Hujayradan tashqari atsidoz bir uglerodli metabolizmni cheklaydi va T hujayra poyasini saqlaydi

O'simta mikro muhitida kislotali metabolik chiqindilarning to'planishi o'simtani shishiradigan limfotsitlarning (TIL) effektor funktsiyalarini inhibe qiladi. Biroq, kislotali muhit T hujayralarining metabolizmi va differentsiatsiyasiga qanday ta'sir qilishi aniq emas. Bu erda biz kislotaning uzoq muddat ta'sir qilish T hujayralarining hujayra ichidagi metabolizmini va mitoxondrial mosligini qayta dasturlashini va T hujayra poyasini saqlab qolishini ko'rsatamiz. Mexanik ravishda hujayradan tashqari atsidozning kuchayishi SLC7A5 ning regulyatsiyasi yo'li bilan metioninning so'rilishini va metabolizmini buzadi, shuning uchun T hujayralarining asosiy genlari promouterlarida H3K27me3 cho'kmasini o'zgartiradi. Ushbu o'zgarishlar "poyaga o'xshash xotira" holatini saqlab turishga yordam beradi va sichqonlarda uzoq muddatli in vivo barqarorlikni va o'simtaga qarshi samaradorligini oshiradi. Bizning topilmalarimiz nafaqat T hujayralarining poyaga o'xshash xususiyatlarini saqlab qolish uchun hujayradan tashqari atsidozning kutilmagan qobiliyatini ochibgina qolmay, balki metionin almashinuvi T hujayra poyasiga qanday ta'sir qilishini tushunishimizni ham rivojlantiradi.

cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

O'simta-antigenga xos T-hujayralarni qabul qilish orqali o'tkazish saraton kasalligini davolash sohasida katta yutuqlarni anglatadi, chunki bu ba'zi malign o'smalarning to'liq regressiyasiga olib keldi. Uning terapevtik samaradorligi ko'p jihatdan uzatilgan T hujayralarining barqarorligi va differentsiatsiyasi holatiga bog'liq1,2. Kamroq tabaqalashtirilgan xotira T hujayralari o'z-o'zini yangilash va ko'p potentsialning ildiz hujayralariga o'xshash xususiyatlari tufayli qabul qiluvchi T-hujayra o'tkazish (ACT) uchun afzal populyatsiya hisoblanadi3,4. Darhaqiqat, ACT uchun ildizga o'xshash xotira T hujayralaridan foydalanish o'simtaga qarshi yuqori javoblarga erishish uchun ko'rsatildi5. Terminal darajada differentsiatsiyalangan effektor T hujayralari bilan solishtirganda, ildizga o'xshash T hujayralari o'ziga xos belgilarga ega6. Ham inson, ham sichqoncha poyasiga o'xshash T hujayralari antigen bilan tajribali va homing bilan bog'langan molekulalarni, jumladan CD62L va CCR7 ning yuqori darajalarini ifodalash bilan tavsiflanadi (ref. 7). Transkripsiya profillari, epigenetik modifikatsiyalar va ildizga o'xshash T hujayralarini tartibga soluvchi metabolik yo'llar haqidagi tushunchamiz so'nggi yillarda keskin rivojlandi8-10. TCF1, KLF2 va LEF1 kabi bir qancha transkripsiya omillari T-hujayra ildizini qo'zg'atuvchi yoki saqlab turishda muhim rol o'ynashi haqida xabar berilgan9. Shunisi e'tiborga loyiqki, TCF1 uzoq muddatli xotira T hujayralarini yaratishga yordam beradigan asosiy transkripsiya omilidir11. Surunkali infektsiyalar paytida TCF{30}} ildizga o'xshash T hujayralarining kichik bir qismi ikkilamchi infektsiyaga qarshi T hujayralarining javobini saqlab turadi1,12. Epigenetik o'zgarishlar T hujayralari uchun xotira-hujayra xususiyatlarini egallash asosidagi transkripsiyaviy o'zgarishlarni boshlash va ushbu transkripsiya ifodasini saqlab qolish uchun vositani ta'minlaydi13. Ko'pgina tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, K4 (H3K4me3) da giston H3 trimetilatsiyasi, faollashuv bilan bog'liq modifikatsiya, xotira bilan bog'liq gen lokuslarida, jumladan, TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 va SELLda, sodda CD ning differentsiatsiyasi paytida erishiladi{47 }} T hujayralari xotira T hujayralariga, holbuki, H3 ning K27 (H3K27me3) da trimetilatsiyasi, bu repressiv modifikatsiya, bu 13-15 lokuslarda yo'qoladi. Aksincha, effektor bilan bog'langan genlar (GZMB, PRF1, IFNG va TBX21) effektor T hujayralarida bu lokuslarda repressiv pasayish va faollashtiruvchi epigenetik modifikatsiyalarning kuchayishini namoyish etadi13,16. Va nihoyat, to'plangan dalillar metabolik davrlar T-hujayra taqdiri qarorlarini belgilaydi va ularning epigenetik va funktsional holatini shakllantiradi17. Qisqa muddatli effektor T hujayralari yuqori darajada glikolitikdir va bir uglerod almashinuviga bog'liq18,19, holbuki ildizga o'xshash xotira T hujayralari yog 'kislotalarining oksidlanishi (FAO) va mitoxondriyal zahira nafas olish qobiliyati (SRC) bilan tavsiflangan aniq metabolik profillarni namoyish etadi, kardinal uzoq muddatli chidamlilik bilan bog'liq xususiyatlar20-22. Shuning uchun metabolik qayta dasturlash T-hujayralarning poyasini samarali olish va uzoq muddatli omon qolish uchun muhimdir.

Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi

Past pH, gipoksiya, glyukoza etishmovchiligi va sut kislotasi bilan boyitish bilan tavsiflangan immunosupressiv o'sma mikro muhiti (TME) T hujayralarining to'g'ri kengayishi, differentsiatsiyasi va funksionalligiga to'sqinlik qiluvchi asosiy to'siqdir23,24. Darhaqiqat, TME tomonidan qo'llaniladigan metabolik stress mitoxondrial imkoniyatlar va fitnesni buzadi, bu esa intratumoral T hujayralarining metabolik etishmovchiligi va disfunktsiyasini keltirib chiqaradi25-28. Qizig'i shundaki, ko'pchilik o'simta infiltratsiya qiluvchi limfotsitlar (TIL) disfunktsiyali, ammo kichik bir qismi ildizga o'xshash xotira yoki prekursor xususiyatlarini o'z ichiga oladi7,29. Ushbu poyaga o'xshash TIL kichik to'plami proliferativ potentsial va qat'iylikni saqlaydi va saraton kasalligiga chalingan odamlarda immun nazorat nuqtasi blokadasi (ICB) va TIL-ACTga ijobiy javob bilan bog'liq11,30. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, hujayradan tashqari atsidozning kuchayishi (↑ [H + ]) T hujayralarining sitolitik faolligini ham in vitro, ham in vivo31-33 bostiradi. Bundan tashqari, kislotali TME dendritik hujayralar (DC) va o'simta bilan bog'langan makrofaglar (TAM) kabi o'simta infiltratsiya qiluvchi miyeloid hujayralarning faolligi va differentsiatsiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatadi34-36. Biroq, ↑[H+] ning T-hujayra ildiziga va metabolik moslashuvga ta'siri deyarli noma'lumligicha qolmoqda. Bu yerda biz xabar beramizki, uzoq muddatli in vitro ↑[H+] taʼsiri terminal effektor CD8+ T hujayralari hisobiga odam va sichqon poyasiga oʻxshash CD8+ T hujayralarining farqlanishini osonlashtiradi. Biz uzoq muddatli ↑[H+] davolash T-hujayra metabolizmini o'zgartirishini va mitoxondrial nafas olish qobiliyatini saqlab qolishini aniqladik. Bundan tashqari, doimiy ↑[H+] ta'siri metioninni qabul qilish va metabolizmni buzadi, bu esa keyinchalik xotira bilan bog'liq genlarning H3K27me3 yotqizilishining pasayishiga olib keladi va shu bilan "poyaga o'xshash xotira" holatini saqlab qolishga yordam beradi. Nihoyat, ↑[H+]-sharoitda yetishtirilgan T-hujayralarining aspirant o'tkazilishi ularning kamroq charchagan fenotipiga mos ravishda in vivo jonli ravishda kuchli o'smaga qarshi faollikni ko'rsatadi. Shunday qilib, bizning tadqiqotimiz hujayradan tashqari atsidozning hujayra metabolizmi va epigenetik naqshlarni qayta qurish orqali T hujayra poyasini saqlab qolishda kutilmagan rolini ochib beradi.

Natijalar

↑[H+] taʼsiri CD8+ T hujayralarining ildizini mustahkamlaydi

Hujayradan tashqari ↑ [H + ] ning ildizga o'xshash T hujayralari differentsiatsiyasiga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini aniqlash uchun biz 10 mM sut kislotasi bo'lgan har ikkala nazorat muhitida, ↑[H+] muhitida 12 kun davomida ekilgan inson T hujayralarida asosiy ildizga o'xshash fenotiplarning oqim sitometrik tahlilini o'tkazdik. (patofiziologik vaziyatlarda laktat konsentratsiyasini taqlid qilish23,35) yoki kislotali muhit (~pH 6,6, xlorid kislota bilan) (1a-rasm). Poyaga o'xshash CD{12}} T hujayralari, jumladan, dastlabki xotira (CD45RO− CD{27+) va markaziy xotira (CD45RO+ CD27+) ↑ shartli T hujayralarida ko'proq ulushi kuzatildi. [H+ ] nazorat muhitiga qarshi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1a-rasm). Bundan tashqari, biz ↑[H+] muhitida ekilgan T hujayralarida ildizga o'xshash hujayralar (CCR7+ CD62L+) ko'proq foizga ega ekanligini aniqladik (1b-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, biz ↑[H+] ta'sirida inson va sichqonchaning CD8+ T hujayralarida oqsil darajasida ildizga o'xshash va markaziy xotira differentsiatsiyasini boshqaradigan asosiy omil bo'lgan TCF1 ifodasining sezilarli darajada ortganini payqadik (1c-rasm va Kengaytirilgan ma'lumotlar 1b-rasm). Bundan tashqari, CCR7 va TCF1 ifodasida [H+]-kontsentratsiyaga bog'liq ta'sir mavjud edi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1c-rasm). ↑[H+] shartli T hujayralarining ildizga o'xshash fenotipiga muvofiq, bu hujayralarda hujayra ichidagi interferon- (IFN-) va o'simta nekrozi omili (TNF-) ishlab chiqarish sezilarli darajada kamaydi (1d-rasm).

T hujayralarining differentsiatsiyasi holatini yaxshiroq tekshirish uchun biz RNK ketma-ketligini (RNK-seq) tahlilini o'tkazdik va uzoq muddatli in vitro ↑[H+] ta'siri aniq transkripsiya profiliga olib kelganligini aniqladik (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1d-rasm). ↑[H+] ga ta'sir qilish PRF1, GZMB va IFNG kabi effektor molekulalarni kodlovchi genlar va birgalikda inhibitor retseptorlari BTLA (1e,f-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar-shakl 1e) ifodasini sezilarli darajada pasayishiga olib keldi. Aksincha, ↑[H+]-kulturalangan T hujayralari T-hujayra ildizi bilan bog'liq bo'lgan BACH2, CCR7, LEF1 va TCF7 ning yuqori ifodasini ko'rsatdi (1e,f-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar-shakl 1e). Gen to'plamini boyitish tahlili (GSEA) ↑[H+] ta'siridan kelib chiqqan transkripsiyaviy naqsh xotira T hujayralarinikiga o'xshashligini ko'rsatdi (1g-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 1f-rasm). Bundan tashqari, miqdoriy polimeraza zanjiri reaktsiyasi (qPCR) tahlili ↑[H+] davolashdan so'ng BACH2, KLF2, LEF1 va TCF7 ning mRNK ifodasi oshishini tasdiqladi (1h-rasm). Birgalikda, bu kuzatishlar ↑[H+] davolash T-hujayralarning transkripsiya profillarini ildizni o'rnatish uchun sezilarli darajada shakllantirishini tasdiqlaydi. Shunisi e'tiborga loyiqki, biz ↑[H+] davolash T hujayralari ko'payishini inhibe qilganligini va hujayra siklining tarqalishini G1 fazasiga va S fazasidan uzoqlashtirishini aniqladik (Qo'shimcha rasm 1a-c). Keyinchalik biz TCR ​​stimulyatsiyasi paytida ↑ [H + ] davolashda T hujayra faollashuvini tekshirdik va ↑ [H + ] ta'siri T hujayra faollashuv belgilarining ifodasiga yoki hujayra hajmiga sezilarli ta'sir ko'rsatmasligini aniqladik (Qo'shimcha rasm. 2a, b). Bundan tashqari, biz T-hujayra faollashgandan so'ng ↑[H+] ta'siri hali ham T hujayralarining ildizga o'xshash holatini keltirib chiqarishi mumkinligini tasdiqladik (Qo'shimcha rasm. 2c-f). Ushbu topilmalar ↑[H+] ta'siriga uchragan T hujayralarining poyaga o'xshash holatni qabul qilishdan farqli o'laroq, shunchaki stimulyatsiyaga chidamli bo'lish ehtimolini istisno qiladi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Oldingi hisobotlar shuni ko'rsatdiki, kislotali muhit in vitro va in vivo 23,31 T hujayralarining sitolitik faolligini keskin ravishda inhibe qiladi. Shuningdek, biz qisqa muddatli ↑[H+] ta'sir qilish sitokinlar ishlab chiqarishni susaytirganini, ammo T hujayralarida ildizga o'xshash fenotipga ozgina ta'sir qilganini aniqladik (kengaytirilgan ma'lumotlar 1g-i va qo'shimcha rasm. 3a-c). Bundan tashqari, ↑ [H + ] ta'sirida sitokin ishlab chiqarishning inhibitiv ta'siri vaqtinchalik va qaytarilmasdir, chunki ↑ [H + ] ni olib tashlash T hujayralari tomonidan sitokin ishlab chiqarishni tezda tiklaydi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1h-rasm). Shunday qilib, kislotali muhit tomonidan T hujayra effektor funktsiyasini inhibe qilish juda tez sodir bo'ladi, holbuki T hujayra poyasini qayta dasturlash uzoq vaqt ↑[H+] ta'sir qilishni talab qiladi. Laktat eritmada ajralmagan shaklda (sut kislotasi) yoki ion tuzi (natriy laktat) sifatida mavjud bo'lganligi sababli, biz keyin natriy laktat T hujayralarining ildiziga o'xshash ta'sir ko'rsatadimi yoki yo'qligini aniqlashga harakat qildik va natriy laktat ham ildiz belgilariga yordam berishini aniqladik. uning samaradorligi sut kislotasi bilan ishlov berishdan (10 mM) ancha past bo'lsa-da (kengaytirilgan ma'lumotlar 1j,k va qo'shimcha shakl 4a-f). Bu topilmalar CD8+ T hujayralarining poyasimon fenotipini induktsiya qilishda ↑[H+] ning ahamiyatini va uning laktat ionlari bilan davolashdan farqini ko'rsatadi.

