Ⅰ QISM: Cistanche Tubulosa ekstraktining streptozototsin-nikotinamid sabab bo'lgan diabetik kalamushlarda erkaklarning reproduktiv funktsiyasiga ta'siri
Mar 04, 2022
Aloqa: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong ® Ahira Jonson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He va Shu-Chun Cheng
Annotatsiya:Qandli diabet - insulin darajasining pasayishi yoki to'qimalarning uni samarali ishlatish uchun samarasizligi tufayli giperglikemiya bilan tavsiflangan surunkali kasallik. Bepushtlik diabetning asosiy natijasi sifatida tanilgan va sperma buzilishi va jinsiy bezlarning disfunktsiyasiga sabab bo'lgan erkak jinsiy tizimiga ta'sir qiladi.Cistanche tubulosaxotira, immunitet va jinsiy qobiliyatni yaxshilash, iktidarsizlikni kamaytirish va ich qotishini kamaytirish qobiliyatiga ega bo'lgan parazit o'simlik. Ushbu tadqiqot echinacoside (ECH) ning yallig'lanishga qarshi va himoya ta'sirini o'rganishga qaratilgan.Cistanche tubulosa ekstrakti(CTE) diabetik kalamushlarning erkak jinsiy tizimida. CTE ning antioksidant, yallig'lanishga qarshi va himoya ta'siri ham in vitro, ham in vivo usullari bilan baholandi. In vitro natijalari shuni ko'rsatadiki, ECH reaktiv kislorod turlarini (ROS) ishlab chiqarishni inhibe qilgan va Star, CYP11A1, CYP17A1 va HSD17p3 oqsillari ifodasini yaxshilagan. In vivo tahlil CTE da uch dozali echinacoside (ECH) (80, 160 va 320 mg/kg) bilan o'tkazildi. Hammasi bo'lib 0,571 mg/kg rosiglitazon (RSG) ijobiy nazorat sifatida qo'llanildi. Qandli diabetga streptozotsin (STZ) (65 mg/kg) va nikotinamid (230 mg/kg) yuqori yog‘li parhez (45 foiz) bilan birgalikda sabab bo‘lgan. In vivo tadqiqotlar ECH qon shakar darajasini, insulin qarshiligini, leptin qarshiligini va lipid peroksidatsiyasini yaxshilaganligini tasdiqladi. U gipotalamusda kisspeptin 1 (KiSS1), G protein bilan bog‘langan GPR 54 retseptorlari, sitokin signalizatsiyasi 3 bostiruvchi (SOCS-3) va sirtuin 1 (SIRT1) xabarchi ribonuklein kislotasi (mRNK) ifodasini tiklaydi va jinsiy aloqani tiklaydi. gormon darajasi. Shunday qilib, ushbu tadqiqot CTE ning antioksidant, yallig'lanishga qarshi va steroidogenez ta'sirini tasdiqladi.
Kalit so‘zlar:qandli diabet; bepushtlik;Cistanche tubulosa ekstrakti (CTE); echinacoside (ECH); yallig'lanishga qarshi faollik; antioksidant faollik; steroidogenez ta'siri
Qandli diabetni davolash:Cistanche tubulosa ekstrakti(CTE)
1.Kirish
Qandli diabet (DM) - bu oshqozon osti bezi etarli miqdorda insulin ishlab chiqarishda samarasizligi yoki tananing uni samarali ishlata olmasligi tufayli qonda glyukoza darajasining oshishi bilan bog'liq holat. JSST ma'lumotlariga ko'ra, qandli diabet bilan kasallanganlar soni 1980 yildagi 108 milliondan 2014 yilda 422 millionga ko'tarildi [1]. To'rtta asosiy toifa mavjud: diabetdan oldingi (qandli diabetdan oldingi bosqich), 1-toifa (oshqozon osti bezi insulin ishlab chiqara olmaydi), 2-toifa (tana insulin ishlatmaydi) va homiladorlik qandli diabet (homiladorlik paytida paydo bo'ladi). Oksidlanish stressi reaktiv kislorod turlari (ROS) va antioksidantlar [2] ishlab chiqarish o'rtasidagi nomutanosiblik tufayli yuzaga keladi, natijada diabetik holatga olib keladi. Qandli diabetning asoratlari orasida buyrak etishmovchiligi, asabning shikastlanishi, ko'rlik, insult, yurak xuruji, homila o'limi va bepushtlik mavjud. [1]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, diabetga chalingan erkaklarda sperma yadrolari, deoksiribonuklein kislotasi (DNK) va mitoxondriyalar sezilarli darajada shikastlangan. Spermatozoidlarni tashish jarayonida oksidlovchi stress erkak jinsiy tizimining jarayonini o'zgartiradi [4,5].
