Echinacoside miyokardni qayta qurishni qaytaradi va yurak faoliyatini yaxshilaydi

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingven Chjan2

Abstrakt

Miyokardni qayta qurish HF ning muhim patologik asosidir, mitoxondriyal oksidlovchi stress miyokard gipertrofiyasi, fibroz va apoptozning rag'batlantiruvchisi hisoblanadi. ECH an'anaviy xitoy tibbiyoti Cistanches Herba ning asosiy faol komponenti bo'lib, ko'plab tadqiqotlar uning asab hujayralari va o'smalarida kuchli antioksidant qobiliyatiga ega ekanligini ko'rsatadi, u mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qiladi, mitoxondrial funktsiyani himoya qiladi, ammo o'ziga xos mexanizm aniq emas. SIRT1/FOXO3a/MnSOD muhim antioksidant o'qi bo'lib, tadqiqot shuni ko'rsatadiki, ECH ligand sifatida SIRT1 bilan kovalent bog'lanadi va miya hujayralarida SIRT1 ifodasini yuqori tartibga soladi. Biz ECH SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signalizatsiya o'qini tartibga solish va kardiyomiyositlarda mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qilish orqali miyokardni qayta qurishni va HF yurak faoliyatini yaxshilashi mumkin deb taxmin qilamiz. Bu erda biz birinchi navbatda AC-16 hujayralari bilan ISO tomonidan oksidlovchi stressning uyali modelini keltirib chiqaramiz va ECH, mitoxondriyal ROS darajasi, mtDNK oksidlanish shikastlanishi, MMP, karbonillangan oqsil, lipid peroksidlanishi, hujayra ichidagi ROS va ECH bilan oldindan ishlov beramiz. apoptoz aniqlanadi, ECH ning mitoxondriyal oksidlovchi stressga ta'sirini va in vitro funktsiyasini tasdiqlang. Keyin, biz ISO tomonidan qo'zg'atilgan HF kalamush modelini yaratamiz va ECH bilan oldindan ishlov beramiz. Yurak funktsiyasi indekslari, miyokardni qayta qurish, mitoxondriyal oksidlovchi stress va funktsiya, SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signalizatsiya o'qining ifodasi o'lchanadi, ma'lumotlar ECH yurak faoliyatini yaxshilaydi, miokard gipertrofiyasini, fibrozni va apoptozni inhibe qiladi, SIRT1 / FOXO3a ifodasini oshiradi. MnSOD signalizatsiya o'qi, mitoxondrial oksidlanish zararini kamaytiradi, mitoxondrial funktsiyani himoya qiladi. Biz ECH miyokardni qayta qurishni teskari qiladi va SIRT1 / FOXO3a / MnSOD o'qini yuqori tartibga solish va HF kalamushlarida mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qilish orqali yurak faoliyatini yaxshilaydi degan xulosaga keldik.

Kalit so'zSechinacoside, yurak etishmovchiligi, mitoxondriyal oksidativ stress, miyokardni qayta qurish

yangi o'tlar cistancheuchunmitoxondriyal oksidlovchi stress

1|KIRISH

Yurak yetishmovchiligi (YY) ko‘pchilik yurak-qon tomir kasalliklarining yuqori tarqalishi va prognozi yomon bo‘lgan yakuniy natijasi bo‘lib, aholining qarish tendentsiyasining kuchayishi bilan butun dunyo bo‘ylab surunkali yurak yetishmovchiligi (CHF) tufayli kasalxonaga yotqizish va o‘lim darajasi keskin oshdi.1 So'nggi 20 yil ichida HF uchun dori-darmonlarni davolash katta yutuqlarga erishdi, ammo ta'siri juda cheklangan, shuning uchun zudlik bilan yangi dorilar kerak. Miyokardning qayta tuzilishi yurak urish tezligining muhim patologik asosi bo'lib, miokard gipertrofiyasi, apoptoz, interstitsial fibroz bilan tavsiflanadi, miokard hujayralari tartibsiz bo'lib, ejeksiyon fraktsiyasining (LVEF) kamayishiga, chap qorincha diastolik va sistolik diastolik o'lchamlarning oshishiga olib keladi. (LVIDd va LVIDs) va chap qorincha fraksiyonel qisqarishining (LVFS) kamayishi.2 Lekin asosiy mexanizmlar hali ham to'liq tushunilmagan. So'nggi yillarda ko'plab tadqiqotlar oksidlovchi stress miyokardni qayta qurishning muhim omili ekanligini tasdiqladi.3-7

Oksidlanish stressi reaktiv kislorod turlari (ROS) yoki erkin radikallarning haddan tashqari ko'p hosil bo'lishi va hujayra tarkibiy qismlarining oksidlanish shikastlanishiga olib keladigan holat bo'lib, bu o'z navbatida hujayra disfunktsiyasini keltirib chiqaradi.8 Mitoxondriya hujayra ichidagi ROSning asosiy manbai bo'lib, natijada nafas olish elektronlarini tashish zanjiridan oqish va mitoxondriyalar ROS ta'siriga eng sezgir pozitsiyadir.9 HF bo'yicha tadqiqotlar nafas olish zanjirining I kompleksidan ROS hosil bo'lishini ko'paytirishni aniqladi.8 ROS ishlab chiqarishning ortishi birinchi navbatda mitoxondrial komponentlarga hujum qiladi va ortiqcha oksidlovchi stressga olib keladi. , oqsillarning karbonillanishi, lipid peroksidatsiyasi va DNKning shikastlanishi10 va mitoxondriyalarning disfunktsiyasi sifatida namoyon bo'ladi, buning natijasida ROS 8 ning haddan tashqari shakllanishiga olib keladi, ayovsiz doira hosil qiladi. Davomiy oksidlovchi stress miokard gipertrofiyasi va miokard fibrozini keltirib chiqarishi mumkin,11-13 va mitoxondriyal membrana oqsillarining karbonillanishi va mitoxondriyal membrana potentsialini yo'qotishi natijasida mitoxondriyaga bog'liq apoptozning faollashishi orqali miokard hujayralarining apoptozini keltirib chiqarishi mumkin. , mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qilish miyokardning qayta tuzilishini va hatto HFni oldini olishning yangi strategiyasi bo'lishi mumkin deb hisoblanadi.15-17