1-rasm|↑[H+] taʼsiri poyaga oʻxshash CD8+ T hujayralarining farqlanishini osonlashtiradi. a Ko'rsatilgan sharoitlarda inson T hujayralarini faollashtirish sxemasi: pH 7,4 (–↑[H+ ], nazorat), pH 6,6 (+↑[H+ ], xlorid kislota) yoki 10 mM sut kislotasi (+↑[H+ ]). PBMCs, periferik qonning mononuklear hujayralari. b, 12-kundagi turli sharoitlarda inson CD8+ T hujayralarida CCR7 va CD62L vakili ifoda profillari. n=3 mustaqil namunalar. c, 12-kundagi turli sharoitlarda inson CD8+ T hujayralarida TCF1 ifodasining vakillik gistogrammalari va miqdoriy aniqlash. n=3 mustaqil namunalar. MFI, o'rtacha floresan intensivligi. d, Inson T hujayralari 12 kun davomida kengaytirilgan va 4,5 soat davomida brefeldin A (BFA) o'z ichiga olgan forbol 12-miristat 13-atsetat (PMA) bilan stimulyatsiya qilingan. IFN- va TNF-ning hujayra ichidagi ekspresyon profili pH 7,4 (chapda), 10 mM sut kislotasi (o'rtada) yoki pH 6,6 (o'ngda) holatida T hujayralari uchun tasvirlangan. n=3 ta mustaqil namuna. e, f, nazorat (pH 7.4) yoki sut kislotasi (10 mM) kengaytirilgan inson T hujayralarining RNK-seq tahlili. Tanlangan genlarning issiqlik xaritasi (e) va xotira, effektor va charchagan T hujayralari bilan bog'liq genlar (f) bilan bog'langan barcha genlarning vulqon syujeti. Vulqon chizmasida x oʻqi 12-kundagi nazorat elementlariga nisbatan sut kislotasi bilan ishlov berilgan hujayralar uchun 2-oʻzgartirilgan qatlam oʻzgarishi (FC) qiymatlarini, y oʻqi esa sozlangan P qiymatlarini ifodalaydi. n=4 ta mustaqil namuna. g, Xotirani boyitish va effektor uchun sut kislotali konditsioner T hujayralari bilan nazoratni solishtiruvchi GSEA sxemasi. NES, normallashtirilgan boyitish balli. h, ko'rsatilgan sharoitlarda T hujayralarida T hujayralarining ildizi (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) bilan bog'liq transkripsiya omillarining miqdoriy mRNK ifodasi. n=3 ta mustaqil namuna. Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi Statistik tahlillar juftlashtirilmagan ikki dumli Student t-testi (b-d,h) bilan aniqlandi. Nominal P qiymatlari va noto'g'ri kashfiyot stavkalari (FDR) GSEA dasturining standart usuli (g) bilan hisoblab chiqilgan.

Ko'tarilgan [H+] metabolik qayta dasturlashni ishga tushiradi

Aniq transkripsiya dasturlari bilan bir qatorda, ildizga o'xshash T-hujayralar ham afzallik bilan noyob metabolik atributlarga ega bo'ladi, jumladan, yuqori FAO va cheklangan glikolitik metabolizm17,20,37. Uzoq muddatli in vitro ↑ [H + ] ta'siriga uchragan T hujayralarining metabolik xususiyatlarini o'rganish uchun biz Gen Ontologiyasi (GO) boyitish tahlilini o'tkazdik va metabolik yo'llar bilan bog'liq genlarni ifodalashda muhim farqlarni topdik, masalan, kichik molekula metabolizmi va glikoliz (2a-rasm). Haqiqatan ham, uzoq muddatli ↑[H+]-shartli T hujayralari uzoq zanjirli yog 'kislotalari almashinuvining kuchayishidan farqli o'laroq, glikoliz va aminokislotalar almashinuvini kamaytirdi (kengaytirilgan ma'lumotlar 2a, b). Uzoq muddatli ↑[H+] ta'siridan farqli o'laroq, qisqa muddatli ↑[H+] davolash faqat glikolizni inhibe qildi, ammo FAOga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi (Qo'shimcha rasm 5a). Miqdoriy PCR tahlili SLC2A1, SLC2A3 va LDHA glikoliz genlari ↑[H+] ta'sirlangan T hujayralarida sezilarli darajada kamayganligini tasdiqladi (kengaytirilgan ma'lumotlar 2c-rasm). Aksincha, ↑[H+] konditsionerligi FAOda ishtirok etgan tezlikni cheklovchi ferment bo'lgan karnitin palmitoiltransferaza 1 (CPT1A tomonidan kodlangan) ifodasini targ'ib qildi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 2c-rasm). ↑ [H + ] tomonidan qo'zg'atilgan metabolik o'zgarishlarni yanada tushuntirish uchun biz xolis metabolomik tahlilni o'tkazdik va ↑ [H + ] bilan o'stirilgan T hujayralarida 285 ta oraliq vositani topdik (kengaytirilgan ma'lumotlar 2d). Xususan, ↑[H+] ga ta'sir qilish oksidlanish uchun mitoxondriyalarga o'tkaziladigan yog' kislotalarining faollashtirilgan shakli bo'lgan ko'plab karnitin turlarini ko'paytirish o'rniga glikolitik oraliq mahsulotlar va ba'zi muhim aminokislotalarni sezilarli darajada kamaytirdi (kengaytirilgan ma'lumotlar 2e-g). [13C6]glyukoza yoki [13C16]palmitat yordamida metabolik oqim tahlili shuni ko'rsatdiki, ↑[H+] ta'siri [13C6]glyukozaning TCA oraliq mahsulotlarga va sut kislotasiga qo'shilishiga keskin to'sqinlik qilgan, shu bilan birga [13C16] palmitat-A ni qo'llab-quvvatlamaydi. hujayradan tashqari atsidoz glikolizni bostiradi va T hujayralarida FAO ni kuchaytiradi (2b-e-rasm). Ushbu ↑[H+]-konditsioner T hujayralari ozuqa moddalarini iste'mol qilishda cheklovlarni ko'rsatdi, buni [13C6] glyukoza iste'molining kamayishi va lipid analoglarining (BODIPY FL C16) so'rilishi tasdiqlaydi, bu elektrokimyoviy gradientning ortishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. (Kengaytirilgan ma'lumotlar 2h, i-rasm).

Cheklangan oziq moddalarni qabul qilish va hujayra metabolizmini almashtirish T hujayralarida signalizatsiya tarmoqlarining o'zgarishiga olib kelishi mumkin. Sut kislotasi bilan ishlov berilgan T hujayralarining GO boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, ta'sirlangan genlarning aksariyati birinchi navbatda PI3K-AKT, mTOR va TCR signalizatsiyasi bilan bog'liq (kengaytirilgan ma'lumotlar 3a-rasm). mTOR signalizatsiyasi T hujayralarining to'g'ri faollashishi uchun immun signallari va metabolik signallarni birlashtirishda markaziy rol o'ynaydi va mTOR signalizatsiyasining inhibisyoni hujayralarni effektor differentsiatsiyasi o'rniga xotira CD8+ T hujayralari shakllanishiga olib keladi38–40. Bizning GSEA tahlilimiz shuni ko'rsatdiki, ↑[H+]-shartli T hujayralarida AKT-mTOR va NF-kB signallarining faolligi nazorat T hujayralaridagiga nisbatan kamaygan (2f-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 3b-rasm). Bu S6 (Ser235 va Ser236 da), 4EBP1 (Thr37 va Thr46 da), AKT (Ser473 da) va NF-kB (Ser536 da) ↑[H+]-shartli T hujayralarida (Ser536 da) fosforlanishining pasayishi bilan yana tasdiqlandi (1-rasm). 2g,h va kengaytirilgan ma'lumotlar 3c-rasm). mTOR turli biologik jarayonlar, jumladan hujayra hajmi, energiya ishlab chiqarish va oqsil sintezining muhim regulyatori ekanligi ma'lum. Haqiqatan ham, biz ↑[H+]-shartli T hujayralarining hujayra o'lchami nazorat T hujayralarinikiga nisbatan kamayganligini aniqladik (kengaytirilgan ma'lumotlar 3d-rasm). Keyinchalik biz SCENITH yordamida ↑[H+]-konditsiyalangan T hujayralarida bioenergiyaga bog'liq protein sintezini baholadik, bu yangi ishlab chiqilgan usul bo'lib, protein sintezi darajasini o'qish uchun puromisin qo'shilishidan foydalanadi42. Kutilganidek, ↑[H+] taʼsiri energiyani koʻp talab qiluvchi oqsil sintezini bostirdi (2i-rasm), bu CD8+ T hujayralarida energiya almashinuvi oʻzgarganligini koʻrsatadi. Ushbu natijalar rapamitsin tomonidan mTOR faolligini inhibe qilish ildiz bilan bog'liq transkripsiya omillarining ifodasini oshirgan oldingi topilmalarga mos keladi (kengaytirilgan ma'lumotlar 3e, f-rasm). Natijalarimizni jamlagan holda, biz uzoq muddatli ↑[H+] ta'sir qilish metabolik o'zgarishlarni tartibga soladi va mTOR faolligini bostiradi, shu bilan T-hujayra ildizini olish va saqlashni osonlashtiradi degan xulosaga keldik.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

↑[H+] vositachiligida metionin almashinuvining cheklanishi epigenetik ildizni saqlaydi.

To'plangan dalillar shuni ko'rsatadiki, bir uglerod almashinuvi T-hujayra taqdiri qarorlarini belgilaydi va ularning funktsional holatini shakllantiradi43,44. Bizning RNK-seq tahlilimiz qisqa muddatli ↑[H+] davolashdan ko'ra uzoq muddatli ta'sirga uchragan T hujayralarida bir uglerodli metabolik jarayon va metionin sikli imzosi uchun zaif boyitilganligini ko'rsatdi (3a-rasm, kengaytirilgan ma'lumotlar 4a-rasm, va qo'shimcha rasm 5b). Shunga ko'ra, ↑ [H + ] ta'siri metionin sikli (MTR, AHCY va BHMT) bilan bog'liq bo'lgan fermentlarni kodlovchi genlarning ifodasini, shuningdek, folat metabolizmini (SHMT1 va SHMT2) inhibe qildi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 4b-rasm). Keyingi metabolomik tahlillar shuni ko'rsatdiki, sut kislotasida o'stirilgan T hujayralarida metionin siklida ishtirok etadigan hujayra ichidagi metabolitlar, jumladan metionin, S-adenosilmetionin (SAM) va S-adenozilhomosistein (SAH) sezilarli darajada kamaygan, ammo serin va homosistein (kengaytirilgan) darajasi oshgan. Ma'lumotlar 4c-rasm). [13C5] metioninni kuzatish metionin, 13C bilan belgilangan hujayra ichidagi SAM (m+5), SAH (m+4) va 5'-metil-tioadenozin (MTA, m) ning o'zlashtirilishi va hujayra ichidagi ko'pligini tasdiqladi. +1) ↑[H+] ta'sirlangan T hujayralarida sezilarli darajada kamaydi (3b-d-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 4d-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, ekzogen metionin qo'shimchasi [13C5] metioninning hamda ↑[H+] ta'sirlangan T hujayralarida tegishli oraliq moddalarning so'rilishini va hujayra ichidagi ko'pligini tikladi (3c,d-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar-rasm 4d), bu ekzogen metionin ekanligini ko'rsatadi. Qo'shimchalar metioninni qabul qilish va ↑[H+] ta'sirlangan T hujayralarining metabolizmini tiklashi mumkin. Keyinchalik biz metionin cheklanishi T hujayralarining ildizlarini qo'zg'atishi mumkinligini tekshirdik. Biz metionin etishmovchiligi haqiqatan ham TCF1+ CD8+ T hujayralari populyatsiyasining induksiyasiga yordam berishini aniqladik, lekin CD62L va CD44 ifodasiga ta'sir qilmadi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 4e, f-rasm). ↑[H+]-induktsiyali T-hujayra ildizida metionin metabolizmining rolini qo'shimcha o'rganish uchun biz T hujayralarini metionin, SAM yoki SAH bilan to'ldirilgan ↑[H+] muhiti bilan o'stirdik. Hujayradan tashqari atsidoz bilan qo'zg'atilgan T hujayra poyasining fenotipi haqiqatan ham SAH emas, balki metionin yoki SAM bilan to'ldirish orqali qisman taqiqlangan (3e-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 4g-i). Hujayra ichidagi metionin DNK va giston metilatsiyasi reaktsiyalari uchun muhim metil guruhi donori bo'lgan SAMga aylanadi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 5a-rasm). Shunday qilib, biz histon metilatsiyasi naqshlarini tavsifladik va ko'tarilgan [H + ] T hujayralarida umumiy H3K27me3 darajasini sezilarli darajada kamaytirdi, ammo boshqa histon metilasyon belgilarining ifodasiga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi (3f-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 5b-rasm). Kutilganidek, ↑[H+] ta'siri ostida T hujayralariga metionin qo'shilishi H3K27me3 ifodasining umumiy darajasini tikladi (3f-rasm). Uzoq muddatli↑[H+] davolashdan o'tgan T hujayralarida kuzatilgan H3K27me3 darajasining o'ziga xos pasayishi bizni ↑[H+] ta'siri H3K27me3 ning cho'kishi uchun xos bo'lgan metiltransferaza selektiv ravishda tartibga soladi, degan faraz qilishga undadi. Darhaqiqat, biz H3K27me3 uchun asosiy metiltransferaza bo'lgan EZH2 ning mRNK va protein darajasida ↑ [H + ] ta'sirlangan T hujayralarida sezilarli darajada kamayganini kuzatdik (Kengaytirilgan ma'lumotlar 5c, d). Bundan tashqari, EZH2 faolligining yuqori o'ziga xos inhibitori GSK126 tomonidan inhibe qilinishi TCF1 ifodasini, shuningdek, CCR7+ CD62L+ CD8+ T hujayralarining foizini oshirdi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 5e,f-rasm). , bu EZH2 selektiv epigenetik modifikatsiyalar orqali xotira-T-hujayra potentsialini tartibga solishi mumkinligi haqidagi oldingi hisobotga muvofiq edi45. ↑[H+] tomonidan qo'zg'atilgan T-hujayra ildizining epigenetik naqshlarida genom bo'ylab o'zgarishlarni aniqlash uchun biz CUT & Tag-seq tahlilini o'tkazdik va promotor, gen tanasi va gen tanasi bo'ylab turli davolash qilingan guruhlar orasida H3K4me3 va H3K27me3 cho'kmasining mutanosibligida minimal o'zgarishlarni aniqladik. intergenik hududlar (Kengaytirilgan ma'lumotlar rasm 5g). Xususan, epigenomik profilni aniqlash uzoq muddatli ↑[H+] bilan davolash qilingan T hujayralarida xotira bilan bog'liq gen lokuslarida (masalan, TCF7, CCR7, ID3, LEF1 va KLF2) H3K27me3 repressiv giston belgisi darajasining pasayishini aniqladi (3g-rasm). . Muhimi, ↑[H+] taʼsiri ostida metionin qoʻshilishi yuqoridagi lokuslarda H3K27me3 darajasini, shuningdek, ularning gen ifodasini qisman tikladi, bu xotira bilan bogʻliq boʻlgan genlarning epigenetik modulyatsiyasida metioninning muhim rol oʻynashini koʻrsatdi (3g-rasm va). Kengaytirilgan ma'lumotlar 5h-rasm). Oldingi tadqiqotga mos ravishda14, PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 va NR4A2 kabi effektor genlar faollashtiruvchi giston-metillanish naqshini (H3K4me3hi va H3K27me3lo) ijobiy tarzda oldi (3g-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, H3K4me3 ning ushbu effektor genlarning promotor hududlaridagi joylashuvi ↑[H+] ta'sirida yetishtirilgan T hujayralarida buzilgan va metionin qo'shilishi bilan tiklangan (3g-rasm). Umuman olganda, bu topilmalar metionin siklining ↑[H+] vositachiligida buzilishi T hujayra poyasining epigenetik saqlanishiga yordam berishini ko'rsatadi.

SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 va SLC43A2 kabi bir nechta metionin tashuvchisi (SLC) metioninni tashishda vositachilik qilishi mumkin46. ↑[H+] taʼsirining T hujayralarida metioninning soʻrilishini va metabolizmini qanday susaytirishini oʻrganish uchun biz turli xil SLClarning ekspresyon modellarini tahlil qildik va ↑[H+] SLC7A5 va SLC38A2 ifodasini keskin pasaytirganini, biroq SLC38A1 ifodasiga kam taʼsir qilganini aniqladik. Ma'lumotlar 6a,b-rasm). Bundan tashqari, ↑[H+] ta'siri SLC7A5 (ref. 47) kabi metionin tashuvchilarning ifodasini tartibga solish uchun xabar qilingan MYC (Kengaytirilgan ma'lumotlar-rasm 6c,d) ifodasi va faolligini pasaytirdi. Bundan tashqari, biz SLC7A5 promouterida va kamroq darajada SLC38A2 promouterida MYC ning yuqori bandligini ko'rsatdik (Kengaytirilgan ma'lumotlar 6e-rasm). Muhimi, uzoq muddatli ↑[H+] bilan ishlov berilgan T hujayralarida ushbu lokuslarga MYC ulanishining sezilarli darajada kamayishi kuzatildi (kengaytirilgan ma'lumotlar 6e-rasm). Ushbu kuzatishlarga muvofiq, MYC ning haddan tashqari ifodalanishi ↑ [H + ] ta'sirlangan T hujayralarida SLC7A5 va SLC38A2 ifodasini sezilarli darajada tikladi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 6f-rasm). Ushbu natijalar ↑[H+] ta'sirida metionin tashuvchilarining ifodasini kamaytirishda MYC ning muhim rolini qo'llab-quvvatlaydi. Qizig'i shundaki, biz metionin qo'shilishi ↑[H+] ta'sirlangan T hujayralarida MYC va SLC7A5 ifodasini tiklashi mumkinligini aniqladik (Kengaytirilgan ma'lumotlar-rasm 6g), bu metionin qo'shimchasi T hujayralarining metioninni qabul qilish qobiliyatini tiklashi mumkinligini ko'rsatadi. metionin tashuvchisi SLC7A5 ifodasini MYC ga bog'liq tarzda tartibga solish. Oldingi tadqiqot shuni ko'rsatdiki, SLC7A5 faollashtirilgan T hujayralarida eng ko'p metionin tashuvchisi47. Bu, bizning oldingi topilmalarimiz bilan birgalikda, SLC7A5 ↑[H+] tomonidan qo'zg'atilgan metioninni cheklashda va poyaga o'xshash holatni saqlashda muhim rol o'ynashi mumkinligini ko'rsatadi. Haqiqatan ham, biz SLC7A5 ning haddan tashqari ifodalanishi ↑ [H + ] tomonidan qo'zg'atilgan ildizga o'xshash fenotipni qisman buzganligini aniqladik (Kengaytirilgan ma'lumotlar 6h, i-rasm), SLC7A5 metionin tashuvchisi ↑ [H + ] - induktsiyalangan T xujayrasi xotirasida ishtirok etishini qo'shimcha ravishda qo'llab-quvvatladi. - fenotipga o'xshash. Turli xil o'simta infiltratsiya qiluvchi CD{69}} T hujayralari subpopulyatsiyalarini tahlil qilib, biz MYC va SLC7A5 ning xotiraga o'xshash CD8+ TILlarida (kengaytirilgan ma'lumotlar-rasm 7a,b) kamayganligini aniqladik. in vitro topilmalarimiz bilan. Shunday qilib, ushbu topilmalar MYC-SLC7A5-metionin o'qi TILlarning xotiraga o'xshash holatini saqlab qolishga yordam berishi mumkinligini ko'rsatadi.

2-rasm|↑[H+] taʼsiri metabolik qayta dasturlashni ishga tushiradi va mTOR signalini bostiradi. a, RNK-seq ma'lumotlaridan foydalangan holda GO tahlili, nazorat va sut kislotasi bilan shartlangan inson T hujayralarida vakili differentsial ifodalangan metabolik genlarni ko'rsatadi (to'g'rilangan P qiymati <4,23 × 10-2). b, [13C6]glyukoza yoki [13C16]palmitat belgilarining sxemasi. c, T xujayralarida ko'rsatilgan m{13}} laktatning umumiy laktatdan yoki m{14}} piruvatning umumiy piruvatdan ulushi. n=3 ta mustaqil namuna. d, [13C6] glyukozadan olingan sitrat (m+2), malat (m+2) va suksinat (m+2) kabi TCA oraliq mahsulotlar uchun izotopomer ulushi. n=3 mustaqil namuna. e, [13C16] palmitatdan olingan T-hujayralardagi umumiy atsetil-KoAdan koʻrsatilgan m+2 atsetil-KoA yoki m{25}} sitrat izotopining umumiy sitratdan ulushi. n=4 mustaqil namuna. f, mTORC1 signalizatsiyasi bilan bog'liq genlar to'plamining statistik tahlili bilan GSEA sut kislotasi bilan shartlangan (chapda) yoki pH 6.6-shartli (o'ngda) inson T hujayralari. g,h, Ko'rsatilgan sharoitlarda inson CD8+ T hujayralarida Ser235 va Ser236 (g) da fosforlangan S6 va Thr37 va Thr46 (h) da fosforlangan 4EBP1 uchun oqim sitometrik tahlili va miqdorini aniqlash. n=3 mustaqil namuna. I, Flow sitometrik tahlili va nazorat yoki sut kislotasi yoki pH 6.6-shartli inson T hujayralarida energiyani ko'p talab qiluvchi oqsil sintezining miqdorini aniqlash. n=3 mustaqil namuna. Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etilgan Statistik tahlillar Benjamini-Xochberg ko'p taqqoslash testi (a) yoki juftlashtirilmagan ikki dumli Student t-testi (c-e,g-i) bilan bir tomonlama Fisherning aniq testi bilan aniqlangan. Nominal P qiymatlari va FDRlar GSEA dasturida standart usul bilan hisoblab chiqilgan (f).

3-rasm|Ko'tarilgan [H+] epigenetik ildizni saqlab qolish uchun T hujayralari metionin almashinuvini o'zgartiradi. Bir uglerod almashinuvi va sistein va metionin almashinuvi bilan bog'liq bo'lgan genlar to'plamining GSEA syujeti sut kislotasi bilan konditsiyalangan inson T hujayralariga nisbatan nazoratda. b, [13C5] metionin belgilarining sxemasi. c, [13C5]metionindan olingan hujayra ichidagi SAM (m+5), SAH (m+4) va MTA (m+1) ​​ulushi, ularning tegishli umumiy hovuzlaridan Nazorat sharoitida yoki 10 mM sut kislotasi yoki metionin (10 mM + Met) bilan to'ldirilgan 10 mM sut kislotasi bilan ekilgan T hujayralari. n=3 ta mustaqil namuna. d, T hujayralarida [12C5] metionin va [13C5] metioninning nisbiy ko'pligi. e, Turli sharoitlarda yetishtirilgan inson CD8+ T hujayralarida TCF1 ning reprezentativ gistogrammasi va miqdorini aniqlash. n=3 ta mustaqil namuna. f, metionin qo'shimchasining inson T hujayralarida giston metilatsiyasiga ta'siri. H3K4me3, K4 da trimetillangan giston H3; H3K79me2, H3 K79 da dimetillangan; H3K27me3, H3 K27 da trimetillangan; H3K9me2, H3 K9 da dimetillangan. n=3 mustaqil namuna. g, H3K27me3 (qizil, chiziq ustida) yoki H3K4me3 (ko'k, chiziq ostida) cho'qqilarini ko'rsatadigan vakil gen lokuslarining genom trek ko'rinishi. CUT & Tag-seq ma'lumotlari ikkita mustaqil namunadan olingan. Ma'lumotlar o'rtacha ± sem nominal P qiymatlari sifatida taqdim etilgan va FDR'lar GSEA dasturining standart usuli bilan hisoblangan (a). Statistik tahlillar Tukeyning ko'p taqqoslash testi (c-f) bilan ikki tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) yordamida amalga oshirildi.

↑[H+] ga ta'sir qilish mitoxondrial moslikni saqlaydi 

↑[H+] shartli T hujayralarida energiya talab qiluvchi oqsil sintezining kamayganligini hisobga olib, biz ↑[H+] ga uzoq muddatli ta'sir qilish hujayraning energiya almashinuvida sezilarli o'zgarishlarga olib kelishi mumkinligini taxmin qildik. Glyukozaga bog'liqlik, mitoxondriyal bog'liqlik, glikolitik sig'im va FAO va aminokislotalarning oksidlanish qobiliyatini hisoblash uchun ikkala nazorat va ↑[H+] shartli T hujayralari SCENITH42 yordamida tahlil qilindi (4a-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 8a-rasm). Metabolomikalar va izotoplarni kuzatish natijalariga ko'ra, biz ↑[H+] ta'sirlangan T hujayralarida mitoxondriyal metabolizmning kuchayganini kuzatdik, glikoliz tezligi esa kamaydi (4b,c-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar-shakl 8b), bu hujayra ichidagi qayta dasturlashdan dalolat beradi. ↑[H+]-shartli T hujayralarida energiya almashinuvi. Dengiz oti tahlili shuni ko'rsatdiki, ↑[H+] bilan shartlangan T hujayralari yuqori kislorod iste'moli tezligini (OCR), shuningdek, uzoq muddatli xotira CD{20}} T hujayralarining asosiy xususiyati SRC va hujayradan tashqari kislotalanish tezligini () ko'rsatdi. ECAR) (4d-h-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 8c-f-rasm). Mitoxondriyal massa/füzyonning ortishi va mitoxondrial membrana potentsialining pasayishi (Dsm) T-hujayra poyasining saqlanishi uchun muhim bo'lganligi sababli, biz ↑[H+]-konditsiyalangan T hujayralarining mitoxondriyalarining miqdori va sifatini qo'shimcha o'rganib chiqdik va ↑[H+ ekanligini aniqladik. ] davolash inson va sichqoncha T hujayralarida mitoxondriyal massasini kuchaytirdi (Fig. 4i,j va Kengaytirilgan ma'lumotlar Fig. 8g,h), ular ham past Dψm (Fig. 4k va kengaytirilgan ma'lumotlar Fig. 8i) saqlaydi. Elektron mikroskop (EM) yordamida ultrastruktura tahlili ↑[H+] taʼsirlangan T hujayralarida sitoplazmada tarqalgan yirik, zich toʻplangan mitoxondriyalar borligini va nazorat T hujayralari bilan solishtirganda koʻp zich, tor kristalarga ega ekanligini aniqladi, bu esa eʼlon qilingan natijalarga mos keladi. xotira T hujayralarida mitoxondriya morfologiyasiga (4l,m-rasm). Ushbu topilmaga muvofiq, biz ↑[H+]-shartli T hujayralarida mitoxondrial sintezning bir nechta muhim regulyatorlarining gen ekspressiyasining kuchayishini kuzatdik (Kengaytirilgan ma'lumotlar-rasm 8j), bu xotira T hujayralarini yaratish uchun zarur rol o'ynashi taklif qilingan50. Umuman olganda, bu topilmalar ↑ [H + ] ta'siri mitoxondrial massani / termoyadroviyni va ildizga o'xshash T hujayralari shakllanishini rag'batlantirish uchun mosligini oshiradi.

cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi

↑[H+] taʼsiri CD8+ T hujayralarining oʻsimtaga qarshi faolligini oshiradi 

Poyaga o'xshash T hujayralari qabul qiluvchi immunoterapiyada singdirish, kengayish va o'simtaga qarshi samaradorlikni qo'llab-quvvatlaydi51. Uzoq muddatli in vitro ↑[H+]-saqlangan CD8+ T-hujayralari uzatilganda yaxshilangan kengayish yoki qat'iylikni namoyon etishini tekshirish uchun CD45.1+ OT-I T hujayralari nazoratda kengaytirilgan yoki ↑[ H+ ]-konditsioner muhit CD45 ga qabul qilingan holda o‘tkazildi.2+C57BL/6N sichqonchalari implantatsiya qilingan o‘simtasiz (5a-rasm). ↑[H+] konditsionerlashda apoptotik hujayralar soni biroz ko'paygan bo'lsa-da (Kengaytirilgan ma'lumotlar-rasm 9a), ↑[H+] sharoitida kengaytirilgan T hujayralari bilan o'tkazilgan sichqonlarning periferik qonida T hujayralarining sezilarli darajada yuqori foizi bor edi. nazorat muhitida kengaytirilganlarga nisbatan (boshqaruv T hujayralari) (5b-rasm). Xuddi shunday, taloq va limfa tugunlarida (LN) T hujayralarining sezilarli darajada yuqori chastotalari aniqlandi (kengaytirilgan ma'lumotlar 9b, c). Bundan tashqari, biz B{22}}OVA o'simtasi bo'lgan sichqonlarda o'smalar, taloq va drenajlovchi limfa tugunlarida ↑[H+] kengaygan hujayralar qabul qilingan sichqonlardagiga nisbatan sezilarli darajada ko'payganini aniqladik. ↑[H+] da saqlanadigan CD8+ T hujayralarining mustahkamligi yaxshilanganligini ko‘rsatuvchi nazorat hujayralari qabul qilindi (5c-e-rasm va kengaytirilgan ma’lumotlar 9d-rasm). Ushbu topilmalarga muvofiq, ↑ [H + ] shartli T hujayralarini olgan sichqonlarning taloq va LNlarida xotira T hujayralarining foizi sezilarli darajada oshdi (5f-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 9e-rasm). Ta'kidlash joizki, ↑[H+]-kengaytirilgan OT-I T hujayralari nazorat T hujayralari bilan solishtirganda o'simta o'sishi sezilarli darajada kechikdi (5g-rasm). Keyinchalik biz ↑[H+]-kengaytirilgan CD19 kimerik-antigen-retseptorlari bilan modifikatsiyalangan (CAR) T hujayralarining terapevtik samaradorligini o'rganib chiqdik, unda CD19-K562 o'simta hujayralari teri ostiga teri ostiga yuborilgan. NCG sichqonlari (5h-rasm). Biz ↑[H+] taʼsiri ham CAR-T hujayralarining ildizini ragʻbatlantirganini, lekin apoptozga taʼsir qilmasligini aniqladik (Kengaytirilgan maʼlumotlar-rasm 9f), buni CCR7+ CD62L+ novdasiga oʻxshash CAR-T ning sezilarli darajada oshgani tasdiqlaydi. hujayralar, shuningdek, TCF1 ning yuqori tartibga solingan ifodasi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 9g, h). Bundan tashqari, ↑[H+]-shartli T hujayralari bilan infuziyadan so'ng NCG sichqonlarining o'simta joylarida va taloqlarida CAR-T hujayralari to'planishining yuqori darajasi kuzatildi (5i-rasm). Kutilganidek, ↑[H+] da kengaytirilgan CAR-T hujayralari bilan qabul qilingan NCG sichqonlari kengaytirilgan CAR-T hujayralarini qabul qilganlarga nisbatan implantatsiya qilingan CD{63}} o'simtaning ko'proq tozalanishini ko'rsatdi. nazorat muhitida (5j-rasm). Birgalikda olingan ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, ↑[H+] davolash T hujayralarining in vivo barqarorligi va o'simtaga qarshi faolligiga yordam beradi.

