FOXO antimikrobiyal peptidlarning ifodasini tartibga soladi va qisqichbaqalar antibakterial immunitetida gemotsitlarning fagotsitozini rag'batlantiradi.

Abstrakt

Umurtqasizlar patogen infektsiyaga qarshi turish uchun tug'ma immunitetga, shu jumladan gumoral va hujayra immunitetiga tayanadi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, vilkalar qutisi transkripsiya omili O (FOXO) sutemizuvchilarning shilliq qavatining immun reaktsiyalarida va umurtqasiz hayvonlarning ichak-gumoral immun regulyatsiyasida ishtirok etadi. Biroq, FOXO umurtqasiz hayvonlarda tizimli va hujayrali immunitetni tartibga solishda ishtirok etadimi yoki yo'qmi noma'lum. Ushbu tadqiqotda biz qisqichbaqalardan (Marsupenaeus japonicus) FOXO ni aniqladik va u oddiy qisqichbaqalarda nisbatan bazal darajada ifodalanganligini, ammo Vibrio anguillarum tomonidan e'tiroz bildirilgan qisqichbaqalarda sezilarli darajada ko'tarilganligini aniqladik. FOXO qisqichbaqalarda mikroblarga qarshi peptidlarni (AMP) ifodalash uchun immunitet tanqisligi (IMD) yo'lining transkripsiya omili Relish ifodasini rag'batlantirish orqali gemolimfa va ichak mikrobiotasi gomeostazini saqlashda muhim rol o'ynadi. Shuningdek, biz patogen infektsiya FOXO ni faollashtirganini va serin / treonin kinaz AKT faolligini kamaytirish orqali uning yadro translokatsiyasini keltirib chiqarganini aniqladik. Yadroda faollashtirilgan FOXO o'zining maqsadli Amp va Relish genlarining bakterial infektsiyaga qarshi ifodasini bevosita boshqargan. Bundan tashqari, FOXO fagotsitoz retseptorlarini tozalash retseptorlari C (Src) va lizosomaga fagosoma savdosi bilan bog'liq bo'lgan ikkita kichik GTPazalar, Rab5 va Rab7 ifodasini ko'tarish orqali gemotsitlarning fagotsitozini rag'batlantirish orqali hujayra immunitetida ishtirok etishi aniqlandi. sitoplazmada. Birgalikda olingan natijalar shuni ko'rsatdiki, FOXO gemolimfa va ichak mikrobiotasining gomeostazasiga normal qisqichbaqalarda IMD yo'lini faollashtirish va AMP ifodasini to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita rag'batlantirish va bakteriya bilan kasallangan qisqichbaqalarda patogenlarga qarshi gemositoz fagotsitozini kuchaytirish orqali ta'sir qiladi. Ushbu tadqiqot umurtqasiz hayvonlarning shilliq (mahalliy) va tizimli antibakterial immunitetida FOXO ning turli funktsiyalarini ochib berdi.

Cistanche qo'shimchasining foydalari - immunitetni qanday mustahkamlash mumkin

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kirish

Forkhead qutisi transkripsiya omili O oilasi oqsillari (FOXOs) organizmlarning turli muhim biologik jarayonlarida, jumladan hujayra aylanishini tartibga solish, shikastlangan DNKni tiklash, saratonga qarshi immunitet va hayot davomiyligini tartibga solishda ishtirok etadi [1,2]. Sutemizuvchilarda toʻrt xil FOXO oqsili (FOXO1, FOXO3, FOXO4 va FOXO6) mavjud; biroq, umurtqasiz hayvonlarda faqat bitta FOXO mavjud bo'lib, u Caenorhabditis elegansda Daf{7}} nomi bilan ham tanilgan [3]. FOXO ning transkripsiya faolligi fosforlanish, asetillanish, metillanish va ubiquitinatsiya kabi post-translatsiyadan keyingi modifikatsiyalarning bir necha turlari bilan tartibga solinadi [4]. Ushbu modifikatsiyalar FOXO yadrosining translokatsiyasiga yoki yadrodan chiqishiga va uning korepressorlar va ko-aktivatorlar bilan o'zaro ta'siriga ta'sir qiladi, bu esa FOXO faolligini oshirishi yoki kamaytirishi va uning turli biologik funktsiyalariga vositachilik qilishi mumkin [5,6]. Faollashtirilgandan so'ng, FOXO turli xil maqsadli genlarning transkripsiyasini tartibga solish orqali ko'plab fiziologik funktsiyalarda ishtirok etadi [7]. FOXOlar turli hujayradan tashqari stimulyatorlar, jumladan o'sish omillari, sitokinlar va gormonlar bilan faollashadi [8]. Insulin yoki insulinga o'xshash o'sish omili 1 (IGF-1) kabi o'sish signallari insulin yo'lining retseptorlari bilan o'zaro ta'sir qiladi va fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K) signalini faollashtiradi, bu esa FOXO ning fosforlanishiga olib keladi. serin/treonin kinaz, protein kinaz B (AKT) [9]. Fosforlangan FOXO yadrodan sitozolga o'tadi yoki uning sitozoldan yadroga o'tishiga to'sqinlik qiladi, bu erda u ubiquitinatsiyalanadi, bu uning proteazoma tomonidan parchalanishiga olib keladi [10]. Aksincha, tashqi o'sish signallari bo'lmasa, PI3K-AKT signalizatsiya yo'li faol emas va fosforlanmagan FOXO maqsadli gen transkripsiyasini rag'batlantirish uchun yadroga o'tadi [11]. FOXO shuningdek, umurtqasiz hayvonlarning antibakterial va virusga qarshi tug'ma immun javoblarida ishtirok etadi [12,13]. Drosophila ning qarigan ichaklarida FOXO ning surunkali faollashishi peptidoglikanni aniqlash oqsili SC2 (immunitet tanqisligi (IMD) yo'lining salbiy regulyatori) ifodasini bostiradi va ichak immun gomeostazini buzadi [14]. FOXO patogenga javob beradigan tug'ma immunitet yo'llaridan mustaqil bo'lgan ochlik stressiga javoban infektsiyalanmagan Drosophila epitelial to'qimalarida mikroblarga qarshi peptid (AMP) genlarini bevosita tartibga soladi [15]. Shu bilan birga, patogen infektsiya enterotsit FOXO ni sitoplazmadan yadroga to'g'ridan-to'g'ri Drosophila ichaklariga kirishiga olib kelishi mumkin [12]. AMPlarning FOXOga bog'liq regulyatsiyasi sutemizuvchilar epitelial to'qimalarida ham sodir bo'ladi, bu hayvonlarda evolyutsion tarzda saqlanib qolganligini ko'rsatadi [16]. Bir qator tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, FOXOlar shilliq qavatning immun reaktsiyalarida patogenlar yoki sitokin stimulyatsiyasi bilan faollashadi [17]. Ularning yadroga ko'chishi va maqsadli genlarining promotorlari bilan bog'lanishi mitogen bilan faollashtirilgan protein (MAP) kinaz yo'li bilan rag'batlantiriladi va PI3K/AKT yo'li bilan inhibe qilinadi. FOXO ning maqsadli genlari yallig'lanishga qarshi signalizatsiya molekulalarini, adezyon molekulalarini va kimyokin retseptorlarini o'z ichiga oladi [17]. FOXOlar patogenlarga qarshi tizimli immunitet reaktsiyalarida ishtirok etadimi yoki yo'qmi, noaniq qolmoqda. AMPlarning patogenlarga qarshi ifodalanishini rag'batlantirish umurtqasiz hayvonlarda gumoral tug'ma immunitetning muhim mexanizmidir [18]. Drosophila tug'ma immunitetida Toll va IMD yo'llari AMP ifodasini tartibga solishda ishtirok etadi va AMPlar bostirib kiruvchi patogenlarni yo'q qilishda muhim rol o'ynaydi [19-21]. Hasharotlar immunitetiga o'xshab Toll, IMD va Yanus kinaz (JAK)/signal transduser va transkripsiya yo'llarining faollashtiruvchisi (STAT) qisqichbaqasimonlarda AMP ifodasini tartibga solishda ishtirok etadi [22,23]. FOXO qisqichbaqasimonlarda patogenlar infektsiyasiga qarshi Toll, IMD va JAK/STAT yo'llaridan mustaqil ravishda AMP ifodasini tartibga sola oladimi yoki yo'qligini aniqlashtirishni talab qiladi. Humoral immunitetdan tashqari, umurtqasizlar ham patogen infektsiyaga qarshi tug'ma immunitet funktsiyalarini bajarish uchun hujayra immunitetiga tayanadi. Gemositlar tomonidan fagotsitoz patogen infektsiyaga qarshi hujayra immunitetining muhim mexanizmlaridan biridir [24]. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, FOXO vositachiligida otofagiya tabiiy qotil (NK) hujayra rivojlanishi uchun zarurdir [25]. Bundan tashqari, FOXO neytrofillar tomonidan bakterial fagotsitozni rag'batlantirishda ishtirok etadi [26]. Qisqichbaqasimonlarda NK hujayralari yoki neytrofillar kabi maxsus immun hujayralari mavjud bo'lmasa-da, qisqichbaqalar gemositlari fagotsitoz orqali patogen bakteriyalar infektsiyasiga qarshi tizimli tug'ma immunitetni qo'llashi mumkin [27]. Biroq, FOXO qisqichbaqalardagi gemositlarning patogen fagotsitozida ishtirok etadimi yoki yo'qmi, aniq emas. Qisqichbaqalar akvakulturasi hayvonlar oqsillarini ishlab chiqarish bo'yicha dunyodagi eng tez rivojlanayotgan tarmoqlardan biri bo'lib, butun dunyo bo'ylab hayvon oqsillariga bo'lgan talabni qondirishga katta hissa qo'shdi. Hozirgi vaqtda qisqichbaqalarning global ishlab chiqarilishi taxminan 4,88 million tonnani tashkil etadi, uning qiymati 39 milliard dollarni tashkil etadi [28]. Biroq, ko'p sonli hayvonlarni birga boqish hayvonlarning sezilarli stressiga olib keladi, bu esa patogenlar, jumladan, bakteriyalar va viruslar, ko'payish va klinik kasalliklarni osonlashtiradi, bu esa sanoat uchun katta iqtisodiy yo'qotishlarga olib keladi [29]. Qisqichbaqalar immunitet mexanizmlarini o'rganish kasallikning oldini olish va nazorat qilish uchun yangi strategiyalarni taqdim etishi mumkin [30]. Ushbu tadqiqotda biz kuruma qisqichbaqalarida (Marsupenaeus japonicus) FOXO ni aniqladik. Foxo ifodasini nokdaun qilgandan so'ng, Vibrio anguillarum sinovidan so'ng, biz bakteriyalarni tozalash qobiliyati va qisqichbaqalarning omon qolish darajasi sezilarli darajada pasayganini aniqladik. Keyingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, FOXO to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita AMPlarning ifodalanishiga yordam berdi va qisqichbaqalardagi bakteriyalarning fagotsitozini kuchaytirdi. Qisqichbaqalarda patogen infektsiyaga qarshi FOXO ta'sirining mumkin bo'lgan mexanizmlari tahlil qilindi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Natijalar

