Tabiiy Scrapie miyaning turli mintaqalarida o'ziga xos tollga o'xshash retseptorlar gen ifodasi va glial reaktsiyasi 3-qism

Biz skrapi bilan tabiiy ravishda infektsiyalangan qo'ylarning miyasining to'rt xil mintaqalarida prion kasalligining nevropatologik belgilari va TLR gen ifodasi o'rtasidagi mumkin bo'lgan bog'liqlikni tekshirdik. Miyaning barcha to'rt qismida biz PrPScdepozitsiya, spongioz, astroglioz va mikrogliozda tabiiy infektsiyalangan qo'ylarga nisbatan sezilarli farqlarni kuzatdik.

Prion kasalligi, shuningdek, ma'badning adolatli kasalligi, mum yeyish kasalligi va boshqalar sifatida ham tanilgan, prionlardan kelib chiqqan o'tkir virusli infektsiya. Kasallik asosan prionlarni o'z ichiga olgan pishmagan ovqatni iste'mol qilish orqali yuqadi. Prionlar bilan kasallanganidan so'ng, u miya yallig'lanishi va asab tizimining shikastlanishiga olib kelishi mumkin va bosh og'rig'i, qusish va isitma kabi alomatlar paydo bo'lishi mumkin.

Biroq, bunday vaziyatga duch kelganimizda, prion kasalligi mavjudligi sababli xotiramizga ishonchni yo'qota olmaymiz. Ko'pchilik infektsiyalangan odamlar davolanishdan so'ng xotirasini tiklashi va tiklashi mumkin.

Albatta, profilaktika nuqtai nazaridan, prion infektsiyasini oldini olish uchun ko'proq pishirilgan ovqatni iste'mol qilishga harakat qilishimiz mumkin. Shu bilan birga, agar siz biron bir alomatni sezsangiz, kasallikning kuchayishiga yo'l qo'ymaslik uchun imkon qadar tezroq shifokorga murojaat qilishingiz kerak.

Kundalik hayotda biz xotirani yaxshilash uchun o'qish, ro'yxatlar tuzish, tadbirlar va ma'lumotlarni tashkil qilish va hokazo kabi oddiy xotira mashg'ulotlarini sinab ko'rishimiz mumkin. Ushbu mashg'ulotlar ko'p vaqt va kuch talab qilmaydi, ammo ular sog'lom miya va samarali xotira funktsiyasini saqlash uchun juda muhimdir.

Muxtasar qilib aytganda, prion kasalligi kabi kasalliklarga duch kelganda, biz unga ijobiy munosabatda bo'lishimiz, professional tibbiy davolanish va profilaktika choralariga murojaat qilishimiz va jismoniy salomatligimiz va samarali mehnatimizni ta'minlash uchun kundalik xotira mashqlariga e'tibor berishimiz kerak. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak va Cistanche xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki u xotira va o'rganish uchun juda muhim bo'lgan atsetilxolin va o'sish omillari darajasini oshirish kabi neyrotransmitterlar muvozanatini ham tartibga solishi mumkin. Bundan tashqari, Cistanche, shuningdek, qon oqimini yaxshilaydi va kislorod yetkazib berishni rag'batlantiradi, bu esa miyaning etarli ovqatlanish va energiya olishini ta'minlaydi va shu bilan miya hayotiyligi va chidamliligini oshiradi.

Miya faoliyatini yaxshilash yo'llarini bilish tugmasini bosing

Bu farqlar medulla oblongatada, eng kaudalareada eng aniq edi. Aksincha, eng yumshoq jarohatlar frontal korteksda, eng ko'p rostralarealarda kuzatilgan. Ushbu ketma-ket naqsh prion neyroinvaziyasi va markaziy asab tizimi bo'ylab tarqalish yo'nalishiga mos keladi, orqa miya va obeksdagi kirish joylaridan boshlanadi va oxir-oqibat frontal korteksga etadi [1,5,51].

Kutilmaganda, ularning anatomik yaqinligini inobatga olgan holda, biz patologiyaning asta-sekin kaudo-rostral rivojlanishiga rioya qilmasdan, talamusdan hipokampusga o'tishda PrPSc cho'kishi va vakuolizatsiyasining keskin pasayishini va astrogliozning sezilarli darajada pasayishini kuzatdik.

CA3 da piramidal hujayrali neyronlarning yaqinligida rod mikrogliya deb nomlanuvchi o'ziga xos mikrogliamorfologiya kuzatilgan, ammo o'rganilgan barcha boshqa neyroanatomik hududlarda yo'q edi.

Ma'lumotlarga ko'ra, ushbu mikroglial profil hozirgi kunga qadar prionlar tomonidan qo'zg'atilgan neyroyallig'lanish bilan bog'liq emas, garchi yaqinda o'tkazilgan tadqiqotda CJD bilan kasallangan odamlarning serebellumida novda shaklidagi mikrogliya mavjudligi haqida xabar berilgan [52].

1900-yillardagi birinchi ta'riflardan beri kam o'rganilgan bo'lsa-da, tayoq mikrogliyasi yaqinda epilepsiya, Lyui tanasi demansi, Xantington kasalligi va AD kabi nevrologik kasalliklarda, xususan, miya yarim korteksi va hipokampusning o'rtacha shikastlangan joylarida qayd etilgan [40,41,53]. Tayoq mikrogliyalarining fenotipik ifodasi va funktsiyalari hali aniq emas.