↑[H+ ] ga ta'sir qilish T-hujayralarining charchashini cheklaydi

Doimiy ↑[H+] taʼsirining T hujayralarining charchashiga in vitro taʼsirini qoʻshimcha oʻrganish uchun biz ↑[H+] bilan astarlangan inson T hujayralarida LAG-3 va TIM-3 ifodasini oʻlchadik, ular bir necha bosqichdan oʻtgan. anti-CD3 antikorlari bilan qo'shimcha stimulyatsiya qilindi va nazorat muhitida konditsioner qilindi (6a-rasm). Biz LAG-3 va TIM-3 ifodalarining ↑[H+] taʼsirlangan T hujayralarida (6b-rasm va kengaytirilgan maʼlumotlar-rasm 10a) kamayganligini aniqladik, bu ↑[H+] bilan davolash natijasida pasayish kuzatilishini koʻrsatdi. T hujayralarining charchashi. Bundan tashqari, biz metioninning yuqori kontsentratsiyasi PD-1, LAG-3 va TIM-3 kabi inhibitiv belgilarning ifodalanishining oshishiga olib kelishini aniqladik. metionin kontsentratsiyasi bu belgilarning ifodasini biroz pasaytirdi (Qo'shimcha rasm 6a-c). Shunisi e'tiborga loyiqki, in vitro ↑[H+] uzoq muddatli ta'sirida o'smalar ichidagi OT-I T hujayralari va CD{24}}CAR T hujayralariga infiltratsiya qiluvchi TIM-3+ LAG-3+ chastotasi katta darajada edi. qabul qilingan transferdan keyin kamayadi (Fig. 6c-e va Kengaytirilgan ma'lumotlar Fig. 10b), bu ularning in vitro pastki charchashiga va in vivo jonli ravishda yaxshilangan o'simtani nazorat qilish qobiliyatiga mos keladi. Bundan tashqari, biz uzoq muddatli ↑[H+] shartli T hujayralari in vitro va in vivo jonli ravishda TOX ifodasini sezilarli darajada kamaytirganini ko'rsatdik (6f,g-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 10c,d-rasm). Yuqorida aytib o'tilganidek, TCF1 va TIM{34}} ifodasi52,53 tomonidan aniqlanganidek, charchagan T-hujayralar, odatda, tug'ma tugaydigan yoki terminalda charchagan kichik to'plamga bo'linishi mumkin. Shunday qilib, biz CD45.1+ TILlarda TCF1 va TIM-3 ifoda naqshini o‘lchadik va TCF1− TIM-3+ terminalda charchagan T hujayralarining chastotasi sezilarli darajada kamayganini payqadik. TCF1+ TIM-3- ↑[H+] konditsionerligi ostida progenitator T hujayralarining sezilarli darajada ortdi (6h-rasm). Bundan tashqari, biz LY108+ TIM-3 - progenitor T hujayralari populyatsiyasi (kengaytirilgan ma'lumotlar-rasm 10e), shuningdek, IFN- + TNF- + T chastotasi ortganini ko'rsatdik. hujayralar (Kengaytirilgan ma'lumotlar 10f-rasm), uzoq muddatli in vitro ↑[H+]-kengaytirilgan asrab olingan T xujayralari charchoqni cheklaydi va ildizni saqlaydi.

Munozara

O'simtaga xos ACT - refrakter o'smalari bo'lgan shaxslarni davolash uchun istiqbolli yondashuv, ammo terapevtik ta'sir asosan TMEdagi T hujayralari disfunktsiyasi bilan cheklangan. So'nggi paytlarda T hujayralarining ildizini saqlab qolish va terapevtik natijalarni yaxshilash uchun in vitro madaniyatida vaqtinchalik glyukoza ochligi, glutamin cheklanishi yoki yuqori hujayradan tashqari kaliy (↑[K+]) bilan T hujayralarini oldindan konditsioner qilishga katta e'tibor qaratildi54-56. Ushbu tadqiqotda biz CD8+ T-hujayralarini yuqori darajadagi [H+] ostida yetishtirish, hayratlanarli darajada T-hujayra poyasini olishga yordam berishini va T-hujayralarining charchashiga chidamliligini oshirib, oʻsimtaga qarshi taʼsirini sezilarli darajada yaxshilashini koʻrsatdik. qabul qilingan T hujayralari.

TME ichida sut kislotasining haddan tashqari to'planishi uzoq vaqtdan beri o'sma immunitetidan qochishning asosiy omili sifatida qaralib kelgan. Masalan, sut kislotasi va kislotali TME CD{0}} T hujayralarining sitolitik faolligini va sitokin ishlab chiqarishni bostirishi isbotlangan31-33,57. Ushbu topilmalarga muvofiq, biz ↑[H+] ga qisqa muddatli in vitro ta'sir qilish effektor sitokin ishlab chiqarishni chuqur inhibe qilish uchun etarli ekanligini, ammo TCF1 ifodasi yoki ildiz bilan bog'liq metabolik xususiyatlarga ta'sir qilmasligini aniqladik. Shunga qaramay, uzoq muddatli ↑ [H + ] davolash kutilmagan tarzda TCF1 ifodasini oshirdi va metabolik qayta dasturlash va epigenetik qayta qurish orqali ildizga o'xshash T hujayralarining fenotipini saqlab qoldi. To'liq faollashgandan so'ng T hujayralarining ↑[H+] ga ta'sir qilishi ham poyaga o'xshash fenotipni keltirib chiqarishi mumkin, shuning uchun past pHga duchor bo'lgan T hujayralari poyaga o'xshash holatni qabul qilish o'rniga, shunchaki stimulyatsiyaga chidamli bo'lib qolish ehtimolini istisno qiladi. Sog'lom odamlarning qonidagi fiziologik sut kislotasi kontsentratsiyasi 1,5-3,0 mM atrofida, ammo TME35,58 da u 10 mM dan 40 mM gacha ko'tarilishi mumkin. Doimiy anti-CD3/CD28 stimulyatsiya modelidan foydalanib, Feng va boshqalar. yaqinda natriy laktatning yuqori konsentratsiyasi histon deasetilaz faolligini inhibe qilish orqali TCF7 super-enhancer lokusudagi H3K27ac darajasini oshiradi, bu esa TCF1 ekspressiyasining oshishiga va CD{31}} T hujayra ildizining rivojlanishiga olib keladi59. Bundan farqli o'laroq, biz sut kislotasining nisbatan past konsentratsiyasi (10 mM), ammo natriy laktat emas, balki uzoq muddatli ta'sir qilish metionin metabolizmini cheklash va H3K27me3 ni tartibga solish orqali T hujayralarining ildizga o'xshash imzosini osongina qo'zg'atishi mumkinligini aniqladik. natriy laktat va sut kislotasi tomonidan aniq epigenetik tartibga solishni aniq qo'llab-quvvatlaydigan novda bilan bog'liq gen lokuslarida cho'kma. Biroq, past kislotali (pH 6,9) davolash doimiy anti-CD3/CD28 stimulyatsiyasi ostida TCF1 ekspressiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatmaydi, bu CD{48}} T hujayralarining ildizga o'xshash imzolari ↑[H+] tomonidan qo'zg'atilganligini ko'rsatadi. ta'sir qilish TCR stimulyatsiyasi bilan bekor qilinishi mumkin. TCR faollashuvi metioninni qabul qilishni kuchaytirishi va T hujayralari faollashishiga yordam berish uchun metionin metabolizmini qayta dasturlashi mumkin19,60. Biz taxmin qildikki, TCR stimulyatsiyasi ↑[H+] bilan davolash qilingan T hujayralarida metioninning so'rilishini kuchaytirishi mumkin, bu metionin metabolizmini cheklaydi, shuning uchun ↑[H+] tomonidan qo'zg'atilgan epigenetik ildizni bezovta qiladi. Bundan tashqari, T-hujayralar laktat ionlaridan hujayradan tashqari uglerod manbai sifatida foydalanishi mumkin, bu doimiy TCR stimulyatsiyasi mavjud bo'lganda yoki yo'q bo'lganda poyani olishni osonlashtiradi. Metabolik faollik T hujayralarining differentsiatsiyasi bilan chambarchas bog'liq va ba'zi metabolik aralashuvlar uzoq muddatli xotira-T hujayralari shakllanishiga katta yordam berishi mumkin21,37,61,62. Shunga ko'ra, bizning metabolomika va izotop kuzatuvi tahlillari uzoq muddatli ↑[H+] ta'siri glyukozaning kamayishi va glikolizning pasayishi va TCA aylanishi metabolizmi kabi ajoyib metabolik qayta dasturlashga olib keladi degan fikrni qo'llab-quvvatlaydi. Bir qator tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, CD{65}} T xotira hujayralari energiya ehtiyojlarini qondirish uchun FAOdan foydalanadi, garchi bu xotira nasl-nasabini farqlash uchun moslashuv bo'lishi mumkin va Cpt1 ning haddan tashqari ifodalanishi T hujayralarining uzoq umr ko'rishiga yordam beradi21,22,63,64. Biroq, Cpt1a ning T hujayralariga xos genetik o'chirilishi modelida Raud va boshqalar. Yaqinda LC-FAO asosan T-hujayralarini faollashtirish va CD8+ T xotira hujayralari65 shakllanishi uchun zarur ekanligini ko'rsatdi. Bunday nomuvofiqlikni tushuntirish qiyin bo'lib qolmoqda. Tadqiqotimiz kontekstida biz hujayradan tashqari atsidoz tufayli yog 'kislotalari almashinuvini qayta dasturlash, ehtimol, xotira T hujayralarining paydo bo'lishi bilan bog'liq deb taxmin qilamiz, garchi bu gipoteza asosidagi aniq mexanizm qo'shimcha tekshirishni talab qiladi. Bundan tashqari, biz ↑[H+] ta'siri glikolitik inhibisyon tufayli yuzaga kelishi mumkin bo'lgan mTOR faolligini inhibe qilganligini aniqladik. Shunisi e'tiborga loyiqki, mTOR signalizatsiyasini bostirish ham metabolik o'zgarishlarni glikolizdan mitoxondrial nafas olishga yordam berishi mumkin. Haqiqatan ham, bu ↑[H+]-kengaytirilgan T-hujayralari mitoxondrial moslikni yaxshilagan, bu SRC va mitoxondriyal massaning sezilarli darajada oshishi va Dsm ning pasayishi bilan tasdiqlanadi. Ildizga o'xshash T hujayralarida boyitilgan va in vivo jonli ravishda uzoq umr ko'rish va yuqori o'simtaga qarshi faollik bilan bog'liq bo'lgan bu mitoxondrial imzolar mitoxondriyal sintez va bo'linish dinamikasi bilan chambarchas modulyatsiya qilinadi22,48,50. Mitoxondrial ichki membrana termoyadroviy oqsili OPA1 xotira-T-hujayrasini yaratishda ajralmas rol o'ynaydi50. Shunga ko'ra, biz hujayradan tashqari atsidoz ham T hujayralarida OPA1 ekspressiyasini kuchaytirganini aniqladik, natijada T hujayralarida termoyadroviy morfologik muvozanat paydo bo'ldi. Ko'pgina hujayra metabolitlari epigenetik modifikatsiyaga bevosita hissa qo'shishi ko'rsatilgan. Misol uchun, bir uglerodli metabolizm giston metilatsiyasi uchun universal metil donor SAMni yaratishi mumkin66.

4-rasm|↑[H+] ta'siriga uchragan T hujayralarida mitoxondrial moslik saqlanib qoladi. nazorat yoki sut kislotasi bilan shartlangan T hujayralarida inson T hujayralarining SCENITH tahlili. Vakolatli tarjima darajasi (anti-Puro) ko'rsatilgan (n=3 ta mustaqil namuna). Chiziqli chiziq 2-deoksi-d-glyukoza + oligomisin (2-DG+O) bilan davolashdan keyin olingan fon darajasini bildiradi. b,c, glikolitik sig'imning miqdoriy tahlili (b) va mitoxondrial bog'liqlik (c) a ichida. n=3 mustaqil namuna. d-f, OCR (d) nazorat va sut-kislota bilan shartli T hujayralari ko'rsatilgan inhibitorlarga javoban bazal sharoitda real vaqtda o'lchandi. FCCP, karbonil siyanid-p-triflorometoksi fenilgidrazon; ROT/AA, rotenon va antimitsin A. Bazal OCR (e), maksimal nafas olish (e) va SRC (f) ning vakillik statistik tahlili. n=9 test; 3 ta mustaqil namuna tahlil qilindi va har bir namuna 3 marta o'lchandi. g,h, ko'rsatilgan inhibitorlarga javoban o'lchangan nazorat yoki sut kislotasi bilan shartlangan T hujayralarining ECAR (g). Bazal ECAR va stressli ECAR (h) ning vakillik statistik tahlili. n=9 test; 3 ta mustaqil namunalar aniqlandi va har bir namuna 3 marta o'lchandi. i, ko'rsatilgan sharoitlarda inson T hujayralarida COXIV va TIM23 ning immunoblot tahlili. Aktin yuklash nazorati sifatida ishlatilgan. j,k, Nazorat yoki sut-kislota- yoki pH 6 da mos ravishda mitoxondriyal massa (MTG) (j) va mitoxondriyal membrana potentsiali (TMRM) (k) vakillik gistogrammalari yoki kontur chizmalari va statistik tahlili.{{30} konditsioner inson T hujayralari. n=3 mustaqil namuna. l, m, Nazorat holatida, sut kislotasi yoki pH 6,6 holatida 12 kun davomida ekilgan T hujayralarining vakili mitoxondrial morfologiyasi, EM tomonidan tahlil qilingan (shkala chizig'i, 1 mkM) (l). T hujayralardagi alohida mitoxondriyalar maydoni (m), n=45 hujayra. Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi Statistik tahlillar juftlashtirilmagan ikki dumli Student t-testi yordamida amalga oshirildi.