FOXO o'ziga xos qisqichbaqalarda bazal darajada ifodalanadi va V. anguillarum bilan kurashgan qisqichbaqalarda yuqori tartibga solinadi.

M. japonicus gemositlari transkriptomi ketma-ketligidan biz Foxoning to'liq uzunlikdagi cDNK ketma-ketligini oldik (GenBank kirish raqami: MW080526). Domenni taqqoslash shuni ko'rsatdiki, bashorat qilingan FOXO oqsili FOXO1, FOXO3, FOXO4 va FOXO6 kabi Homosapiens FOXOlariga o'xshash Forkhead (FH) domeniga ega va shunga o'xshash AKT fosforillanishiga ega (S1A-rasm). Filogenetik tahlil natijalari shuni ko'rsatdiki, FOXOlar umurtqali va umurtqasiz FOXOlarni o'z ichiga olgan ikkita klasterga bo'lingan va FOXO qisqichbaqasi filogenetik daraxtdagi umurtqasizlar shoxchasida to'plangan (S1B rasm). Inson FOXO'lariga o'xshash [31] qisqichbaqalar FOXO hujayradan tashqari regulyatsiya qilingan kinaz (ERK) fosforillanishni o'zgartirish joylariga va CREB bog'lovchi oqsilni (CBP) asetilatsiyani o'zgartirish joylariga ega, ammo sir tuin 1 (SIRT1) deatsetilatsiyani o'zgartirish joylari va c-JUN N-terminaliga ega emas. kinaz (JNK) fosforillanishni o'zgartirish joylari (S2-rasm). Qisqichbaqalar FOXO ni taniydigan poliklonal antikorlar Escherichia coli da ifodalangan FOXO ning rekombinant FH domeni yordamida tayyorlangan (1A-rasm). FOXO ning mRNK va oqsil darajasida to'qimalar taqsimotini tahlil qilish uning barcha tekshirilgan to'qimalarda ifodalanganligini ko'rsatdi (1B-rasm). V. anguillarum tomonidan qo'zg'atilgan qisqichbaqalarning gemositlari va ichaklarida FOXO ekspressiyasining vaqt kursi qPCR va western blotting yordamida tahlil qilindi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, FOXO gemositlar va ichaklarda mRNK darajasida (1C va 1D-rasm) va oqsil darajasida (1E va 1F-rasm) ko'tarilgan. Ushbu natijalar FOXO ning V. anguillarum infektsiyasiga javob berishda ishtirok etishini ko'rsatdi va bizni qisqichbaqalar immunitetida FOXO funktsiyasini o'rganishga undadi.

FOXO sog'lom qisqichbaqalarda gemolimfa va ichak mikroflorasining gomeostazini tartibga solishda ishtirok etadi.

Qisqichbaqalarda gemolimfa va ichak mikroflorasi gomeostazida FOXO funktsiyasini o'rganish uchun RNK aralashuvi amalga oshirildi va bakterial yuk tahlil qilindi. Natijalar Foxo-RNAi qisqichbaqalarida Foxo ifodasi sezilarli darajada kamayganligini ko'rsatdi (2A va 2B-rasm). Foxo RNAi ning maqsaddan tashqari ta'siri Fox oilasining boshqa genlarining (shu jumladan Foxk2 va Foxn3) ifodasini aniqlash orqali ham tahlil qilindi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, Foxo'ning ishdan chiqishi Foxk2 yoki Foxn3 ifoda darajalarini kamaytirmagan (S3A-S3C-rasm). Vestern blot va lyuminestsent immunotsitokimyoviy tahlillardan foydalanib, Foxoning o'chirilishidan so'ng bakteriyalar tomonidan e'tiroz bildirilgan qisqichbaqalarning ichaklari va gemositlarida FOXO ning hujayra osti tarqalishini kuzatdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, dsGfp guruhi bilan solishtirganda, qisqichbaqalar V. anguillarum (S3D–S4E' anjir) bilan kasallangan bo'lsa ham, Foxo-RNAi qisqichbaqalarida yadrodagi FOXO darajasi sezilarli darajada pasaygan. Yuqoridagi barcha natijalar bizning Foxo RNAi tahlilimiz gemositlar va ichaklarda (shu jumladan sitoplazma va yadroda) Foxoni o'chirishi mumkinligini ko'rsatdi. Keyinchalik, biz qisqichbaqalarda Foxo nokdaun qilinganidan keyin gemolimfa va ichaklardagi bakterial yukni normal sharoitda (bakterial muammosiz) tahlil qildik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, gemolimfa va ichaklardagi bakteriyalar soni Foxo ifodasi muvaffaqiyatli yiqitilgandan so'ng sezilarli darajada oshgan (2C va 2D-rasm). Biz Foxo-RNAi qisqichbaqalarining bakterial muammosiz omon qolish darajasini yanada tahlil qildik va natijalar Foxo-nockdown qisqichbaqalarining omon qolish darajasi nazorat bilan solishtirganda sezilarli darajada kamayganligini ko'rsatdi (2E-rasm). Ushbu natijalarni qo'shimcha tekshirish uchun biz antibiotiklar bilan davolangan Foxo-RNAi qisqichbaqalarining omon qolish darajasini tahlil qildik va natijalar dsGfp guruhi bilan solishtirganda mikrobsiz qisqichbaqalarning omon qolish darajasi sezilarli darajada kamaymaganligini ko'rsatdi (2F-rasm). Barcha natijalar FOXO normal sharoitda qisqichbaqalarda in vivo mikrobiota (jumladan, gemolimfa va ichak mikrobiota) gomeostazida rol o'ynashini ko'rsatdi.

cistanche qo'shimchasi foydalari - immunitetni oshiradi

FOXO sog'lom qisqichbaqalarda Relish va Amp ifodasini rag'batlantirish orqali gemolimfa va ichak mikroflorasi gomeostazini tartibga solishda ishtirok etadi.

Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, sog'lom qisqichbaqalar aylanib yuruvchi gemolimfada kam, ammo barqaror miqdordagi bakteriyalar va oshqozon-ichak traktida doimiy miqdorda bo'lsa-da bakteriyalar va kappa B (NF) yadro omili bilan boshqariladigan antimikrobiyal peptidlar (AMP) kabi immunitet effektorlarini o'z ichiga oladi. Ikki oksidaza (DUOX) yo'li bilan boshqariladigan -kB) yo'li va reaktiv kislorod turlari (ROS) gemolimfa va ichak mikrobiotasida gomeostazda muhim rol o'ynaydi [32-34]. Oddiy sharoitlarda FOXO ning gemolimfa va ichak mikroflorasi gomeostazini tartibga solishda ishtirok etish mexanizmini o'rganish uchun biz birinchi navbatda FOXO ning gemotsitlar va ichaklarda normal sharoitda subhujayra taqsimlanishini aniqladik. Natijalar normal sharoitda qisqichbaqa gemositlari va ichak hujayralari yadrolarida FOXO ning zaif signalini ko'rsatdi (3A va 3B-rasm), bu oddiy sharoitda qisqichbaqalardagi in vivo mikrobiota tomonidan ozgina FOXO faollashtirilganligini ko'rsatdi. AMP ifodasi Drosophila [35] ichaklaridagi IMD yo'li bilan tartibga solinadi. Shuning uchun biz Relish transkripsiya omili FOXO ning maqsadli geni bo'lishi mumkin deb taxmin qildik. Biz Foxo yiqitgandan so'ng qisqichbaqalar gemositlari va ichaklarida IMD yo'lining transkripsiya omili bo'lgan Relishning mRNK ifodasini aniqladik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, Relish ifodasi Foxo-nockdown qisqichbaqalarida (3C va 3D-rasm) sezilarli darajada kamaydi va shunga o'xshash natijalar oqsil darajasida (3E va 3E-rasm) olingan. Natijalar shuni ko'rsatdiki, FOXO Relish ifodasini rag'batlantirishi va IMD yo'lini faollashtirishi mumkin. FOXO gemo-limfa va oshqozon-ichak trakti gomeostazida IMD signalizatsiyasi orqali ishtirok etishini tasdiqlash uchun mikrobsiz qisqichbaqalar olindi (3F-rasm) va RELISH faollashuvi va AMP ifodasi aniqlandi. Nazorat bilan solishtirganda, ichak hujayralari va gemositlar yadrolarida FOXO va RELISH miqdori sezilarli darajada kamaydi (3G va 3H-rasm). Shu bilan birga, mikrobda FOXO va/yoki RELISH tomonidan tartibga solinishi mumkin bo‘lgan AMP lar, jumladan Crustins (CrusI-2 dan 5 gacha) va Anti-lipopolisaxarid omillari (Alf A1, B1, C1, D1 va E1) ifodasi tekshirildi. -bepul qisqichbaqalar va natijalar shuni ko'rsatdiki, CrusI-3, Alf-B1 va Alf-C1 qisqichbaqalarning gemotsitlari va ichaklarida sezilarli darajada kamaygan (3I va 3J-rasm). Alf-B1 va Alf C1 ifodasi IMD yo'li [36] tomonidan tartibga solinganligini hisobga olsak, bu natijalar FOXO gemolimfa va oshqozon-ichak traktining normal sharoitda IMD yo'li orqali ifodalanishini rag'batlantirish uchun gomeostazni tartibga solishda ishtirok etishini ko'rsatdi. AMP.

