GRP78 haddan tashqari ifodalanishi PINK1-IP3R vositachiligidagi neyroprotektiv mitofagiyani qo'zg'atadi 3-qism

3.1.3. GRP78 orqali mitofagiyani induktsiya qilish neyroproteksiyaga vositachilik qiladi

Biz GRP{0}}vositachiligi neyroproteksiyasi nuqsonli organellalarni olib tashlashni tezlashtirish uchun mitoxondriyalarning selektiv autofagiyasini qo'zg'atish orqali bo'lishi mumkin, deb taxmin qildik.

So'nggi yillarda tobora ko'proq tadqiqotlar mitoxondriyalarning xotirani shakllantirish va saqlashda muhim rol o'ynashini ko'rsatdi. Mitoxondriyalar energiya ishlab chiqarish uchun mas'ul bo'lgan hujayralardagi muhim organdir. Bundan tashqari, mitoxondriyalar butun hujayra metabolizmini va oksidlanish-qaytarilish reaktsiyalarining muvozanatini tartibga solishda ham ishtirok etadilar. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, mitoxondriya ham neyronlarning qo'zg'aluvchanligidagi o'zgarishlarni tartibga solish orqali uzoq muddatli xotiraning mustahkamlanishiga ta'sir qilishi mumkin.

Mitoxondriyalar hujayralardagi oksidlanish metabolizmi uchun javobgardir va hujayralar energiyasi asosan mitoxondriyadagi adenozin trifosfat (ATP) orqali uzatiladi. Neyronlar, inson tanasining axborot uzatish birliklari sifatida, ayniqsa, yuqori energiya talabiga ega, shuning uchun ularning sog'lom mitoxondriyalarining normal ishlashi neyronlarning fiziologik xususiyatlari va asab tizimining normal ishlashi uchun juda muhimdir. Tadqiqotchilar kasallik yoki qarish holatida mitoxondriyalarning sog'lig'iga zarar etkazishini va ularning funktsiyasini susaytirishini aniqladilar, buning natijasida neyronlarning funktsiyasi pasayadi va xotira qobiliyatiga ta'sir qiladi.

Xotirani shakllantirish va saqlash bir vaqtning o'zida neyronlar, sinapslar va mitoxondriyalar o'rtasida murakkab muvofiqlashtirishni talab qiladi. Neyronlarning oxiridagi sinapslarda mitoxondriyalar neyronlarni qo'llab-quvvatlovchi neyronlar va glial hujayralar o'rtasida joylashgan. Ushbu sinapslar o'ziga xos tuzilishga ega va juda plastik bo'lib, xotira va o'rganish ehtiyojlariga qarab sozlanishi mumkin. Mitoxondriyalar sinapslarning "ishlab chiqarish markazi"ga o'xshab, neyronlar va sinapslarni zarur energiya va moddalar bilan ta'minlaydi, bu esa neyronlarning qo'zg'aluvchanligini tezda tartibga solishi va sinapslarning uzoq muddatli plastikligi va barqarorligini saqlab turishi mumkin.

Mitoxondriya va xotira bilan bog'liq yana bir tadqiqot yo'nalishi hujayralarni transformatsiya bilan bog'liq omillar (oqsil turi) orqali davolashdir. Ushbu davolash mitoxondrial funktsiyani kuchaytirishi, metabolizm tezligini oshirishi va neyronlar va sinapslarning sog'lig'ini himoya qilishi mumkin. Ushbu tadqiqotlarga asoslanib, mitoxondriyalarning sog'lig'ini mustahkamlash orqali biz Altsgeymer va boshqa nevrologik kasalliklar xavfini kamaytirgan holda xotiramiz va intellektual qobiliyatimizni oshirishimiz mumkin.

Xulosa qilib aytganda, mitoxondriyalar xotirani shakllantirish va saqlashning ajralmas qismidir. Mitoxondriyalarning sog'lig'i neyronlar va sinapslarning normal ishlashi va uzoq muddatli plastiklik va barqarorlikni saqlash uchun zarurdir. Mitoxondriyalarning sog'lig'ini saqlash, Altsgeymer va boshqa nevrologik kasalliklar xavfini kamaytirish, aql va xotirani yaxshilash uchun ovqatlanish, jismoniy mashqlar va turmush tarzi odatlariga e'tibor qaratishimiz kerak. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak va Cistanche xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki u xotira va o'rganish uchun juda muhim bo'lgan atsetilxolin va o'sish omillari darajasini oshirish kabi neyrotransmitterlar muvozanatini ham tartibga solishi mumkin. Bundan tashqari, Cistanche deserticola qon oqimini yaxshilaydi va kislorod yetkazib berishni rag'batlantiradi, bu esa miyaning etarli ovqatlanish va energiya olishini ta'minlaydi va shu bilan miya hayotiyligi va chidamliligini oshiradi.

Xotirangizni yaxshilash yo'llarini bilish tugmasini bosing

Ushbu gipotezani qo'llab-quvvatlovchi GRP78 makroautofagiyani [4] (keyingi o'rinlarda autofagiya deb yuritiladi) rag'batlantirishi isbotlangan.

