DNKga bog'liq bo'lgan protein kinaz katalitik subunit (DNK-PKcs) erkak sichqonlarda surunkali buyrak kasalligining rivojlanishiga yordam beradi Ⅱ

TAF7 ning DNK-PKcs vositachiligida fosforillanishi buyrak fibrozini kuchaytiradi

DNK PKcs ni tartibga soluvchi mumkin bo'lgan molekulyar mexanizmlarni batafsilroq aniqlash uchunCKD rivojlanishi, DNK-PKcs ning mumkin bo'lgan substratlarini aniqlash uchun fosfoproteomika bajarildi. 5a-rasmda ko'rsatilganidek, differentsial fosforlangan oqsillarning aksariyati yadro oqsillari edi. Thefosforlanish darajasiBu oqsillarning faqat 6 ta oqsili bor edibuyrak to'qimalarida sezilarli darajada kamayadivulqon uchastkalarida ko'rsatilganidek, WT sichqonlari bilan solishtirganda DNK-PKcs - / - sichqonlari (5a-rasm). DNK-PKcs−/− sichqonlari va WT boshqaruvlari o‘rtasidagi differentsial fosforlangan oqsillarning issiqlik xaritasi tahlili shuni ko‘rsatdiki, Slc4a1, Ampd2, Hbb-b1, Gas2, Ank1 va TAF7 ko‘rsatilgan saytlarining fosforillanish darajasi DNK-PK nokautidan keyin sezilarli darajada pasaygan (Fig. 5a). Hujayra osti lokalizatsiyasini tahlil qilish va ushbu oqsillarni sindirish orqali biz DNK-PKcs buyrak fibroziga vositachilik qilishini aniqladik, ehtimol TFIIDning bir bo'limi bo'lgan TAF7 fosforillanishi orqali. Koimmunopresipitatsiya tadqiqotlari DNK-PKcs va TAF7 o'rtasidagi to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sirni aniqladi (5b-rasm). DNK-PKcs va TAF7 o'rtasida oqsil-oqsil ulanishi ClusPro39,40 onlayn ma'lumotlar bazasi orqali tahlil qilindi. O'rnatish natijalari DNK-PKcs va TAF7 o'rtasida mumkin bo'lgan to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sirni ko'rsatdi va TAF7 saytining 213-serini DNK-PKcs bilan bog'lanishi mumkin bo'lgan eng yaqin saytlardan biri hisoblanadi (Qo'shimcha rasm 6a). TAF7 ning DNK-PKcs tomonidan to'g'ridan-to'g'ri fosforillanganligini tahlil qilish uchun in vitro kinaz tahlili o'tkazildi. Kinaz tahlilining mahsulotlari massa spektrometriyasi bilan tahlil qilindi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, inson TAF7 ning S213, T137, Y24 va S171 joylari DNK-PKcs tomonidan fosforlangan (Qo'shimcha rasm 6b). Bundan tashqari, bizning natijalarimiz inson organizmidagi p-DNK-PKcs va TAF7 oqsillari darajasi o'rtasida ijobiy bog'liqlikni aniqladi.CKD buyrakTAF7 bilan p DNK-PKcs ning immunofluoresans bilan birgalikda bo'yash orqali to'qimalar (5c-rasm).

BUYRAK UCHUN O'TKAN FORMULASINI BILISH UCHUN SHU YERGA BOSING

Oldingi tadqiqot shuni ko'rsatdiki, TAF7 ning hisoblangan molekulyar og'irligi taxminan 40 kDa, ammo fosforlangan TAF7 taxminan 55 kDa41. Western blot va immunohistokimyoviy bo'yash natijalari shuni ko'rsatdiki, TAF7 darajalari WT boshqaruvlarining buyrak to'qimalarida UUO tomonidan katta darajada qo'zg'atilgan (5d-rasm va qo'shimcha 6d-rasm). DNK-PKcs nokauti WT nazorati bilan solishtirganda asosiy va UUO modellarida TAF7 ning fosforillanishini inhibe qildi (5d-rasm). UUO sichqonlarida TAF7 ning fosforillanishi Phos-tag SDS-PAGE42 tomonidan ham tasdiqlangan (Qo'shimcha rasm 6c). Xuddi shunday natijalar UIR modelida ham kuzatildi (5e-rasm). DNK-PKcs inhibitori NU7441 bilan davolash, shuningdek, sichqonlarda UIR tomonidan qo'zg'atilgan TAF7 ning yuqori tartibga solingan fosforillanishini inhibe qildi (5f-rasm). Bundan tashqari, Western blot tomonidan tahlil qilingan TAF7 protein darajasi HK-2 hujayralarida DNK-PKcs nokautini (5g-rasm) va HK2 (5h-rasm) yoki NRF{28}}F hujayralarida NU7441 bilan davolashni ko'rsatdi. (5i-rasm) in vitroda TGF 1 tomonidan qo'zg'atilgan TAF7 ning yuqori tartibga solingan fosforillanishini inhibe qildi.