1-rasm. V. anguillarum bilan kurashgan qisqichbaqalarda FOXO yuqori darajada tartibga solingan. (A) Quyonlarda tayyorlangan FOXO ga qarshi poliklonal antikorlar yordamida FOXO ni aniqlash uchun E. coli va g'arbiy blottingda FOXO ning FH domenining rekombinant ifodasi. Lane 1, Foxo-pGEX4T-1 bilan E. coli umumiy oqsillari. Lane 2, IPTG induktsiyasidan keyin bakteriyalarning umumiy oqsillari. Lane 3, tozalangan rekombinant FOXO. Lane 4, ishlov berilmagan qisqichbaqalar ichaklarida FOXO western blotting yordamida aniqlandi. M, Protein molekulyar massasi belgilari. (B) Foxo ning mRNK (yuqori panel) va oqsil (pastki panel) darajalarida to'qimalar taqsimoti mos ravishda RT-PCR va g'arbiy blotting tomonidan aniqlandi. ACTB -aktin so'zining qisqartmasi. (C, D) Gemositlarda (C) va ichaklarda (D) Foxoning mRNK ifoda namunalari endogen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef-1 ning geometrik o'rtacha ifodasi yordamida qPCR orqali tahlil qilindi. (E, F) Gemositlarda (E) va ichaklarda (F) FOXO ning protein ifodasi naqshlari g'arbiy blot bilan aniqlandi. Pastki panellarda uchta takroriy statistik tahlil natijalari ko'rsatilgan. Western blotdagi bantlar uchta mustaqil takrorlashdan bantlarni skanerlash orqali ImageJ dasturi yordamida raqamlashtirildi. FOXO/-aktinning nisbiy ifoda darajalari o'rtacha ± SD sifatida ifodalangan va nazorat qisqichbaqasining qiymati bitta qilib belgilangan. Rasmdagi xato chiziqlari SD-larni ko'rsatadi (uchta nusxa).

FOXO qisqichbaqalarda V. anguillarum chaqiruvi bilan faollashadi va gemolimfa va ichaklarning patogenlarini tozalashda ishtirok etadi.

Xabar qilinishicha, FOXO bakterial yoki sitokin stimulyatsiyasi bilan faollashishi mumkin va sutemizuvchilarda ma'lum maqsadli genlarning ifodasini tartibga solish uchun yadroga ko'chiriladi [17]. Bakteriyalar tomonidan qo'zg'atilgan qisqichbaqalarda FOXO faollashtirilgan yoki yo'qligini aniqlash uchun qisqichbaqalar ichaklarida FOXO ning hujayra ichidagi tarqalishi western blotting yordamida tahlil qilindi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, ichak hujayralari sitoplazmasidagi FOXO miqdori V. anguillarum chaqiruvidan keyin 2 dan 4 soatgacha asta-sekin kamayadi (4A-rasm). Aksincha, ichak hujayralarining yadrosida FOXO miqdori V. anguillarum bilan infektsiyadan keyin sezilarli darajada oshdi (4B-rasm). FOXO ning tizimli immunitetdagi rolini tahlil qilish uchun V. yillik larum stimulyatsiyasidan 2 soat keyin qisqichbaqa gemositlarida FOXO ning yadro translokatsiyasini kuzatish uchun floresan immunotsitokimyoviy tahlildan foydalanildi. Biz bakterial sinovdan kelib chiqqan FOXO ning yadroga translokatsiyasi sezilarli darajada oshganini aniqladik, ammo PBS bilan bog'liq qisqichbaqalarda aniq o'zgarish yo'q (4C va 4C-rasm). Yadro orqali ko'chirilgan FOXO patogenlarni tozalashda ishtirok etadimi yoki yo'qligini o'rganish uchun biz bakterial sinovdan keyin 6 soatdan keyin Foxo-nockdown qisqichbaqasidagi gemolimfa va ichakdagi bakterial yukni tahlil qildik. Biz Foxoni yiqitgandan so'ng, gemolimfa va ichaklardagi bakteriyalar yuki nazorat guruhlaridagiga nisbatan sezilarli darajada oshganligini aniqladik (4D-rasm). Bundan tashqari, V. anguillarum bilan kasallangan Foxo-nockdown qisqichbaqalarining omon qolish darajasi nazorat bilan solishtirganda sezilarli darajada kamaydi (4E-rasm). Ushbu natijalar FOXO ning ichak hujayralari va gemositlarda faollashtirilganligini ko'rsatdi va FOXO bakterial infektsiyaga qarshi mahalliy va tizimli immunitet reaktsiyalarida ishtirok etishini ko'rsatdi.

2-rasm. FOXO ichak (mahalliy) va tizimli antibakterial immun javoblarda ishtirok etadi. (A, B) qPCR (A) va western blotting (B) yordamida aniqlanganidek, qisqichbaqalarning gemositlarida (A) va ichaklarida (B) Foxo-RNAi samaradorligi. Endogen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef-1 ning geometrik o'rtacha ifodasi yordamida qPCR sana tahlili. Xato satrlari SD-larni ko'rsatadi. (C) Foxo-nockdown qisqichbaqasining gemolimfa bakteriyalarini qattiq LB kulturasi bilan aniqlash (uchta takrorlash); Nazorat sifatida dsGfp in'ektsiyasi ishlatilgan. Suyultirish nisbati 1:10 edi. (D). Foxo nokdaun qisqichbaqalari va dsGfp-in'ektsiya qisqichbaqalarida bakterial muammosiz gemolimfa va ichaklardagi bakteriyalar soni. (E). Foxo-RNAi qisqichbaqalarining bakterial muammosiz omon qolish darajasi. Nazorat sifatida dsGfp in'ektsiyasi ishlatilgan. (F). Antibiotiklar bilan davolangan Foxo-RNAi qisqichbaqalarining omon qolish darajasi. Nazorat sifatida dsGfp in'ektsiyasi ishlatilgan. Oddiy: antibiotiklar bilan davolanmagan yovvoyi turdagi qisqichbaqalar.

3-rasm. FOXO ning bazal miqdori gemositlar va ichak hujayralarining yadrolariga o'tadi, Relish ifodasini targ'ib qiladi va keyinchalik normal sharoitda gemolimfa va ichak mikrobiotasi gomeostazini tartibga solish uchun IMD yo'lini faollashtiradi. (A) Oddiy qisqichbaqalar gemositlarida FOXO ning hujayra osti taqsimlanishini aniqlash uchun immunotsitokimyodan foydalanilgan. Masshtab satri=20 mkm. Cy: sitoplazma; Nu: Yadro. (B) Western blotting oddiy qisqichbaqalar va V. anguillarum bilan kasallangan qisqichbaqalardan ichak hujayralarida FOXO ning hujayra osti tarqalishini aniqlash uchun ishlatilgan. (C) Endogen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef-1 ning o'rtacha geometrik ifodasi yordamida qPCR orqali Foxo nokautidan so'ng qisqichbaqa gemositlarida mRNK darajasida Relish ifodasi aniqlandi. (D) Foxo yiqitilgandan so'ng qisqichbaqalar ichaklarida mRNK darajasida Relish ifodasi endogen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef-1 ning geometrik o'rtacha ifodasi yordamida qPCR yordamida aniqlandi. (E) RELISH darajasi Foxo yiqitilgandan keyin qisqichbaqalarda western blotting yordamida aniqlandi. (E') E panelining uchta nusxasi ImageJ dasturi yordamida raqamlashtirildi. (F) Qisqichbaqalarda antibiotiklar bilan davolashdan 24 soat keyin gemolimfa va ichaklarning bakterial yuki. (G) Yadrodagi FOXO antibiotiklar bilan davolashdan 24 soat o'tgach, qisqichbaqalarning gemositlari va ichaklarida western blotting yordamida aniqlandi. (H) Yadrodagi RELISH qisqichbaqalar gemositlari va ichaklarida antibiotiklar bilan davolashdan 24 soat o'tgach, g'arbiy blotting yordamida aniqlandi. (I, J) Mikrobsiz qisqichbaqalarning gemositlari (I) va ichaklaridagi (J) Amp ifodasi ichki mos yozuvlar genlari sifatida -aktin va Ef{14}} yordamida qPCR yordamida aniqlandi. Nazorat sifatida oddiy qisqichbaqalar (H2O in'ektsiyasi) ishlatilgan.

Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, FOXO transkripsiya faolligi fosforillanish modifikatsiyasi bilan tartibga solinadi va serin/treonin kinaz AKT Forkhead transkripsiya omillarini fosforlash va ularning noaniq translokatsiyasini inhibe qilish orqali ularning faoliyatini tartibga soladi [9,37]. Patogen bakteriya infektsiyasidan so'ng yadrodagi FOXO ning ko'payishiga AKT ta'sir qiladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz qisqichbaqalar Aktni yiqitgandan keyin sitoplazma va yadrodagi FOXO tarkibini birinchi navbatda western blotlash yo'li bilan aniqladik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, gemositlar va ichak hujayralari yadrosidagi FOXO miqdori qisqichbaqalarda V. anguillarum infektsiyasidan 2 soat o'tgach (5C va 5C'-rasm) Akt ifodasi (5A va 5B-rasm) nokauta qilinganidan keyin sezilarli darajada oshgan. Eksperimental natijalarni tekshirish uchun biz, shuningdek, Aktni yiqitgandan so'ng, qisqichbaqalar gemositlarida FOXO ning hujayra ichidagi tarqalishini kuzatish uchun immunotsitokimyoviy tahlildan foydalandik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, Akt V. anguillarum bilan infektsiyadan keyin 2 soat o'tgach, gemositlar yadrosida FOXO sezilarli darajada ko'paygan (5D va 5D'-rasm). Qo'zg'atuvchining infektsiyasi AKT faoliyatiga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini o'rganish uchun biz inson p-AKT (Ser473) antikoridan foydalangan holda patogen infektsiyadan keyin AKT ning fosforillanish o'zgarishini aniqladik (AKT qisqichbaqalarining fosforlanish joyi Ser486) va fosforlangan AKT darajasi sezilarli darajada kamayganligini aniqladik. V. anguillarum infektsiyasidan 30 daqiqadan so'ng qisqichbaqalarning gemositlari va ichaklari (5E va 5F-rasm). Ushbu natijalar patogen infektsiyaning fosforlangan AKT darajasini pasaytirishi mumkinligini ko'rsatdi, bu ferment faolligini inhibe qiladi va AKT ning FOXO ni fosforillash qobiliyatini pasaytiradi. Fosforlanmagan FOXO yadroga kiradi va uning maqsadli genlarining ifodalanishini keltirib chiqaradi. rasm SDlarni bildiradi.

cistanche ekstrakti

Patogen infektsiya AKT faolligini pasaytiradi va FOXO yadro translokatsiyasini keltirib chiqaradi

FOXO bakteriyalar bilan kasallangan qisqichbaqalarda mikroblarga qarshi peptidlar ifodasini tartibga solish orqali bostirib kiruvchi bakteriyalarga qarshi immunitetni himoya qiladi.

FOXO qisqichbaqalardagi bakterial infektsiyaga qarshi javobga ta'sir qilish mexanizmini o'rganish uchun biz birinchi navbatda FOXO tomonidan tartibga solinadigan immun effektor genlarini aniqladik. V. anguillarum muammosi boʻlgan yoki boʻlmagan qisqichbaqalarning gemositlari va ichaklarida Foxo muvaffaqiyatli nokdaun qilinganidan soʻng, CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 va Alf-E1 ning ifoda darajalari jim boʻlgan qisqichbaqalarda sezilarli darajada kamaydi. nazorat guruhidagilar bilan (6A va 6B-rasm). Natijalarni qo'shimcha tekshirish uchun biz Akt yiqitilgandan keyin to'rtta AMP ifodasini aniqladik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, to'rtta AMP ifodasi V. anguil larum infektsiyasidan keyin 6 soatdan keyin nazorat guruhidagiga nisbatan sezilarli darajada oshgan (6C va 6D-rasm). Oddiy holatda (3I va 3J-rasm) yuqori tartibga solinadigan AMP (jumladan, Alf-B1 va Alf-C1) bilan solishtirganda, V. bilan kasallangan qisqichbaqalarda qo'shimcha AMP geni (CrusI-3, Alf-E1) ham yuqori tartibga solingan. anguillarum (6A va 6B-rasm). Oldingi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, RELISH qisqichbaqalarda Alf-B1 va Alf-C1 ekspressiyasini rag'batlantiradi [36]. Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, FOXO CrusI-3 va Alf-E1 kabi AMP ifodasini IMD signalizatsiya yo'lidan mustaqil ravishda to'g'ridan-to'g'ri boshqarishi mumkin. Gipotezani tasdiqlash uchun FOXO Alf-E1 promouteriga bog'lanishi mumkinligini aniqlash uchun ChIP tahlili o'tkazildi. Alf-E1 ning promotorlar ketma-ketligi olingan (S4-rasm) va FOXO bilan bog'lanish joylari taxmin qilingan (6E-rasm). ChIP natijasi FOXO Alf-E1 promouteriga ulanishi mumkinligini ko'rsatdi (6F-rasm). Ushbu natijalar FOXO qisqichbaqalardagi AMPlarning ifodasini to'g'ridan-to'g'ri tartibga solish orqali antibakterial immunitetda ham ishtirok etishini ko'rsatdi.

4-rasm. V. anguillarum tomonidan chaqirilgan qisqichbaqalarda FOXO yadrosiga ko'chiriladi. (A, B) Bakteriyalar tomonidan e'tirozlangan qisqichbaqalar ichak hujayralarining sitoplazmasida (A) va yadrosida (B) FOXO taqsimoti, g'arbiy blot (A va B pastki panellari) yordamida tahlil qilingan. G'arbiy blotting bantlari ImageJ dasturi yordamida uchta takroriy tasmalarni skanerlash orqali raqamlashtirildi. FOXO/ -aktin yoki FOXO/Histon 3 ning nisbiy ifoda darajalari o'rtacha ± SD sifatida ifodalangan va nazorat qisqichbaqasining qiymati bitta qilib belgilangan. (C) 2 soatdan keyin qisqichbaqalar gemositlarida FOXO ning yadroviy translokatsiyasi. anguillarum chaqiruvi floresan immunotsitokimyoviy tahlillar yordamida aniqlandi. PBS in'ektsiyasi nazorat sifatida ishlatilgan. Masshtab satri=20 mkm. (C') C panelining statistik tahlili Gemositlarda FOXO va DAPI bilan bo'yalgan yadrolarning kolokalizatsiyasi WCIF ImageJ dasturi tomonidan tahlil qilindi. (D) Foxo-nokdaun qisqichbaqalarining gemolimfa va ichaklaridagi bakteriya soni V. anguillarum in'ektsiyasidan keyin; Nazorat sifatida bakterial in'ektsiyadan keyin qisqichbaqalarda dsGfp-in'ektsiya ishlatilgan. (E) V. anguillarum bilan kasallangan Foxo-RNAi qisqichbaqalarining omon qolish darajasi. Nazorat sifatida dsGfp in'ektsiyasi ishlatilgan.

FOXO SRC ifodasini rag'batlantirish orqali bakteriyalarga qarshi gemositlarning fagotsitozini rag'batlantiradi

Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, FOXO sutemizuvchilarda neytrofillar fagotsitozini tartibga solish uchun CXCR2 va CD11b ning promotor hududlari bilan bevosita o'zaro ta'sir qiladi [26]. FOXO qisqichbaqalar antibakterial immunitetida gemositlar fagotsitozi bilan bog'liqligini tekshirish uchun biz turli usullar yordamida Foxo bilan aralashuvdan so'ng fagotsitlar tezligini tekshirdik. Foxo nokdaun qilingandan so'ng, Foxo-nockdown guruhining fagotsitar tezligi va fagotsitar indeksi nazorat guruhiga (dsGfp) qaraganda ancha past edi (7A va 7A-rasm). Foxoning o'chirilishidan keyin gemositlarning fagotsitlar tezligini aniqlash uchun biz oqim sitometriyasidan ham foydalandik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, Foxo-RNAi guruhining fag sitoz darajasi ham dsGfp guruhiga nisbatan sezilarli darajada pasaygan (7B va 7B-rasm). Ushbu natijalarni qo'shimcha tasdiqlash uchun biz Akt yiqitilgandan keyin fagotsitlar tezligini ham tekshirdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, nazorat guruhidagilarga nisbatan fagotsitlar tezligi va fagotsitar indeks sezilarli darajada oshgan (7C va 7C-rasm). Ushbu natijalar FOXO qisqichbaqalardagi gemositlarning fagotsitoziga yordam berishini ko'rsatdi. FOXO qisqichbaqalarda gemositlar fagotsitozini qanday kuchaytirishini o'rganish uchun biz qisqichbaqalar fagotsitozida ishtirok etgan ilgari xabar qilingan genlarning ifodasini aniqladik. B (SRB) va C klassi (SRC) toifasidagi tozalovchi retseptorlari gemositlar fagotsitozida ishtirok etishi xabar qilingan [38,39]. Biz gemositlar va ichaklarda Foxoning ovozini yo'qotgandan so'ng Srb emas, balki Src ning mRNK ifoda darajasi sezilarli darajada kamayganini aniqladik (7D va 7E-rasm), qisqichbaqalarda Akt yiqilgach, Src ifodasi sezilarli darajada oshdi (7F-rasm). Xuddi shunday natijalar oqsil darajasida ham olingan (7G va 7G-rasm). Ushbu natijalar FOXO SRC ifodasini rag'batlantirish orqali qisqichbaqalardagi patogenlarning gemosit fagotsitozini rag'batlantirishini ko'rsatdi.

FOXO qisqichbaqalarda fagotsitoz paytida RAB5 va RAB7 ifodalanishiga yordam beradi.

Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, kichik GTPazalar, RAB5 va RAB7 yangi endotsitozlangan pufakchalarni erta va kech endosomalarga tashishning asosiy regulyatorlari hisoblanadi [40]. RAB5 dastlabki termoyadroviy hodisalarning asosiy regulyatori va erta endosomalarning belgisidir [41,42]. RAB7 kech fagosoma-lizosoma sintezi uchun zarur va kech endosomalarning belgisi hisoblanadi [43]. RAB5 va RAB7 qisqichbaqalarda patogenlarni tozalashda ishtirok etadimi yoki yo'qligini o'rganish uchun biz birinchi navbatda Rab5 va Rab7 ekspressiya naqshlarini tahlil qildik va bakteriyalar bilan kurashgan qisqichbaqalarda ikkita kichik GTPazalar yuqori darajada tartibga solinganligini aniqladik (S5A-S5D-rasm). Biz Rab{15}}RNAi va Rab{16}}RNAi qisqichbaqalarining bakterial sinovdan so‘ng omon qolish darajasini yanada tahlil qildik va natijalar Rab5 va Rab7 qisqichbaqalarining omon qolish darajasi nazorat qisqichbaqasi bilan solishtirganda sezilarli darajada kamayganligini ko‘rsatdi ( S5E va S5F rasm). Ushbu natijalar RAB5 va RAB7 bakterial patogenlarga qarshilik ko'rsatishda muhim funktsiyalarni bajarishini ko'rsatdi. RAB5 va RAB7 ning FOXO vositachiligidagi fagotsitozda ishtirok etishini o'rganish uchun qisqichbaqalarda Foxo ifodasi bilan aralashuvdan so'ng Rab5 va Rab7 ning mRNK ifoda darajalarini tekshirdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, Rab5 va Rab7 ifoda darajalari gemositlar va ichaklarda sezilarli darajada kamaydi (8A va S6A-rasm). qisqichbaqalarda Akt yiqilgach, Rab5 va Rab7 ifodasi sezilarli darajada oshdi (8B-rasm). Yuqoridagi natijalarni yanada tasdiqlash uchun Foxo yoki Akt nokdaun qisqichbaqalarida RAB5 va RAB7 oqsillari darajasi ham aniqlandi. DsGfp in'ektsiya guruhi bilan solishtirganda, RAB5 va RAB7 darajalari Foxo-nockdown qisqichbaqalarda gemotsitlar va ichaklarda ham sezilarli darajada kamaydi, lekin V. anguillarum tomonidan stimulyatsiya qilinganidan keyin 2 soatdan keyin Akt-nockdown qisqichbaqalarida sezilarli darajada oshdi (8C-8D'; S6B-rasmlar). va S6B'). Ushbu natijalar RAB5 va RAB7 qisqichbaqalardagi gemositlarning FOXO vositachiligidagi fag sitozida ishtirok etishini ko'rsatdi. Bundan tashqari, biz RAB5 va RAB7 qisqichbaqalar gemositlarida V. anguillarum bilan birgalikda lokalizatsiya qilinganligini aniqladik (9-rasm). Birgalikda olingan natijalar RAB5 va RAB7 qisqichbaqalarda FOXO vositachiligidagi fagotsitozda ishtirok etishini ko'rsatdi.

5-rasm. Patogen infektsiyasi AKT faolligini pasaytirdi, bu esa qisqichbaqalarning gemositlari va ichak hujayralarida FOXO yadroviy translokatsiyasiga yordam berdi. (A, B) Endogen nazorat genlari (A) va g'arbiy blot (B) sifatida -aktin va Ef-1 ning geometrik o'rtacha ifodasidan foydalangan holda qPCR yordamida qPCR orqali aniqlangan qisqichbaqa gemositlari va ichaklarida Akt-RNAi samaradorligi. (C) Akt-knockdown qisqichbaqasidan olingan ichak sitoplazmasi va yadrosidagi FOXO miqdori western blot usulida tahlil qilindi. dsGfp boshqaruv sifatida ishlatilgan. (C') Panelning statistik tahlili (C). ImageJ dasturi uch takroriy rasmlarni skanerlash orqali bantlarni raqamlashtirish uchun ishlatilgan. (D) Akt-nockdown qisqichbaqa gemositlarida FOXO ning yadroviy translokatsiyasi lyuminestsent immunotsitokimyoviy tahlil yordamida V. anguillarum sinovidan 2 soat keyin aniqlandi. dsGfp boshqaruv sifatida ishlatilgan. Masshtab satri=20 mkm. (D') (D) ning statistik tahlili. WCIF ImageJ dasturi ekspozitsiya qiymatini aniqlagandan so'ng gemositlarda anti-FOXO (yashil) va DAPI bilan bo'yalgan yadro (ko'k) ning floresans intensivligi nisbati bilan birgalikda lokalizatsiyani tahlil qilish uchun ishlatilgan. (E, F) V. anguillarum tomonidan chaqirilgan qisqichbaqalarning gemositlari (E) va ichaklaridagi (F) fosforlangan AKT (p-AKT) tarkibining o'zgarishi. Pastki panellar mos ravishda western blotting va statistik tahlil chiziqlariga asoslangan (E) va (F) raqamlarining raqamlangan raqamlari.

Cistanche choyi

Munozara

FOXO juda muhim transkripsiya omili sifatida ko'plab fiziologik va metabolik funktsiyalarda ishtirok etadi [44,45]. Ushbu tadqiqotda biz qisqichbaqalardan (M. japonicus) FOXO ni aniqladik va u normal sharoitda AMP ifodasini tartibga solish orqali gemolimfa va ichak mikrobiotasining gomeostazini tartibga solishda ishtirok etishini aniqladik. FOXO qisqichbaqalarda bakterial infektsiya bilan faollashishi va yadroga ko'chirilishi mumkin, bu erda u to'g'ridan-to'g'ri va bilvosita (IMD yo'li bilan) AMPlarning ifodasini tartibga soladi. FOXO patogenlarga qarshi gemositoz fagotsitozini rag'batlantirish uchun SRC va kichik GTPazlar, RAB5 va RAB7 kabi fagotsitoz bilan bog'liq genlarning ifodasini kuchaytirdi. Shuning uchun FOXO qisqichbaqasi patogenlarga qarshi tizimli va mahalliy (ichki ichak) immunitet reaktsiyalarida turli rol o'ynaydi (10-rasm). Inson FOXOlari bilan solishtirganda, qisqichbaqalar FOXO nisbatan saqlanib qolgan amino kislotalar ketma-ketligiga va AKT fosforillanish joylariga ega; ammo, qisqichbaqalar FOXO ning ikkinchi AKT fosforillanish joyi serin o'rniga treonindir. FOXO ning AKT fosforillanishi FOXO ning yadro va sitoplazmatik transportini boshqaradi [9]. Ushbu tadqiqotda biz AKT FOXO ning yadroviy kirishini nazorat qilish bilan bog'liqligini aniqladik. V. anguillarum infektsiyasidan so'ng, fosforlangan AKT darajasi sezilarli darajada kamaydi, bu patogen-infektsiyalangan qisqichbaqalarda AKT faolligi pasayganligini ko'rsatdi, shu bilan FOXO ning yadroviy tutilishi yoki yadro translokatsiyasini oshiradi va keyinchalik maqsadli genlarning ekspressiyasini keltirib chiqaradi, Patogen infektsiyaga qarshi turish uchun Relish va Amp kabi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, FOXO AMP ifodasi yo'lini faollashtirish uchun peptidoglikanni aniqlash oqsili SC2 (IMD yo'lining salbiy regulyatori) ifodasini bostirish orqali Drosophila ichak mikroflorasining gomeostazida ishtirok etadi [14]. RELISH Drosophilada gipoksiya bardoshliligini nazorat qilishda FOXO ning asosiy maqsadli geni sifatida xabar qilingan [46]. Boshqa hayvonlar singari, qisqichbaqalar oshqozon-ichak traktida nisbatan yuqori va doimiy mikrobiota mavjud. Ko'payib borayotgan dalillar, shuningdek, ba'zi sog'lom umurtqasizlar, shu jumladan qisqichbaqalar gemolimfasida ham barqaror miqdordagi bakteriyalar borligini ko'rsatadi [47]. Bizning oldingi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, C tipidagi lektin gemolimfa mikrobiotasining gomeostazini tartibga solishda AMP [34] ifodasini saqlab turish orqali ishtirok etadi, ammo biz AMP ifodasini tartibga solishda qanday signal yo'llari ishtirok etishini bilmaymiz. Bu erda bizning natijalarimiz FOXO normal sharoitda IMD signalizatsiyasi orqali gemolimfa va ichak mikroflorasi gomeostazini tartibga solishda ishtirok etishini ko'rsatdi. Infektsiyalanmagan qisqichbaqalarda Foxoning nokdaunti Relish ifodasini sezilarli darajada kamaytirdi va qisqichbaqalarning omon qolish darajasi bakterial infektsiyasiz ham sezilarli darajada kamaydi. Oddiy qisqichbaqa hujayralarining yadrosida ham oz miqdorda FOXO topdik. Shuning uchun biz FOXO normal sharoitda gemolimfa va ichak florasining gomeostazini tartibga solishda Relish ifodasini rag'batlantirish va keyinchalik IMD yo'li bilan AMP ifodasini kuchaytirish orqali ishtirok etadi deb o'ylaymiz. Ushbu natijalar FOXO qisqichbaqalarda gemolimfa va oshqozon-ichak traktining mikrobiota gomeostazini rag'batlantirish uchun mahalliy va tizimli immunitetda ishtirok etishini ko'rsatdi. Gumoral immunitet AMP batareyasini ishlab chiqarish orqali teskari tezlikda patogen infektsiyaga qarshilik ko'rsatishda hal qiluvchi rol o'ynaydi [21,48]. Gumoral javob tizimli javob sifatida gemolimfaga chiqariladigan yoki mahalliy javob sifatida epidermis yuzasiga yoki oshqozon-ichak trakti bo'shlig'iga chiqariladigan AMP ning induktiv sintezi va sekretsiyasini o'z ichiga oladi [19]. AMP ifodasi asosan meva chivinlarida Toll/Dif va IMD/Relish signalizatsiya yo'llari bilan tartibga solinadi [49]. Hozirgi vaqtda qisqichbaqalarda AMPlarning bir nechta oilalari aniqlangan, ular orasida qobiq, lipopolisaxaridlarga qarshi omillar (Alfs) va peneydinlar mavjud [50]. Ushbu tadqiqot shuni ko'rsatdiki, FOXO to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita (IMD/Relish signalizatsiyasi orqali) CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 va Alf-E1ni o'z ichiga olgan AMP ifodasini tartibga solishi mumkin. Oddiy sharoitlarda qisqichbaqalar gemositlari va ichaklarida FOXO ning past faollashuvi in ​​vivo mikrobiota gomeostazini saqlab qolish uchun Foxoning asosiy maqsadli genini, ya'ni Relishni boshqarishi mumkin deb o'ylagandik. INFEKTSION paytida invaziya qiluvchi patogenlar FOXO ni faollashtiradi, ularning aksariyati yadroga ko'chiriladi, u erda Relishdan tashqari ko'proq maqsadli genlarni, jumladan, Alf-E1 va CrusI-3 kabi ba'zi AMPlarni boshqaradi. Birgalikda FOXO gemolimfa va oshqozon-ichak traktida IMD signalizatsiyasini bazal darajada faollashtirish orqali sog'lom qisqichbaqalarda gemolimfa va ichak mikrobiota gomeostazini tartibga solishda ishtirok etadi. Patogen infektsiya AKT faolligini pasaytirish orqali FOXO ni faollashtiradi va tizimli immunitet va mahalliy (ichak) immunitetda to'g'ridan-to'g'ri va bilvosita AMPlarning ifodalanishiga yordam beradi. Fagotsitoz - bu retseptor vositachiligidagi, aktin va ATPga bog'liq bo'lgan hodisa bo'lib, zarrachalar yoki patogenlarning o'ziga xos sitomembran retseptorlari bilan bog'lanishi natijasida yuzaga keladi va mezbon o'zini patogenlardan himoya qilishi mumkin bo'lgan muhim immunitet jarayonidir [24]. RAB5 va RAB7 kabi kichik GTPazalar fagotsitozda membranani qayta qurish va vesikula trafigini davom ettirishda ishtirok etadi. Oldingi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, SRB va SRC tozalovchi retseptorlari qisqichbaqalar retseptorlari sifatida gemositlar fagotsitozida ishtirok etadi [38,39]. Ushbu tadqiqotda biz Foxo yiqitilgandan so'ng, Src ifodasi sezilarli darajada kamayganini va gemositlarning fagotsitoz tezligi sezilarli darajada kamayganini aniqladik, bu Src FOXO ning maqsadli geni ekanligini va FOXO patogen bakteriyalarning SRC vositachiligidagi fagotsitozida ishtirok etishini ko'rsatadi. FOXO, shuningdek, ikkita kichik GTPazalar, RAB5 va RAB7 ifodasini targ'ib qilishi mumkin. Bu kichik GTPazalar erta va kech fagosomalarning ketma-ket tashilishida ishtirok etadi va asosiy determinant hisoblanadi [51]. Fagosomalar hujayraning periferiyasidan hujayra ichidagi hududga ko'chib o'tadi, transport paytida RAB5 RAB7 bilan almashtiriladi va yakuniy mahsulotlar parchalanish uchun lizosomaga o'tkaziladi [52,53]. Shuningdek, biz RAB5 va RAB7 gemositlardagi patogenlar bilan birgalikda joylashishi mumkinligini aniqladik, bu patogenlar lizosomalarda parchalanishdan oldin erta va kech fagosomalardan o'tib, qisqichbaqalardagi gemositlar tomonidan fagotsitlanganligini ko'rsatdi. Shuning uchun FOXO gemositlarning fagotsitozini rag'batlantirish orqali hujayra immun javobida ishtirok etadi. Xulosa qilib aytganda, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, FOXO nafaqat normal sharoitda mikrobiota gomeostazini tartibga solishda, balki AMP va gemositlarning fagotsitozini rag'batlantirish orqali infektsiyalangan qisqichbaqalarda patogen bakteriyalarni tozalashda ham ishtirok etadi.