Echinacoside (ECH), tabiiy feniletanoid glikozid, an'anaviy xitoy tibbiyoti bo'lgan Cistanches Herba ning asosiy faol komponentidir. So'nggi yillarda ECH asab tizimi va o'smalar bo'yicha keng miqyosda o'rganildi va uning antioksidant, yallig'lanishga qarshi, apoptozga qarshi va o'smaga qarshi xususiyatlari kabi turli xil farmakologik ta'sirga ega ekanligi xabar qilindi.18,19In. asab hujayralari, ECH antioksidant qobiliyatini sezilarli darajada oshiradi, ROS ishlab chiqarishni kamaytiradi, mitoxondriyal membrana potentsialini (MMP) yaxshilaydi va hujayra hayotiyligini oshiradi,20 mitoxondriyal funktsiyaga himoya ta'sirini ko'rsatadi va mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qiladi, oksidlovchi shikastlanishdan himoya qiladi va xotirani yaxshilaydi, oxir-oqibat oldini oladi. neyrodegeneratsiya.21,22 ECH shuningdek, SOD faolligini oshiradi va miya to'qimalari va retinaning to'qimalarida himoya rolini o'ynaydi,19,23, ammo uning antioksidant ta'sirining o'ziga xos mexanizmi aniq emas.

SIRT1 oksidlovchi stress bilan chambarchas bog'liq va SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signalizatsiya o'qi eng muhim antioksidant o'qi bo'lib, mitoxondriyal oksidlovchi stressni bostirish uchun mas'uldir, MnSOD mitoxondriyalarda keng tarqaladi va birinchi navbatda ROS ni tozalash uchun javobgardir, shuning uchun mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qilish, bu antioksidant o'qni faollashtiradigan birikmalar oksidlovchi stressni inhibe qilishi mumkin.24,25 Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar ECH o'zining farmakologik ta'sirini p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads kabi bir nechta signalizatsiya yo'llarini tartibga solish orqali amalga oshirishini ko'rsatdi. , va SIRT1 signalizatsiya yo'li.26-29 Yangi tadqiqot ECH ligand sifatida SIRT1 bilan kovalent bog'lanishini va miya hujayralarida SIRT1 ifodasini yuqori tartibga solishini aniqladi.26 Bu ECH kardiomiotsitlarda mitoxondrial oksidlovchi stressni inhibe qilishi va miyokardni teskari qilishi mumkinligini ko'rsatadi. qayta qurish. Shu bilan birga, ECH ning ta'siri bo'yicha tadqiqotlar asab tizimi yoki o'simtaga qaratilgan, ECH ning kardiyomiyositlardagi mitoxondriyal oksidlovchi stressga ta'siri va mexanizmlari va miyokardni qayta qurish noma'lumligicha qolmoqda. Bu erda biz birinchi navbatda ISO tomonidan oksidlovchi stressning uyali modelini yaratamiz va ECH ning mitoxondriyal oksidlovchi stress va in vitro funktsiyasiga ta'sirini tasdiqlaymiz. Keyinchalik, biz ISO tomonidan qo'zg'atilgan HF kalamush modelini o'rnatamiz va ECH miyokardni qayta qurishni teskari qilishini va SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signalizatsiya o'qini yuqori tartibga solish va HF kalamushlarida mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qilish orqali yurak faoliyatini yaxshilashini ko'rsatamiz. Natijalar yurak etishmovchiligining oldini olish uchun yangi dori vositalarini ishlab chiqish uchun eksperimental dalillarni taqdim etish uchun mo'ljallangan.

2|MATERIALLAR VA USLUBLAR

2.1|Hujayra madaniyati va davolash

AC16 xujayralari Bena Culture Collection'dan sotib olinadi. Hujayralar yuqori glyukozali Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhitida (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, AQSh) 10% homila sigir zardobida (10% FBS; Gibco) T-75 kolbalarda saqlanadi (Corning Glassworks, Corning, NY, AQSh). Sharoitlar 5 foiz CO2 bo'lgan namlangan atmosferada 37 daraja haroratda saqlanadi. Hujayralar 70% -80% qoʻshilish darajasiga yetgandan soʻng, ISO (Sigma, AQSh) guruh hujayralari 24 soat davomida 10uM ISO (Sigma, AQSH) oʻz ichiga olgan muhit bilan inkubatsiya qilinadi, ECH guruhi hujayralari 50uM ECH (MCE) bilan oldindan ishlov beriladi. , AQSh) 30 daqiqa oldingi ISO ekspozitsiyasi uchun. Boshqaruv hujayralari (Ctrl) hech narsa bilan ishlanmaydi.

cistanche sotiladiekstrakti

2.2|Luminol chemiluminescence yordamida mitoxondriyal ROS darajasini aniqlash

Mitoxondriyalar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Mitoxondriya izolyatsiyasi to'plami (Sigma, AQSH) yordamida AC-16 hujayralaridan ajratiladi va tozalanadi. Protein kontsentratsiyasi BCA protein tahlili to'plami (Biotech) tomonidan aniqlanadi. Mitoxondriyal ROS darajasi luminal (3-aminoftalik gidrazid 5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazinedion) yordamida Elisa to'plami yordamida aniqlanadi. (GERMED SCIENTIFIC INC, AQSh), u ROS bilan reaksiyaga kirishadi va taxminan 460 nm cho'qqisiga ega bo'lgan tarmoqli spektri bo'lgan fotonlar emissiyasini keltirib chiqaradi va Nisbiy yorug'lik birligi (RLU) kimilyuminesans o'lchash asbobi tomonidan aniqlanadi va RLU/ug ga aylanadi. mitoxondriyal oqsil.