Spermatogenez jarayoni gipotalamus-gipofiz-gonadal (HPG) o'qi tomonidan boshqariladi. Gipotalamus tomonidan ishlab chiqarilgan gonadotropinni chiqaradigan gormon (GnRH) luteinlashtiruvchi gormon (LH) va follikulani ogohlantiruvchi gormon (FSH) ishlab chiqarishni rag'batlantiradi. Leydig hujayralari seminifer tubulaga ulashgan va LH nazorati ostida testosteron ishlab chiqaradi. FSH erkak gormoni o'tishiga yordam beradigan antigen bog'lovchi oqsil (ABP) ishlab chiqarishni qo'zg'atadi. Shunday qilib, bepushtlik va boshqa muammolar asosan HPG o'qida yuzaga keladigan buzilishlar tufayli yuzaga keladi. Streptozototsin-nikotinamid kombinatsiyasini qo'llash tajriba kalamushlarida diabetni keltirib chiqaradi. Streptozotsin oshqozon osti bezidagi insulin ishlab chiqaradigan p hujayralari uchun zaharli kimyoviy birikma va nikotinamid suvda eriydigan vitamin bo'lib, p hujayralarini to'liq shikastlanishdan himoya qiladi [6].
Cistanche tubulosa - cho'l o'simlik turi, shuningdek, "Rou Cong-Rong" [7]. Bu xlorofil boʻlmagan parazit oʻsimlik boʻlib, asosan Calotropis Procera daraxtining ildizida oʻsadi va qurgʻoqchil Gansu, Sinxay, Shinjon, Moʻgʻuliston, Eron va Hindistonda keng tarqalgan. Cistanche tubulosaning umumiy nomi "cho'l sümbülü". U Xitoy an'anaviy tibbiyotida keng qabul qilingan va unga "Cho'l jenshen" nomi berilgan. U tibbiy sohada morbid leykoreya, ko'p metrorragiya, surunkali buyrak kasalliklari, ich qotishi, jinsiy quvvatsizlik va bepushtlikni davolash uchun keng qo'llaniladi. Kimyoviy tarkibiy qismlarCistanche tubulosauchuvchan bo'lmagan feniletanoid glikozidlar (PHG), iridoidlar, lignanlar, uchuvchi yog'lar, alditollar, oligosakkaridlar va polisaxaridlardan iborat [8]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, bu o'simlikdan olingan echinacoside ROS darajasini tartibga solish orqali shikastlangan fibroblastni himoya qiladi [9]. Ushbu birikma neyroproteksiya va osteoporozning oldini olish bilan bir qatorda antioksidant, vazorelaksatsiya va yallig'lanishga qarshi faollikni keltirib chiqaradi [10,11].
Ushbu tadqiqot o'rganishga qaratilgan ediCistanche tubulosa ekstraktining ta'siristreptozototsin-nikotinamid bilan qo'zg'atilgan diabetik kalamushning reproduktiv disfunktsiyasida ECHni o'z ichiga olgan.