5-rasm|↑[H+]-kengaytirilgan T hujayralari o'simtaga qarshi faollikni oshiradi. a,b, Nazorat yoki sut-kislota bilan kengaytirilgan CD8+ T xujayralari asrab olingan transferdan so'ng (n=6 sichqoncha) barqarorlik uchun tahlil qilindi. Yangi ajratilgan sichqoncha CD45.1+ OT-I T hujayralari 2 kun davomida sichqoncha IL-2 va plastinka bilan bog‘langan sichqonchaga qarshi CD3 va sichqonchaga qarshi CD28 antikorlari bilan faollashtirildi va so‘ngra sichqonchani o‘z ichiga olgan madaniy muhitda saqlangan. sichqonchani IL-2 qabul qilinmaguncha (CD3&CD28+IL-2). Hayvonlar tajribasining sxemasi (a), shuningdek, vakil FACS chizmalari va CD45.1+ va CD45.2+ qondagi T hujayralarining statistik tahlili (b) da ko'rsatilgan. c–g, CD45.1+ OT-I T hujayralari nazorat yoki sut kislotasi muhitida 7 kun davomida kengaytirildi va B16-OVA-tumorli sichqonlarga o'tkazildi va infiltratsiya nisbati baholandi. (n=5 sichqon). B16-OVA oʻsimtasi boʻlgan sichqonlar (c) yordamida hayvonlar ustida oʻtkazilgan tajriba sxemasi, shuningdek, vakil FACS chizmalari (chapda) va uzatilgan CD45 soni (oʻngda) statistikasi.1+ OT- I o'simtadagi T hujayralari (d). sc, teri ostiga in'ektsiya. CD45.1+ T hujayralari (e) va vakillik maʼlumotlari (chapda) va CD62L+ CD44+ CD45.1+ T hujayralari (f) foizi (oʻngda) statistikasi. ) taloqda ko'rsatilgan. O'simta o'sish egri chizig'i (g) (n=5 sichqon, 14-kun). h–j, CD19-CAR T xujayralari nazorat yoki sut kislotasi muhitida 12 kun davomida kengaytirildi va K562 o'simtali NCG sichqonchasini haddan tashqari ekspreslovchi CD19-ga o'tkazildi va o'simta va taloqdagi infiltratsiya nisbati baholangan (n=6 sichqon). Hayvonlar tajribasining sxemasi (h), o'simta va taloqdagi o'tkazilgan T hujayralarining vakillik foizi (i) va o'simta o'sish egri chiziqlari (j) ko'rsatilgan (n=6 sichqon, 10-kun). Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi Statistik tahlillar juftlashtirilmagan ikki dumli Student t-testi yordamida amalga oshirildi.

6-rasm|↑[H+] taʼsiri T hujayralarining charchashini cheklaydi. In vitroda inson T hujayralarining surunkali stimulyatsiyasi sxemasi. b, FACS vakili LAG-3 va TIM-3 uchun nazorat yoki sut kislotasi sharoitida yetishtirilgan surunkali stimulyatsiya qilingan inson T hujayralarida. n=3 ta mustaqil namuna. c, CD45da LAG-3 va TIM-3 ifodasi.1+ B{9}}OVA o‘simtasi bo‘lgan C57BL/6N sichqonlaridan (n=5 ta sichqon) olingan TILlar ). d, CD45da LAG-3, TIM-3 va PD-1 ifodasini miqdoriy aniqlash.1+ B16-OVA-tumorli C57BL/ dan TILs. 6N sichqon (n=5 sichqon). e, oqim sitometriyasi bilan aniqlangan CD19-K562 o'simtali NCG sichqonlarining o'simta infiltratsiya qiluvchi CD19-CAR T hujayralarida LAG-3 va TIM-3 ifodasi (n=6 sichqon). f, CD45da TOX ifodasi.1+ B16-OVA o'simtasi bo'lgan C57BL/6N sichqonlaridan olingan TILlar (n=5 sichqon). g, CD19-K562 o'simtali NCG sichqonlaridan (n=6 sichqon) o'simta infiltratsiya qiluvchi CD19-CAR T hujayralarida TOX gistogrammalari va statistik tahlili. h, Chap, CD45da TIM-3 va TCF1 uchun reprezentativ oqim sitometriyasi chizmalari.1+ B16-OVA o'simtasi bo'lgan C57BL/6N sichqonlarining TILlari (n=5 sichqon) . To‘g‘ri, TCF1+ TIM-3– yoki TCF1– TIM-3+ populyatsiyasining foizi. Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi Statistik tahlillar juftlashtirilmagan ikki dumli Student t-testi yordamida amalga oshirildi.

S-2-gidroksiglutarat va -gidroksibutirat kabi metabolitlar xotira-T-hujayralarining farqlanishining epigenetik regulyatori sifatida faoliyat yuritishi xabar qilingan67,68. Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, doimiy ↑[H+] davolash metioninni qabul qilish va metionin metabolizmini metionin tashuvchilarining ekspressiyasini inhibe qilish orqali hujayra ichidagi metionin, SAM va SAH pasayishi bilan cheklaydi. Ushbu natijalar nima uchun T-hujayralari TME69 da metioninni qabul qilish uchun o'simta hujayralarini ortda qoldirishga qodir emasligini qisman tushuntirishi mumkin. Mexanik jihatdan biz ↑[H+] ta'siri MYC ifodasini va uning SLC7A5 promotoriga ulanishini keskin kamaytirganini, natijada SLC7A5 ekspressiyasining pasayishiga va T hujayralarida metionin metabolizmining buzilishiga olib kelishini ko'rsatdik. Qizig'i shundaki, metionin qo'shimchasi MYC va SLC7A5 ekspressiyasini, shuningdek, ↑[H+] ta'sirlangan T hujayralarida metionin siklining oqimini tiklashi mumkin, bu metioninni qabul qilish qobiliyatining tiklanishi, ehtimol, metionin tashuvchisi regulyatsiyasi tufayli bo'lganligini ko'rsatadi. SLC7A5 MYC-ga bog'liq. mTOR faoliyati MYC tarjimasini tartibga solish uchun xabar qilingan70. Shunga ko'ra, biz MYC ning ↑[H+] tomonidan qo'zg'atilgan pastga regulyatsiyasi, ehtimol, mTORning progressiv inhibisyoni va metioninni qabul qilishning buzilishi orqali translyatsion repressiyaga bog'liq deb taxmin qildik. Bunday repressiya ekzogen metionin qo'shilishi bilan qaytarilishi mumkin, ammo aniq mexanizm qo'shimcha o'rganishni talab qiladi. Metionin siklidan olingan SAM effektor-T-hujayra differensiatsiyasi paytida giston metilatsiyasi va epigenetik remodelingga vositachilik qiladi8,71. ↑[H+]-kengaytirilgan T hujayralarida hujayra ichidagi SAM ning kamayishi bilan mos ravishda, biz H3K27me3 ning umumiy ko'pligi va uning T-hujayra poyasi lokuslarining promouterida to'planishi sezilarli darajada kamayganligini aniqladik. H3K27me3 va H3K4me3 selektiv ravishda T hujayralarining effektor yoki ildiz dasturida markaziy bo'lgan genlarning ekspressiyasiga mos keladigan tarzda o'zgartiriladi14. Haqiqatan ham, ↑[H+]-kengaytirilgan T hujayralarida effektor-gen promotorlari ichida H3K4me3 ning kam boyitilganligi kuzatildi. Shunday qilib, ↑[H+] holatida metioninni qabul qilish va metabolizmning buzilishi natijasida yuzaga keladigan metil-donor SAM darajasining pasayishi epigenetik o'zgarishlarga olib keladi, natijada T hujayralarining xotira holatiga differensiatsiyasini ta'minlaydi. Qizig'i shundaki, ↑[H+] ta'sirida metionin qo'shilishi nafaqat ↑[H+] ta'sirlangan T hujayralarida MYC va SLC7A5 ifodasini qutqaribgina qolmay, balki MYC-SLC7A5 uchun muhim rolni qo'llab-quvvatlovchi H3K27me3 ifodasining umumiy darajasini tiklaydi. - ↑[H+]-induktsiyali epigenetik ildizni tartibga solishda metionin almashinuvi o'qi. Haqiqatan ham, biz SLC7A5 ning haddan tashqari ifodalanishi ↑[H+] ta'siri ostida bo'lgan poyaga o'xshash fenotipni qisman buzganligini aniqladik, bu SLC7A5 metionin tashuvchisining ↑[H+] ta'siri ostida T hujayra xotirasiga o'xshash fenotipni olishdagi muhim rolini qo'llab-quvvatladi.

Ko'pgina TILlar tarixan o'smalar ichida doimiy TCR ta'siri tufayli tugaydi deb hisoblangan, ammo paradoksal ravishda TCF1 transkripsiya faktorini ifodalovchi TILlardagi T-hujayra klonotiplarining kichik bir qismi ildiz hujayralariga o'xshash xususiyatlarni saqlab qoladi. Bizning topilmalarimiz shuni ko'rsatdiki, ↑[H+] ta'siri T hujayra effektor funktsiyasini qoplaydi va MYC-SLC7A5-metionin almashinuvi o'qi orqali T hujayra ildizini saqlaydi, bu TIL ning kichik bir qismi nima uchun hali ham ildizni ushlab turishi haqidagi hozirgi paradoksni tushuntirish imkonini beradi. xotira yoki prekursor xususiyatlari kabi. Darhaqiqat, shunga o'xshash topilmalar haqida xabar berilgan, bunda TMEdagi kaliy ionlari T-hujayra effektor funktsiyasi va ildiziga ta'sir qiluvchi ikki tomonlama rol o'ynaydi56,72, TME immunosupressiv omillarining kompleks ta'sirini qo'llab-quvvatlaydi (masalan, surunkali TCR stimulyatsiyasi, gipoksiya va past glyukoza) T hujayralarining funktsiyasi va differentsiatsiyasi. Bundan tashqari, o'smalar ichidagi kislotali hududlar juda dinamik bo'lib, fazoviy va vaqtinchalik tartibga solinadi va hujayradan tashqari atsidozga moslashgan T hujayralarining yaroqliligi, ular intratumoral T hujayralari effektor funktsiyasi va differentsiatsiyasiga ta'sir qilishi mumkin bo'lgan boshqa qattiq TME omillariga duch kelganda soyada qolishi mumkin. Bundan tashqari, biz tug'ma charchagan T hujayralariga (LY108+ TIM-3–) qaraganda, terminalda charchagan T hujayralarida (LY108− TIM-3+) MYC ning yuqori ifodasini kuzatdik. MYClo T xujayralari xotira taqdirini afzal ko'rganligi haqidagi oldingi hisobotlarga muvofiq73. ↑[H+] ta'sirlangan T hujayralarida SLC7A5 ifodasi va metioninning so'rilishining kamayishi bilan mos ravishda, SLC7A5 ekspressiyasi o'smalar ichidagi LY108+ TIM-3 - progenitori tugaydigan T hujayralari populyatsiyasida ham sezilarli darajada kamaydi, MYC-SLC7A5-metionin tartibga soluvchi o'qi in vivo ham ishlashi mumkinligini ko'rsatadi. Endi ma'lum bo'lishicha, kamroq tabaqalangan ildizga o'xshash xotira T hujayralari uzoq muddatli barqarorlik va disfunktsiya rivojlanishiga qarshilik ko'rsatishi tufayli yuqori o'simtaga qarshi terapevtik ta'sirga egadir51,74. Biz bu yerda uzoq muddatli ↑[H+]-konditsioner CD8+ T-hujayralari in vivo jonli ravishda yaxshilangan qat'iyatlilik va yuqori o'simtaga qarshi qobiliyatini ko'rsatganligi va terminalda tugaydigan T hujayralari populyatsiyasi (TCF1− TIM{) kamayganligi haqida ishonchli dalillar keltirdik. {39}} ) va oʻsmalar ichida poyaga oʻxshash progenitor kichik toʻplami (TCF1+ TIM-3– ) koʻpaygan. Xulosa qilib aytganda, bizning ushbu tadqiqotimiz T-hujayra effektor funktsiyasini bostirishga ↑[H+] ta'sirining ko'p o'lchovli ta'siri va uning T hujayralarining ildiziga tasodifiy ta'siri haqida tushuncha beradi.

Usullari

Sichqoncha va hujayra chiziqlari

Barcha hayvonlar tajribalari Suzhou Tizim Tibbiyot Instituti (ISM-IACUC-0151-R)ning Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo‘mitasi (IACUC) roziligi bilan amalga oshirildi va hayvonlar patogensiz sichqonchani maxsus muassasalariga joylashtirildi. Sichqonlar standart sharoitlarda, 12-soat/12-soat yorug‘lik/qorong‘u davrlarda va 22–24 daraja haroratda va 6{46}}% namlikda, cheklanmagan oziq-ovqat va suv bilan saqlanadi. mavjudligi va har kuni tekshiriladi. Barcha o'sma yuklari Suzhou Tizim Tibbiyot Institutining Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan ruxsatnomadan oshmadi. CD45.1+ C57BL/6N fonida OT-I TCR transgenli urg‘ochi sichqonlar birga joylashtirilgan. CD45.2+ 6–8 xaftalik C57BL/6N urgʻochi sichqonlari qabul qiluvchi sifatida Vital daryosidan sotib olindi. Ayol NCG (NOD/ ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) 6-8 haftalik sichqonlar GemPharmatech kompaniyasidan sotib olindi. In vivo bir mustaqil tajriba uchun CD45.1+ va CD45.{30}} sichqonlari (6–12 hafta) jinsi boʻyicha moslashtirildi. American Type Culture Collection (ATCC) HEK{34}}T hujayralari 10% homila sigir zardobi (FBS) va 1% penitsillin-streptomitsin bilan toʻldirilgan DMEM muhitida saqlangan. ATCC dan sichqonchaning melanoma hujayra liniyasi B16 OVA ni ifodalash uchun transduktsiya qilindi va 10% FBS va 1% penitsillin-streptomitsin bilan to'ldirilgan DMEM muhitida saqlangan. ATCC dan K562 hujayralari inson CD19 ni ifodalash uchun transduktsiya qilindi va 10% FBS, 1% penitsillin-streptomitsin, 1% GlutaMAX, 0,1 M HEPES, 1% muhim bo'lmagan aminokislotalar, 1 mM natriy va 1 mM natriy bilan to'ldirilgan RPMI 1640 muhitida o'stirildi. mM -merkaptoetanol. Yuqoridagi barcha reagentlar Gibco kompaniyasidan sotib olingan.

Birlamchi T-hujayra izolyatsiyasi, faollashuvi va retrovirus transduktsiyasi

Sichqoncha CD{0}} T limfotsitlari 6-12 xaftalik erkak yoki urg'ochi OT-I sichqonlarining taloqlaridan CD8 sodda T hujayralari izolyatsiyasi to'plami (BioLegend) yordamida ajratildi va RPMIda yetishtirildi{{5} } 10% FBS, 1% penitsillin-streptomitsin, 1% muhim bo'lmagan aminokislotalar, 1% GlutaMAX, 1 mM natriy piruvat, 0,1 M HEPES va 50 mM -merkaptoetanol bilan to'ldirilgan muhit. -2 (20U/ml, Peprotech). In vitroda bitta mustaqil tajriba uchun erkak va urg'ochi sichqonlar (6-12 hafta) jinsi moslashtirilgan. Tozalangan hujayralar sichqonchaga qarshi CD3 (2 ug/ml, BioLegend) va sichqonchaga qarshi CD28 (1 ug/ml, BioLegend) antikorlari bilan 48 soat davomida faollashtirildi. Sog'lom donorlardan olingan inson periferik qon mononuklear hujayralari (PBMCs) Sailybio'dan sotib olindi va RMPI{28}} muhitida 5% inson zardobida (Gemini), 1% penitsillin-streptomitsin, 1% muhim bo'lmagan aminokislotalar, 1% GlutaMAX, 1 mM natriy piruvat, 0,1 M HEPES va 50 mkM -merkaptoetanol inson IL-2 (100 U/ml, Peprotech) ishtirokida. 3 kun davomida PBMClarni faollashtirish uchun insonga qarshi CD3 (1 ug/ml, BioLegend) va insonga qarshi CD28 (1 ug/ml, BioLegend) monoklonal antikorlari ishlatilgan. Tozalangan sichqoncha va inson T hujayralari ko'rsatilgan madaniyat sharoitida faollashtirildi va kengaytirildi: pH 7,4, pH 6,6, sut kislotasi (Sangon) yoki natriy laktat (Sangon). Quyidagi metabolitlar pH 6,6 yoki sut kislotasi (10 mM) muhitini to'ldirish uchun ishlatilgan: metionin 800 mkM (MCE), SAM 100 mkl (MCE) yoki SAH 100 mkM (Sigma). Virusli transduktsiya uchun har bir quduqda 1 × 106 PBMC 24-quduq plitalari faollashtirildi. 48 soat faollashtirilgandan so'ng, muhitning ko'p qismi 10 ug / ml polibrene (Santa Cruz) bilan konsentratsiyalanmagan retrovirus supernatant bilan almashtirildi. 600 g 90 daqiqa davomida 30 gradusda santrifüj qilingandan so'ng, hujayralar yangi muhit bilan 24 soat davomida inkubatorda o'stirildi. Transduktsiya 24 soatdan keyin takrorlandi va keyin madaniyat uchun yangi muhitga qaytarildi. INFEKTSION samaradorligini aniqlash uchun past yaqinlikdagi nerv o'sish omili retseptorlari (LNGFR) ishlatilgan.