Biroq, bu morfologik xususiyat odatda shikastlangan yoki shikastlanishga moyil bo'lgan neyron elementlarning mavjudligi bilan mos kelishi neyroprotektiv rolni ko'rsatadi [42,54,55].

Rod mikrogliyalari og'ir lezyonlar bilan bog'liq emas, chunki bu sharoitda ameboid morfologiyasiga o'tish kutiladi [56]. Skrapi bilan kasallangan qo'ylarning hipokampusida rodmikrogliyaning mavjudligi, ammo miyaning boshqa hududlarida emas, bu sohada kuzatilgan cheklangan neyron yo'qotish bilan yaxshi mos keladigan neyroprotektiv muhitni ko'rsatishi mumkin.

TLR ifodasini tahlil qilishimiz lezyon zo'ravonligi va TLR genining haddan tashqari ko'payishi o'rtasidagi to'g'ridan-to'g'ri bog'liqlikni ko'rsatadi, bu prion nevropatologiyasining yuqorida aytib o'tilgan kaudo-rostral rivojlanishiga to'g'ri keladi.

Aksincha, TLR4 lezyon zo'ravonligidan qat'i nazar, barcha sohalarda bir xil darajada haddan tashqari ifodalangan. Yengilroq neyronal zararlangan hududlarda (ya'ni, hipokampus va frontal korteks) TLR4 haddan tashqari ekspressiyasi makrofaglar va mikrogliya [23,57] kabi fagotsitar hujayralar uchun ilgari tasvirlanganidek, anevroprotektiv rolni aks ettirishi mumkin. priondisease va inson bemorlari [22,26,31].

Biz faqat medulla oblongatasida TLR7 ning ko'tarilishini kuzatdik, bu eng ko'p shikastlangan hududda spongioz va PrPSc cho'kmasining eng yuqori darajalari aniqlangan.

Apoptoz orqali neyronlarning o'limi ilgari TLR7 stimulyatsiyasi bilan bog'liq edi [58,59] va uning medulla oblongatasida haddan tashqari ifodalanishi ushbu mexanizm bilan bog'liq bo'lishi mumkin [60]. TLR1 ning neyrodegenerativ kasalliklardagi roli hali aniq bo'lmasa-da, mikroglial faollashuvda TLR2 ishtiroki amyotrofik lateral skleroz, MS va AD [61,62] da tobora ko'proq namoyon bo'lmoqda.

TLR2in prion kasalliklarining roli to'liq tushunilmagan bo'lsa-da, foydali ta'sirlar taklif qilingan: intraserebral inokulyatsiya bilan skrapiyadan keyin TLR2 ni ifodalamaydigan sichqonlarda omon qolish muddati kamayadi [22].

TLR2 va MyD88 haddan tashqari ifodalanishi, shuningdek, talamusda kuzatilgan TNF- va IL-6 ko'payishini tushuntirishi mumkin bo'lgan proinflamatuar mikrogliya fenotipini ham ko'rsatishi mumkin [8,63].

Qizig'i shundaki, EOC 13.31 xujayralari, o'lmas mikrogliyaga o'xshash sichqon hujayralari chizig'idan foydalangan holda o'tkazilgan tajribalar TLR2 faollashuviga javoban yallig'lanish yo'lining disregulyatsiyasini ko'rsatdi va fagotsitoz uchun maqbul bo'lmagan holatda mikrogliyaning to'planishi va TLR2 ifodasi o'rtasidagi bog'liqlikni taklif qildi [26] .

Shu sababli, medulla oblongata va talamusda TLR2 haddan tashqari ko'payishi, fagotsitar mikrogliyaning haddan tashqari darajasi ham aniqlangan eng shikastlangan sohalar, PrPSc ning disfunktsional tozalanishi PrPSc ning doimiy to'planishiga va neyron shikastlanishiga olib kelishi mumkinligini ko'rsatadi [9,17].

Skrapi bilan kasallangan qo'ylarning hipokampusidagi topilmalarimiz boshqa tahlil qilingan miya sohalariga nisbatan qarama-qarshi naqshni aniqladi, TLR1, TLR2 va MyD88 ning regulyatsiyasi pasaygan va sitokin o'zgarmagan.

Bu mikrogliyaning hipokampusda boshqacha javob berishini ko'rsatishi mumkin; Haqiqatan ham, neonatal sichqonlarning (0–3 kunlik) va neyrotoksikpeptid PrP106-126 bilan stimulyatsiya qilingan birlamchi mikroglial hujayra madaniyatlarida TLR2 etishmovchiligi mikroglial faollashuvni neyrotoksikdan neyroprotektiv fenotipga o'tkazishi ko'rsatilgan [63] ].

Biroq, prion patologiyasida PrP106-126 peptidining ahamiyati so'roq qilingan [64]. CD36 naqshni aniqlash retseptorlarining boshqa turi bo'lib, amiloid hosil qiluvchi peptidlar kabi endogen ligandlarni taniy oladi, bu komponentlarning endotsitik o'zlashtirilishida rol o'rnatadi [65,66]. Ushbu retseptor yallig'lanishga qarshi mikroglial holat bilan bog'langan [67].

