Perfluorooktan kislotaning C57BL/6J sichqonlarida ichak mikrobiotasiga va mikrobial metabolitlarga ta'siriⅡ

2. Materiallar va usullar

2.1. Hayvonlar

To'rt haftalik o'ziga xos patogensiz C57BL / 6J erkak sichqonlari Jekson laboratoriyasidan (Bar Harbor, ME, AQSh) sotib olingan. Sichqonlar ichimlik suvini ad libitum iste'mol qilishdi. Jorjiya universitetidagi hayvonlarni saqlash joyi 22 ◦C va 40−70% namlikda, 12:12 soat yorug'lik: qorong'u tsiklda saqlangan. PFOA ta'sir qilish tajribasidan oldin beshta sichqon bitta qafasga joylashtirildi va sichqonlar to'rt hafta davomida haftada bir marta tasodifiy ravishda katakchalarni almashtirdilar. PFOA ta'siri sichqonlar sakkiz haftalik bo'lganida boshlangan va ta'sir qilish davri to'rt hafta davom etgan. Tajriba boshida sichqonlar PFOA ta'sir qilish guruhiga yoki nazorat guruhiga tasodifiy tarzda (har bir guruhda n=10 sichqon), bitta katakda bitta sichqoncha bilan tayinlandi. PFOA (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSH) sichqonlarga ichimlik suvi orqali yuborilgan. Ichimlik suvida PFOA ning yakuniy kontsentratsiyasi millionga 1 qismni (ppm) tashkil etdi. Doza avvalgi tadqiqotimiz [24] asosida tanlangan. Controlmice ichimlik suvini PFOA qo'shmasdan iste'mol qildi. Hayvon protokoli Jorjiya universiteti hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo‘mitasi tomonidan tasdiqlangan (protokol kodi: A2014 10-014-Y2-A1).

Qabziyatni uy sharoitida davolash usullariga BOSING

2.2. Metabolitlarni ekstraktsiya qilish

Metabolitlarni ekstraksiya qilish yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi [25]. Qisqacha aytganda, har bir sarum namunasidan 20 µL 225 µL metanol bilan ekstraksiya qilindi. Namunalar 10 soniya davomida vortekslangan. Keyin yuqoridagi namunalarga 750 µL metil tert-butil efir (MTBE) va 188 mkL suv qo‘shildi, fazalarni ajratish. Namunalar 4 ◦C da 6 daqiqa davomida chayqatildi, so'ngra 14,000×g da 2 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Ekstraksiya erituvchisi gazsizlandi va -20 ◦C da oldindan sovutildi. Yuqori qutbsiz faza (350 µL) Labconco Centrivap sovuq tuzoq konsentratori (Labconco, Kanzas, MO, AQSh) yordamida to‘liq quruq bo‘lguncha to‘plandi va bug‘landi. Jigar va najas namunalari uchun har bir namunaning 10 mg iga 225 µL metanol va 750 µLMTBE qo‘shilgan. Namunalar aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, AQSh) yordamida 30 qum uchun 1500 rpm tezlikda homogenlashtirildi, so'ngra vortekslandi va 4 ◦C da 6 daqiqa davomida chayqatildi. Keyin namunalarga 188 µL suv qo‘shildi, so‘ngra 14,000× g da 2 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Yuqori qutbsiz faza (350 mkl) to'plangan va to'liq quruq bo'lguncha bug'langan. Quritilgan namunalar 60 µL 4:1 asetonitril va suvda (v/v) ichki standartlarga muvofiq qayta suspenziya qilindi. Namunalar vortekslangan, so'ngra 5 daqiqa davomida sonikatsiya va 14,000×g da 2 daqiqa davomida santrifüj qilingan. Supernatant LC-MS tahlili uchun to'plangan.