DNK-PKcs buyrak fibrozida TAF7 ning fosforillanishida ishtirok etganligi sababli, biz TAF7 etishmovchiligi buyrak epiteliya hujayralarining dedifferentsiyasiga yoki TGF 1 tomonidan induktsiya qilingan interstitsial fibroblastlarning faollashishi va proliferatsiyasiga ta'sir qilishi mumkinligini tekshirdik. TAF7 hujayralari va NRKTC nokauti {5} }}F xujayralari CRISPR/Cas9 yordamida yaratilgan va TAF7 nokaut hujayralarining muvaffaqiyatli qurilishi Western blot tomonidan tasdiqlangan (Qo'shimcha 6e-rasm). Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, TAF7 nokauti buyrak epiteliya hujayralarining defferentsiatsiyasini yaxshilagan, bu TGF 1 ta'siridan keyin FN va kollagen I ishlab chiqarishning past darajasi bilan ko'rsatilgan (5j, l-rasm). Xuddi shunday, TAF7 nokauti FN ishlab chiqarishning past darajalari (5k-rasm), kollagen I (5m-rasm), -SMA (5n-rasm) ko'rsatganidek, TGF 1 tomonidan qo'zg'atilgan NRF-49F hujayralarining profibrotik fenotipini to'mtoq qildi. ), shuningdek, TAF7 - / - hujayralarida EU bo'yashining past darajasi (5o-rasm). Buyrak epiteliya hujayralarida TAF7 ning haddan tashqari ko'payishi profibrotik fenotipni qo'zg'atish uchun etarli yoki yo'qligini aniqlash uchun HK-2 hujayralari yoki NRK49F hujayralari inson TAF7 yoki uning mutantining haddan tashqari ifodalangan plazmidlari bilan transfektsiya qilindi. Western blot natijalari shuni ko'rsatdiki, HK-2 yoki NRF49F hujayralarining profibrotik fenotipi haqiqatan ham TAF7 yoki uning mutantlarining haddan tashqari ifodalanishi bilan yaxshilangan (Qo'shimcha 6h,j-rasm). Biroq, TAF7 ning profibrotik ta'siri HK-2 hujayralarida DNK-PKcs nokauti bilan deyarli butunlay bloklangan (Qo'shimcha 6i-rasm). Bundan tashqari, biz TAF7 etishmovchiligi DNK-PKcs ning profibrotik ta'siriga ta'sir qilishi mumkinligini tekshirdik. Qizig'i shundaki, TAF7 etishmovchiligi DNK-PKcs haddan tashqari ekspressiyasining profibrotik ta'sirini inhibe qildi (Qo'shimcha 6f-rasm) va NU7441 ning mPTC hujayralarida anti-profibrotik ta'sirini blokirovka qildi (Qo'shimcha rasm. 6g). Yaqinda Vang S va boshqalar. topilgan sitoplazmatik DNK-PKclar ko'paygan va Fis1 bilan o'zaro ta'sirlashgan va uni TQ motivida Thr34 da fosforlangan, bu Fis1 ning Drp1 ga yaqinligini oshirgan va AKI43 da mitoxondrial parchalanishni keltirib chiqargan. Bizning tadqiqotimizda yadro ekstraktsiyasi oqsilini tahlil qilish natijalari shuni ko'rsatdiki, DNK-PKcs asosan mahalliylashtirilgan va AKI modelidan farq qiladigan UUO sichqonlarining buyraklari yadrosida ko'paygan (Qo'shimcha rasm 6k). Va Fis1ni yiqitish TGF 1 bilan sinovdan o'tgan buyrak quvurli epiteliya hujayralarida profibrotik javobni kuchaytirdi, bu Fis1 CKDda DNK-PKcs ning profibrotik rolida vositachilik qilmaganligini ko'rsatadi (Qo'shimcha rasm. 6l). Birgalikda bu ma'lumotlar DNK-PK vositachiligida TAF7 ning fosforillanishi buyrak fibrozini kuchaytirishini ko'rsatdi.