6-rasm. FOXO qisqichbaqalardagi antibakterial rollarini AMPlarning ifodalanishini tartibga solish orqali bajaradi. (A, B) Endogen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef-1 ning o'rtacha geometrik ifodasi yordamida qPCR tomonidan aniqlangan Foxo-nockdown qisqichbaqalarining gemositlari (A) va ichaklaridagi (B) Amp ifodasi; Nazorat sifatida qisqichbaqalarda dsGfp in'ektsiyasi ishlatilgan. Ma'lumotlar Mann-Whiteny U testi yordamida statistik tahlil qilindi. (C, D) Akt qisqichbaqasining gemositlari (C) va ichaklaridagi (D) Amp ifodasi endogen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef-1 ning geometrik o'rtacha ifodasi yordamida qPCR orqali tahlil qilindi; Nazorat sifatida qisqichbaqalarda dsGfp in'ektsiyasi ishlatilgan. Muhim farqlar bir tomonlama ANOVA yordamida tahlil qilindi. (E) Alf-E1 promouterida FOXO ning taxminiy bog'lanish joylarining sxematik diagrammasi. (F) ChIP va RT-PCR primerlar (Alf-E1-F va Alf-E1-R, 1-jadval) yordamida Alf-E1 promotorlar ketma-ketligiga FOXO ulanishini aniqlash uchun ishlatilgan. RT-PCR, shuningdek, ChIP yordamida Alf-E1 kodlash hududini RT-PCR primerlari (Alf-E1-RT-F va Alf-E1-RT-R. 1-jadval) bilan kuchaytirish uchun ishlatilgan. shablon sifatida DNK olingan. Nazorat sifatida IgG antikorlari ishlatilgan va maqsadli bandni tasdiqlash uchun oddiy genomik DNK kuchaytirilgan fragment ishlatilgan.

7-rasm. FOXO SRC ifodasini rag'batlantirish orqali qisqichbaqalarda patogenlarning gemosit fagotsitozini kuchaytiradi. (A) V. anguillarumning gemotsit fagotsitozi floresan mikroskop ostida lyuminestsent immunotsitokimyoviy tahlil yordamida kuzatiladi. V. anguillarum FITC (yashil) bilan belgilangan va hujayra yadrolari DAPI (ko'k) bilan bo'yalgan. Qizil o'q fagotsitar gemositlarni ko'rsatadi. Masshtab satri=20 mkm. (A') Foxo-nockdown qisqichbaqalarida fagotsitlar tezligi va fagotsitar indeksning statistik tahlili. Nazorat sifatida dsGfp in'ektsiya guruhi ishlatilgan. Har bir tajribada floresan mikroskop ostida besh yuz gemosit hisoblangan. Ma'lumotlar Student's t-test yordamida statistik tahlil qilindi. (B) Oqim sitometriyasi yordamida tahlil qilingan gemositlar tomonidan bakterial fagotsitoz. Tarkibida bakteriyalar (R2) boʻlgan fagotsitozlangan gemotsitlar fagotsitlanmagan gemositlardan (R3) IDEAS Application v6.0 dasturidan foydalangan holda gemositlardagi etiketli bakteriyalarning floresans signali asosida ajratildi. (B') Oqim sitometriyasi ma'lumotlariga asoslangan gemositlarning fagotsitlar tezligi. Har bir tahlil uchun uch ming gemosit hisoblangan va uchta takrorlash amalga oshirilgan. Nazorat sifatida dsGfp guruhi ishlatilgan. (C) Akt nokdaun qisqichbaqalarida V. anguillarum gemositoz fagotsitozini floresan mikroskop ostida kuzatish. Masshtab satri=10 mkm. (C') Paneldagi ma'lumotlarga asoslangan fagotsitlar tezligi va fagotsitar indeksning statistik tahlili (C). (D) Endojen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef-1 ning o‘rtacha geometrik ifodasi yordamida qPCR yordamida tahlil qilingan Foxo nokdaun qisqichbaqasi gemositlaridagi Srb va Src mRNK ifoda darajasi. Nazorat sifatida dsGfp in'ektsiyasi ishlatilgan. (E) Foxo-RNAi qisqichbaqalarining ichaklarida Srb va Src mRNK ifodasi endogen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef-1 ning o'rtacha geometrik ifodasi yordamida qPCR tomonidan tahlil qilingan. (F) Endogen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef{17}} ning geometrik o'rtacha ifodasi yordamida qPCR orqali tahlil qilingan Akt-RNAi qisqichbaqasi gemositlarida Src ning mRNK ifodasi. (G) Foxo-RNAi yoki Akt-RNAi qisqichbaqalari gemositlaridagi SRC oqsil darajasi, g'arbiy blot yordamida tahlil qilingan. dsGfp in'ektsiyasi nazorat sifatida ishlatiladi. (G') Panelning uchta nusxasi ma'lumotlariga asoslangan statistik tahlil (G).

Materiallar va usullar

Etik bayonot

Barcha hayvonlar tajribalari Xitoy Milliy Direktivlariga (GB 14922.2–2011 va GB 14925–2010) muvofiq amalga oshirildi. Tadqiqotda antikor tayyorlash uchun quyon tajribalari Shandong Universiteti Hayot fanlari maktabi (SYDWLL-2021-54) Hayvonlarni parvarish qilish va farovonlik qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan protokollarga muvofiq amalga oshirildi. Bizning tadqiqotimizda qisqichbaqalardan foydalanish qoidalariga muvofiq tasdiqlash shart emas edi, chunki bizning tadqiqotimiz keng jamoatchilik tomonidan tez-tez iste'mol qilinadigan cheklangan miqdordagi oddiy qisqichbaqalardan foydalangan.

