorat sifatida kosmetika sanoatida tijoriy ravishda qo'llaniladigan, mavjud bo'lgan o'zgarmas o'simliklardagi gidrokinon glyukozid birikmasi Arbu-tin belgilandi. ETB va EFB ning melanogenezga qarshi faolligi arbutinga qaraganda kuchliroq edi, bu ETB va EFB kosmetika sanoatida terini oqartiruvchi vositalar sifatida qo'llanilishi mumkinligini ko'rsatadi.

EFBda (1,91 × 106) blestrin D ning nisbiy tepalik maydoni ETB (0,46 × 10)dagidan taxminan to'rt barobarga teng. EFBdagi 56 (8,73 × 106) va 93 (0,64 × 106) birikmalarining nisbiy tepalik maydoni ETBdagidan (0,01×106 va 0,10 × 106 dan kam) sezilarli darajada yuqori. Bu EFBexning ETBga qaraganda kuchliroq anti-melanogen ta'sir ko'rsatishining sabablaridan biri bo'lishi mumkin. Shunisi qiziqki, tirozinaza va adenilat siklaza tomon uchta ligandning barchasi stilbenoidlarga (bibenzillar, fenantrenlar va uning hosilasi) tegishlidir. Stilbenoidlar tabiiy o'simlik polifenollari, Yallig'lanishga qarshi, mikroblarga qarshi va antioksidant faollik kabi ajoyib bioaktivliklari tufayli so'nggi yillarda katta qiziqish uyg'otdi [49]. Resveratrol eng keng tarqalgan stilbenoiddir. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, resveratrol va uning hosilalari katalitik faollikni, gen ekspressiyasini va tirozinazning translatsiyadan keyingi modifikatsiyasini sezilarli darajada inhibe qilishi mumkin. Shunday qilib, ular kosmetikada terini oqartiruvchi va qarishga qarshi vositalar sifatida foydali ekanligini ko'rsatdi [41, 50].

Cistanche kosmetikada terini oqartiruvchi va qarishga qarshi vosita sifatida foydali ekanligini ko'rsatdi.

Qo'shimcha ma'lumot olish uchun rasmni bosing.

Xulosa

Ushbu tadqiqotda B. striatatuber (PTB) va tolali ildizlardan (FPB) va B. striata tuber (ETB) va tolali ildizlarning (EFB) 95 foiz etanol ekstraktidan olingan xom polisaxaridning antioksidant va anti-melanogen faolligi tizimli ravishda o'rganildi. . Natijalar shuni ko'rsatdiki, EFB eng kuchli DPPH, ABTS radikallarini tozalash va temir temirni kamaytiradigan faollikka ega. Bundan tashqari, ETB va EFB in vitro tirozinaz faolligini va zebrafish embrionlarining melanin sintezini dozaga bog'liq holda sezilarli darajada kamaytirishi mumkin. Molekulyar bog'lanish shuni ko'rsatdiki, asosan stilbenoidlarga tegishli bo'lgan, dastlabki ligandning bog'lanish yaqinligi bilan solishtirganda, tirozinaza va denilat siklaza bilan kuchliroq bog'lanishni namoyon qiladi. Ushbu topilmalar farmatsevtika va kosmetika sanoatida terini oqartiruvchi tabiiy vositalar sifatida ETB va EFB dan foydalanishning asosini tasdiqladi.