TAF7 RAPTOR ifodasini ko'tarish orqali mTORC1 faollashuviga yordam beradi

TAF7 ning profibrotik ta'sir mexanizmlarini o'rganish uchun RNK-Seq TGF 1 bilan yoki TGF 1 bilan davolash qilingan NC va TAF−/− mPTC hujayralarida transkriptomik o'zgarishlarni tahlil qilish uchun o'tkazildi. RNK-Seq natijalari TAF7 nokauti TGFni yaxshilaganligini ko'rsatdi {{5} }mPTClarda fibroz bilan bog'liq gen ifodasi (Qo'shimcha rasm 7a, b). KEGG yo'lini boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, mTOR signalizatsiya yo'li TGF 1 bilan ishlov berilmagan TAF - / - va NC mPTC hujayralari o'rtasidagi yuqori yo'l edi (6a-rasm). Gen to'plamini boyitish tahlili (GSEA) TGF 1 bilan davolashdan so'ng mTOR signalizatsiya yo'lining sezilarli darajada yuqori regulyatsiyasini aniqladi, bu esa NC nazorat hujayralariga nisbatan mPTC hujayralarida TAF7 nokautidan keyin sezilarli darajada kamaydi (6a-rasm). mTOR signalizatsiyasining issiqlik xaritasi tahlili shuni ko'rsatdiki, mTORC144,45 ning ijobiy regulyatori bo'lgan RPTOR (RAPTOR) mPTC hujayralarida TAF7 ning nokauti bilan inhibe qilingan TGF 1 bilan davolash orqali oshirilgan (6b-rasm).

RPTOR ning oqsil darajasi va mTOR ning fosforillanishi, Western blot tomonidan tahlil qilinganidek, mPTC hujayralarida TGF 1 bilan davolashdan keyin sezilarli darajada oshdi. Biroq, TAF7 etishmovchiligi NC nazorati bilan solishtirganda RPTOR ning protein darajasini va mPTC hujayralarida TGF 1 tomonidan induktsiya qilingan mTOR fosforillanishini kamaytirdi (6c-rasm). mTOR va uning oqsil sheriklari, jumladan Raptor, Rictor va Mlst8 ning MRNK darajalari qRT-PCR tomonidan tahlil qilindi va natijalar TGF 1 bilan davolash Rptor, Rictor va Mlst8 ning mRNK darajasini oshiradi, lekin mTOR emas. TAF7 etishmovchiligi NC nazorat hujayralari bilan solishtirganda mPTC hujayralarida TGF 1 bilan davolash bilan ham, davolashsiz ham Raptorning mRNK darajasini sezilarli darajada kamaytirdi, lekin Rictor, Mlst8 yoki mTOR emas (Qo'shimcha rasm. 7c). Xuddi shunday, DNK-PKcs etishmovchiligi yoki inhibisyonu mRNK darajasini sezilarli darajada kamaytiradiRaptorin buyrak to'qimalariUUO sichqonlari va UIR sichqonlari (Qo'shimcha rasm 7d, e). Bundan tashqari, biz TGF 1 tomonidan induktsiya qilingan inson Raptorining transkripsiyaviy faollashuvida TAF7 serin 213 fosforlanishini tahlil qilish uchun TAF7, TAF7- S213D va TAF7-S213A ning ikki xil qoldiq 213 serin sayt mutantlarini yaratdik. HK{10}} hujayra. Lusiferaza tahlili natijalari shuni ko'rsatdiki, bu barcha TAF7 mutantlarining haddan tashqari ifodalanishi inson Raptorining transkripsiya faollashuvini kuchaytirdi, garchi TAF7- S213A guruhining nisbiy lyusiferaza faolligi TAF7-WT va TAF7-guruhidan pastroq bo'lsa-da. {15}}S213D guruhlari (6d-rasm). Bundan tashqari, ChIP tahlil natijalari TAF7 to'g'ridan-to'g'ri Rptor promouteriga ulanishi mumkinligini ko'rsatdi (6e-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatdiki, TAF7 TGF 1 tomonidan qo'zg'atilgan RPTOR ning transkripsiyaviy faollashuviga vositachilik qiladi, ehtimol faqat 213 qoldiqning fosforlanishi orqali emas. Bundan tashqari, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, RPTOR ning protein darajasi va mTOR fosforlanishi ikkalasi ham edi.buyrak to'qimalarida ko'payadiUUO va UIR sichqonlarining soni va asosiy va model sichqonlarida DNK-PKcs nokautidan keyin sezilarli darajada kamaydi (6f-i-rasm). Xuddi shunday natijalar ham NRF-49F hujayralarida DNK-PKcs nokautli HK-2 hujayralari va NU7441 bilan davolashga javoban kuzatildi (6j, k-rasm). Bundan tashqari, Western blot natijalari shuni ko'rsatdiki, DNK-PKcs yoki TAF7 haddan tashqari ekspressiyasidan so'ng RPTOR protein darajasi va mTOR fosforillanishi ortgan (Qo'shimcha rasm 7f, g). Bundan tashqari, RPTORning ishdan chiqishi TGF 1 tomonidan qo'zg'atilgan mTOR ning fosforillanishini sezilarli darajada inhibe qildi (Qo'shimcha rasm 7h). Birgalikda olingan bu natijalar TAF7 ning DNK-PKcs vositachiligida fosforillanishi RPTOR ifodasini ko'tarish orqali mTORC1 faollashuviga yordam berishini ko'rsatadi.