Hayvonlar

Har birining vazni taxminan 6-10 g bo'lgan sog'lom qisqichbaqalar (Marsupenaeus japonicus) Xitoyning Shandong viloyati Qingdao shahridagi suv mahsulotlari bozoridan olingan. Tajribadan oldin qisqichbaqalar yangi muhitga moslashish uchun kamida 1 kun davomida qisqichbaqalar ekish tizimida gazlangan dengiz suvi bilan 23-25˚C da yetishtirildi.

8-rasm. RAB5 va RAB7 qisqichbaqalardagi gemositlarning FOXO vositachiligidagi fagotsitozida ishtirok etadi. (A, B) qPCR bakterial infektsiyasi bo'lgan va bo'lmagan Foxo-knockdown qisqichbaqasi (A) va Akt-knockdown qisqichbaqasi (B) gemositlarida Rab5 va Rab7 ning mRNK ifoda darajalarini tahlil qilish uchun ishlatilgan. qPCR endogen nazorat genlari sifatida -aktin va Ef-1 ning o'rtacha geometrik ifodasidan foydalangan. (C) V. anguillarum sinovidan keyin 2 soatdan keyin Foxo-nockdown qisqichbaqa gemositlaridagi RAB5 va RAB7 oqsil darajasi western blotting yordamida aniqlanadi. (C') Panelning uchta nusxasi ma'lumotlariga asoslangan statistik tahlil (C). (D) V. anguillarum sinovidan keyin 2 soatdan keyin Akt-nockdown qisqichbaqasi gemositlaridagi RAB5 va RAB7 oqsil darajasi western blotting yordamida aniqlanadi. (D') Panelning uchta nusxasi ma'lumotlariga asoslangan statistik tahlil (D).

Bioinformatik tahlil

Foxo ning to'liq uzunlikdagi cDNK ketma-ketligi M. japonicus (BGI, Shenzhen, Xitoy) gemositlari va ichak transkripsiyasi tome sekvensiyasidan olingan. Foxoning ochiq o'qish ramkasi (ORF) ketma-ketlikni tasdiqlash uchun bir juft primer (Foxo-EX-F va Foxo-EX-R; 1-jadval) yordamida kuchaytirildi. Tegishli cDNK kontseptual ravishda ExPASy-Translation vositasi (http://cn.expasy.org/) yordamida chiqarilgan oqsil ketma-ketligini olish uchun tarjima qilingan. O'xshashlik tahlili BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/) yordamida amalga oshirildi va domen arxitekturasini bashorat qilish SMART (http://smart.eblheidelberg.de) yordamida amalga oshirildi. MEGA 6.0 dasturi [54] yordamida turli turlardan FOXOlarning filogenetik daraxti qurilgan.

9-rasm. RAB5 va RAB7 V. anguillarum bilan birgalikda joylashadi. RAB5 va RAB7 ning FITC etiketli V bilan birgalikda lokalizatsiyasi. anguillarum qisqichbaqa gemositlarida, floresan immunotsitokimyoviy tahlil yordamida tahlil qilingan. Bakteriyalar FITC (yashil) bilan etiketlangan va qisqichbaqalarga AOK qilingan. Gemositlar beshta qisqichbaqadan bakterial in'ektsiyadan keyin 30 daqiqa va 1 soat ichida to'plangan va anti-RAB5 yoki anti RAB7 antikorlari bilan inkubatsiya qilingan. Ikkilamchi antikor quyonga qarshi IgG Alexa-546 (qizil) edi. Yadrolar DAPI (ko'k) bilan bo'yalgan. Gemositlarda birgalikda lokalizatsiya oq o'qlar bilan ko'rsatilgan. Masshtab satri=10 mkm.

10-rasm. Qisqichbaqalarda mahalliy va tizimli tug'ma immunitetda FOXO ishtirokining sxematik tasviri. (A) Infektsiyalanmagan sharoitda FOXO gemolimfa va ichak mikrobiotasining gomeostazini Relish va keyinchalik AMP ifodasini rag'batlantirish orqali saqlaydi. (B) Infektsiyalangan sharoitda patogen infektsiya bilan AKT fosforillanishi kamayadi, natijada yadroda FOXO miqdori ko'payadi. FOXO to'g'ridan-to'g'ri invaziv patogenlarni yo'q qilish uchun Relish va AMPlarning ifodalanishiga yordam beradi; boshqa tomondan, FOXO SRC vositachiligidagi fagotsitoz yo'li orqali patogenlarning fagotsitozini rag'batlantiradi.

Bakterial sinov va namuna yig'ish

Vibrio anguillarum (ATCC 43305) Shandong universiteti (Vey Xay, Xitoy) dengiz kollejidan olingan va hozirda laboratoriyamizda saqlanmoqda. V. anguillarum LB muhitida bir kechada 37˚C da kultivatsiya qilindi va ikkinchi kuni 1:100 inokulyatsiyada 4 soat davomida qayta kultivatsiya qilindi. Logarifmik o'sish bosqichidagi bakteriyalar 5000 × g da 5 daqiqa davomida 4 ° C da santrifüj qilish yo'li bilan to'plangan va ikki marta fosfat tamponli sho'r suv bilan yuvilgan (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, va 1,8 mM KH24M). pH 7.4). V. anguillarum qisqichbaqalar bilan kurashish uchun fosfatli buferli sho'r suvda qayta suspenziyalangan. Taxminan 2 × 107 koloniya hosil qiluvchi birlik (CFU) / qisqichbaqalar mikroshprits yordamida har bir qisqichbaqaning qorin bo'shlig'iga AOK qilingan. Nazorat guruhiga bir xil hajmdagi PBS yuborildi. RNK va oqsillarni olish uchun kamida uchta qisqichbaqadan gemositlar, yurak, gepatopankreas, gill, oshqozon va ichaklar yig'ilgan. Gemositlarni yig'ish uchun gemolimfa 0,8 ml antikoagulyant tampon (10% natriy sitrat) bilan oldindan yuklangan shprits yordamida ventral sinusdan chiqarildi va keyin gemositlarni izolyatsiya qilish uchun 4 ° C da 8 daqiqa davomida 700 × g da tez santrifüj qilindi.

RNK va oqsillarni ajratib olish va cDNK sintezi

Umumiy RNK TRIzol (ET101, Transgen, Pekin, Xitoy) yordamida qisqichbaqalarning gemositlari va turli organlaridan olingan. Turli organlardan oqsillar Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) Lizis Buferi (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Xitoy) yordamida ekstraksiya qilingan. Birinchi zanjirli cDNK sintezi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda cDNK sintez to'plami (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vankuver, Kanada) yordamida amalga oshirildi.

Jadval 1. Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan primerlarning ketma-ketligi.

MasterMix; Amaliy biologik materiallar-abm, Vankuver, Kanada), ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq.

Rekombinant ekspresyon va antikor tayyorlash

Foxo ning cDNK ketma-ketligi Foxo-EX-F va Foxo-EX-R primerlari yordamida teskari transkripsiya polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-PCR) orqali kuchaytirildi (1-jadval). Keyin tozalangan PCR mahsulotlari cheklovchi fermentlar yordamida hazm qilindi va pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, AQSh) plazmidiga bog‘landi. va tuzilgan plazmidlar Escher ichia coli Rosseta (DE3) hujayralariga aylantirildi. Protein ifodasi 37˚C da 1 mM izopropil{10}} D-tiogalaktopiranozid yordamida induktsiya qilindi. Rekombinant oqsillar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda glutation (GST) qatroni (C600031, BBI, Shanxay, Xitoy) yordamida yaqinlik xromatografiyasiga duchor bo'ldi. FOXO ga qarshi quyon antiserumlari ilgari tavsiflangan usul bo'yicha tayyorlangan [55].

Western bloting

Turli organlardan yoki gemositlardan olingan oqsillar 10% natriy dodesil sulfat poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) yordamida ajratildi. SDS-PAGE jellaridagi oqsillar transfer buferi (25 mM Tris-HCl, 2{14}} mM glisin, 0.037% mM SDS va 20% etanol) yordamida tsellyuloza nitrat membranasiga o'tkazildi. va 5% yog'siz sut yoki 3% sigir zardobi albuminida (BSA) Tris-buferli tuzda (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8.0) xona haroratida yumshoq silkitib, 1 soat davomida inkubatsiya qilinadi. Keyin membranalar birlamchi antiserum bilan inkubatsiya qilindi: 1:100 suyultirilganda Anti-FOXO, 1:25 da anti-RAB5, 1:25 da anti Rab7, 1:250 da anti-beta aktin (ACTB) (bizning laboratoriyamizda tayyorlangan) ); Giston{29}} poliklonal antikorlar (A2348, ABclonal, Wuhan, Xitoy, 1:2500); antifosforillangan (p)-AKT poliklonal antikorlari (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Xitoy, 1:500) va kechasi 4˚C da muloyimlik bilan silkitiladi. TBST (TBS ga 0,1% Tween{41}} qo‘shilgan) bilan uch marta yuvilgandan so‘ng, membranalar ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi (ZB2308 ZSGB-Bio, Pekin, Xitoy, 1:5,000) yoki ( ZB2301 ZSGB-Bio, Pekin, Xitoy, 1:5,000) xona haroratida 3 soat davomida yumshoq chayqash bilan. Immunoreaktiv oqsil guruhlari qorong'u sharoitda nitrotetrazolium ko'k xlorid (A610379, BBI) va P-toluidin tuzi (A610072, BBI) eritmasi yoki kuchaytirilgan kimilyuminesans (ECL) yordamida ishlab chiqilgan. -aktin yoki giston-3 uchun havola ishlatilgans.