2.3. Maqsadsiz metabolizm profilini yaratish

Maqsadsiz metabolomik profillash ilgari tasvirlanganidek amalga oshirildi [25]. TheVanquish UHPLC tizimi (Thermo Scientific, Waltham, MA, AQSH) Acquity UPLC BEH Amid ustuni (150 mm × 2,1 mm × 1,7 mkm) bilan metabolitlarni ajratish uchun ishlatilgan, bu Acquity VanGuard BEH Amide oldingi bilan birlashtirilgan. ustun (5 mm × 2,1 mm × 1,7 mkm, Waters, Milford, MA, AQSh). LC-MS darajasidagi suv (100%), 10 mM ammoniy formati va 0,125% chumoli kislotasi (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO , AQSH) mobil faza sifatida A ishlatilgan. Shu bilan birga, 95:5 asetonitril: 10 mM ammoniy format va 0,125% chumoli kislotasi bo'lgan suv (v/v) mobil faza sifatida ishlatilgan. Gradient 0-da 100% B bilan boshlangan. 2 min, 70% Bat 7,7 min, 9,5 daqiqada 40% B va 10,25 daqiqada 30% B, keyin 12,75-16,75 daqiqada 100% B. Oqim tezligi 0,4 ml / min da ushlab turildi. Spektrlar Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, AQSh) yordamida elektrosprey ionizatsiyasi (ESI) musbat rejimida to'plangan. Massa diapazoni MS/MS spektrlarini olish uchun ma'lumotlarga bog'liq rejim bilan m/z 60 dan 900 gacha o'rnatildi. Maqsadsiz metabolomika ma'lumotlari birinchi bo'lib ABF konvertori yordamida ABF fayllariga aylantirildi (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (2022 yil 6 iyulda kirish mumkin)). MSDIAL 5.1.0.1 versiyasi metabolitlarni identifikatsiyalash va miqdorini aniqlash uchun ishlatilgan [26]. Mass Spectral Feature List Optimizer (MS-FLO) maʼlumotlarni keyingi saralash uchun xususiyatlarni belgilash orqali xususiyatlar roʻyxati sifatini yaxshilash uchun ishlatilgan [27]. Saqlash vaqti m/z kutubxonalarMetabolitlarni identifikatsiyalash uchun Shimoliy Amerikadagi MassBank va Fiehn HILIC MS/MS spektrlari ma'lumotlar bazalaridan foydalanilgan.

2.4. 16S rRNK genlar ketma-ketligi

Jami DNK najas namunalaridan PowerSoil® DNK izolyatsion to'plami (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, AQSH) yordamida ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda chiqarildi. 515F va 806R primerlari 16S rRNAgenining V4 hududini kuchaytirish uchun ishlatilgan, keyin normallashtirish va shtrix kodlash orqali. DNK IlluminaMiSeq v2 to'plamida 500 tsikldan iborat bo'lgan. 16S rRNK geni ketma-ketligi ma'lumotlari Mikrobial Ekologiyaning Quantitative Insights (QIIME) II [28] yordamida tahlil qilindi. Qisqacha qilib aytganda, xom ketma-ketlik ma'lumotlari DADA2 orqali, so'ngra operativ taksonomik birlik (OTU) tanlovi orqali denoizatsiya qilindi. Sikit-learn Naive-Bayes-ga asoslangan tasniflagich tomonidan o'qitiladigan SILVA (versiya 138) ma'lumotlar bazasi sifatida ishlatilgan.

2.5. Statistik tahlil

PFOA va nazorat guruhlari o'rtasidagi farqlarni tushuntirib beradigan bakterial nasllarni aniqlash uchun chiziqli diskriminant tahlilining ta'sir hajmi (LEfSe) ishlatilgan [29]. Metabolitlarni taqqoslash uchun PFOA va nazorat guruhlari o'rtasidagi p-qiymatlarini hisoblash uchun Mann-Whitney U testi ishlatilgan. Noto'g'ri kashfiyot darajasi bir nechta taqqoslashni tuzatish uchun ishlatilgan. p-qiymati < 0.05 bo'lgan metabolitlar muhim deb topildi. Qisman eng kichik kvadratchalar diskriminant tahlili (PLS-DA) va yo'lni boyitish tahlili MetaboAnalyst 5.0 [30] yordamida amalga oshirildi. MixOmics ichak mikrobiotasini va najas metabolitlarini integral tahlil qilish uchun ishlatilgan - bu omiks ma'lumotlarini ko'p qirrali tahlil qilish uchun integrativ tizimdir [31].