6-rasm|TAF7 ning DNK-PKcs vositachiligida fosforillanishi RPTOR ifodasini ko'tarish orqali mTORC1 faollashuviga yordam beradi. mTOR signalizatsiyasi (qizil shrift bilan ko'rsatilgan) TAF7−/− va NC guruhlari o'rtasida yuqori differentsial ifodalangan signal omili ekanligini ko'rsatadigan RNK-seq. GSEA mTOR signalizatsiyasi NC + TGF 1 guruhida yuqori tartibga solinganligini va TAF7−/− + TGF 1 guruhida (n=2), TGF 1 (5 ng/ml) davolashda 24 soat davomida bostirilganligini ko'rsatdi. b Har birining 24 soati (n=2) uchun TGF 1 (5 ng/ml) bilan ishlov berilgan yoki bo‘lmagan NC guruhlariga nisbatan TAF7−/− guruhlarida Rptor (qizil shrift bilan ko‘rsatilgan) kamayganligini ko‘rsatadigan issiqlik xaritasi tasviri guruh). c RPTOR, mTOR va fosforlangan mTOR ning protein darajalari TAF7−/− va NC mPTClarda Western blot tomonidan tahlil qilingan, 24 soat davomida TGF 1 (5 ng/ml) bilan ishlangan. Chiziqlar miqdoriy aniqlash natijalarini ifodalaydi (oʻrtacha ± SD, n=3 mustaqil tajriba). d TGF 1 (5 ng/ml) bilan HK-2 hujayralarida 24 soat davomida lusiferaza reportyor tahlili. Barlar 3 ta mustaqil tajriba natijalarini ifodalaydi (o'rtacha ± SD). TAF7ning Raptor promouteriga ulanishini tahlil qilish uchun e ChIP tahlili o'tkazildi. Chiziqlar miqdoriy aniqlash natijalarini ifodalaydi (oʻrtacha ± SD, n=3 mustaqil tajriba). f RPTOR, mTOR va fosforlangan-mTOR oqsil darajalari Western blot yordamida tahlil qilindi.buyrak to'qimalariUUO (7-kun) yoki UIR (21-kun) (g), NU7441 (40 mg/kg) va transport vositasini davolash sichqonlari UUO (h) yoki UIR (i), DNK PKcs−/− yoki NC HK-2 hujayralarida (j), NU7441 (0,1 mkM) yoki TGF 1 (5 ng) bilan ishlov berilgan NRK{8}}F xujayralari (k) /ml) 24 soat davomida. Chiziqlar miqdoriy aniqlash natijalarini ifodalaydi (oʻrtacha ± SD, har bir guruhning n=6 sichqonchasi va hujayra modellari uchun n ta=3 mustaqil tajriba). d, e uchun p-qiymatlarini aniqlash uchun bir tomonlama ANOVA va undan keyin Tukeyning bir nechta taqqoslash testi ishlatilgan. Ikki tomonlama ANOVA va keyin Shidákning ko'p taqqoslash testi c, f-k uchun p-qiymatlarini aniqlash uchun ishlatilgan. Manba ma'lumotlari Manba ma'lumotlar fayli sifatida taqdim etiladi.