2.3|8-OHdG mitoxondriyal DNKning oksidlovchi shikastlanishini baholash uchun ishlatiladi.

Mitoxondriyal DNKning oksidlovchi shikastlanishi 8-Gidroksi-2-deoksiguanozin (8-OHG) tarkibini aniqlash orqali baholanadi. Hujayralardagi tozalangan mitoxondriyalar yuqoridagi kabi mitoxondriya izolyatsiyasi to'plami (Sigma) yordamida ajratiladi. Protein kontsentratsiyasi BCA protein tahlili to'plami (Biotech) tomonidan aniqlanadi. Keyin ular ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Elisa to'plami (GERMED SCIENTIFIC INC, AQSh) yordamida 8-OHdG darajasini aniqlash uchun ajratiladi. Rang o'zgarishining absorbsiyasi spektrofotometrda 450 nm to'lqin uzunligida o'lchanadi. Namunalardagi 8-OHdG kontsentratsiyasi keyinchalik namunalarning OD ni standart egri chiziqqa solishtirish orqali aniqlanadi va ng/ml ga aylanadi.

2.4|JC tomonidan MMP o'lchovi-1

Mitoxondriyalar ajratib olinadi va AC-16 dan tozalanadi va oqsil kontsentratsiyasi yuqorida aytib o'tilganidek aniqlanadi. Keyin mitoxondriyalar 1 mg/ml konsentratsiyada qayta suspenziya qilinadi, MMP ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq JC-1 tahlil to'plami yordamida o'lchanadi. Floresans intensivligi qo'zg'alish to'lqin uzunligida o'lchanadi: 490 nm, tirqish 5 nm, emissiya to'lqin uzunligi: 590 nm, spektrofotometr asbobi bilan 5 nm yoriq, 30 natijalar FLU/ugP sifatida ifodalanadi.

2.5|AC-16 hujayralardagi oqim sitometriyasi orqali apoptotik hujayralarni aniqlash

Oqim sitometriyasi hujayra apoptozini baholash uchun ishlatiladi. Annexin V-FITC/PI apoptozni aniqlash to'plami (CWBIO, Xitoy) yetkazib beruvchining ko'rsatmalariga muvofiq apoptotik va nekrotik hujayralarni aniqlash uchun ishlatiladi. Erta bosqich apoptoz, kech bosqich apoptoz yoki nekroz, hujayra qoldiqlari va yashovchan hujayralar V (plyus )/PI (-), anneksin V (plyus)/PI (plyus), V (-)/PI aneksin sifatida aniqlanadi. ( plus ) va mos ravishda V (-)/PI (-) ilovasi. Floresan intensivligi oqim sitometri (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San-Xose, CA, AQSH) yordamida tahlil qilinadi. Har bir tajriba 3 marta takrorlanadi.

2.6|Oqim sitometri orqali hujayra ichidagi ROSni baholadi

Davolanishdan keyin hujayralar tripsinlanadi, PBS bilan ikki marta yuviladi. Keyin hujayralar PBSda qayta suspenziya qilinadi, 1 mkM yakuniy konsentratsiyada DCFH-DA (Beyotime, Xitoy) bilan bo'yaladi va CO2 bilan inkubatorda 37 daraja 1 soat davomida inkubatsiya qilinadi va keyin oqim sitometrida 488 nm qo'zg'alishda sinovdan o'tkaziladi. . Floresan intensivligi hujayra ichidagi ROS darajasini ifodalaydi.

2.7|AC-16 hujayralari mitoxondriyalaridagi karbonil oqsil miqdorini tekshiring

Davolanishdan so'ng tozalangan mitoxondriyalar ajratiladi va muzda sonikatsiya qilinadi va mitoxondriyal nuklein kislotalarni cho'ktirish uchun 1 foizli streptomitsin sulfat bilan ishlov beriladi, oqsil kontsentratsiyasi aniqlanadi. Karbonil oqsili tarkibi Elisa to'plami (GERMED SCIENTIFIC INC, AQSH) yordamida karbonil guruhini dinitrofenilgidrazin (DNPH) bilan derivatlash asosida tekshiriladi, to'plam ko'rsatmalariga ko'ra, OD mikroplyonka o'quvchi bilan o'lchanadi va nmol / ga aylantiriladi. standart egri bilan solishtirish orqali mg protein.

2.8|AC-16 hujayralari mitoxondriyalarida lipid peroksidlanish darajasini aniqlash.

Davolanishdan so'ng hujayralar to'planadi va parchalanadi, mitoxondriyalar ajratiladi va tozalanadi va ultratovush yordamida yoriladi, oqsil kontsentratsiyasi BCA protein tahlili to'plami (Biotech) bilan aniqlanadi, lipid peroksidlanishi TBARS tahlili orqali malondialdegid (MDA) darajasi bilan aniqlanadi. , to'plam yordamida (Nan jing Jian cheng, Xitoy) va MDA darajasi ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq o'lchanadi. OD 586 nm da mikroplastinka o'quvchi tomonidan aniqlanadi va standart egri chiziq bilan solishtirish orqali mkmol/g oqsiliga aylanadi.

2.9|Hayvonlar va davolash

Og'irligi 120-140 g bo'lgan yosh erkak Sprague-Dawley kalamushlari Sian Jiao Tong universiteti laboratoriya hayvonlar markazidan (Shansi, Xitoy) sotib olingan. Tekshiruv AQSh Milliy Sog'liqni saqlash instituti tomonidan chop etilgan Laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha qo'llanmaga (NIH nashri № 85-23, 1996 yilda qayta ko'rib chiqilgan) mos keladi va eksperimental protokollar mahalliy hokimiyat tomonidan tasdiqlangan ( Xi 'a Jiao Tong universiteti Tibbiyot bo'limining biotibbiy etika qo'mitasi). HF ning kalamush modeli yuqorida tavsiflanganidek o'rnatildi.31 Qisqacha aytganda, Isoproterenol (10 mg/kg) kuniga bir marta qorin bo'shlig'iga in'ektsiya yo'li bilan 2 hafta davomida (HF guruhi sifatida belgilanadi), ECH 20 dozada qo'llaniladi. ug/g kuniga bir marta qorin bo'shlig'iga in'ektsiya yo'li bilan ISO davolashdan 30 minut oldin (ECH guruhi sifatida belgilanadi) va qabul qilish 2 hafta davom etadi. Nazorat hayvonlariga 0,9 foiz NaCl (Ctrl guruhi sifatida belgilangan) kiritiladi. Yurak faoliyatini baholash uchun ekokardiyografiya o'lchovlari o'tkaziladi.