Oqim sitometriyasi

Hujayralar floresan antikorlar bilan bo'yalgan va keyin oqim sitometriyasi bilan tahlil qilingan. Yuzaki markerni bo'yash uchun hujayralar floresan konjugatsiyalangan antikorlar va FACS buferida (2% FBS bilan fosfat tamponlangan sho'r suv (PBS)), so'ngra 2% paraformaldegid (Casmart) bilan fiksatsiyalangan jonli/o'lik o'lik hujayralar bo'yash to'plami (Invitrogen) bilan bo'yalgan. xona haroratida 20 daqiqa. Fosfo-oqsillarni hujayra ichidagi bo'yash uchun oldindan bo'yalgan hujayralar Fiksatsiya buferi (BioLegend) bilan mahkamlangan va keyin o'tkazuvchanlik tamponida (Invitrogen) fosfo-maxsus antikorlar bilan bo'yalgan. Hujayra ichidagi sitokinlarni aniqlash uchun hujayralar 4,5 soat davomida Brefeldin A (BFA) (BioLegend) ishtirokida forbol miristat asetat (PMA) bilan rag'batlantirildi. Keyin, oldindan bo'yalgan hujayralar mahkamlangan va o'tkazuvchanlik tamponida sitokin antikorlari bilan bo'yalgan. Hujayra ichidagi transkripsiya faktorini bo'yash uchun hujayralar sirt belgilarini aniqlash uchun Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit va FACS buferida floresan konjugatsiyalangan antikorlar bilan oldindan bo'yalgan. Keyin hujayralar FOXP3/Transkripsiya faktorini fiksatsiyalash tamponi (Invitrogen) yordamida muz ustida 30 daqiqa davomida o'rnatildi va Permeabilizatsiya tamponida transkripsiya omili antikorlari bilan bo'yaldi. Bo'yashdan keyin hujayralar oqim sitometriyasi uchun FACS buferida qayta suspenziya qilindi. Oqim sitometriyasi ma'lumotlari BD LSR Fortessa va BD FACSDiva (v8.0.2) tomonidan to'plangan va FlowJo (v10.4) dasturi bilan tahlil qilingan. Vakillarni o'tkazish strategiyalari kengaytirilgan ma'lumotlar 10b-rasmda keltirilgan.

RNK ketma-ketligi

RNK-seq tahlili 1a-rasmda ko'rsatilganidek, ko'rsatilgan sharoitlarda ekilgan 12-kun davomida kengaytirilgan T hujayralari yordamida amalga oshirildi. Qisqacha aytganda, T-hujayra kengayishidan 12 kun o'tgach, umumiy RNK TRIzolda (Takara) gomogenlash va suyuq azot bilan RNazsiz naychalarda muzlatish orqali chiqarildi. RNK yaxlitligi Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent) yordamida baholandi. Kutubxonalar TruSeq RNK namunasini tayyorlash to'plami (FC-122-1001, Illumina) yordamida qurilgan. Keyin kutubxonalar Illumina NovaSeq 6000 (PE150) platformasi yordamida ketma-ketlashtirildi va taxminan 40 million juftlashtirilgan oʻqishlar yaratildi (Novogene). Xom o'qishlar soni ajratildi va keyin DESeq2 (v1.28.1) yordamida kutubxona hajmi omillari bilan normallashtirildi. Namunalar bo'yicha dispersiyani barqarorlashtirish uchun muntazam logarifm (r-log) transformatsiyasi ishlatilgan. Differensial ravishda ifodalangan genlarning GO va KEGG yo'lini boyitish tahlili klaster profili (v3.16.0) bilan amalga oshirildi. Ifoda issiqlik xaritalari R paketi "pheatmap" (v1.0.12) yordamida yaratilgan. GSEA tahlili uchun GSEA v.4.0 dan foydalanilgan.

CUT & Tag-seq

Illumina uchun Hyperactive Universal CUT & Tag Assay Kit (TD903, Vazyme) yordamida CUT&Tag-seq yuqorida tavsiflanganidek bajarildi75. Qisqacha aytganda, inson T hujayralari nazorat sharoitida, sut kislotasi yoki sut kislotasi 800 mkM metionin bilan 12 kun davomida kengaytirildi. Keyin, 1 × 105 T hujayralari nuklein materiallarni ekstraktsiya qilish uchun lizing qilindi va xona haroratida 10 daqiqa davomida ConA boncuklar bilan inkubatsiya qilindi. Hujayralar birlamchi antikor (anti-H3K27me3 yoki anti-H3K4me3) bilan oldindan aralashtirilgan 50 mkl antikor buferida qayta suspenziya qilindi va kechasi 4 darajada inkubatsiya qilindi. Namunalar xona haroratida ikkilamchi antikor bilan 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va keyin DNK parchalanishini buzish uchun xona haroratida 1 soat davomida A/G-Tn5 transpozaza oqsili bilan birgalikda inkubatsiya qilindi. Tozalangan DNK kutubxonani tayyorlash uchun ishlatilgan va Illumina Nova6000 sekvenseri tomonidan PE150 yordamida ketma-ketlashtirilgan.

CUT & Tag-seq tahlili

FastQC (v{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) ketma-ketlikni o'qish sifatini tekshirish uchun ishlatilgan. Trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) yordamida oʻqish sifati minimal Phred balli 20gacha qisqartirildi. . CUT&Tag-seq tomonidan H3K27me3 va H3K4me3 tomonidan ishlab chiqarilgan barcha o'qishlar Bowtie2 (v2.2.8) (https:// bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) yordamida hg38 inson genomiga moslashtirildi: –local– juda sezgir-mahalliy-no-unal-no-mixed-no-discordant-phred33 -I 10 -X 700. DNKsi o'z ichiga kirmagan namunalar ChIPseqSpikeInFree usuli yordamida normallashtirildi. Turli xil sharoitlar va muolajalar bo'yicha namunalar uchun miqyoslash omillarini samarali aniqlash uchun yangi normalizatsiya usuli76. H3K27me3 uchun cho'qqilar MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ eng yuqori_qo'ng'iroq_mac'lar yordamida chaqirildi. .html) opsiyalari bilan '-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0,1'. H3K4me3 uchun eng yuqori chaqiruvda “-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all” parametrlari bilan MACS2 ishlatilgan. Cho'qqilar ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/) bilan izohlangan va vizualizatsiyalar deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en) yordamida yaratilgan. /develop/) va pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

qRT-PCR

Jami RNK TRIzol (Takara) bilan ajratildi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq HiScript teskari transkriptaza (Vazyme) bilan cDNKga teskari transkripsiya qilindi. Miqdoriy real vaqtda PCR uchun ABI prism 7500 real vaqt PCR tizimi (Termo Fisher) va 2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq ishlatilgan. ACTB ichki standart sifatida ishlatilgan. mRNKning nisbiy ifodasi 2−DCT usuli yordamida hisoblangan. QPCR uchun ishlatiladigan primer ketma-ketliklarini qo'shimcha 1-jadvalda topish mumkin.

Western bloting

Protein ifodasini tahlil qilish uchun hujayralar yig'ildi va sovuq PBS bilan yuvildi va umumiy protein muz ustida 1% SDS (Sangon) yordamida ekstraksiya qilindi. Protein kontsentratsiyasi BCA protein tahlili to'plami (Merck) bilan o'lchandi. Protein namunalari SDS-PAGE jellari bilan ajratildi va keyin PVDF membranalariga (Millipore) o'tkazildi. Membranalar Tween20 bo'lgan PBSda 5% yog'siz sut bilan bloklangan. Bloklashdan so'ng, membranalar bir kechada 4 daraja haroratda birlamchi antikorlar va xona haroratida 2 soat davomida HRP bilan bog'langan ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. HRP signali elektroxemiluminesans (ChemeMINI610) tomonidan ishlab chiqilgan va Sage Capture (v2.19.12) tomonidan to'plangan. Ma'lumotlar tahlili ImageJ (v1.8.0) dasturi yordamida amalga oshirildi.

Mitoxondrial morfologik tahlil

{0}}quduq plitalarining har bir qudug'ida PBMClar inson anti-CD3 va anti-CD28 antikorlari tomonidan 3 kun davomida faollashtirildi va RPMI{6}} muhitida 12 kun davomida turli sharoitlarda yetishtirildi. Keyin, 1 × 106 PBMC to'plangan va oldindan sovutilgan fiksatsiya tamponida (2,5% glutaraldegid, 0,1 M fosfat tampon (PB), pH 7,4) kechada 4 daraja haroratda o'rnatildi. PBS bilan uch marta yuvilgandan so'ng, hujayralar 2 soat davomida PBSda 1% osmiy tetroksidda mahkamlangan, suvsizlangan va standart protsedura bo'yicha Spurr qatroniga kiritilgan. Ultra yupqa bo'laklar uranil asetat va qo'rg'oshin sitrat bilan bo'yalgan. Mitoxondrial morfologiya Hitachi HT{21}} transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) (v01.20) va AMT-XR81DIR kamerasi yordamida tasvirlangan.

Antikorlar va reagentlar

Oqim sitometrik tahlili uchun ishlatiladigan antikorlar quyidagilar edi. APC insonga qarshi NGFR (kat. № 345108, FACS uchun 1:1, 000), FITC insonga qarshi CD4 (kat. № 357406, FACS uchun 1:200), Pacific Blue antiinson CD8 (kat. № 300928, FACS uchun 1:200), APC-Cy7 odamga/sichqonchaga qarshi CD44 (kat. № 103028, FACS uchun 1:200), PE insonga qarshi CCR7 (kat. № 353204, 1) :FACS uchun :200), PE insonga qarshi TNF- (kat. № 502909, FACS uchun 1:200), PE-Cy7 insonga qarshi CD45RO (kat. № 304230, FACS uchun 1:200), APC anti- inson IFN- (kat. № 502512, FACS uchun 1:200), PE-Cy7 insonga qarshi LAG-3 (kat. № 369310, FACS uchun 1:200), PE insonga qarshi TIM{{ 52}} (kat. № 345006, FACS uchun 1:200), BV711 insonga qarshi PD-1 (kat. № 329928, FACS uchun 1:200), Percp-Cy5.5 insonga qarshi CD62L (kat. № 304824, FACS uchun 1:200), APC insonga qarshi CD27 (kat. № 302810, FACS uchun 1:200), BV711 sichqonchaga qarshi CD8 (kat. № 100748, FACS uchun 1:200). ), PE-Cy7 sichqonchaga qarshi CD62L (kat. No. 104418, FACS uchun 1:200), APC-Cy7 sichqonchaga qarshi CD45.2 (kat. No. 830789, FACS uchun 1:200), Pacific Blue anti- sichqoncha CD45.1 (kat. № 110722, FACS uchun 1:200), APC anti-sichqonchani Ly108 (kat. yo'q. 134610, FACS uchun 1:200), PE sichqonchaga qarshi LAG-3 (kat. № 125207, FACS uchun 1:200), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC Antikor (kat. № 626811, 1) FACS uchun :200), PE sichqonchaga qarshi TNF- (kat. № 506306, FACS uchun 1:200) va APC sichqonchaga qarshi IFN- (kat. No. 505810, FACS uchun 1:200) BioLegend’dan sotib olindi. . Tirik/oʻlik tuzatiladigan oʻlik hujayralar boʻyoqlari toʻplami, PerCP-eFluor710 sichqonchaga qarshi PD-1 (kat. raqami. 46-9981-82, FACS uchun 1:200), PE fosfor-S6 (Ser235/236) (mushuk) № 12-9007-42, FACS uchun 1:200), inson/sichqonchaga qarshi PE TOX (kat. raqami. 12-6502-82, FACS uchun 1:200) va PE-Cy7 sichqonchaga qarshi TIM{ {149}} (kat. raqami. 25-5870-82, FACS uchun 1:200) Thermo Fisherdan xarid qilingan. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (kat. № 6709, FACS uchun 1:200) va fosfor-4E-BP1 (Thr37/46) (kat. № 2846, FACS uchun 1:200) dan sotib olingan. Hujayra signalizatsiya texnologiyasi. Alexa Fluor 647 anti-puromisin (kat. №. MABE343-AF647, FACS uchun 1:800) Merck'dan xarid qilingan. Western blots uchun ishlatiladigan antikorlar quyidagilar edi. Quyonga qarshi fosfo-Akt (Ser473) (kat. № 4060, 1:1, 000 IB uchun), anti-fosfo-NF-kB p65 (Ser536) (kat. № 3033, 1:1) ,000 IB uchun), anti-c-MYC (kat. № 18583, 1:1,000 IB uchun), anti-EZH2 (kat. № 5246, 1:1,{ {200}} IB uchun), anti-tri-metil-giston H3 (Lys27) (kat. № 9733, 1:1,000 IB uchun), anti-tri-metil-giston H3 (Lys4) (kat. № 9751, 1:1, 000 IB uchun), anti-di-metil-giston H3 (Lys9) (kat. № 4658, 1:1, 000 IB uchun) , anti-di-metil-giston H3 (Lys79) (kat. № 5427, IB uchun 1:1,000), anti-giston H3 (kat. № 9715, 1:1,{{242) }} IB uchun), anti-COXIV (kat. № 850, 1:1, 000 IB uchun), anti-quyon IgG (HRP bilan bog'langan) (kat. № 7074, 1:2,{ IB uchun {253}}) va sichqonchaga qarshi IgG (HRP bilan bog'langan) (kat. № 7076, IB uchun 1:2,000) Cell Signaling Technology'dan xarid qilingan. Sichqoncha anti-Tim23 (kat. № 611223, IB uchun 1:1,000) BD Biosciences kompaniyasidan edi. Sichqoncha anti- -aktin (kat. №. 66009-1-Ig, 1:5,000 IB uchun), anti-SLC7A5 (kat. №. 67951-1-Ig, 1: 1,000 IB uchun) va quyonlarga qarshi SLC38A1 (kat. No. 12039-1-AP, 1:1,000 IB uchun) Proteintech kompaniyasidan edi. Quyonga qarshi SLC38A2 (kat. № BMP081, IB uchun 1:1,000) Medical & Biological Laboratories'dan xarid qilingan.