DNK-PK inhibisyoni in vivo va in vitro metabolik qayta dasturlashni to'g'rilaydi

Oldingi bir nechta tadqiqotlarga ko'ra9,46, mTORC1 ning aberrant faollashuvi metabolik qayta dasturlash vositachiligida buyrak fibrozining rivojlanishiga yordam beradi.fibrotik buyraklar. Shunday qilib, biz DNK-PK yoki TAF7 ning inhibisyonu fibrotik buyraklardagi metabolik qayta dasturlashni to'g'rilaydimi yoki yo'qligini tekshirdik. TGF 1-davolangan NC va TAF−/− mPTC hujayralarida transkriptomik oʻzgarishlarning RNK-Seq tahliliga asoslanib, KEGG yoʻlini boyitish tahlili shuni koʻrsatdiki, metabolik signalizatsiya yoʻli TGF {{4} oʻrtasidagi eng differentsial ifodalangan yoʻllardan biri boʻlgan. }davolangan TAF−/− va NC mPTC hujayralari (7a-rasm). Bundan tashqari, GSEA NC nazorat hujayralariga nisbatan TAF7 nokautli mPTC hujayralarida TGF 1 bilan davolashdan keyin oksidlovchi fosforillanish va yog 'kislotasi oksidlanish (FAO) yo'lining sezilarli darajada yuqori regulyatsiyasini aniqladi (7a-rasm). NC nazorati bilan solishtirganda mPTClarda TAF7 taqillatilganda glikoliz yo'li sezilarli darajada kamaydi (7a-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatdiki, TAF7 etishmovchiligi PTC hujayralarida TGF 1-bo'lgan metabolik qayta dasturlashni tuzatadi.

Fibrotik buyraklardagi metabolik qayta dasturlashni tartibga solishda DNK-PKcs rolini tushunish. Birinchidan, yog 'kislotalari oksidlanishida ishtirok etadigan asosiy fermentlarning oqsil va mRNK darajalari (CPT1, CPT2, ACOX1 va ACOX2) Western blot va qRT-PCR tomonidan tahlil qilindi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, WT sichqonlarining buyraklarida UUO yoki UIR sharoitida ushbu fermentlarning ekspressiyasi sezilarli darajada kamayadi, ammo DNK-PKcs nokaut sichqonlarida ularning ifodasi sezilarli darajada tiklandi (7b-rasm, c va qo'shimcha rasm. 8). Ikkinchidan, mitoxondriyal morfologiya va funktsiya oksidlovchi fosforlanish uchun zarurdir va elektron mikroskopiya UUO tomonidan qo'zg'atilgan WT sichqonlarining buyrak tubula hujayralarida mitoxondriyalarning aniq bo'linishini aniqladi, bu DNK-PKcs-/-mice (Fig) buyrak kanalchalari hujayralarida sezilarli darajada yaxshilandi. 7f). Ushbu natijalar WT sichqonlarida UUO tomonidan qo'zg'atilgan g'ayritabiiy oksidlovchi fosforillanish va yog 'kislotalari almashinuvi DNK-PKcs nokauti bilan yaxshilanganligini ko'rsatdi.

Glikoliz buyrak fibrozining xususiyati bo'lib, buyrak fibrozining rivojlanishiga yordam beradi. Glikoliz tezligini cheklovchi fermentlar bo'lgan geksokinaza 2 (HK2) va laktat dehidrogenaza A (LDHA) oqsil darajalari Western blot tomonidan tahlil qilindi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, HK2 va LDHA darajalari UUO sichqonlari va UIR sichqonlarining buyrak to'qimalarida sezilarli darajada ko'tarilgan, bu fibrotik buyraklardagi glikolitik faollikni oshiradi. Bundan farqli o'laroq, HK2 va LDHA ning past darajalari bilan ko'rsatilgandek, UUO va UIR modellarida WT sichqonlariga nisbatan DNK-PKcs etishmayotgan sichqonlarning buyrak to'qimalarida glikoliz sezilarli darajada inhibe qilingan (7d, e-rasm). TGF 1-davolangan DNK-PKcs−/− HK-2 hujayralari va NU{11}}NRK-49F hujayralarida glikolitik faollikni tahlil qilish uchun hujayradan tashqari kislotalanish tezligi (ECAR) tahlillari o‘tkazildi. in vitro. DNK-PKcs ning nokauti va NU7441 bilan davolash TGF 1-boshqaruv hujayralariga nisbatan yuqori tartibga solinadigan ECARni sezilarli darajada kamaytirdi (7g-h-rasm). TAF7-/- ning nokauti, shuningdek, TGF 1 tomonidan qo'zg'atilgan mPTClarda ECARning yuqori regulyatsiyasini sezilarli darajada kamaytirdi (7i-rasm). Bundan tashqari, DNK-PKcs−/− va NU{21}}bilan ishlov berilgan hujayralarning madaniy muhitidagi hujayradan tashqari laktat darajasi ham kamaydi (7j, k-rasm).