In vitro, BV-2 hujayralarini, o'lmas mikroglial hujayraning bir turi, PrP106-126 bilan stimulyatsiyasi CD36 ko'tarilishiga olib keladi, yallig'lanishga qarshi sitokinlar va iNOS va NO ishlab chiqarishni oshiradi [68,69].

Bundan tashqari, CD36 tomonidan -amiloid peptidning tan olinishi tug'ma immun javobni faollashtiradigan yangi heterotrimerik CD36-TLR4-TLR6 kompleksining yig'ilishini ishga tushiradi [70,71].

Bizning tadqiqotimizda hipokampusdan tashqari barcha hududlar CD36 ning sezilarli darajada ko'tarilishini ko'rsatdi. CD36, TLR4 va TLR6 ning eng ko'p shikastlangan joylarida, medulla oblongata va obexda ko'tarilishi prion infektsiyasiga javoban yallig'lanishga qarshi mikroglial holatni qo'zg'atishda ushbu triadaning ishtirokini ko'rsatadi.

Aksincha, hipokampusda CD36 va TLR6 haddan tashqari ekspressiyasining yo'qligi bu heterotrimer hosil bo'lmaganligini ko'rsatadi, bu miyaning ushbu mintaqasida yana anevroprotektiv muhitni ko'rsatadi.

Mikrogliyaning miyaning ushbu mintaqasida nima uchun boshqacha munosabatda bo'lishini tushuntirish kerak. Prion shtammiga xos hujayra tropizmi mikroglioz vastrogliozning naqshini aniqlashi mumkin bo'lsa-da, so'nggi topilmalar ikkala reaktsiyaga asosan miya mintaqasi [18,72] ta'sirini ko'rsatadi.

Mikrogliya ham, astrogliya ham CNS bo'ylab bir xil javob bermaydi va bu mintaqaga xos bo'lgan javob prion kasalliklarida ba'zi miya mintaqalarining selektiv zaifligiga olib kelishi mumkin [16,18].

Shu munosabat bilan, mikrogliyaning prion infektsiyasiga yallig'lanish reaktsiyasi PrPSc [14,73-75] ning sialilatsiyasi bilan tartibga solinadi va PrPSc sializatsiyasi miya hududiga bog'liq [18]. Xususan, PrPSc ning sialillanishining yuqori darajasi hipokampus va korteksda talamus va miya poyasiga qaraganda yuqori bo'lib, bu miya mintaqalarining selektiv zaifligida potentsial rolni ko'rsatadi [18,73,75].

Hipokampusdagi PrPSc sialilatsiyasining yuqori darajasi prion replikatsiyasining sekinlashishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, bu bizning topilmalarimiz shuni ko'rsatadiki, ushbu mintaqaning sezgirligining pasayishi bilan mos ravishda ushbu mintaqada o'ziga xos prion-induktsiyali mikroglial faollashuvga olib keladi.

Qizig'i shundaki, oldingi topilmalar gippokampning tabiiy CJD infektsiyasida [76,77] prion neyrotoksikligidan himoyalangan bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi va CJD holatlarining batafsil nevropatologik tadqiqotlari boshqa miya hududlariga qaraganda hipokampusda engilroq lezyonlar haqida xabar berdi [76].

Xususan, asosan hipokampusni o'z ichiga olgan arxikorteks CJDdagi boshqa kortikal hududlar bilan solishtirganda nisbatan tejamkor ko'rinadi [77]. Tabiiy CJDda tasvirlangan bu engil hipokampal ishtirok, tabiiy ravishda scrapie bilan kasallangan qo'ylardagi mavjud topilmalar bilan mos keladi.

Qizig'i shundaki, kamida ikkita tabiiy prion kasalligiga qarshi bu qisman himoya miya yarim korteksining filogenetik jihatdan eng qadimgi mintaqasi bo'lgan va kortikal to'qimalarning eng asosiy turidan iborat bo'lgan hipokampusda sodir bo'ladi.

Ushbu bog'liqlikning ahamiyatini o'rganish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi. Xulosa qilib aytganda, bizning natijalarimiz tabiiy skrapiya bilan kasallangan qo'ylarning hipokampusida spongioz, PrPScdepozitsiya va astroglioz darajasi kutilganidan pastroq bo'lgan engil nevropatologiyani aniqladi. -skrapielozlarning rostral tarqalishi.

Bundan tashqari, hipokampusda eksklyuziv mikroglial morfologiya, novda mikrogliyaning mavjudligi, neyroprotektiv rol o'ynashi mumkin [54], aniq naqshni aniqlash retseptorlari (TLR genlari va CD36) gen ekspresyon profili bilan birga, bu miya mintaqasini boshqa neyroanatomiklardan ajratib turadi. tabiiy scrapie bilan kasallangan qo'ylardagi hududlar.

Ushbu topilmalar gipokampusdagi tabiiy prion infektsiyasiga qarshi neyrohimoya darajasini ko'rsatadi, bu esa qo'shimcha tekshirishga loyiqdir. Proteinning noto'g'ri qatlamlanishi natijasida kelib chiqadigan neyrodegenerativ kasalliklar oqsilning noto'g'ri to'planishi, glial faollashuvi va glial yallig'lanish vositachilarining chiqarilishidan iborat bo'lgan yallig'lanish siklini o'z ichiga oladi, bu esa oqsil parchalanishini kuchaytiradi va kuchaytiradi. neyro yallig'lanish.