Cistanche tubulosa
2. Materiallar va usullar
2.1.Materiallar
ECH va CTE Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Tayvan) dan sotib olindi. Kengaytirilgan glikatsiyaning yakuniy mahsulotlari (AGEs) Biovision kompaniyasidan (San-Fransisko, CA, AQSh) sotib olingan. LC-540 va TM3 hujayra liniyalari Oziq-ovqat sanoati tadqiqot va rivojlantirish institutidan (Xsinchu, Tayvan) xarid qilingan. Besh haftalik Sprague-Dawley (SD) erkak kalamushlari Milliy laboratoriya hayvonlar markazidan (Taypey, Tayvan) sotib olindi. Feed Lab Diet® PMI Nutrition International, Inc.dan (Taypey, Tayvan) sotib olingan. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) Sigma kompaniyasidan (Sent-Luis, MO, AQSh) olingan. Metanol va 4-(2-gidroksietil)-1-piperazinetansülfonik kislota (HEPES) ham Sigma'dan sotib olingan. Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhiti/F12 va tripsin-EDTA GIBCO (Nyu-York, NY, AQSh) dan olingan. 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolium bromid (MTT), dikloro-dihidro-fluoresein diasetat (DCFH-DA), dimetil sulfoksid (DMSO) va nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma'dan sotib olindi. Glyukoza fermentativ to'plamlari Yaponiyaning Tokio shahridagi Kyokutoseiyaku shahridan olingan. Insulin ELISA to'plamlari Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Shvetsiya) dan sotib olingan. T-PER to'qima oqsili ekstrakti reagenti Thermo Scientific kompaniyasidan (Chikago, IL, AQSh) sotib olindi. Anti-Inson/Sichqoncha/Kalamush yadro omili-kappa B NF-kB poliklonal antikorlari Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, AQSHdan sotib olingan. Kengaytirilgan glikatsiyaning yakuniy mahsuloti (RAGE) poliklonal antikorlari, odam/sichqon/kalamushga qarshi Starr poliklonal antikorlari va odam/sichqon/kalamushga qarshi sitoxrom P450 17A1 monoklonal antikorlari uchun anti-sichqoncha/rat retseptorlari Gene Tex’dan sotib olindi. (Irvine, CA, AQSH). Anti-Inson/Sichqoncha/Kalamush CYP11A1 poliklonal antikorlari Cell Signaling Technology (Beverli, PA, AQSh) dan olingan. Easy-Blue reaktivi Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, AQSH) dan sotib olingan. Agaroza va DNK belgisi 100 bp Promega, Corporation (Madison, WI, AQSh) dan olingan. RNeasy Lipid Tissue Mini Kit QIAGEN, Hilden, Germaniyadan sotib olingan.
2.2.Usullar
2.2.1. In Vitro tahlili
LC{0}} va TM3 hujayra madaniyati: LC{2}} hujayralar 37 OC da natriy bikarbonat (1,5 g/L) bilan to‘ldirilgan Earl balanslangan tuz eritmasi (EBSS) muhitida yetishtirildi. -glutamin (2 mM), muhim bo'lmagan aminokislotalar (0,1 mM), natriy piruvat (1,0 mM) va homila sigir zardobi (FBS) (10 foiz) 5 foiz CO2 inkubatori (CO2 inkubatori, Napco 5410, Tayvan). TM3 hujayra liniyasi glyukoza (4,5 g/L), natriy piruvat (0,5 mM), L-glutamin (2,5 mM), natriy bikarbonat (1,2 g/L) bilan to'ldirilgan Dulbecco/s modifikatsiyalangan Eagle muhitida (DMEM) yetishtirildi. 4-(2-gidroksietil)-1-piperazinetansülfonik kislota (HEPES, 15 mM) va homila buzoq zardobi (FCS, 10 foiz ) yoki ot zardobi (5 foiz ) 37 OC da 5 foizli CO2 inkubatori.
Echinacoside (ECH) ning hujayra hayotiyligini aniqlash: 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid (MTT) reaktivi hujayra hayotiyligini tahlil qilish uchun ishlatiladi. Hujayra konsentratsiyasi 96-quduq plastinkasida 2 x 105 hujayra/ml ga o'rnatildi. Keyin 20 l ECH (2 foiz muhitda suyultirilgan) qo'shildi va 5 foizli CO2 inkubatorida 37 OC da 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, 100 l MTT reaktivi qo'shildi va qorong'i sharoitda 4 soat 37 OC uchun inkubatsiya qilindi. Absorbans 570 nm da o'lchandi (ELISA o'quvchi, Dynatech MR5000, Kloten, Shveytsariya).
Restive CeH viabiHiy (foiz )=[(570 nm da namuna — 570 nm da boʻsh)]/[(570 da nazorat — 570 da Ablank)] x 100.