DNK-PKcs-/− sichqonlarida metabolik qayta dasturlash qanday yaxshilanganligini tushunish uchun biz UUO operatsiyasidan keyingi metabolit o'zgarishlarini tahlil qilish uchun metabolomik profildan foydalandik (8a-rasm). UUO WT sichqonlarining buyraklarida buzilgan glyukoza metabolizmini keltirib chiqardi, bu DNK-PKcs ning nokauti bilan tiklangan WT UUO buyraklarida piruvat kabi glyukoza metabolitlarining pastga regulyatsiyasi bilan tasdiqlanadi (8a-rasm). Bundan tashqari, UUOga duchor bo'lgan WT sichqonlarining buyraklarida laktat to'planishining ko'payishi ham kuzatildi, bu buyrak hujayralarida oksidlovchi fosforillanishdan glikolizning kuchayishigacha metabolik o'tishni ko'rsatadi. Biroq, DNK-PKcs - / - sichqonlarining shikastlangan buyraklarida glikoliz sezilarli darajada inhibe qilingan (8a-rasm). Bundan tashqari, WT UUO sichqonlarining buyraklarida karnitin bilan konjugatsiyalangan uzun zanjirli yog 'kislotalari, jumladan, lauroil karnitin (8a-rasm) va miristoyl karnitin (8a-rasm) to'planishi kuzatildi, bu yog' kislotalari almashinuvidagi nuqsonlarni ko'rsatadi. Bundan farqli o'laroq, DNK-PKcs nokauti UUO tomonidan qo'zg'atilgan barcha anormalliklarni katta darajada tuzatdi. Birgalikda bu natijalar DNK PK yoki TAF7 ning inhibisyoni shikastlanish yoki TGF 1 in vivo va in vitro natijasida kelib chiqqan metabolik qayta dasturlashni to'g'irlashini ko'rsatadi.

Munozara

Hujayra shikastlanishi natijasida boshlangan epiteliya deferentsiyasi va miyofibroblast faollashuvi va proliferatsiyasi CKD2 ning rivojlanishiga yordam beradi. Garchi DNKning shikastlanish reaktsiyasi (DDR) ko'pincha buyrak epiteliyasining shikastlanishi bilan bog'liq bo'lsa-da47, uning epiteliya dedifferentsiyasi va progressiv CKDda miyofibroblast faollashuvidagi potentsial roli haqida kam narsa ma'lum. Ushbu tadqiqotda bizning natijalarimiz DNKga bog'liq bo'lgan protein kinaz katalitik bo'linmasi bo'lgan DNK PKcs ning ifodalanishi fibrotik buyraklarda kuchayganligini va CKD rivojlanishiga yordam berganligini ko'rsatdi. Garchi DNK-PKcs DNKning ikki zanjirli uzilishlari (DSBs)24,25 yoki ROS26 tomonidan faollashtirilgan bo'lsa-da, bizning natijalarimiz DNK-PKcs ifodasi TGF 1-SMAD signalizatsiyasi bilan ham faollashtirilganligini ko'rsatdi, DNK-PKcs nokauti esa SMAD2/SMAD3ni inhibe qildi. . Bu natijalar fibrozda TGF 1-SMAD signalizatsiya faollashuviga vositachilik qiluvchi yangi yoʻlni taklif qiladi.

Keyinchalik, biz global prkdc gen-nokaut sichqonlarini yaratdik. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, DNK-PKcs ning yo'q qilinishi buyrak naychalarining shikastlanishini va UUO va UIR sichqoncha modellarida buyrak interstitsial fibrozining rivojlanishini susaytirdi. DNK-PK limfotsitlardan mustaqil ravishda buyrak fibroziga yordam beradi degan xulosaga kela olmaymiz, chunki DNK-PKcs-/− sichqonlarining eng ko'zga ko'ringan fenotipi limfotsitlar yetishmovchiligidir27,48. Limfotsitlar etishmovchiligining potentsial ta'sirini istisno qilish uchun biz CRISPR/cas9 knock-in sichqonlari yordamida in vivo jonli ravishda o'ziga xos DNK-PKcs nokautiga ega proksimal buyrak quvurli epitelial hujayrasini qurdik. Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, DNK-PKcsning buyrak kanalchalariga xos o'chirilishi UUOda buyrak interstitsial fibrozining rivojlanishiga ham to'sqinlik qilgan. Bundan tashqari, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, DNK-PKcs etishmovchiligi quvurli epiteliya hujayrasi fenotipini saqlab qolgan va in vitro interstitsial fibroblast faollashuvini tartibga solgan. Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, DNK-PKcs epiteliya deferentsiyasi va miyofibroblast faollashuviga vositachilik qiladi, ehtimol limfotsitlar etishmovchiligi bilan bevosita bog'liq emas. Bundan tashqari, biz yuqori darajada o'ziga xos DNK-PKcs inhibitori NU7441 ning antifibrotik ta'sirini tekshirdik va natijalar NU7441 bilan davolash UUO va UIR sichqoncha modellarida buyrak interstitsial fibrozining rivojlanishini sezilarli darajada susaytirganligini ko'rsatdi. NU7441 fiziologik dozalarda DNK-PK ning qisman inhibitori hisoblanadi. Oldingi tadqiqot shuni ko'rsatdiki, NU7441 davosi kattalar sichqonlarida B hujayralari funktsiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatmaydi33. Bundan tashqari, biz DNK-PKcs nokaut sichqonlarini UUO sichqonchasi modelida NU7441 bilan davolash orqali NU7441 ning DNK-PKcsga xos ta'sirini tasdiqladik. Ushbu natijalar NU7441 ning CKDni klinik davolash uchun potentsial transformatsiyasini ko'rsatadi, ammo qo'shimcha tadqiqotlar zarur.

Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, DNK-PKcs etishmovchiligi in vivo va in vitro DSBsni kuchaytirmagan, bu DNK-PKcs buyrak shikastlanishi va buyrak oraliq fibroziga vositachilik qiladi, ehtimol DDRdagi roli orqali emas. Fosfoproteomik tahlil shuni ko'rsatdiki, TAF7 ning fosforillanishi DNK-PKcs - / - sichqonlarining buyrak to'qimalarida kamaygan. TAF7 etishmovchiligi buyrak epitelial hujayralari va TGF 1 tomonidan qo'zg'atilgan fibroblastlarning profibrotik fenotipini inhibe qildi. TAF7 ning profibrotik ta'siri buyrak epiteliya hujayralarida DNK-PKcs etishmovchiligi bilan deyarli butunlay bloklandi. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, TAF7 DNK-PKcs kinaz faolligi uchun substratdir va TAF7 ning DNK-PKcs vositachiligida fosforillanishi buyrak fibrozini kuchaytiradi.

RNK-Seq natijalari shuni ko'rsatdiki, TAF7 mTORC149,50 ning ijobiy regulyatori bo'lgan Raptor ifodasini yuqori tartibga solish orqali mTORC1 faollashuviga yordam beradi. Fosfoproteom natijalari shuni ko'rsatdiki, TAF7 ning serin-213da fosforillanishi DNK-PKcs−/− sichqonlarining buyraklarida WT nazoratidagiga nisbatan sezilarli darajada kamaygan. Mass-spektrometriya tahlili shuni ko'rsatdiki, inson TAF7 ning S213, T137, Y24 va S171 joylari in vitroda DNK-PKcs tomonidan fosforlangan. Bundan tashqari, TAF{15}}WT, TAF7-S213D va TAF{18}}S213A kabi turli xil TAF7 mutantlarining transfeksiyasi HK-2 hujayralarida inson Rptorining transkripsiya faollashuvini oshirdi. Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, TAF7 TGF 1 tomonidan qo'zg'atilgan Rptorning transkripsiyaviy faollashuviga vositachilik qiladi, ehtimol faqatgina uning 213- saytining fosforillanishi orqali. TAF7 asosiy transkripsiya omili emas, lekin TAF141,51 kabi boshqa TAF lar bilan oʻzaro taʼsir qiladi va transkripsiya omillarining fermentativ faolligini tartibga soladi, bu esa nima uchun TAF7 ning haddan tashqari ifodalanishi HKda inson RPTOR transkripsiyasini faollashtirmaganini tushuntirishi mumkin{{28} } TGF 1 bilan davolashsiz hujayralar. TAF7 ning bir nechta serin qoldiqlari transkripsiyani faollashtirish yoki inhibe qilish uchun fosforlangan bo'lishi mumkin41. Misol uchun, oldingi tadqiqot shuni ko'rsatdiki, TAF7 ning serin 264 ga fosforillanishi TAF7 ning TAF1 bilan bog'lanishini buzgan va natijada D141 siklinining transkripsiyaviy regulyatsiyasi yuzaga kelgan. TAF{37}}bog'liq transkripsiyadan tashqari, TAF7 ham TAF1-mustaqil transkripsiyasini51 tartibga soladi. Ushbu tadqiqotda ChIP tahlili natijalari TAF7 ning Rptor promouteriga to'g'ridan-to'g'ri ulanishi mumkinligini ko'rsatdi, bu TAF7 Rptor ifodasini boshlash uchun boshqa transkripsiya omillari bilan hamkorlik qilishi mumkinligini ko'rsatdi. Rptorning TAF vositachiligida transkripsiyani ko'tarish mexanizmlari qo'shimcha tadqiqotlarga muhtoj bo'lsa-da, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, DNK-PKcs Rptor ifodasini tartibga solish orqali mTORC1 faollashuvini rag'batlantirish uchun TAF7 fosforillanishiga vositachilik qiladi.