Kasallikning ma'lum bir bosqichida o'ziga xos TLR inhibitörleri yordamida mikrogliya faollashuvini yo'naltirish orqali ushbu ayovsiz tsiklni to'xtatish keyingi neyroyallig'lanishni cheklash uchun istiqbolli yondashuv bo'lishi mumkin. Bizning topilmalarimiz bunday yondashuv uchun potentsial maqsad sifatida TLR2 pastga regulyatsiyasini ta'kidlaydi, chunki bu mikrogliyaning neyrotoksikdan anevroprotektiv fenotipga o'tishini keltirib chiqarishi mumkin [63].

Nihoyat, neyrodegenerativ kasalliklarning sichqoncha modellari yordamida glialfenotiplarning xilma-xilligini tavsiflashda katta yutuqlarga erishilgan bo'lsa-da, sichqoncha modellari prion kasalliklarining asosiy jihatlarini ishonchli aks ettiradimi yoki yo'qmi, ba'zi munozaralar masalasidir [78,79].

Tg338 transgen modelidagi natijalarimiz prion infektsiyasining umumiy patologik belgilarini, jumladan PrPSc ning aniq cho'kishi, neyropil spongioz, astroglioz va mikrogliozni takrorladi.

Biroq, yuqtirilgan sichqonlar TLR1 va TLR2 ning sezilarli darajada haddan tashqari ko'payishini va TLR7 haddan tashqari ekspressiyasiga moyilligini ko'rsatdi. Ushbu genlarning yuqori regulyatsiyasi ilgari scrapie [22,26] bilan kasallangan sichqonchaning boshqa modellarida tasvirlangan bo'lsa-da, bu naqsh bizning qo'y miyasidagi topilmalarimizga ziddir. Shunisi e'tiborga loyiqki, sichqonchaning miyasida biz TLR4 ifodasida hech qanday o'zgarishlarni kuzatmadik, bu gen uchun eng katta ekspression o'zgarishlar qo'y namunalarida kuzatilgan.

Bu qarama-qarshi topilmalar turli infektsiya yo'llari va/yoki tg338 sichqonlarida prion oqsili ifoda darajalarining natijasi bo'lishi mumkin [80,81]. Shunga qaramay, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, katta o'lchamli tg338 sichqonlarida skrapi intraserebralinokulatsiyasi tabiiy skrapie infektsiyasida kuzatiladigan immun javobni qaytarmaydi.

4. Materiallar va usullar

4.1. Scrapie bilan kasallangan va nazorat qo'ylari

Ushbu tadqiqotga yigirma bir urg'ochi Rasa Aragonesa qo'ylari (2 yoshdan 6 yoshgacha) kiritilgan. Oldin xabar qilinganidek, barchasi PRNP polimorfizmlari uchun genotiplangan [82] va ARQ/ARQ genotipini ko'rsatishi aniqlangan. Nazorat hayvonlari (n=8) hech qanday qorayish holatlari qayd etilmagan suruvdan tanlangan.

Skrapi bilan kasallangan hayvonlar (n=13) skrapi bilan zararlangan podalardan olingan va ularga rektal shilliq qavat biopsiyalarining immunohistokimyoviy (IHC) tashxisi qo'yilgan. INFEKTSION e'lon qilingan mezonlar [83] bo'yicha obexda PrPSc ning o'limdan keyingi immunodetatsiyasi bilan tasdiqlangan.

Hayvonlar vena ichiga barbituratlarning haddan tashqari dozasi va ekssanguinatsiya orqali evtanizatsiya qilindi.

Evtanaziya paytida barcha skrapiya bilan kasallangan qo'ylarda turli xil zo'ravonlikdagi klinik belgilar namoyon bo'ldi: ba'zi hayvonlarda raqamli stimulyatsiyadan keyin orqa va yonboshlarning qichishi va tana holatining engil pasayishi kabi boshlang'ich belgilar namoyon bo'ldi, boshqalari esa o'z-o'zidan tirnalganligi kabi rivojlangan klinik belgilarni ko'rsatdi. quyruq ildizi, bel sohasi va oyoq-qo'llari, nevrologik belgilar, shu jumladan ataksiya va bosh titrashi, tish silliqlash, jun yo'qolishi va kuchli vazn yo'qotishi [84].

4.2. Tg338 Sichqoncha infektsiyasi

Skrapi, o'n haftalik tg338 sichqonlarining (n=8) sichqoncha modelining miyasida TLR gen ifodalarini baholash uchun (qoy VRQ/VRQ PrPC 8- haddan tashqari ifodalangan 10-katlama [ 85]) klinik bosqichda qurbonlik qilingan tabiiy skrapie bilan kasallangan Rasa Aragonesa qo'yidan miya hovuzi bilan emlangan.

Sichqonlar izofluran anesteziyasi ostida o'ng miya yarim shariga 20 uL scrapie inokulum (PBSda 2% s/s suyultirilgan) bilan emlangan. Intraserebral inyeksiyalar 50 mkL shprits va 25G igna yordamida amalga oshirildi. Emlashdan so'ng, analjeziyani qo'zg'atuvchi buprenorfin (0,3 mg / kg) teri ostiga yuborildi.