Nitroblue Tetrazolium (NBT) kamaytirish tahlili va 2,{1}}difenil-1-pikrilgidrazil (DPPH) tahlili: Hujayralar soni 1x 1{{10}}6 hujayra/ml ga sozlangan. . Keyin, 50 mg/ml ECH, resveratrol (RES) va ilg'or glikatsiyaning yakuniy mahsulotlari (AGEs) (nazorat) qo'shildi va 18 soat davomida 37OC da birgalikda kultivatsiya qilindi. Keyin 0,3 ml NBT eritmasi (0,1 mg/ml NBT, 5 foiz FBS va 10 ml DMEMda erigan 3 foiz dimetil sulfoksid (DMSO)) qo'shildi va 37 OC da 5 foiz CO2 da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Santrifüjdan so'ng (800 xg 3 daqiqa davomida) supernatant olib tashlandi va 200 l DMSO qo'shildi va ultratovushli osilatorda (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Tayvan) 5 daqiqa davomida chayqatildi. Absorbans 630 nm da o'lchandi. DPPH radikal tahlili uchun standart sifatida Trolox (95 foiz alkogolda) olingan. Keyin 75 l 0,5 mM DPPH eritmasi 25 l namunalar bilan aralashtirildi va xona haroratida qorong'i joyda 30 daqiqa davomida reaksiyaga kirishdi. Aralash chayqatildi va absorbans 517 nm da o'lchandi.
Reaktiv kislorod turlari (ROS) tarkibini tahlil qilish: Hujayra soni 2% FBS o'z ichiga olgan 12-quduq plastinkasida 2 x 105 hujayra/ml ga o'rnatildi. Keyin plastinkaga 50 l/ml ECH, RES va AGE qo'shildi va 37 OC da 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. 24 soatdan keyin 2Z,7Z-diklorofloressein-diatsetat (DCFH-DA) qo'shildi va 37 OC da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Santrifüjdan so'ng (400x g, 5 min) supernatant olib tashlandi va hujayralar ikki marta fosfat tamponli tuz (PBS) bilan yuvildi. Hujayralar 1 ml PBSda to'xtatilgandan so'ng va ROS darajalari oqim sitometri yordamida aniqlandi (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, AQSH).
Proteinning identifikatsiyasi va miqdoriy tahlili: Proteinlar protein ekstraktsiya reaktivi (T-PER) yordamida ekstraksiya qilingan. Hujayra zichligi 12-quduq plastinkasida 2 x 105 hujayra/ml va 50 l/ml ECH, RES va ilg'or glikatsiyaning yakuniy mahsuloti (RAGE) antagonisti retseptoriga o'rnatildi va AGE qo'shildi va 5 foizli CO2 inkubatorida 37 OC da 24 soat davomida inkubatsiya qilinadi. Shundan so'ng, 400 l T-PER qo'shildi, hujayralarni qirib tashladi va 125,{12}}xg haroratda 20 daqiqa (4 OC) davomida santrifüj qilindi. Supernatant yig'ildi va keyingi tahlil qilish uchun -80 OC (-80 OC muzlatgichi, Nuaire, Plymouth, MN, AQSh) da saqlangan. Protein miqdorini aniqlash uchun bicinchoninic kislota (BCA) to'plami ishlatilgan. Keyin, 10 l standart hujayra eritmasi va 200 RL BCA reaktivi 8-quduq plastinkalariga qo'shildi va 37 O Cin 5 foizli CO2 inkubatorida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Absorbans 562 nm da o'lchandi. Protein identifikatsiya tahlili natriy dodesil sulfat (SDS)-poliakrilamid gel (SDS-PAGE) elektroforezi orqali amalga oshirildi. Protein yuklash tamponiga protein lizatini qo'shish orqali namunalar tayyorlandi va maxsus oqsillarni aniqlash uchun western blot tahlili o'tkazildi.