Bakteriyalar tomonidan e'tiroz bildirilgan qisqichbaqalarda to'qimalarning taqsimlanishi va ifoda shakllari

Foxo/FOXO ning gemotsitlar, yurak, gill, balg'am, oshqozon va ichaklarda to'qima taqsimoti Foxo-F va Foxo-R primerlari bilan RT-PCR yordamida tahlil qilindi (1-jadval) va anti-FOXO antikorlari bilan g'arbiy bloting, mos ravishda. PCR protsedurasi 3 daqiqa davomida 94˚C da dastlabki inkubatsiyadan iborat; keyin 30 s 94˚C, 30 s uchun 50˚C va 30 s uchun 72˚C 35 sikl; keyin 72˚C 10 daqiqa davomida. PCR mahsulotlari agaroz gel elektroforezi (1,5% agaroz) yordamida tahlil qilindi. Ichki nazorat sifatida -aktin geni (-aktin-F va -aktin-R; 1-jadval) ishlatilgan. V. anguillarum bilan kurashgan qisqichbaqalardagi RNK va oqsil darajasida Foxo/FOXO ning vaqt kursi ifodasi namunalari termal sikl qurilmasida (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Germaniya) miqdoriy real vaqtda PCR (qPCR) yordamida tahlil qilindi. o'z navbatida west ern blotting. qPCR protsedurasi quyidagilarni o'z ichiga oladi: 10 daqiqa davomida 95˚C; 95˚C da 10 s va 60˚C da 50 s uchun 40 tsikl; keyin 65˚C dan 95˚C gacha erish davri. Foxo ning ifoda pro-fayllari 2-DACT usuli [56] yordamida normallashtirish uchun ikkita ichki nazorat gen -aktin va Ef-1 geometrik oʻrtacha qiymatidan foydalangan holda ishlab chiqarilgan. qPCR da primer juftining samaradorligi chiziqli standart egri chiziq hosil qilish uchun cDNK aralashmasining 10-katta logarifmik suyultirilishi bilan MIQE usuli [57] boʻyicha tahlil qilindi.

Yadro va sitoplazmatik oqsillarni izolyatsiyasi

Ichak to'qimasi qisqichbaqalardan ajratilgan va PBSda uch marta yuvilgan. Protein ekstraksiyasi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda yadro va sitoplazmatik oqsillarni ekstraksiya qilish to'plami (R0050, Solarbio, Pekin, Xitoy) yordamida amalga oshirildi. Individual farqlarni bartaraf etish uchun oqsil olish uchun kamida uchta qisqichbaqa ishlatilgan.

RNK interferentsiyasi tahlili

Gen funktsiyasini tahlil qilish uchun biz RNK aralashuvini (RNK) tahlillarini o'tkazdik. T7 promotorlar ketma-ketligini o'z ichiga olgan bir necha juft primerlar (Foxo-RI-F va Foxo-RI-R; Rab5-RI-F va Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F va Rab7 -RI-R; Akt-RI-F va Akt-RI-R. 1-jadval) dsRNK sintezi uchun shablonlarni kuchaytirish uchun yaratilgan. T7 RNK polimeraza (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) va cDNK shablonidan foydalanib, biz dsRNK fragmentlarini sintez qildik. Ikki zanjirli Yashil floresan oqsil dsGfp RNK nazorat vazifasini o'tadi, u dsGfp sintezi uchun primer sifatida Gfp-RI-F va Gfp -RI-R (1-jadval) yordamida kuchaytirildi. Keyin dsRNK bo'laklari (har biri 50 ug/har biri) mikroshprits yordamida M. japonicusning qorin bo'shlig'i segmentiga AOK qilindi va 12 soatdan keyin xuddi shu dozada ikkinchi in'ektsiya amalga oshirildi. RNK aralashuvining samaradorligi miqdoriy real vaqtda teskari transkripsiya PCR (qRT-PCR, cDNKni hosil qilish uchun RNKning teskari transkripsiyasini o'z ichiga oladi, keyinchalik u qPCR tahlilida shablon sifatida ishlatilgan) yoki ikkinchi in'ektsiyadan 24 soat keyin g'arbiy blot yordamida tahlil qilindi. -aktin ichki ma'lumotnoma sifatida ishlatilgan.

Ma'lumotnomalar

1. Kalnan DR, Brunet A. FoxO kodi. Onkogen. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.

2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS va boshqalar. DNKni tiklash yo'li Gadd45 oqsili orqali FOXO3a transkripsiya omili tomonidan kechiktiriladi. Fan. 2002; 296 (5567): 530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.

3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Yashasin FOXO: qarish va uzoq umr ko'rishda FOXO oqsillarining rolini ochish. Qarigan hujayra. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.

4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. FOXO oqsillarining uch qatlamli nazorati-fosforilatsiyasi, asetilatsiyasi va ubiquitinatsiyasi. Hujayra aylanishi. 2005; 4(7): 908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. FoxO transkripsiya omillarini atsetilatsiya va oqsil-protein o'zaro ta'siri bilan tartibga solish. Bba-Mol hujayra Res. 2011; 1813 (11): 1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.

6. Vang Y, Chjou YM, Graves DT. FOXO transkripsiya omillari: ularning klinik ahamiyati va tartibga solinishi. Biomed Res Int. 2014; 2014: 1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.

7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J va boshqalar. Caenorhabditis elegansning umr ko'rish davomiyligiga ta'sir qilish uchun DAF-16 oqimi ostida harakat qiluvchi genlar. Tabiat. 2003 yil; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Insulin/IGF-1R, SIRT1 va FOXOs yo'llari - suyak va osteosarkoma uchun qiziqarli o'zaro ta'sir ko'rinishi. Old endokrinol (Lozanna). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.

9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Xu LS va boshqalar. Akt vilkalar transkripsiyasi omilini fosforlash va inhibe qilish orqali hujayraning omon qolishiga yordam beradi. Hujayra. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.

10. Huang H, Regan KM, Vang F, Vang DP, Smit DI, van Deursen JMA va boshqalar. Skp2 FOX01 ni ubiquitin vositachiligidagi degradatsiya orqali o'smalarni bostirishda inhibe qiladi. P Natl Acad Sci AQSh. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.

11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Li L, Tissenbaum HA va boshqalar. Fork boshi transkripsiya faktori DAF-16 C. elegansda insulinga o'xshash metabolik va uzoq umr ko'rish signallarini uzatadi. Tabiat. 1997 yil; 389 (6654): 994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.

12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Drosophiladagi og'iz infektsiyasidan omon qolish uchun ichak FoxO signalizatsiyasi talab qilinadi. Shilliq qavat immunol. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112. PMID: 26627459.

13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO Drosophila'da RNK aralashuvini tartibga soladi va RNK virusi infektsiyasidan himoya qiladi. P Natl Acad Sci AQSh. 2015; 112 (47): 14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.

14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 kommen disbiyozini cheklash va umrini uzaytirish uchun ichak immun gomeostazini rag'batlantiradi. Hujayra. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.

15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P va boshqalar. Tug'ma immunitet gomeostazini FOXOga bog'liq tartibga solish. Tabiat. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.

16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M va boshqalar. FOXO transkripsiya omillari nafas olish epitelial hujayralarida tug'ma immunitet mexanizmlarini tartibga soladi. J Immunol. 2013 yil; 190(4):1603– 1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.

17. Graves DT, Milovanov TN. Shilliq qavat immuniteti va FOXO1 transkripsiya omillari. Old immunol. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.

18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Mikroblarga qarshi peptidlar: umurtqasiz hayvonlardan umurtqali hayvonlargacha. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.

19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Drosophila melanogasterdagi immunitet - mikroblarni tanib olishdan butun organizm fiziologiyasigacha. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.

20. Xoffman J.A., Reyxart JM. Drosophila tug'ma immuniteti: evolyutsion nuqtai nazar. Nat immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.

21. Hultmark D. Drosophila immuniteti: yo'llar va naqshlar. Curr Opin Immunol. 2003 yil; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.

22. Li FH, Xiang JH. Xitoyda qisqichbaqalarning tug'ma immunitetiga oid tadqiqotlardagi so'nggi yutuqlar. Dev Comp Immunol. 2013 yil; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.

23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Vang JX. C tipidagi lektinning o'ralgan domeni Domeless retseptorlari bilan bog'lanishi qisqichbaqalar bakterial infektsiyasiga qarshi immun javobida JAK/STAT yo'lini bevosita faollashtiradi. PLoS patogi. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.

24. Gordon S. Fagotsitoz: immunobiologik jarayon. Immunitet. 2016; 44(3): 463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.

25. Vang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ va boshqalar. FoxO1-vositalangan autofagiya NK hujayralari rivojlanishi va tug'ma immunitet uchun zarur. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.

26. Dong G, Song L, Tian C, Vang Y, Miao F, Zheng J va boshqalar. FOXO1 bakteriyalar keltirib chiqaradigan neytrofil faolligini tartibga soladi. Old immunol. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.

27. Vang XW, Chjao XF, Vang JX. C tipidagi lektin umurtqasiz hayvonlarda gemositik fagotsitozni rag'batlantirish uchun beta-Integrin bilan bog'lanadi. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.

28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Infektsiyalarga qarshi kurashish uchun qisqichbaqalar o'zini himoya qilishni o'rgatish. Trends Biotechnol. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.

29. Flegel TW. Osiyoda qisqichbaqalar patogenlarining tarixiy paydo bo'lishi, ta'siri va hozirgi holati. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.

30. Vang PH, Huang TZ, Chjan XB, Xe JG. Qisqichbaqalarda virusga qarshi himoya: tug'ma immunitetdan virusli infektsiyagacha. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.

31. Obsil T, Obsilova V. FOXO transkripsiya faktorlarini tartibga solish asosidagi struktura/funksiya munosabatlari. Onkogen. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.