Nazorat sifatida, tg338 sichqonlari (n=8) yuqorida tavsiflangan bir xil protsedura bo'yicha skrapie-salbiy qo'ylardan miya gomogenati bilan emlangan. Sichqonlar klinik belgilarning rivojlanishi uchun kuzatilgan va og'ir ataksiya va ovqatlana olmaslik kabi kasallikning terminal belgilari paydo bo'lganda, bachadon bo'yni dislokatsiyasi bilan evtanizatsiya qilingan.

Skrapie-musbat inokulyatsiya bilan kasallangan sichqonlarning o'rtacha yashash vaqti 187 ± 26 dpi ni tashkil etdi.

4.3. To'qimalarni yig'ish

CNS dan namunalar to'plangan va sagittal ravishda ikki yarmiga bo'lingan; Ulardan biri gistopatologik va immunogistokimyoviy tahlil uchun 10% neytral tamponlangan formalinga biriktirilgan, ikkinchisi esa to'g'ridan-to'g'ri muzlatilgan va protein tahlili uchun -80 ◦C da saqlangan yoki RNK ekstraktsiyasi uchun RNAlaterTM eritmasida (InvitrogenTM, Waltham, MA, AQSH) barqarorlashtirilgan va keyin muzlatilgan va saqlanadi. -80 ◦C da.

4.4. PRNP ketma-ketligi

Ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Speedtools Tissue DNK Extraction kit (Biotools, Madrid, Ispaniya) yordamida qon namunalaridan DNK olindi. PCR amplifikasiyasi va ketma-ketligi avval tavsiflanganidek amalga oshirildi [82].

4.5. Immunogistokimyo

Formalin bilan biriktirilgan to'qimalar standart gistopatologik protseduralarga muvofiq qayta ishlandi. To'qimalarning bo'laklari parafin bilan singdirilgan, 4 mkm qalinlikdagi bo'laklarga bo'lingan va vakuolatsiya va neyropil spongiozni baholash uchun gematoksilin-eozin (HE) bilan bo'yalgan.

PrPSc aniqlash uchun IHC qo'ylardagi sichqoncha monoklonal asosiy antikor L42 (1:500 xona haroratida 30 daqiqa davomida suyultirish) (R-Biopharm, Darmshtadt, Germaniya) va sichqonlarda quyon poliklonal antikor R486 yordamida amalga oshirildi (1: 8000 suyultirish, bir kechada 4 ◦C da (R. Jekman, nashr etilmagan) ilgari tasvirlanganidek [86,87].

Bo'limlar, shuningdek, astrosit belgisi glial fibrilyar kislotali oqsil (GFAP) (1: 500; Dako, Glostrup, Daniya) va mikroglia markerining ionlashtirilgan kaltsiyni bog'laydigan adaptor molekulasi 1 (Iba1) (1: 1000; Vako, Rimond) uchun an'anaviy immuno-bo'yoqdan o'tkazildi. , VA, AQSh), nashr etilgan protokollarga muvofiq [88]. Barcha gistologik va IHC baholashlar klinik ma'lumotlarga ko'r bo'lmagan ikkita veterinariya patologi tomonidan amalga oshirildi.

Spongioz va PrPSc bo'yash intensivligini baholash yarim miqdoriy jihatdan amalga oshirildi va oldingi tadqiqotlarda tavsiflangan mezonlarga muvofiq moslashtirildi: neyropil va perikariyaning vakuollanishi 0 (yo'q) dan 5 gacha (juda ko'p va birlashuvchi) [51], PrPSc signali, avval xabar qilinganidek, 0 (yorliqsiz) dan 5 (intensiv bir xil yorliqlash) gacha bo'lgan immuno-bo'yoq darajasiga qarab hisoblangan [89] va GFAP va Iba1 immunobelinglash darajasi {{ dan o'zgarib turadigan shkalada baholangan. 8}} dan 5 gacha (0=zaif bo'yash; 5=butun mintaqa bo'ylab sezilarli immunobelinglash) [88]. Miyaning to'rtta hududi baholandi: frontal korteks (Fc) talamus (Th), hipokampal shakllanish (Hc) va medulla oblongata (Mo) va har bir hudud ball uchun global tahlil qilindi va grafik ravishda o'rtacha ± standart xato sifatida ko'rsatilgan.

4.6. Western Blot

Har bir miya sohasi (Fc, Th, Hc va Mo) 100 mg miya to'qimalari 13 ta scrapie bilan kasallangan qo'ylar, 8 ta rivojlangan klinik belgilar va 5 ta klinik belgilari bilan 1 ml lizis buferida gomogenlashtirildi.

8 ta yuqtirilgan va 8 ta nazorat sichqonlarining hemiensefalonlari lizis tamponida 10% (w/v) da gomogenlashtirildi. To'qimalar namunalari TeSeEPrecess 48 TM gomogenizatori (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh) yordamida bir hil holga keltiriladigan silliqlash naychalari (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh) edi va oqsil kontsentratsiyasi PierceTM BCA Protein Assay kit (ThermoScientificTM,) yordamida o'lchandi. Waltham, MA, AQSH) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq.

PrPres tahlilini o'tkazish uchun to'qimalarning gomogenatlaridan teng miqdorda protein 10 daqiqa davomida 37 ◦C da, ilgari ta'riflanganidek, proteinaza K eritmasi bilan inkubatsiya qilindi [90].