Qabziyatni yo'qotish uchun tabiiy o'simlik dori-Cistanche

Cistanche - Orobanchaceae oilasiga mansub parazit oʻsimliklar turkumi. Bu o'simliklar shifobaxsh xususiyatlari bilan mashhur va asrlar davomida an'anaviy xitoy tabobatida (TCM) ishlatilgan. Cistanche turlari asosan Xitoy, Moʻgʻuliston va Markaziy Osiyoning boshqa qismlarida qurgʻoqchil va choʻl hududlarida uchraydi. Cistanche o'simliklari go'shtli, sarg'ish poyalari bilan ajralib turadi va ularning sog'liq uchun foydali foydalari uchun juda qadrlanadi. TCMda Cistanche tonik xususiyatlarga ega ekanligiga ishoniladi va odatda buyrakni oziqlantirish, hayotiylikni oshirish va jinsiy funktsiyani qo'llab-quvvatlash uchun ishlatiladi. Bundan tashqari, qarish, charchoq va umumiy farovonlik bilan bog'liq muammolarni hal qilish uchun ishlatiladi. Cistanche an'anaviy tibbiyotda uzoq vaqtdan beri qo'llanilgan bo'lsa-da, uning samaradorligi va xavfsizligi bo'yicha ilmiy tadqiqotlar davom etmoqda va cheklangan. Biroq, uning dorivor ta'siriga hissa qo'shishi mumkin bo'lgan feniletanoid glikozidlar, iridoidlar, lignanlar va polisakkaridlar kabi turli xil bioaktiv birikmalar mavjudligi ma'lum.

Wecistanche ningcistanche kukuni, cistanche tabletkalari, cistanche kapsulalari, va boshqa mahsulotlar yordamida ishlab chiqilgancho'lcistanchexom ashyo sifatida, bularning barchasi ich qotishini bartaraf etishga yaxshi ta'sir qiladi. Muayyan mexanizm quyidagicha: Cistanche an'anaviy qo'llanilishi va tarkibidagi ba'zi birikmalar asosida ich qotishidan xalos bo'lish uchun potentsial foyda keltirishi mumkin. Cistanchening konstipatsiyaga ta'siri bo'yicha ilmiy tadqiqotlar cheklangan bo'lsa-da, uning ich qotishidan xalos bo'lish potentsialiga hissa qo'shishi mumkin bo'lgan ko'plab mexanizmlar mavjud deb hisoblanadi. Laksatif ta'siri:Cistancheuzoq vaqtdan beri an'anaviy xitoy tabobatida ich qotishi uchun vosita sifatida ishlatilgan. Uning engil laksatif ta'siri bor, bu ichak harakatini rag'batlantirish va ich qotishini keltirib chiqarishi mumkin. Bu ta'sir Cistanche tarkibidagi turli xil birikmalar, masalan, feniletanoid glikozidlar va polisakkaridlar bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Ichaklarni namlash: An'anaviy foydalanishga asoslanib, Cistanche, ayniqsa, ichaklarga mo'ljallangan namlovchi xususiyatlarga ega. Ichaklarning namlanishi va yog'lanishini rag'batlantirish asboblarni yumshatishga yordam beradi va o'tishni osonlashtiradi va shu bilan ich qotishini engillashtiradi. Yallig'lanishga qarshi ta'sir: ich qotishi ba'zida ovqat hazm qilish tizimidagi yallig'lanish bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Cistanche tarkibida yallig'lanishga qarshi xususiyatlarga ega deb hisoblangan ma'lum birikmalar, jumladan, feniletanoid glikozidlar va lignanlar mavjud. Ichaklardagi yallig'lanishni kamaytirish orqali u ichak harakatining muntazamligini yaxshilashga va ich qotishidan xalos bo'lishga yordam beradi.