2.10|Ekokardiyografik o'lchovlar

Hayvonlar qorin bo'shlig'iga 300 mg / kg xloralgidratni yuborish orqali anesteziya qilinadi. Ekokardiyografik tekshiruvlarni o'tkazish uchun SONOS{1}} ultratovush tizimi 7,5 MGts (HP, AQSh) ultratovush transduseridan foydalaniladi. Chap qorincha ejeksiyon fraktsiyasi (LVEF), chap qorincha fraktsiyasining qisqarishi (LVFS), chap qorincha diastolik oxirgi o'lchamlari (LVIDd), chap qorincha sistolik oxirgi o'lchamlari (LVIDs), yurak urish tezligi (HR), diastoladagi interventrikulyar septal qalinligi (IVSTd) ), diastoladagi chap qorincha orqa devorining qalinligi (LVPWTd) biz ilgari tasvirlanganidek o'lchanadi.32

RASM 1 50mkmol ECH 10 mkmol/L ISO tomonidan qo‘zg‘atilgan AC-16 hujayralarining mitoxondrial oksidlanish stressini samarali ravishda inhibe qiladi va mitoxondrial funktsiyani himoya qiladi va apoptozni kamaytiradi.

2.11|Yurak og'irligining tana vazniga nisbati (HW / BW) o'lchanadi

Anesteziyadan oldin kalamush o'lchanadi, yangi yurak ajratiladi va qonni 0,1mol/L PBS bilan yuvadi, tomirlarni va boshqa ortiqcha to'qimalarni kesib tashlaydi va yurak tortiladi, so'ngra HW/BW (mg/100g) hisoblangan.

2.12|Gistologik bo'yash

Sichqonlarning yuraklari kesiladi va 4 foizli paraformaldegidda mahkamlanadi, kerosinga solinadi va qalinligi 5 mkm bo'lgan bo'laklarga bo'linadi. Patologik o'zgarishlarni kuzatish uchun gematoksilin-eozin (HE) bo'yalishi va kalamush miokard to'qimalarining kollagen tolalarini baholash uchun Masson trixromidan foydalaniladi. Yurak kollagen hajmi ulushi (CVF) va kardiomiotsitlar ko'ndalang kesimi Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, AQSh) bilan o'lchanadi.

2.13|TUNEL bo'yash

Chap qorinchadan miyokard to'qimasi yig'iladi va TUNEL tahlili biz tomonidan ilgari tavsiflanganidek amalga oshiriladi32

2.14|Transmissiya elektron mikroskopi

Yangi yurak to'qimasi 2,5 foizli glutaraldegidda 4 daraja haroratda, to'qima keyin 1 mm3 hajmda kesiladi va yana 2,5 foizli glutaraldegidda 4 daraja haroratda 2 soat davomida mahkamlanadi, so'ngra 0.1mol/L PBS bilan yuviladi, mahkamlanadi. 1 foizli osmik kislotada, aseton bilan suvsizlangan, epoksi qatroni qoʻshilgan, taxminan 8{17}}0nm yupqa boʻlgan ultra yupqa boʻlaklar hosil boʻladi, uranil asetat va qoʻrgʻoshin sitrat bilan boʻyaladi, soʻngra transmissiya elektron mikroskopida (H{) kuzatiladi. {13}}, Hitachi Limited, Yaponiya). Mitoxondriyal morfologiyada ECH ning himoya ta'sirini aniqlash uchun o'rtacha mitoxondriyal atrofi, o'rtacha mitoxondrial kesma maydoni, degeneratsiya foizi va mitoxondriyadagi vakuolizatsiya foizi Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, AQSH) bilan statistik tahlil qilinadi.

2.15|Miqdoriy PCR

Jami RNK chap qorincha to'qimasidan Trizol reaktivi bilan tayyorlanadi (Invitrogen, Karlsbad, AQSh). cDNK TUREscript 1st Strand cDNA sintez to'plami (Takara, Yaponiya) yordamida sintezlanadi. Haqiqiy vaqtda PCR uchun ishlatgan kollagenning o'ziga xos primer ketma-ketligi quyidagicha: oldinga: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3', orqaga: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3'. GAPDH oldinga 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', teskari 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Haqiqiy vaqtda miqdoriy PCR (qPCR) SYBRPremix Ex bilan amalga oshiriladi Taq (Perfect Real Time) (Takara, Yaponiya). mRNKning nisbiy darajasi 2-DACT usuliga muvofiq GAPDH ga normallashtirish orqali hisoblanadi.

2.16|SIRT1, FOXO3a, MnSOD oqsili ifodasining Western blot tahlili

Chap qorincha to'qimalarining umumiy oqsili sovuq RIPA buferi (BioRad, AQSH) yordamida Proteaz inhibitör kokteyli (Sigma-Aldrich) yordamida muz ustida chiqariladi. Konsentratsiya BCA usuli bilan aniqlanadi. Western blot protseduralari avval tasvirlangan.33 Qisqacha, oqsil namunasi 15 foizli natriy dodesil sulfat-poliakrilamid jellarida fraksiyalanadi, PVDF membranalariga (BioRad, AQSh) o‘tkaziladi, 5 foizli yog‘siz sut bilan bloklanadi va sichqonchadan olingan MYH antikori bilan inkubatsiya qilinadi. (Suyultirilgan 1:200, Santa Kruz, AQSh). Keyin, xren peroksidaza bilan konjugatsiyalangan echki sichqonchasi antikori bilan inkubatsiya qilinadi (1:2,000 suyultirilgan, Santa Kruz, AQSh). Proteinning nisbiy darajasi o'rtacha nurlanish qiymatini -aktinga normallashtirish orqali hisoblanadi. Protein bantlari kimilyuminesans tizimi (ChemiDoc XRS, BioRad) tomonidan aniqlanadi.