Natijada olingan namunalar 12% CriterionTM XT Bis-Tris Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSH) da elektroforezga solindi va TBST (Tris-)dagi 2% yog'siz quruq sut bilan 1 soat davomida blokirovka qilingan PVDF membranalariga o'tkazildi. 0.1% Tween20 bilan tamponlangan sho'r suv).

Immunoblotlanish uchun membranalar kechasi davomida 4 ◦C da Sha31 birlamchi antikori (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Frantsiya) bilan 1 mkg/ml konsentratsiyada inkubatsiya qilindi, so'ngra otquloq peroksidazasi bilan xona haroratida (RT) 1 soat inkubatsiya qilindi. konjugatsiyalangan sichqonchaga qarshi IgG ikkilamchi antikor (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, AQSH).

Immunoreaktivlik kimyoluminesans substrat ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmshtadt, Germaniya) yordamida aniqlandi. TLR4 oqsili ifodasi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq 2 × Laemmli Sample buferi (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh) bilan aralashtirilgan to'qimalar homogenatlaridan tahlil qilindi. .

Har bir quduqqa qirq mikrogram jami oqsil yuklandi, 7,5% CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSH) da ishga tushirildi va PVDF membranalariga o'tkazildi, so'ngra ular 4% sigir zardobi albumini bilan 2 soat davomida bloklandi. (BSA) (Merck, Darmshtadt, Germaniya) RT da TBST da. Membranalar tunda 4 ◦C da quyon poliklonal anti-TLR4 antikori (Novus Biological, Minneapolis, MN, AQSH) bilan 0,5 mkg/ml konsentratsiyada inkubatsiya qilindi va keyin yuvilib, echki antiquyon IgG bilan inkubatsiya qilindi ( H + L) HRP ikkilamchi antikor (ThermoScientificTM, Waltham, MA, AQSH) RT da 1 soat 1:20,000.

Blotlar yuqorida ta'riflanganidek ingl. Keyin membranalar RestoreTM Western Blot Stripping buferi (ThermoScientificTM, Waltham, MA, AQSH) bilan 37 ◦C da 15 daqiqa davomida tozalandi, yuvildi va yana blokirovka qilindi.

Keyin membranalar 1:1000 da sichqonchaning monoklonal-aktin birlamchi antikori (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, AQSh) bilan 4 ◦C da tun davomida inkubatsiya qilindi, yuvildi va sichqonchaga qarshi m-IgGkBP-HRP ikkilamchi antikori (Santa Cruz) bilan inkubatsiya qilindi. Biotexnologiya, Dallas, TX, AQSH) 1 soat. Yuvishdan keyin blotlar yuqorida aytib o'tilganidek ishlab chiqilgan.

Densitometriyalar ImageJ dasturi yordamida amalga oshirildi va qiymatlar -aktin yordamida normallashtirildi. Normallashtirilgan qiymatlar GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, AQSH) bilan ifodalangan.

Infektsiyalangan va nazorat guruhlarini solishtirish uchun statistik tahlillar Student t-testi bilan o'tkazildi va dispersiyalarning tengligi Levene'stest tomonidan SPSS dasturi yordamida aniqlandi (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, AQSH).Guruhlar orasidagi farqlar * p da statistik ahamiyatga ega deb hisoblangan<0.05.

4.7. RNK ekstraktsiyasi, cDNK sintezi va genni ifodalash

Qo'ylarning umumiy RNKsi frontal korteks, talamus, gippokampus va medulla oblongatasidan 90 mg to'qimalar namunalaridan olingan. Sichqoncha miyalari o'rta chiziqda bo'lingan va undan umumiy RNK olingan<90 mg obtained from the thalamic area. 

Mumkin bo'lgan genomik DNK ifloslanishini olib tashlash uchun TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, AQSh) bilan birlashtirilgan RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germaniya) bilan TeSeEPrecess 48TM gomogenizatori (Bio-Rad) yordamida to'qimalar homogenlashtirildi. RNK kontsentratsiyasi NanoDrop spektrofotometri (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) yordamida spektrofotometrik tarzda aniqlandi va namunaning tozaligini tekshirish uchun har bir namuna uchun 260/280 va 260/230 nisbati tahlil qilindi.

Bir mikrogram komplementar DNK (cDNK) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverli, MA, AQSh) yordamida sintez qilindi. Bundan tashqari, DNase bilan davolash samaradorligi RT-salbiy namunalarda baholandi. Teskari transkripsiyadan so'ng, suyultirilgan cDNKning bir xil to'plami TLRlarni kuchaytirish uchun qPCR o'tkazildi.

Maqsadli genlar ifodasini normallashtirish uchun ikkita tez-tez ishlatiladigan uy xo'jaligi (HK) genlari tanlangan: glitseraldegid{0}}fosfat dehidrogenaza (GAPDH) va aktin-beta (ACT) [91]. Ushbu HK genining barqarorligi bizning eksperimental sharoitimizda tekshirildi. Xabarchi RNK (mRNK) ifodasi qPCR yordamida 1 dan 10 gacha cho'chqalar TLR genlari, 1 dan 9 gacha sichqonchaning TLR genlari va ikkala tur uchun MyD88 geni uchun aniqlandi.