T-hujayra metabolik tahlili

Nazoratda BODIPY FL C16 qabul qilinishini yoki ↑[H+] bilan ishlov berilgan T hujayralarini tekshirish uchun T hujayralari yangi eritilgan 1 mkM BODIPY FL C16 (Invitrogen) bilan 1 soat davomida o'stirildi, so'ngra sirtni bo'yashdan oldin PBS bilan ikki marta yuvildi. Turli davolash guruhlarida metabolik bog'liqlikni yanada o'rganish uchun SCENITH (tarjimani inhibe qilish orqali yagona hujayrali energiya almashinuvi) usuli yordamida tajribalar o'tkazildi42. Qisqacha aytganda, T xujayralari 96-quduq plitalariga 1 × 106 hujayra/ml da ekilgan. Keyin hujayralar nazorat (Ctrl), 2-deoksi-d-glyukoza (yakuniy kontsentratsiya 100 mM), oligomisin (yakuniy konsentratsiya 5 mM) yoki ingibitorlar aralashmasi bilan yakuniy konsentratsiyalarda 40 daqiqa davomida 37 daqiqa davomida ishlov berildi. daraja. Puromitsin (yakuniy konsentratsiya 10 ug/ml) oxirgi 30 daqiqada qo'shilgan. Puromitsin bilan davolashdan so'ng hujayralar sovuq PBS bilan yuvilgan va Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit va sirt belgilariga qarshi antikorlar bilan oldindan bo'yalgan. Hujayra ichidagi puromisinning bo'yalishidan so'ng hujayra ichidagi transkripsiya omillari uchun bo'yash jarayoni o'tkazildi.

LC-MS/MS bilan metabolik tahlil

Metabolomik tahlil va namuna yig'ish avvalgi hisobotlarda bo'lgani kabi amalga oshirildi77. Qisqacha aytganda, PBMClar 24-quduq plastinkalarida inson anti-CD3/CD28 tomonidan 3 kun davomida alohida faollashtirildi va nazorat yoki sut kislotasi bilan RPMI 1640 muhitida 12-kungacha yetishtirildi. Keyin, 8 × Har bir namuna uchun 1{28}}6 hujayra (har bir guruhda n=4 ta mustaqil namuna) toʻplandi va 1.5-ml trubkaga 300 g 4 gradusda 5 daqiqa davomida santrifüjlash uchun oʻtkazildi. sovuq PBS bilan yuviladi. Yana 5 daqiqa davomida 300 g santrifüjdan so'ng, 80% sovuq metanol qo'shildi va hujayra pelletini to'liq buzish uchun kuchli vortekslandi, so'ngra hujayralar -80 daraja muzlatgichga o'tkazildi. Namunalar 12,000 g haroratda 10 daqiqa 4 darajada santrifüj qilindi. Supernatant yig'ildi. Nihoyat, ekstraktlar liyofilizatsiya qilindi va Novogeneda UHPLC-MS/MS tomonidan tahlil qilindi. UHPLC–MS/MS tomonidan yaratilgan xom maʼlumotlar fayllari Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher) yordamida har bir metabolit uchun eng yuqori hizalanish, eng yuqori yigʻish va miqdorni aniqlash uchun qayta ishlandi. Keyinchalik ma'lumotlarni tahlil qilish uchun Metaboanalyst (v5.0) dasturi ishlatilgan va keyin P <0.05 yordamida sezilarli darajada boyitilgan yo'llar tanlangan.

Barqaror-izotop-yorliqlash tajribalari

13C metabolik oqimi T hujayralarida yuqorida tavsiflangan usullar yordamida amalga oshirildi60,78,79. Qisqacha aytganda, PBMClar yuqorida ta'riflanganidek, 24-quduq plastinkalarida inson anti-CD3/CD28 bilan 3 kun davomida har bir quduqqa faollashtirildi. [13C6] glyukoza izlash uchun vosita 11 kundan keyin 10% dializlangan FBS (Thermo Fisher Scientific), 1% penitsillin-streptomitsin, 1% muhim bo'lmagan aminokislotalar, 50 mkM bilan to'ldirilgan glyukozasiz RPMI (Gibco) ga o'tkazildi. -merkaptoetanol va 0,1 M HEPES, 11 mM [13C6] glyukoza (Kembridge Isotope Laboratories) nazorat yoki 10 mM sut kislotasi bilan, 24 soat davomida. [13C16]palmitat izlash uchun 2 × 107 T-hujayralari faollashtirildi va yuqorida tavsiflanganidek, 12-kunda nazorat yoki 10 mM sut kislotasi sharoitlari bilan tugallangan muhitga joylashtirildi, tarkibida 200 mkM [13C16] palmitat (Kembrij izotop laboratoriyalari), 8 kun davomida h. [13C5] metioninni kuzatish uchun T hujayralari nazorat ostida, sut kislotasi yoki sut kislotasi 800 mkM metionin sharoitida 12 kun davomida kengaytirildi. Keyin 4 × 107 T hujayralari metioninsiz to'liq RPMI muhitiga (Gibco) o'tkazildi va nazorat sharoitida, sut kislotasi yoki metionin bilan to'ldirilgan sut kislotasi (tarkibida 100 mkM, 100 mkM yoki 800 mkM [13C5] metionin mavjud) bilan o'stirildi. (Kembrij izotop laboratoriyalari), 8 soat davomida. Tegishli supernatantlar yig'ilib, keyin -80 daraja haroratda saqlanadi. Hujayralar santrifüjlash (300 g, 4 daraja, 5 min) yo'li bilan granulalarga aylantirildi, ikki marta sho'r suv bilan yuvildi va darhol suyuq azotda muzlatildi va -80 darajada saqlanadi. Metabolitlar muzdek sovuq HPLC darajasidagi 80% metanol yordamida ekstraksiya qilindi va qisqa vaqt ichida vortekslandi, so'ngra 200 ml HPLC darajasidagi suv, so'ngra 500 ml HPLC darajasidagi xloroform (metanol: suv: xloroform nisbati, 5: 2: 5) qo'shildi. ). Aralash vortekslangan va fazalarni ajratish uchun santrifüj qilingan. Supernatantlar keyingi derivatizatsiya uchun vakuumli spin bilan quritildi, so'ngra 2% (og'irlik / hajm) metoksiamin gidroxlorid (226904, Sigma-Aldrich) bilan piridinda 60 daqiqa davomida 37 darajada inkubatsiya qilindi va N-metil-N-( tert-butildimetilsilil) trifloroasetamid 1% tert-butildimetilxlorosilan (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) bilan 30 daqiqa davomida 45 darajada. [13C6] glyukoza hosilalari GC-HRMS, DB-35MS ustunli Trace 1310 gaz xromatografi (Termo Fisher) (Agilent Technologies) va Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS tizimi (Thermo Fisher) tomonidan tahlil qilindi. GC-MS/MS metabolomik tahlillari Metabo-Profile tomonidan o'tkazildi. Metabolitlar Xcalibur (v4.1) va TraceFinder (v5.1) (Termo Fisher) tomonidan aniqlandi va miqdori aniqlandi, shu jumladan ushlab turish vaqti, ion parchalarining zaryad-massa nisbati va eng yuqori intensivlik. [13C16] palmitat va [13C5] metionin hosilalari o'ta yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasi - uch tomonlama to'rt kutupli massa spektrometri (UPLC-TQMS) bilan tahlil qilindi. UPLC-TQMS dan olingan xom ma'lumotlar Waters' MassLynx dasturi (v4.1, Waters) yordamida metabolitlarning eng yuqori ekstraktsiyasi, integratsiyasi, identifikatsiyasi va miqdorini aniqlash uchun tahlil qilindi. Keyingi statistik tahlil uchun R tili (v4.1.1) ishlatilgan.

B16 o'simta modeli va qabul qiluvchi hujayra uzatish immunoterapiyasi

T hujayralarining in vivo jonli ravishda o'simtaga qarshi faolligini tekshirish uchun 0.2 × 106 B16-OVA melanoma hujayralari teri ostiga C57BL/6N urg'ochi sichqonlariga yuborildi. O'simta implantatsiyasidan to'qqiz kun o'tgach, sichqonlar turli sharoitlarda 7 kun davomida kengaytirilgan urg'ochi OT-I sichqonlaridan 5 × 106 T hujayralari bilan tomir ichiga yuborildi. O'simtali sichqonlar ACT dan oldin 5 Gy subletal nurlanish oldi. O'simta maydoni har 2 kunda o'lchanadi va uzunlik (mm) × kenglik (mm) sifatida hisoblanadi. 300 mm2 ga yaqinlashadigan o'simta maydoni bo'lgan sichqonlar evtanizatsiya qilindi. Turli sharoitlarda kengaytirilgan T hujayralarining barqarorligini o‘rganish uchun urg‘ochi OT-I sichqonlarining 4 × 106 CD45.1+ T hujayralari C57BL/6N urg‘ochi sichqonlariga qabul qilingan holda o‘tkazildi. Bir hafta o'tgach, sichqonlar evtanizatsiya qilindi va izolyatsiya qilingan qon, taloq va limfa tugunlari hujayralari hisoblandi. O'tkazilgan T hujayralarining nisbati oqim sitometriyasi orqali CD45.1+ va CD45.2+ ni ifodalovchi T-hujayralarni o'rnatish orqali aniqlandi.

NCG sichqon modeli va CD19-CAR-T terapiyasi

Ayol NCG sichqonlari teri ostiga 1 × 106 CD19-K562 hujayralari bilan implantatsiya qilindi. O'simta hajmi 75 mm3 ga yetganda, sichqonlar 5 × 106 transduktsiyasiz T hujayralarini va nazorat ostida yoki 10 mM sut kislotasi o'z ichiga olgan muhitda ekilgan CD19-CAR T hujayralarini oldi. O'simta o'sishi har 2 kunda elektron kalibrlar bilan o'lchandi va uzunlik (mm) × kenglik (mm) bo'yicha hisoblab chiqildi. O'simta maydoni 300 mm2 dan katta bo'lgan sichqonlar evtanizatsiya qilindi. O'smalar to'plangan, hazm qilingan va Percoll (Sigma) bilan qayta ishlangan, so'ngra T hujayra funktsiyasi va fenotipi oqim sitometriyasi bilan aniqlangan.

Bazal kislorod iste'moli darajasi va hujayradan tashqari kislotalanish tezligini tahlil qilish

Metabolik xususiyatlarni tahlil qilish uchun OCR va ECAR dengiz oti XF24 analizatori (Agilent) tomonidan baholandi. Qisqacha aytganda, 12 kun davomida turli xil sharoitlarda o'stirilgan inson T hujayralari buferlanmagan XF muhiti (10 mM glyukoza 1 mM natriy piruvat va 2 mM glutaminni o'z ichiga olgan buferlanmagan RPMI 1640) ​​bilan oldindan ishlov berilgan. . Keyinchalik, inson T-hujayralari XF24 hujayra madaniyati mikroplastinasiga 0.5 × 106 xujayraga ekilgan va CO2 bo'lmagan inkubatorda 37 darajada 1 soat davomida inkubatsiya qilingan. Hujayra yopishqoqligini oshirish uchun plitalar xona haroratida 5 minut davomida 100 g tormozsiz aylantirildi. Kislorod iste'moli va hujayradan tashqari kislotalanish bazal sharoitda va 1,25 mM oligomisin, 50 mM 2-deoksid-glyukoza, 1,5 mM FCCP, 0,5 mkM rotenon va 0,5 mkM antimitsin A ga javoban tahlil qilindi. maksimal OCR dan bazal OCR.

ChIP-qPCR

Xromatin immunoprecipitatsiyasi (ChIP) ishlab chiqaruvchining ChIP-IT ekspress enzimatik kesish to'plami (Active Motif) bilan ta'minlangan ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. Qisqacha aytganda, nazorat ostida yoki 10 mM sut kislotasi sharoitida o'stirilgan 15 million inson T hujayralari xona haroratida 10 daqiqa davomida formaldegid bilan biriktirildi va fiksatsiya reaktsiyasi 1 × glisin qo'shilishi bilan to'xtatildi. Ruxsat etilgan hujayralar PMSF va oqsilni inhibe qilish kokteyli bilan pelletlangan va hujayra lizisidan oldin -80 darajada saqlangan. Keyin eritilgan pellet yadroviy materialni olish uchun 30 daqiqa davomida muz ustida PMSF va oqsilni inhibe qiluvchi kokteyli bilan 1 ml muzli sovuq lizis tamponida qayta suspenziya qilindi. So'ngra yadro pelleti qayta suspenziyaga solingan va 37 daraja haroratda 15 daqiqa davomida kromatinni kesish uchun fermentativ kokteyl bilan hazm qilingan. Kesilgan kromatin anti-c-MYC (CST, kat. № 18583, ChIP uchun 1:100) va anti-IgG (CST, kat. № 2729, ChIP uchun 1:100) bilan protein G magnit boncuklari bilan inkubatsiya qilindi. Kechasi 4 daraja. Keyin magnit boncuklar ChIP buferlari bilan to'rt marta yuvildi va 50 ul elusyon buferi bilan elutildi. Elutsiya qilingan DNK 65 darajada 2,5 soat davomida teskari o'zaro bog'langan va keyin fenol-xloroform ekstraktsiyasi bilan tozalangan. Tozalangan DNK maqsadli genlarning promotorlarida MYCning boyitilganligini aniqlash uchun ChIP-qPCR o'tkazish uchun ishlatilgan. ChIP-qPCR uchun ishlatiladigan primerlarni qo'shimcha 2-jadvalda topish mumkin.

Mitoxondriyal massa va membrana potentsialini tahlil qilish

Mitokondriyal massa va membrana potentsiali MitoTracker Green va tetrametirhodamin metil ester (TMRM) yordamida tahlil qilindi. Hujayralar 250 nM MitoTracker Green (Termo Fisher) yoki 50 nM TMRM (Termo Fisher) bilan hujayra sirtini bo'yashdan oldin 37 daraja (5% CO2) inkubatorda 1 soat davomida bo'yalgan. Hujayralar uch marta FACS buferi bilan yuvildi, so'ngra keyingi FACS tahlili uchun sirt markerlari bo'yaldi.

Statistik tahlil

Statistik tahlil GraphPad Prism 8-versiyasi yordamida amalga oshirildi.0. Natijalar o'rtacha ± sem sifatida ko'rsatiladi Ikki dumli Student t-testi davolashni nazorat guruhlari bilan solishtirish uchun ishlatilgan. Bir nechta taqqoslash uchun Tukey's Sidak yoki Dunnettning ko'p taqqoslash testi bilan ikki tomonlama ANOVA qo'llanildi. P < 0.05 statistik ahamiyatga ega deb hisoblandi.

Ma'lumotnomalar

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. Sog'lik va kasalliklarda T xotira ildiz hujayralari. Nat. Med. 23, 18–27 (2017).

2. Gao, S. va boshqalar. Ildiz hujayralariga o'xshash xotira T hujayralari: qorong'u tomondan nuqtai nazar. Hujayra immunol. 361, 104273 (2021 yil).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP. Inson saratoni uchun shaxsiy immunoterapiya sifatida qabul qiluvchi hujayra o'tkazish. Fan 348, 62–68 (2015).

4. Ribas, A. & Wolchok, JD Saraton immunoterapiyasi nazorat nuqtasi blokadasidan foydalangan holda. Fan 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA Stem, effektor va xotira CD8+ T hujayralarining gibrid holatlari. Immunol tendentsiyalari. 41, 17–28 (2020).

6. Galletti, G. va boshqalar. Odamlarda alohida taqdir majburiyatlariga ega bo'lgan ildizga o'xshash CD8+ xotira T-hujayralarining ikkita kichik to'plami. Nat. Immunol. 21, 1552–1562 (2020).

7. Gattinoni, L. va boshqalar. Ildiz hujayralariga o'xshash xususiyatlarga ega bo'lgan inson xotirasi T hujayralari to'plami. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).