2.17|Sichqoncha miyokardida mitoxondriyal oksidlovchi stressni o'lchash

Kalamush miokardining tozalangan mitoxondriyalari ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Mitoxondriya izolyatsiyasi to'plami (Sigma, AQSH) yordamida ajratiladi, mitoxondriyal ROS, MMP, mtDNKning oksidlanish shikastlanishi, karbonillangan oqsil miqdori va mitoxondriyadagi lipid peroksidlanish darajasi xuddi shu usullar yordamida aniqlanadi. yuqorida tavsiflangan hujayra tajribalari. Shunisi e'tiborga loyiqki, miokard to'qimalarida ROS DCFH-DA lyuminestsent problari bilan aniqlanadi, flüoresan intensivligi ferment-yorliqli o'lchov asbobi bilan aniqlanadi, natijalar RLU/ug mitoxondriyal oqsil sifatida ifodalanadi.

2.18|Statistik tahlil

Barcha ma'lumotlar ± SEM vositasi sifatida taqdim etiladi. Bir tomonlama ANOVA bir nechta guruhlar o'rtasidagi farqlarni solishtirish uchun ishlatiladi, so'ngra Tukey post hoc muhimlik testi. Barcha statistika SPSS15.0 dasturi (SPSS Inc, IL, AQSH) yordamida aniqlanadi. P <.05 ehtimollik="" qiymati="" muhim="">

3|NATIJALAR

3.1|50 mkM ECH AC-16 hujayralarida mitoxondriyal oksidlovchi shikastlanish va apoptozni samarali tarzda inhibe qiladi.

Ishlov berilmagan hujayralar Ctrl guruhi sifatida o'rnatiladi. Birinchidan, 1A-rasmda ko'rsatilganidek, ECH ISO tomonidan qo'zg'atilgan mitoxondrial ROSni inhibe qiladi. ISO bilan ishlov berilgan hujayralar Ctrl bilan solishtirganda mitoxondrial ROSda sezilarli o'sishni ko'rsatadi va bu o'sish 50 mkM ECH bilan oldindan ishlov berish orqali sezilarli darajada zaiflashadi. Ikkinchidan, ECH ISO tomonidan qo'zg'atilgan mtDNKning oksidlovchi shikastlanishini inhibe qilishi mumkin. 8-OHdG oksidlovchi stress natijasida yuzaga kelgan eng koʻp uchraydigan DNK lezyonlaridan biri hisoblanadi va oksidlovchi DNKning shikastlanishi va tiklanishining biomarkeridir. 1B-rasmda ko'rsatilganidek, AC{6}} hujayralaridan tozalangan mitoxondriyadagi 8-OHdG tarkibi aniqlangan, natijalar ISO bilan davolash qilingan hujayralardagi mitoxondriyalardagi 8-OHdG darajasi keskin oshganligini ko'rsatadi, ammo o'zgarish 50 mkM ECH ga qaytarildi. Uchinchidan, ECH ISO tomonidan buzilgan MMPni himoya qilish uchun samarali. Ctrl hujayralari bilan solishtirganda ISO bilan ishlov berilgan hujayralarda floresans intensivligi sezilarli darajada kamayadi, 50 mkM ECH bilan oldindan ishlov berish esa MMPning pasayishini sezilarli darajada susaytiradi, 1C-rasmda ko'rsatilgan. To'rtinchidan, ECH AC-16 hujayralarida mitoxondriyal oqsilning oksidlanish shikastlanishidan himoya qiladi. 1D-rasmda ko'rsatilganidek, ISO davolash hujayralarining mitoxondriyalaridagi karbonil oqsili miqdori sezilarli darajada oshadi va ECH ta'sirni susaytiradi. Beshinchidan, ECH shuningdek, ISO tomonidan qo'zg'atilgan AC-16 hujayralarida mitoxondriyal lipid peroksidatsiyasini inhibe qiladi. 1E-rasmda ko'rsatilganidek, ISO hujayralarining mitoxondriyalaridagi lipid peroksidlar darajasi Ctrl hujayralarinikiga qaraganda yuqoriroq, bu o'sish esa 50 mkM ECHdan oldingi ishlov berish bilan sezilarli darajada kamayadi. Oxir-oqibat, ECH hujayra ichidagi ROS to'planishini inhibe qiladi. 1F-rasmda ko'rsatilganidek, ISO hujayralarida hujayra ichidagi ROS darajasi sezilarli darajada oshadi va ECH bilan oldindan ishlangan hujayralarda sezilarli darajada kamayadi. 1G-rasmda AC{21}} hujayralarining apoptoz tezligi Ctrl hujayralariga nisbatan 10 mkM ISO bilan 24 soatlik inkubatsiyadan so‘ng sezilarli darajada oshgani ko‘rsatilgan, holbuki 50 mkM ECHga ega bo‘lgan dastlabki ishlovdan o‘tgan hujayralar ISO-induktsiyali apoptozni sezilarli darajada kamaytiradi.

2-rasm ISO tomonidan qo'zg'atilgan HF kalamushlarining yurak gipertrofiyasi ECH bilan davolash orqali engillashtiriladi va yurak faoliyati sezilarli darajada yaxshilanadi.