Ikkita yallig'lanishga qarshi (TNF- va IL-6) va ikkita yallig'lanishga qarshi (IL-10 va TGF-) sitokinlar ham qo'y talamusida va gippokampida o'rganildi. Primer ketma-ketligi va samaradorligi avval nashr etilgan yoki Primer3Plus vositasi yordamida ishlab chiqilgan [92](2-jadval).

Biz standart egri chiziq hosil qiluvchi har bir genning samaradorligini nazorat cDNK ning 1:2 ketma-ket suyultirilishini kuchaytirib, so‘ngra dastlabki shablon kontsentratsiyasi va sikl chegarasi (Ct) qiymatlari o‘rtasidagi chiziqlilikni tekshirish orqali tekshirdik. Barcha genlar 0.9 va 0.99 orasida korrelyatsiya koeffitsientini ko'rsatdi, standart egri chiziqlarning qiyalik qiymati -3,2 dan -3,5 oralig'ida va qPCR samaradorligi 90-110%.

qPCR reaktsiyalari Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR System yordamida, 96-universal kuchaytirish shartlari bilan bajarildi: 95 ◦C da 10 daqiqalik boshlang‘ich faollashtirish va cDNK denaturatsiyasi bosqichi, keyin 95 ◦C da 3 sekundlik 40 tsikl. va 30 o'tirdi 60 ◦C.

Nonspesifik PCR amplikonlari yoki yuqori darajadagi primerdimerlar mavjudligini aniqlash uchun biz har bir qPCR reaktsiyasidan so'ng dissotsiatsiya egri protokolini o'tkazdik. Har bir namuna 15 ng cDNA, 5 mkL Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) va kerakli miqdorda oldinga va teskari reaktsiyadan iborat 10 mkL umumiy reaksiya hajmida uch nusxada tahlil qilindi. primerlar (2-jadval).

Nukleazsiz suv 10 mkl yakuniy hajmgacha qo'shildi. Genlarni ifodalash darajalari qiyosiy Ct usuli yordamida aniqlandi. Natijalar katlama o'zgarishi sifatida taqdim etildi va nazorat guruhining o'rtacha darajasiga nisbatan genekspressiya farqlari 1 ga ko'tarildi.

4.8. Ma'lumotlarni tahlil qilish va statistika

To'plangan barcha miqdoriy ma'lumotlar Shapiro-Wilk Wtest bilan normallik uchun sinovdan o'tkazildi. Infektsiyalangan va nazorat guruhlari o'rtasidagi gistologik va immunohistokimyoviy farqlar parametrik yoki parametrik bo'lmagan ma'lumotlar taqsimotiga qarab Student's t-testi yoki Mann-Whitney U testi yordamida baholandi.

Skrapi bilan kasallangan qo'ylarda miyaning to'rt xil mintaqalari o'rtasidagi statistik farqlar parametrik yoki parametrik bo'lmagan ma'lumotlar taqsimotiga qarab, bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) va keyin Bonferroni post hoc testi yoki Kruskal-Wallis testi yordamida aniqlandi. qPCR ma'lumotlarining statistik tahlillari har bir gen uchun o'rtacha ∆Ct qiymatlaridan o'tkazildi.

Infektsiyalangan va nazorat guruhlarini statistik taqqoslash uchun har bir genning normal tarqalishiga qarab Student's t-testi yoki Mann-Whitney U testi o'tkazildi va farqlar tengligi Leven testi bilan aniqlandi. Ifodadagi farqlar p < 0.05 da muhim deb hisoblangan.

Rasmlardagi p-qiymatlarni belgilash uchun quyidagi belgilar ishlatilgan: * p < 0.05; ** p 0 dan kichik yoki teng.01; # p < 0.1. Statistik tahlillar uchun SPSS (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, USA) dasturidan foydalanildi. Grafiklar GraphPad Prism 6.0 (San-Diego, CA, AQSh) yordamida yaratilgan va raqamlarda ko'rsatilgan ma'lumotlar o'rtacha va o'rtachaning standart xatosini (o'rtacha ± SEM) ifodalaydi.

5. Xulosalar

Bizning ma'lumotlarimizga ko'ra, ushbu tadqiqot tabiiy scrapie bilan kasallangan qo'ylar va eksperimental ravishda scrapie bilan kasallangan katta o'lchamli tg338 sichqonlarining miyaning turli mintaqalarida TLRgenlarning ifoda darajasini tavsiflovchi birinchi tadqiqotdir.

Bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, TLRlar, ayniqsa qo'ylardagi TLR4 va sichqonlarda TLR1 va TLR2 skrapie patogenezida ishtirok etadi. Bundan tashqari, o'rganilgan barcha boshqa hududlardan farqli o'laroq, noyob mikroglial morfologiya bilan birga TLR genekspressiyasining o'ziga xos profili. va hipokampusda kuzatilgan engil nevropatologiya, naturalscrapie infektsiyasida miya mintaqasiga xos immunitet reaktsiyasini ko'rsatadi.

Biroq, har bir hujayra turining neyroyallig'lanishga aniq hissasini tushunish uchun mikrogliya, astrogliya va neyronlardagi TLR ekspressiyasini scrapie infektsiyasida tavsiflash uchun qo'shimcha tadqiqotlar kerak bo'ladi. Bundan tashqari, TLR faollashuvi prionning toksikligiga bevosita javobmi yoki boshqa yallig'lanish mexanizmlari tufayli yuzaga keladimi, hali aniqlanmagan.