Oldingi bir qancha tadkikotlar mTORC1 signalizatsiyasi fibrotik buyraklardagi dedifferentsial epiteliya hujayralari va miofibroblastlarda faollashgani haqida xabar berdi9,52. DNK-PK ham DNK uzilishlariga javoban o'simta hujayralarida AKT/mTOR signalini fosforillashi va faollashishi haqida xabar berilgan bo'lsa-da53, aniq mexanizm noma'lum. Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, TAF7 ning DNK-PKcs vositachiligida fosforillanishi Rap tor ifodasini ko'tarish orqali mTORC1 faollashuviga yordam beradi va fibrotik buyraklarda mTORC1 faollashuvining mumkin bo'lgan mexanizmini ta'minlaydi. mTORC1 ning surunkali faollashuvi ko'plab kasalliklarda, shu jumladan CKD9,54da metabolik qayta dasturlashga yordam beradi. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, buyrak naycha hujayralari ham, fibroblastlar ham CKD9,10,13 ga javoban metabolik fenotiplarni o'zgartiradi. Yog 'kislotalarining oksidlanish yo'llari va oksidlovchi fosforillanishdan glikolizga o'tish metabolik qayta dasturlashning asosiy xususiyati hisoblanadi9,10. mTOR metabolik gomeostazni saqlashda markaziy rol o'ynaganligi sababli, mTOR inhibisyonu nojo'ya ta'sirlarni ko'rsatadi. Bundan tashqari, TGF signalizatsiyasining uzoq muddatli inhibisyonu ham qabul qilinishi mumkin bo'lmagan salbiy ta'sirlar bilan bog'liq57. Ushbu tadqiqotda biz DNK-PKcs faolligi KKD ostida uning mustahkam kuchayishidan farqli o'laroq, oddiy buyraklarda deyarli aniqlanmasligini aniqladik. Shunday qilib, DNK-PKcs inhibisyonu fibrotik buyraklardagi metabolik qayta dasturlashni to'g'rilaydi.

8-rasm|DNK-PK ni yo'q qilish metabolik qayta dasturlashni to'g'rilaydi. ko'rsatilgandek, har bir guruhdagi buyrak to'qimalarining metabolik tahlili. Har bir guruhdagi (n=4) buyraklardagi glikoliz yo‘lidagi metabolitlarning nisbiy darajalari, yog‘ kislotalari almashinuvi va Krebs sikli ko‘rsatilgan issiqlik xaritasi tasviri. Barlar har bir guruhning buyraklardagi vakili metabolitlarining statistik tahlilini ifodalaydi (o'rtacha ± SD, har bir guruhning n=4 sichqonchasi). P-qiymatlarini aniqlash uchun bir tomonlama ANOVA va undan keyin Tukeyning ko'p taqqoslash testi ishlatilgan. b Ishchi model (shablon BioRender.com bilan yaratilgan), unda DNK-PKcs TAF7 fosforillanishi orqali Raptor/mTORC1 signalizatsiyasining faollashuviga vositachilik qiladi va shikastlangan epiteliya hujayralari va miofibroblastlarda metabolik qayta dasturlashni rag'batlantiradi.

Ma'lumotnomalar

1. Romagnani, P. va boshqalar. Surunkali buyrak kasalligi. Nat. Rev. Dis. Astarlar 3, 17088 (2017).

2. Humphreys, BD Buyrak fibrozining mexanizmlari. Annu. Ruhoniy fiziol. 80, 309–326 (2018).

3. Nath, KA Progressiv buyrak kasalligida tubulointerstitium. Buyrak Int. 54, 992–994 (1998).

4. Zhou, D. & Liu, Y. 2015 yilda buyrak fibrozisi: Buyrak fibrozining mexanizmlarini tushunish. Nat. Ruhoniy Nefrol. 12, 68–70 (2016).

5. Wynn, TA & Ramalingam, TR Fibroz mexanizmlari: fibrotik kasallik uchun terapevtik tarjima. Nat. Med. 18, 1028–1040 (2012).

6. Meng, XM, Nikolic-Paterson, DJ & Lan, HY TGF-beta: fibrozning asosiy regulyatori. Nat. Ruhoniy Nefrol. 12, 325–338 (2016).

Wecistanche-ning qo'llab-quvvatlovchi xizmati - Xitoydagi eng yirik cistanche eksportchisi:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Batafsil texnik xususiyatlar uchun xarid qiling:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

BUYRAK UCHUN 25% EKINAKOSID VA 9% AKTEOSID BILAN TABIY ORGANIK SİSTANCHE EKSTRAKTINI OLISH UCHUN SHU YERGA BOSING