3.2|ECH miyokardni qayta qurishni bekor qiladi va ISO tomonidan qo'zg'atilgan HF kalamushlarining yurak funktsiyasini yaxshilaydi

2A-rasmda ko'rsatilganidek, HF kalamushlarida yuraklar aniq gipertrofiya bo'lib, ECH bilan davolash orqali qaytariladi. 2B-D va L rasmlarida ko'rsatilganidek, ECH HW/BW ni kamaytiradi. Ekokardiyografiya natijalari shuni ko'rsatadiki, HF guruhida LVEF va LVFS sezilarli darajada kamayadi, LVIDd, LVIDs va IVSTd HF guruhida sezilarli darajada oshadi. Shu bilan birga, ECH LVIDd, LVIDs, IVSTdni sezilarli darajada kamaytiradi va LVEF va LVFSni yaxshilaydi, uchta guruh o'rtasida HRda sezilarli farq yo'q, LVPWTd HFda ortadi, lekin ECH va Ctrl yoki ECH va HF o'rtasida farq yo'q, barchasi kabi 2E-K rasmda ko'rsatilgan. HE bo'yash natijalari shuni ko'rsatadiki, miyokard gipertrofiyasi, tartiblangan buzilish yoki degeneratsiya nekrozi, yallig'lanish hujayralari infiltratsiyasi va interstitsial giperemiya va shish paydo bo'lishi HF kalamushlarida va ECH bu zararlarni sezilarli darajada engillashtiradi, miyokard gipertrofiyasi va tartiblangan buzilishlarni engillashtiradi. degeneratsiya nekrozi va yallig'lanish infiltrati kamayadi, 3A-rasmda ko'rsatilganidek. Kardiomiotsitning kesma maydoni o'lchanadi, u ISO dan keyin sezilarli darajada oshadi va 3E-rasmda ko'rsatilganidek, ECH bilan ishlov berilgan guruhda kamayadi. Massonni bo'yash orqali kollagen cho'kmasini baholash shuni ko'rsatadiki, HF kalamushlarida chap qorincha kollagen miqdori aniq ko'payadi va ECH bilan davolashdan keyin kamayadi, bu esa CVFni aniq kamaytiradi. Haqiqiy vaqtda PCR tahlili shuni ko'rsatadiki, prokollagen tipi Ⅰ transkriptlari ISO kalamushlarida yuqori tartibga solinadi va ECH kalamushlarida pastga tartibga solinadi, bu natijalar bir-biriga mos keladi, 3B va FG rasmlarida ko'rsatilgandek, ma'lumotlar ECH kollagen cho'kmasini samarali ravishda kamaytirishini ko'rsatadi. . Kardiyomiyositlardagi TUNEL-musbat hujayralar soni HF kalamushlarida Ctrl bilan solishtirganda sezilarli darajada ko'paygan, ECH miyokard hujayralari apoptozini sezilarli darajada kamaytiradi va 3C-D-rasmda TUNEL-musbat hujayralarning past va yuqori quvvatli sohalarda vakillik tasviri ko'rsatilgan va shakl. 3H miyokard hujayralarining apoptoz tezligini ko'rsatadi. Ushbu natijalar ECH miyokard gipertrofiyasi, miyokard interstitsial fibrozi va apoptozni samarali tarzda bartaraf etishini va ISO tomonidan qo'zg'atilgan HF kalamushlarida yurak faoliyatini yaxshilashini ko'rsatadi.

3-rasm Gistologik bo'yash natijalari shuni ko'rsatadiki, ECH ISO tomonidan qo'zg'atilgan HF kalamushlarining chap qorincha remodelatsiyasini teskari qiladi.

3.3|ECH HF kalamushlarida miyokard ultrastrukturasini himoya qiladi

Transmissiya elektron mikrograflari natijalari 4A-B-rasmda ko'rsatilganidek, miyokard ultrastrukturasining shikastlanishi ECH tomonidan zaiflashishi mumkinligini ko'rsatadi. Miyofibrillalar vertikal joylashuvga ega, sarkomer strukturasi aniq, miofilamentlar tartibli joylashtirilgan, Z chizig'i aniq. Ctrl kalamushlarida mitoxondriyalar chiroyli tarzda joylashtirilgan va tuzilishi aniq. Shu bilan birga, miofibrillar tartibsiz, yorilib, erigan, sarkomer tuzilishi loyqa, Z chizig'i yo'q, miokard qisqarish zonasi ko'rinadi, mitoxondriyalarning soni va hajmi ko'payadi, mitoxondriyalar turli shakl va o'lchamlarda, tartibsiz joylashgan, strukturasi noaniq, shish va crista parchalanishi, qulashi yoki to'planishi va HF kalamushlarida vakuolga eriydi. ECH aniq bu o'zgarishlarni susaytiradi, yurak mushak tolalarining ko'pchiligi chiroyli tarzda joylashtirilgan va miokard filamentlari aniq, Z chizig'i mavjud, garchi filamentlarning bir oz erishi aniq bo'lsa-da, sarkomer tuzilishi aniq, mitoxondriyal zichligi pasaygan, shakllar va o'lchamlari engillashadi, yanada aniqroq joylashadi, mitoxondriyalarning shishishi va kristallarning parchalanishi, qulashi yoki to'planishi va vakuolizatsiyasi HF bilan solishtirganda ECH tomonidan aniq kamayadi. Mitoxondriyaning shishishi va kristallanishi, qulashi yoki to'planishi va qisman vakuolizatsiyasi mitoxondriyal degeneratsiya sifatida aniqlanadi. Natijalar ECH miyokard ultrastrukturasini samarali himoya qilishini va ayniqsa, 4C-F-rasmda ko'rsatilganidek, HF kalamushlarida mitoxondriyal morfologiyani himoya qilishini ko'rsatadi.

4-rasm ECH kardiomiotsitlarning ultrastrukturasini va ISO tomonidan qo'zg'atilgan HF kalamushlarining mitoxondrial morfologiyasini himoya qiladi.

3.4|ECH SIRT1, FOXO3a va MnSOD ning oqsil ifodasini tartibga soladi

Western Blot tahlili shuni ko'rsatadiki, SIRT1, FOXO3a va MnSOD ning protein ekspresyon darajasi HF kalamushlarida sezilarli darajada pasayadi, ammo ECH, aniqki, pasaygan protein ifodasini yuqoriga boshqaradi. Immunoblotting va statistik tahlil natijalarining vakili oqsil guruhlari 5-rasmda ko'rsatilgan. Ma'lumotlarning bir qismi ECH SIRT1, FOXO3a va MnSOD oqsil ifodasini oshirishini ko'rsatadi.