2.2.2.In Vivo tahlili
Hayvon modeli dizayni: Oltmishta {0}} haftalik erkak Sprague-Dawley (SD) kalamushlari Milliy laboratoriya hayvonlar markazidan (Taypey, Tayvan) sotib olindi. Har bir kalamush alohida-alohida dezinfektsiyali zanglamaydigan po'latdan yasalgan qafaslarda 12 soat yorug'lik / 12 soat qorong'i tsikl bilan boshqariladigan harorat (23 1 daraja) va namlik (40-60 foiz) ostida joylashtirildi. Oziq-ovqat va suv ad libitum bilan ta'minlangan. Har bir kalamush birinchi haftada xonakilashtirildi va asosiy parhez sifatida 5001 laboratoriya kemiruvchi dietasi berildi. Barcha protseduralar Tayvan Milliy Okean Universiteti, Tayvanning Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi (IACUC tasdiqlash № 101026) standartiga amal qildi. Uyga aylantirilgandan so'ng, kalamushlar ikki guruhga bo'lingan: laboratoriya dietasi 5001 bilan oziqlangan nazorat guruhi (Con) va butun tajriba davomida yuqori yog'li parhez bilan oziqlangan diabetik guruh (HFD, 40 foiz). 4 hafta davomida HFD bilan oziqlanganidan so'ng, diabetik guruh kalamushlari diabetes mellitus (DM) ni qo'zg'atish uchun streptozotosin (65 mg / kg) (STZ) bilan AOK qilindi. STZ yuborilgandan keyin 15 daqiqa ichida nikotinamid (230 mg / kg tana vazni) yuborildi. In'ektsiyadan bir hafta o'tgach, diabetik mellitusning (DM) muvaffaqiyatli indüksiyasini aniqlash uchun og'iz orqali glyukoza bardoshlik testi (OGTT) o'tkazildi. Shundan so'ng hayvonlar oltita guruhga bo'lingan: nazorat (laboratoriya dietasi 5001 bilan oziqlangan); DM guruhi (DM plus 45 foiz HFD); DMR guruhi (DM plyus rosiglitazon: 0,571 mg / kg BW) ortiqcha 45 foiz HFD; DME1 guruhi (DM plus CTE: 80 mg/kg BW) plus 45 foiz HFD; DME2 guruhi (DM plus CTE: 160 mg/kg BW) plus 45 foiz HFD; va DME4 guruhi (DM plus CTE: 320 mg/kg BW) plus 45 foiz HFD. Rosiglitazon (RSG) ijobiy nazorat sifatida qabul qilindi. Tayvan oziq-ovqat va farmatsevtika idorasining (TFDA) sog'lom oziq-ovqat funktsional baholash ko'rsatmalariga muvofiq CTE ning uchta dozasi (80, 160 va 320 mg / kg) ishlatilgan. Muolajalar tajriba oxirigacha o'tkazildi. Barcha eksperimental kalamushlar 6 haftadan so'ng qurbon qilindi. Sichqonlardan olingan qon 4 daraja haroratda 15 daqiqa davomida 3000 rpm da santrifüj qilindi.
Cistanche tubulosa ning samarali tarkibiy qismlari
Supernatant quyidagi tahlil uchun tekshirildi
Umumiy glyukoza, triglitserid va xolesterinni aniqlash: Glyukozani aniqlash glyukoza fermentativ to'plamlari orqali amalga oshirildi. Keyin 20 ta qon plazmasi namunalari reagentlarga qo'shildi va 5 daqiqa davomida 37 daraja haroratda saqlanadi. Umumiy triglitseridlar va umumiy xolesterin kontsentratsiyasi triglitseridlar va xolesterin fermentativ to'plamlari yordamida aniqlandi. Keyin reaktivlarga 10 ^L qon plazmasi qo'shildi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmasi bo'yicha tajriba o'tkazildi. Absorbans 510 nm da o'lchandi.
Plazmadagi umumiy glyukoza/triglitserid/xolesterol (mg/dL)=(-ABlank)/(Astandart - ABlank) x 200.
Namuna: Qon namunalarini singdirish, ABlank: Namunasiz to'plamlarning yutilish qiymati, Standart: Standart reagentning absorbsiya qiymati, 200: 200 mg/dL konsentratsiyadagi standart reagentlar.
Insulin, leptin va gomeostatik modelni baholash - insulin qarshiligini (HOMA-IR) aniqlash: Insulin darajasi insulin Elishay to'plamlari bilan aniqlandi. Bu erda reagentlarga 25 qon plazmasi qo'shildi va absorbans 450 nm da o'lchandi. Leptinning umumiy miqdori leptin fermenti immunometrik tahlil to'plami yordamida aniqlandi. Keyin 100 ta plazma tahlil qilindi va absorbans ELISA o'quvchi yordamida 450 nm da o'lchandi. Barcha tajriba ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq o'tkazildi. HOMA-IR qiymati gomeostaz modelini baholash tenglamasidan aniqlandi=ochlik plazmasidagi insulin kontsentratsiyasi (mU/ml) x ochlik plazmasidagi glyukoza kontsentratsiyasi (mmol/L)/22,5.