TLRlar toprion kasalliklarini terapevtik yondashuvlar uchun istiqbolli maqsadni tashkil qiladi va shuning uchun ushbu sohada keyingi yutuqlarni ta'minlash uchun TLR tomonidan boshqariladigan neyroinflamatuar javoblarni yaxshiroq tushunish kerak bo'ladi.

Qo'shimcha materiallar: Quyidagilar onlaynda mavjudhttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Muallif hissalari: kontseptsiya, tadqiqot va ma'lumotlar kuratsiyasi, MCG va LMC; yozish-asl qoralama tayyorlash, MG-M., MCG va LMC; eksperimental metodologiya, MG-M.;yozuv-ko'rib chiqish va tahrirlash, MG-M., MCG, LMC va AO; in vivo metodologiyasi, MB; fundingacquisition, RB va JJB; molekulyar metodologiya, BS-P.; supervision, MCG va JJB Barcha mualliflar qo'lyozmaning chop etilgan versiyasini o'qib chiqdi va rozi bo'ldi.

Moliyalashtirish: Ushbu tadqiqot "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Aragon hukumati) tomonidan "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes" loyihasi orqali moliyalashtirildi.

Institutsional Tekshirish Kengashining bayonoti: Hayvonlar bilan bog'liq barcha protseduralar Ispaniyaning Hayvonlarni himoya qilish to'g'risidagi RD53/2013 qonuniga va Evropa Ittifoqining eksperimental maqsadlarda foydalaniladigan hayvonlarni himoya qilish bo'yicha 2010/63 yo'riqnomasiga kiritilgan yo'riqnomalarga amal qiladi. Protokol Saragosa universitetining Hayvonlar tajribasi etikasi qo‘mitasi tomonidan tasdiqlangan (ruxsatnoma raqami: PI38/159 2015 yil oktyabr va PI19/{8}} aprel 2014).

Axborotlangan rozilik bayonoti: qo'llanilmaydi.

Ma'lumotlar mavjudligi to'g'risidagi bayonot: Ushbu tadqiqotda keltirilgan ma'lumotlar maqola matni, raqamlari va qo'shimcha materialida mavjud.

Tashakkur: Biz Olivier Andreoletti (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) va VincentBeringue (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay)ga ushbu tajribalar uchun ishlatiladigan tg338 sichqonchani taqdim etgani uchun minnatdorchilik bildiramiz.

Manfaatlar to'qnashuvi: Mualliflar manfaatlar to'qnashuvi yo'qligini e'lon qilmaydi. Tadqiqotni loyihalashda moliyachilarning roli yo'q edi; ma'lumotlarni yig'ish, tahlil qilish yoki talqin qilishda; qo'lyozmani yozishda yoki natijalarni nashr etish to'g'risida qaror qabul qilishda. Ushbu qo'lyozmadagi rasm va raqamlar asl ma'lumotlardir.

Ma'lumotnomalar

1. Andreoletti, O.; Berton, P.; Mark, D.; Sarradin, P.; Grosklaud, J.; van Keulen, L.; Shelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Naturalscrapie bilan Romanov suruvidan sezgir qo'ylarning ichak bilan bog'langan limfoid va asab to'qimalarida PrP(Sc) ning erta to'planishi. J. General Virol. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prion kasalliklari va BSE inqirozi. Fan 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. Makbrayd, Pensilvanya; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bryus, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Oshqozon-ichak traktidan markaziy asab tizimiga erta tarqalishi splanxnik va vagus nervlarning vegetativ tolalarini o'z ichiga oladi.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [CrossRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions va ularning miyaga halokatli sayohati. Nat. Rev. Mikrobiol. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Vred, A.; Wemheuer, BIZ; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc turli xil prion turlari bilan bog'langan qo'ylarning miyasida tarqalish naqshlari. veterinar. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perri, VH; Gordon, JL Sichqonlarning markaziy asab tizimida erta yallig'lanish reaktsiyasi uchun dalillar. Neuroscience 1996, 74, 1-5. [CrossRef]

7. Sandberg, MK; Al-Dujayliy, H.; Sharps, B.; De Oliveyra, MVt; Shmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner, S.; Wadsworth, JD; va boshqalar. Prion nevropatologiyasi infektsiya titri cho'qqisiga chiqqandan so'ng, muqobil prion oqsili izoformlarining to'planishini kuzatib boradi. Nat. Kommun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vinsenti, J.E.; Merfi, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Kansellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Surunkali neyrodegeneratsiyaning vaqt kursida mikrogliyaga javob berishni aniqlash. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Prion kasalliklarida mikroglia. J. Klin. Tekshirish. 2017, 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomes-Nicola, D. Prion kasalliklarida mikrogliyaning roli: Funktsional xilma-xillik paradigmasi. Front. Qarish nevrologiyasi. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Louson, LJ; Perri, VH; Dri, P.; Gordon, S. Oddiy kattalar sichqonchasi miyasida mikrogliyaning tarqalishi va morfologiyasida heterojenlik. Neuroscience 1990, 39, 151-170. [CrossRef]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Astrositlar morfologiyasi va fiziologiyasida heterojenlik. Miya Res. Vahiy 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com