3.5|ECH chap qorincha miokard to'qimalarida mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qiladi

Ushbu qismda mitoxondriyal ROS, MMP, mitoxondriyal DNKning oksidlanish shikastlanishi, karbonil oqsil miqdori va kalamushlarning chap qorincha miokard to'qimalarida mitoxondriyadagi lipid peroksidlanish darajasi o'lchanadi va natijalar hujayra tajribalari bilan mos keladi, ya'ni: 6-rasmda ko'rsatilganidek, ECH mitoxondriyal ROSni pasaytiradi, MMP ni himoya qiladi, mtDNKning shikastlanish darajasini engillashtiradi, mitoxondriyadagi karbonil oqsili va lipid peroksidatsiyasini kamaytiradi.

5-rasm ECH SIRT1, FOXO3a va MnSOD oqsillarini ifodalash darajasini ko'taradi, bu esa HF kalamushlarida pastga regulyatsiya qilinadi.

4|MUHOKAZA

Ushbu tadqiqot ECH SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signalizatsiya o'qini yuqori tartibga solish va mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qilish orqali miyokardni qayta qurishning oldini olish va yurak faoliyatini yaxshilashda samarali rol o'ynashini ko'rsatadi.

Mitoxondriyalar oksidlovchi fosforillanishning qo'shimcha mahsuloti sifatida ROS hosil bo'lishining asosiy joyi bo'lib, ularning ROS ga yaqinligi, mitoxondriyal oqsillar, lipidlar va mtDNK mitoxondriyal ROS ning haddan tashqari emissiyasidan keyin oksidlovchi shikastlanishning asosiy maqsadi hisoblanadi,34,35 bu zarar ROSning keyingi ishlab chiqarilishini rag'batlantiradi, shafqatsiz doira davom etadi, ROS va oksidlovchi stress ko'plab signalizatsiya yo'llarini faollashtirish orqali miyokard gipertrofiyasi, apoptoz, interstitsial fibroz va HFga olib kelishi mumkin.35 Demak, mitoxondriyal oksidlanishni inhibe qilishni maqsad qilgan dorilar stress miyokardni qayta qurishning oldini olish uchun samarali. ECH tabiiy feniletanoid glikozid bo'lib, an'anaviy xitoy o'ti Cistanche tubulosa tarkibiga kiradi. u keng miqyosda o'rganilgan va so'nggi yillarda o'smaga qarshi, apoptozga qarshi, qarishga qarshi, neyroprotektiv ta'sir va boshqalar kabi farmakologik faoliyat turlariga ega ekanligi isbotlangan. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ECH ning farmakologik ta'siri asosan uning antioksidant va yallig'lanishga qarshi faollik xususiyatiga bog'liq,18,21 va ECH mitoxondriyal ROSni pasaytiradi va mitoxondriyal funktsiyani nerv hujayralarida oksidlovchi shikastlanishdan himoya qiladi.20,22 Bu erda biz birinchi navbatda shuni ko'rsatdik. ECH kardiyomiyositlarning mitoxondriyal ROS ni pasaytiradi, shuning uchun MMP ni yaxshilaydi, mtDNK, oqsil va lipidlarning oksidlovchi shikastlanishini kamaytiradi, mitoxondriyal oksidlovchi shikastlanishni samarali ravishda in vitro va in vivo jonli ravishda inhibe qiladi va apoptozni kamaytiradi, shuning uchun u miyokardning qayta tuzilishini tiklaydi va yurak faoliyatini yaxshilaydi. Bu shuni anglatadiki, ECH miyokardni qayta qurish va yurak urish tezligining oldini olish uchun potentsial yangi doridir.

Oddiy sharoitlarda mitoxondriyal ROS asosan mitoxondriyalarda tarqaladigan va mitoxondriyal oksidlanish shikastlanishidan himoya qiluvchi MnSOD tomonidan tozalanadi. Ang II kardiyomiyositlarning MnSOD ifodasini sezilarli darajada kamaytiradi va miokard gipertrofiyasini keltirib chiqaradi, ammo resveratrol MnSOD ekspresyonini oshirishi va Ang II tomonidan qo'zg'atilgan miokard gipertrofiyasini inhibe qilishi mumkin.36 HFda MnSOD faolligi sezilarli darajada kamayadi va mitoxondriyal ROS generatsiyasi ko'tariladi. .37,38 Yurakka xos MnSOD geni nokautli sichqonlarda mitoxondriyal ROSni tozalab bo'lmadi va kardiomiotsitlarda ROS ko'paydi, bu mitoxondrial disfunktsiyaga va yurakning progressiv kengayishiga olib keldi, natijada yurak etishmovchiligiga olib keldi.39 Ushbu tadqiqotda biz tasdiqlaymiz. MnSOD ifodasi sezilarli darajada kamayadi, bu ECH bilan davolashda zaiflashadi va shu bilan mitoxondriyal ROS kamayadi va mitoxondriyal oksidlovchi stress inhibe qilinadi. Bu shuni anglatadiki, ECH MnSOD ifodasini yuqori tartibga solish orqali kardiyomiyositlarni oksidlanish shikastlanishidan himoya qiladi, biz ushbu ta'sirlar ostida yotgan molekulyar mexanizmlarni batafsil o'rganamiz.