8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR & Ho, PC T-hujayralarning charchashini metabolik va epigenetik tartibga solish. Nat. Metab. 2, 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. Efektor va xotira CD8+ T hujayralari differentsiatsiyasining transkripsiyaviy nazorati. Nat. Rev. Immunol. 12, 749–761 (2012).

10. Huang, Q. va boshqalar. Limfa tugunlarini drenajlashda PD-1/PD-L1 blokadasiga vijdonan javob beruvchilar sifatida o'simtaga xos xotira CD8+ T hujayralarining primordial farqlanishi. 185-uya, 4049–4066 (2022).

11. Siddiqiy, I. va boshqalar. Poyaga o'xshash xususiyatlarga ega intratumoral Tcf1+ PD-1+ CD8+ T hujayralari emlash va nazorat nuqtasi blokadasi immunoterapiyasiga javoban o'sma nazoratini ta'minlaydi. Immunitet 50, 195–211 (2019).

12. Jeannet, G. va boshqalar. Funktsional CD8 T hujayra xotirasini o'rnatishda Wnt yo'li effektorining Tcf-1 muhim roli. Proc. Natl akad. Sci. AQSH 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP CD8+ T hujayralari differentsiatsiyasining epigenetik nazorati. Nat. Rev. Immunol. 18, 340–356 (2018).

14. Crompton, JG va boshqalar. CD8+ T xujayralari kichik to'plamlarining nasl-nasab munosabatlari epigenetik landshaftdagi progressiv o'zgarishlar bilan aniqlanadi. Hujayra Mol. Immunol. 13, 502–513 (2016).

15. Yu, B. va boshqalar. Epigenetik landshaftlar CD8+ T hujayralari differentsiatsiyasini tartibga soluvchi transkripsiya omillarini ochib beradi. Nat. Immunol. 18, 573–582 (2017).

16. Araki, Y. va boshqalar. Giston metilatsiyasining genom bo'yicha tahlili gen transkripsiyasining xromatin holatiga asoslangan regulyatsiyasini va CD 8+ T-hujayralarining xotira funktsiyasini aniqlaydi. Immunitet 30, 912–925 (2009).

17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Metabolic dasturlari virusli infektsiya, saraton va qarishda T hujayralari immunitetini moslashtiradi. Hujayra Metab. 34, 378–395 (2022).

18. Phan, AT va boshqalar. Konstitutsiyaviy glikolitik metabolizm virusli infektsiya paytida CD8+ T hujayralari efektori xotirasini farqlashni qo'llab-quvvatlaydi. Immunitet 45, 1024–1037 (2016).

19. Sinclair, LV va boshqalar. T hujayralarida metionin almashinuvining antigen retseptorlari nazorati. eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Sallivan, D. va boshqalar. Xotira CD8+ T hujayralari rivojlanish uchun zarur bo'lgan metabolik dasturlashni qo'llab-quvvatlash uchun hujayraning ichki lipolizidan foydalanadi. Immunitet 41, 75–88 (2014).

21. Pearce, EL va boshqalar. Yog 'kislotalari almashinuvini modulyatsiya qilish orqali CD8 T-hujayra xotirasini kuchaytirish. Tabiat 460, 103–107 (2009).

22. Van der Windt, GJ va boshqalar. Mitoxondriyal nafas olish qobiliyati CD8+ T hujayralari xotirasi rivojlanishining muhim regulyatoridir. Immunitet 36, 68-78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF Kislotali o'simta mikromuhiti saratonning haydovchisi sifatida. Annu. Ruhoniy fiziol. 82, 103–126 (2020). 24. Tommen, DS & Shumaxer, saraton kasalligida TN T hujayralari disfunktsiyasi. Saraton hujayrasi 33, 547–562 (2018).

25. Scharping, NE va boshqalar. O'simta mikro muhiti intratumoral t-hujayra metabolik etishmovchiligi va disfunktsiyasini qo'zg'atish uchun t-hujayra mitoxondrial biogenezini bostiradi. Immunitet 45, 374–388 (2016).

26. Yu, YR va boshqalar. CD8+ TILlardagi buzilgan mitoxondrial dinamika T-hujayralarining charchashini kuchaytiradi. Nat. Immunol. 21, 1540–1551 (2020).

27. Chang, CH va boshqalar. O'simta mikromuhitidagi metabolik raqobat saraton rivojlanishining haydovchisidir. 162-uya, 1229–1241 (2015).

28. Scharping, NE va boshqalar. Gipoksiya ostida doimiy stimulyatsiya natijasida paydo bo'lgan mitoxondriyal stress tezda T-hujayralarning charchashiga olib keladi. Nat. Immunol. 22, 205–215 (2021).

29. Jansen, CS va boshqalar. Intra-tumoral joy ildizga o'xshash CD8 T hujayralarini saqlaydi va farqlaydi. Tabiat 576, 465–470 (2019).

30. Im, SJ va boshqalar. PD-1 terapiyasidan so'ng proliferativ portlashni ta'minlovchi CD8+ T hujayralarini aniqlash. Tabiat 537, 417–421 (2016).

31. Haas, R. va boshqalar. Laktat T hujayralari migratsiyasini va effektor funktsiyalarini nazorat qilishda metabolik va yallig'lanishga qarshi davrlarni tartibga soladi. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. va boshqalar. T-hujayralari o'zlarining effektor funktsiyalarini bostirish uchun limfa tugunlarida kislotali bo'shliqlar hosil qiladi. Nat. Kommun. 11, 4113 (2020).

33. Kalsinotto, A. va boshqalar. Mikromuhitning kislotaliligini modulyatsiya qilish inson va sichqon o'simtasini infiltratsiya qiluvchi T limfotsitlarida anergiyani qaytaradi. Saraton Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. Gottfrid, E. va boshqalar. O'simtadan olingan sut kislotasi dendritik hujayra faollashuvini va antigen ekspressiyasini modulyatsiya qiladi. Qon 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio, OR va boshqalar. O'simtadan olingan sut kislotasi bilan o'simta bilan bog'liq makrofaglarning funktsional polarizatsiyasi. Tabiat 513, 559–563 (2014).

36. Erra Diaz, F. va boshqalar. Hujayradan tashqari atsidoz va mTOR inhibisyonu inson monotsitlari hosil bo'lgan dendritik hujayralarning farqlanishiga olib keladi. Hujayra vakili 31, 107613 (2020).

37. Sukumar, M. va boshqalar. Glikolitik metabolizmni inhibe qilish CD8+ T hujayralari xotirasini va o'smaga qarshi funksiyasini kuchaytiradi. J. Klin. Invest. 123, 4479–4488 (2013).

38. Scholz, G. va boshqalar. mTOR signalizatsiyasining modulyatsiyasi ildiz hujayralariga o'xshash xotira T hujayralarining shakllanishiga olib keladi. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).

39. Pollizzi, KN va boshqalar. mTORC1 va mTORC2 CD8+ T hujayralarining differentsiatsiyasini tanlab tartibga soladi. J. Klin. Invest. 125, 2090–2108 (2015).

40. Chjan, L. va boshqalar. Sutemizuvchilarning rapamisin kompleksi 2 maqsadi CD8 T hujayralari xotirasi differentsiatsiyasini Foxo1-bog'liq tarzda boshqaradi. Hujayra vakili 14, 1206–1217 (2016).

41. Zhou, H. & Huang, S. mTOR signalizatsiyasining o'simta hujayralari harakatchanligi, invaziya va metastazdagi roli. Curr. Protein Pept. Sci. 12, 30–42 (2011).

42. Arguello, RJ va boshqalar. SCENITH: oqim sitometriyasiga asoslangan usul, energiya almashinuvini bir hujayrali o'lchamlari bilan funktsional ravishda profillash. Hujayra Metab. 32, 1063–1075 (2020).

43. Ron-Harel, N. va boshqalar. Mitoxondrial biogenez va proteomani qayta qurish T-hujayralarini faollashtirish uchun bitta uglerod almashinuvini rag'batlantiradi. Hujayra Metab. 24, 104–117 (2016).

44. Xan, C., Ge, M., Xo, PC & Zhang, L. Yoqilg'i T-hujayra antitumor immuniteti: aminokislotalar almashinuvi qayta ko'rib chiqildi. Saraton immunol. Res. 9, 1373–1382 (2021).

45. Kakaradov, B. va boshqalar. CD8+ T hujayralari differentsiatsiyasining erta transkripsiya va epigenetik regulyatsiyasi bir hujayrali RNK ketma-ketligi bilan aniqlangan. Nat. Immunol. 18, 422–432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. Aminokislotalar va ularning T hujayralari immuniteti va saraton terapiyasida tashuvchilari. Mol. 80-uya, 384–395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA. Myc T-hujayra proteomalarini va T-hujayra faollashuvi jarayonida metabolik yo'llarni qanday nazorat qilishini miqdoriy tahlili. eLife 9, e53725 (2020).

48. Sukumar, M. va boshqalar. Mitoxondriyal membrana potentsiali hujayra terapiyasi uchun mustahkamlangan ildizga ega hujayralarni aniqlaydi. Hujayra Metab. 23, 63–76 (2016).

49. Alizadeh, D. va boshqalar. IL15 mTORC1 faolligini kamaytirish va ularning ildiz hujayralari xotirasi fenotipini saqlab qolish orqali CAR-T hujayralarining antitumor faolligini oshiradi. Saraton immunol. Res. 7, 759–772 (2019).

50. Bak, MD va boshqalar. Mitoxondrial dinamika metabolik dasturlash orqali T hujayra taqdirini boshqaradi. 166-uya, 63–76 (2016).

51. Krishna, S. va boshqalar. Poyaga o'xshash CD8 T hujayralari inson saratoniga qarshi qabul qiluvchi hujayrali immunoterapiya javobiga vositachilik qiladi. Fan 370, 1328–1334 (2020).

52. Burger, ML va boshqalar. Antigen ustunlik ierarxiyasi o'smalarda TCF1+ progenitori CD8 T hujayralari fenotiplarini shakllantiradi. 184-uya, 4996–5014 (2021).

53. Guo, Y. va boshqalar. Terminal holdan toygan CD8+ T hujayralarini IL-10 tomonidan metabolik qayta dasturlash o'smaga qarshi immunitetni kuchaytiradi. Nat. Immunol. 22, 746–756 (2021).

54. Klein Geltink, RI va boshqalar. Qabul qiluvchi hujayra terapiyasi uchun CD8+ efektor T hujayralarining metabolik konditsiyasi. Nat. Metab. 2, 703–716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Glutamin CD8 T hujayralarining antitumor faoliyatini tartibga soladi. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).

56. Vodnala, SK va boshqalar. O'smalarda T hujayralarining ildizi va disfunktsiyasi umumiy mexanizm tomonidan qo'zg'atiladi. Science 363, eau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. va boshqalar. Kam hujayradan tashqari pH tufayli inson T limfotsitlarining noaniq faollashuvi B7/CD28 kostimulyatsiyasi bilan antagonizatsiya qilinadi. Yevro. J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).

58. Pucino, V. va boshqalar. Surunkali yallig'lanish o'chog'ida laktat to'planishi CD4+ T hujayralarining metabolizmini qayta tiklash orqali kasallikning rivojlanishiga yordam beradi. Hujayra Metab. 30, 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. va boshqalar. Laktat o'simtaga qarshi immunitetni oshirish uchun CD8+ T hujayralarining ildizini oshiradi. Nat. Kommun. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG va boshqalar. Metionin almashinuvi epigenetik qayta dasturlashni tartibga solish orqali T yordamchi hujayra javoblarini shakllantiradi. Hujayra Metab. 31, 250–266 (2020).

61. Chjan, L. va Romero, P. CD8+ T hujayralari taqdiri qarorlari va antitumor immunitetining metabolik nazorati. Trends Mol. Med. 24, 30–48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF Glyukoza etishmovchiligi CD8+ T hujayralarida bir nechta asosiy gen ekspresyon hodisalari va effektor funktsiyalarini inhibe qiladi. Yevro. J. Immunol.38, 2438–2450 (2008).

63. O'Sallivan, D. va boshqalar. Xotira CD8+ T hujayralari rivojlanish uchun zarur bo'lgan metabolik dasturlashni qo'llab-quvvatlash uchun hujayraning ichki lipolizidan foydalanadi. Immunitet 49, 375–376 (2018).

64. Lin, R. va boshqalar. Yog 'kislotalarining oksidlanishi oshqozon adenokarsinomasida CD8+ to'qima-rezident xotira t-hujayralarining omon qolishini nazorat qiladi. Saraton immunol. Res 8, 479–492 (2020).

65. Raud, B. va boshqalar. Etomoksirning tartibga soluvchi va xotira T hujayralariga ta'siri Cpt1a vositachiligidagi yog 'kislotasi oksidlanishiga bog'liq emas. Hujayra Metab. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ Epigenomga metabolik kirishlar. Hujayra Metab. 25, 544–558 (2017).

67. Tyrakis, PA va boshqalar. S-2-gidroksiglutarat CD8+ T-limfotsitlar taqdirini tartibga soladi. Tabiat 540, 236–241 (2016).

68. Chjan, H. va boshqalar. Ketogenez natijasida hosil bo'lgan beta-gidroksibutirat CD8+ T-hujayra xotirasi rivojlanishining epigenetik regulyatoridir. Nat. Hujayra Biol. 22, 18–25 (2020).

69. Bian, Y. va boshqalar. Saraton SLC43A2 T-hujayra metionin metabolizmini va histon metilatsiyasini o'zgartiradi. Tabiat 585, 277–282 (2020).

70. Wall, M. va boshqalar. Rapamitsin tomonidan c-MYC ning translatsion nazorati terminal miyeloid differentsiatsiyasiga yordam beradi. Qon 112, 2305–2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Epigenetikaning metabolik nazorati va uning CD8+ T hujayralari differentsiatsiyasi va funktsiyasidagi roli. Old. Immunol. 10, 2718 (2019 yil).

72. Eil, R. va boshqalar. O'simta mikro muhitida ionli immunitetni bostirish T hujayralari effektor funktsiyasini cheklaydi. Tabiat 537, 539–543 (2016).

73. Guo, A. va boshqalar. cBAF kompleks komponentlari va MYC CD8+ T hujayralari taqdirida erta hamkorlik qiladi. Tabiat 607, 135–141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. Xotira T-hujayrasini hosil qilish va ildizning metabolik nazorati. Sovuq bahor Harb. Perspektiv. Biol. 13, a037770 (2021).

75. Kaya-Okur, HS va boshqalar. Kichik namunalar va bitta hujayralarni samarali epigenomik profillash uchun CUT & Tag. Nat. Kommun. 1930 yil 10 (2019 yil).

76. Jin, H. va boshqalar. ChIPseqSpikeInFree: giston modifikatsiyalaridagi global o'zgarishlarni keskin kirmasdan aniqlash uchun ChIP-seq normalizatsiya yondashuvi. Bioinformatika 36, ​​1270–1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ Global metabolit profilini yaratish uchun suspenziya bilan o'stirilgan sutemizuvchilar hujayralaridan metabolitlarni olish. Nat. Protok. 6, 1241–1249 (2011).

78. Li, C. va boshqalar. Aminokislotalar katabolizmi GCN2-eIF2 o'qi orqali gematopoetik ildiz hujayralari proteostazini tartibga soladi. Hujayra ildiz hujayrasi 29, 1119–1134 (2022).

79. Wenes, M. va boshqalar. Mitoxondriyal piruvat tashuvchisi xotira T-hujayralarining differentsiatsiyasini va antitumor funktsiyasini tartibga soladi. Hujayra Metab. 34, 731–746 (2022).