Plazma lipidlarining peroksidlanishi: Bu yerda {0}}.5 ml qon plazmasi 1 ml reagent (15 foiz, trikloroatsetik kislota tarkibida 0, 25 n xlorid kislotalar (HCl) bilan aralashtiriladi. ) va 0.375 foiz , 0,25 N HCl dagi tiobarbiturik kislota w/v) va suv hammomiga (Water Bath, BUCHI461, Tsyurix, Shveytsariya) 100 daraja C haroratda 15 daqiqaga joylashtiriladi. Sovutgandan so'ng, 1 ml n-butanol qo'shildi, kuchli chayqatildi va 1500 xg da 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Supernatant yig'ildi va absorbans 532 nm [12] da o'lchandi.
Malondialdegid (MDA) kontsentratsiyasi (nM/ml)=[(532 nm da namuna - Ablank at532 nm)/ (532 nm da standart - 532 nm da Ablank)] x 5.
Plazma testosteron va luteinlashtiruvchi gormon (LH) darajasini aniqlash: testosteron Elishay to'plami qon plazmasidagi testosteron darajasini o'lchash uchun ishlatilgan. LH kontsentratsiyasini aniqlash uchun RIA to'plami ishlatilgan. Keyin 50 l plazma qo'shildi va hisob-kitoblar LH-RP-3 (standart) gormoni kontsentratsiyasiga asoslandi. Keyingi qadamlar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi.
O'simta nekroz omili (TNF)-a va interleykin-6 (IL-6) kontsentratsiyasini aniqlash: Olingan antikor qoplama buferida 250 marta suyultirilib, {{4} ga qo'shildi. }quduq plitasi (100 l/quduq) va bir kecha davomida 4 daraja C haroratda saqlang. Supernatant aspiratsiya qilindi va besh marta yuvish buferi bilan yuvildi (1 marta PBS, 0,05 foiz Tween 20). 200 ^ g tahliliy suyultiruvchi bilan inkubatsiyadan so'ng (1 soat), hujayralar yuvish tamponi bilan 5 marta yuvildi va har bir quduqqa 100 ^ L standart eritma yoki sinov namunalari qo'shildi va 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. Yuvishdan keyin 100 RL IL{18}} aniqlangan antikorlar qo'shildi va 1 shlyapa xona haroratida inkubatsiya qilindi. Supernatant aspiratsiya qilindi va 5 marta yuvildi. Keyin 480 RL ferment avidin-horseradish peroksidaza (HRP) qo'shildi va xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Supernatant aspiratsiya qilindi va yuvish tamponi bilan besh marta yuvildi. Keyin 100 RL substrat eritmasi qo'shildi va xona haroratida 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, har bir quduqqa 50 RL to'xtash eritmasi (1M fosfor kislotasi) qo'shildi va absorbans 450 nm da o'lchandi.
Cistanche Echinacoside ning foydasi: Antioksidlanish
Sperma va moyak parametrlarini tahlil qilish
Sperma namunalarini yig'ish: Sperma namunalarini yig'ish avval [13] da xabar qilingan usulga muvofiq amalga oshirildi. Spermatozoidlar supernatantdan to'plangan va keyingi tahlil uchun ishlatilgan.
Sperma soni, sperma harakatchanligi va anormal sperma: Sperma soni gemositometr va tripan ko'k eritmasi yordamida hisoblab chiqilgan. Keyin 100 RL sperma suyuqligi tripan ko'k eritmasi bilan aralashtirildi va gemositometr va mikroskop yordamida sperma soni, harakatchanligi va anormal sperma hisoblab chiqildi [14].
Nitro ko'k Tetrazolium NBT qisqarishi va Sperma va moyakning lipid peroksidlanishi: Lipid peroksidatsiyasi va NBT qisqarishi plazma tahlilining bir xil tartibiga muvofiq tahlil qilindi.