MnSOD ifodasi transkripsiya omili bo'lgan FOXO3a tomonidan tartibga solinadi va MnSODning gen promotor mintaqasida bog'lanadi va gen transkripsiyasini rag'batlantirishga olib keladi.40 SIRT1 FOXO3a ning yuqori oqimidagi molekulasidir va u FOXO3a ni deatsetilatsiya yo'li bilan faollashtirishi mumkin. SIRT1/FOXO3a/MnSOD signalizatsiya o'qi hujayra turlarida oksidlovchi stressdan himoya qilishda muhim rol o'ynaydi, estradiol bilan signalizatsiya o'qini faollashtirish oksidlovchi stressni inhibe qiladi va yurak himoyasini ta'minlaydi24; Resveratrol tomonidan signalizatsiya o'qining faollashishi oksidlovchi stressdan kelib chiqqan hujayra o'limini inhibe qiladi40; Aks holda, angiotensin II SIRT1/FoxO3a/MnSOD yo'lini inhibe qiladi va mitoxondriyal oksidlanish stressini, osteoblastlarda mtDNKning shikastlanishini keltirib chiqaradi,41-toifa 5 adenilil siklaza MnSOD ifodasini inhibe qilish orqali oksidlovchi stressni oshiradi. SIRT1, FoxO3a va MnSOD ifodasi HF kalamushlarida sezilarli darajada kamayadi va mitoxondriyal ROS ko'tariladi va oksidlovchi stress kuchayadi, ammo o'zgarishlar ECH tomonidan qaytariladi. Yangi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, ECH to'g'ridan-to'g'ri SIRT1 ni ligand sifatida bog'laydi va 9 ta kovalent bog'lar bilan kompleks hosil qiladi va asab hujayralarida SIRT1 ifodasini yuqoriga ko'taradi. Kardiyomiyositlarda SIRT1, keyin FoxO3a orqali MnSOD gen ekspressiyasini tartibga soladi va mitoxondriyal ROS va oksidlovchi stressni inhibe qiladi.

Uzoq muddatli surunkali ishemiya miyokardning uyqu holatiga olib kelishi mumkin, bu qishki miyokard hujayralari odatda kontraktil filamentlarning yo'qolishini ko'rsatadi, sitozolda ortiqcha glikogen granulalari, sarkoplazmatik retikulum va ko'ndalang kanalchalar yo'qoladi,43shuningdek, mitoxondriyal o'lcham va shakldagi anomaliyalar mavjud. , reaktiv miokard gipertrofiyasi va interstitsial fibroz, bu miyositlarning yo'qolishiga ikkilamchi bo'ladi.44 Biz tadqiqotimizda yuqoridagi o'zgarishlarni HF kalamushlarida ham kuzatdik, holbuki ECH bu o'zgarishlarni sezilarli darajada engillashtiradi, chunki so'nggi tadqiqot ishemik stressdan so'ng yurak funktsiyasi tiklanishi mumkin. miokardning uyqu holatining xususiyati,45 miyokard glikogen darajasi ham o'lchanadi, natijalar 7J-rasmda ko'rsatilganidek, uchta guruh o'rtasida sezilarli farq yo'qligini ko'rsatadi.

Oldingi tadqiqot, shuningdek, ishemik bo'lmagan yurak etishmovchiligi cho'chqa modelida miyokardning uyqu holatini yuqori chastotali LV bo'sh devorini tezlashtirish orqali aniqladi46, chunki mikrovaskulyar obstruktsiya miyokard kutish holatida va natijada kontraktil disfunktsiyada muhim rol o'ynaydi va bu holat sezilarli darajada yaxshilanadi. Mikrovaskulyar obstruktsiya dori vositasida qaytariladi.47 Hozirgi vaqtda ba'zi tadqiqotlar revaskulyarizatsiya terapiyasi miyokardning uyqu holatida samarali ekanligi to'g'risida xulosaga keldi,43 HE va Masson bo'yoqlaridan foydalangan holda, biz HF kalamushlarida miokard kapillyarlari va arteriolyar zichligi aniq kamayishini va sezilarli darajada engillashishini kuzatamiz. 7A-H-rasmda ko'rsatilganidek, ECH tomonidan. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, arpa beta-glyukan kabi boshqa tabiiy birikmalar MnSOD,48,49 ifodasini ko'paytirish orqali kardioprotektiv ta'sir ko'rsatadi va MnSOD ko'tarilishi miyokard kapillyar zichligi va VEGF ifodasining oshishi bilan bog'liq. Biz VEGF ifodasini aniqlash uchun RT-PCR o'tkazdik, ma'lumotlar gistologik bo'yashning topilmasiga mos keladi, ya'ni ECH angiogenezni rag'batlantirishi va VEGF ifodasini tartibga solish orqali miyokard kapillyar zichligini oshirishi mumkin, 7I-rasmda ko'rsatilganidek. Ushbu tadqiqot shuni ko'rsatadiki, ECH yuqori tartibga soluvchi SIRTI/FOXO3a/MnSOD yo'li va VEGF ifodasi orqali miyokard kapillyarlari va arteriollarini himoya qilishi va oshirishi va shu bilan uxlab yotgan miyokardni bostirishi va yurak faoliyatini yaxshilashga hissa qo'shishi mumkin.

Cistanche hissa qo'shadiuchunyurak faoliyatini yaxshilash.

Qo'shimcha ma'lumot olish uchun bu yerni bosing.

Shunisi e'tiborga loyiqki, kardiomiotsitlar apoptozi yurak etishmovchiligidagi muhim patologik o'zgarish sifatida yaxshi ma'lum va ushbu tadqiqot haqiqatan ham HF kalamushlarida va ECHda apoptotik hujayralarning katta miqdori SIRTI / FOXO3a / MnSOD yo'lini tartibga solish va inhibe qilish orqali apoptozni sezilarli darajada kamaytirishini tasdiqlaydi. Yuqorida aytib o'tilganidek, mitoxondriyal oksidlovchi stress.

Eng muhimi, ECH miokardning qayta tuzilishini qaytaradi va SIRT1/FoxO3a/MnSOD signalizatsiya o'qini yuqori tartibga solish orqali yurak faoliyatini yaxshilaydi, shu bilan mitoxondriyal oksidlovchi stressni inhibe qiladi va uxlab yotgan miyokardni kamaytiradi. Shunday qilib, ECH miyokardni qayta qurish va HF ning oldini olish yoki davolash uchun potentsial dori ekanligi taklif etiladi.