Superoksid dismutaza (SOD) va katalaza faolligini aniqlash: Superoksid dismutaza (SOD) faolligi RANSEL to'plami yordamida tahlil qilindi. Bu yerda, {0}}.01,7 ml reaksiya eritmasiga (0,05 mM ksantin, 0,025 mM 2-({) 5 ml moyak gomogenatlari qo‘shildi. {9}}yodofenil)- 3-(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolium xlorid (INT)). Aralashtirgandan so'ng, 0,25 ml ksantin oksidaza (80 U / L) qo'shildi va xona haroratida 30 s davomida xona haroratida reaksiyaga kirishdi. Absorbans 505 nm da o'lchandi. Moyak gomogenatining oqsil kontsentratsiyasi Bio-Rad DC protein tahlili to'plami bilan aniqlandi va uning o'ziga xos faolligi (U/mg protein) hisoblab chiqildi. Katalaza (CAT) faolligi ilgari xabar qilingan usul bo'yicha aniqlandi [15].
H&E (gematoksilin va eozin) bo'yash
Moyak 24 soat davomida formalinning 10 foiziga namlangan va 4 daraja S da saqlangan. To'qimalarni mikro o'lchamga kesib, slaydga biriktirilgan. Fiksatsiyadan so'ng (95% metanol plyus 5% sirka kislotasi) slaydlar 3 daqiqa davomida gematoksilinga botirildi, 5 daqiqa davomida oqadigan suv bilan yuvildi va keyin ularni bir daqiqa davomida 50%, 70% va 90% spirt bilan namlang. Shundan so'ng, slaydlar 10 soniya davomida eozin bilan bo'yalgan va 100 foizli spirtga bir daqiqa davomida so'naguncha namlangan. Nihoyat, slayd bir daqiqa davomida ksilenda namlangan. Keyinchalik, slayd havoda quritilgan va muhrlangan. Bo'yalgan naycha morfologiyani kuzatish uchun teskari fazali kontrastli mikroskopga (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Yaponiya) joylashtirildi.
Gipotalamusni tahlil qilish
Sichqoncha KISS1, G-protein bilan bog'langan retseptor (GPR) 54, sitokin signalizatsiyasini bostiruvchi 3 (SOCS-3) va sirtuin 1(SIRT1) gen ketma-ketliklari NCBI (Milliy Biotexnologiya Axborot Markazi) genlar bazasidan aniqlandi. va maxsus primer Primer 5 yordamida ishlab chiqilgan.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, AQSH.). Tajribada ishlatiladigan primerlar 1-jadvalda keltirilgan.
Gipotalamusdan ribonuklein kislotasini (RNK) ajratib olish. Miyaning gipotalamusidan RNKni olish RNeasy Lipid Tissue Mini Kit yordamida amalga oshirildi. Olingan mRNKlar teskari transkripsiya (RT) va polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) bilan miqdoriy jihatdan o'lchandi. RT tahlilidan olingan kompliment DNK keyinchalik foydalanish uchun -20 darajada saqlangan. Chiqarilgan DNK Taq polimeraza yordamida polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) tahlilidan o'tkazildi. Keyin, 5 ~ 10 ^ L PCR mahsuloti olindi va 1,5 foizli agar kolloidida elektroforez bilan tahlil qilindi. Rasm UVP BioDoc-It tasvirlash tizimida olingan. Teskari transkripsiyalangan komplementar deoksiribonuklein kislotasi (cDNK) olindi va IQ SYBR Green Supermix Kit yordamida PCR o'tkazildi. Keyinchalik, u iQTM 5 optik tizim dasturiy ta'minoti bilan tahlil qilindi. Proteinlar protein ekstraktsiya reagenti (T-PER) yordamida ekstraksiya qilingan. Keyin 400 ^L T-PER ga 20 mg moyak gomogenati qo'shildi va santrifuga qilindi (Yuqori tezlikda santrifuga, Hettich CR-12, Tuttlingen, Germaniya) 4 daraja (125,000 xg) uchun 20 min. Quyidagi usul in vitro tahlilida "oqsilni aniqlash va miqdoriy tahlil qilish" ga o'xshash edi.
2.3.Statistik tahlil
Tajriba natijalari oʻrtacha standart ogʻish (Oʻrtacha SD) sifatida ifodalangan va maʼlumotlar Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 dasturiy taʼminoti, IBM, Armonk, Nyu-York, NY, AQShdan foydalangan holda tahlil qilingan. Guruhlar orasidagi farqlar bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) bilan tahlil qilindi. Turli guruhlarning bir nechta taqqoslashlari Duncan testi orqali muhim daraja sifatida p < 0.05="" qiymatida="" tahlil="">