Biz bir nechta yaxshi tavsiflangan autofagiya modulyatorlari: mTORC1 ni inhibe qilish orqali autofagiyani faollashtiradigan rapamitsin va autofagiya oqimining ikkita inhibitori: 3-metilladenin ({{4}) yordamida GRP{0}}induktsiyalangan neyroproteksiya uchun autofagiya zarurligini aniqlashga harakat qildik. }}MA), III sinf fosfatidilinositolkinaz PI3K inhibitori va LY294002, I sinf PI3K inhibitori.

Avtofagiya modulyatorlarining uchtasi ham GFP, ham GRP78 guruhlarida tun bilan ishlov berilgan hujayralardagi omon qolishni transport vositalariga nisbatan kamaytirdi (4A-rasm). Ushbu natijalar ER-stressli hujayralardagi GRP78 haddan tashqari ekspressiyasining neyroprotektiv ta'siri uchun etarli bo'lmasa-da, PI3K-Beclin1 yo'li orqali autofagiyaning to'g'ri boshlanishi va kech oqim zarurligini ko'rsatdi.

Shakl 3. GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi stressli NSC34 hujayralarida mitoxondriyal disfunktsiyani qutqaradi. (A) GRP78 yoki bog'liq bo'lmagan oqsillarni nazorat qilish (GFP) uchun plazmid vektor bilan nukleofektlangan NSC34 hujayralarida GRP78 darajalarini ko'rsatadigan immunoblot va chiziqli grafik. (B) 1 µg/ml tunikamitsin (Tun) (chapda) yoki 10 mkM nokodazolni o‘z ichiga olgan muhitda 24 soatdan keyin GFP- yoki GRP{8}}ekspressiv NSC34 hujayralarining (± SEM degani) omon qolish foizi (o‘ngda) MTT tahlili yordamida aniqlangan (n=4; * p < 0.005,** p < 0,001 va GFP, Student t-testi ). (C) GFP yoki GRP78 ni haddan tashqari ifodalovchi va Tun yoki transport vositasi (chapda) yoki efavirenz (EFV) bilan nazorat yoki vosita (o'ngda) bilan ishlov berilgan hujayralardagi MitoSOX floresansining miqdoriy tahlili. (D) GFP yoki GRP78 haddan tashqari ifodalangan va Tun yoki transport vositasi (chapda) yoki EFV yoki vosita (o'ngda) bilan ishlov berilgan hujayralardagi TMRM floresansining miqdoriy tahlili (GFP-Veh - nazorat guruhi). (E) Chapda: GFP yoki GRP78 haddan tashqari ifodalangan va Tun bilan ishlov berilgan hujayralardagi vaqt funktsiyasi sifatida O2 kontsentratsiyasining (Clark tipidagi O2 elektrodidan foydalangan holda) vakillik tahlili. O'ngda: GFP yoki GRP78 (GFP-Veh - nazorat guruhi) haddan tashqari ifodalangan hujayralardagi 5 soatlik Tuntreatmentdan keyin O2 iste'moli (n=4; * p < 0,05 va Veh-GFP, # p < 0,05 va GRP78, bir tomonlama ANOVA).

Shakl 4. Mitofagiya uchun mitoxondriya teglash GRP78 haddan tashqari ifodasi bilan imtiyozli. (A) GFP yoki GRP78 plazmidlari bilan nukleofektlangan va Tun bilan ishlov berilgan yoki Tun bilan kombinatsiyalangan yashovchan NSC34 hujayralari (o'rtacha ± SEM) foizining chiziqli grafigi: rapamisin (RAPA), 3MA yoki LY-902, boshqaruv vositasi (Veh), davolashdan 24 soat o'tgach, MTT tahlili bilan aniqlanadi (GFP-Veh - nazorat guruhi) (n=4–8, * p < 0.05 va boshqalar.

Veh-GFP; # p < 0.05 va Tun-GFP).(B) PARK2-Ha plazmidning o'zi (yuqori, o'rta panellar, boshqaruv) bilan nukleofektlangan hujayralarning reprezentativ konfokal tasvirlari GRP78 plazmidi (pastki panellar) transport vositasi (Veh) yoki Tun (5 soat) bilan ishlangan va HA (yashil) va HSP60 (qizil) uchun immuno-bo'yalgan; masshtab paneli=10 mkm. (C) Veh, Tun va Tun+GRP78 guruhlaridan Parkin va Hsp60 birgalikda mahalliylashtirishning Pearson korrelyatsiya koeffitsientining o'rtacha ± SEM (n=4; * p < 0,05 va Parkin-Veh, # p < 0,05 va boshqalar.

Parkin-Tun, bir tomonlama ANOVA). (D) 5 soat davomida transport vositasi yoki Tun bilan ishlov berilgan GFP- yoki GRP78-ortiqcha ifodalangan hujayralardagi mitoxondrial (mito) va sitozolik (sito) birlashtirilgan fraktsiyalardagi ko'rsatilgan oqsillar uchun chap, Western blots. Tahlil qilingan oqsillar: OPA-1, CV-, PDI, GRP78, Ubiquitinated qoldiqlar, LC3 va aktin. O'ng tomonda, GRP78 ning ikkala birlashtirilgan fraktsiyalarda va mitoxondriyal fraktsiyadagi LC{{1{{20}}}}IIda aktin (sitozol) yoki V kompleksining beta bo'linmasiga nisbatan o'rtacha burma o'zgarishining chiziqli grafiklari. (CV-B) (mitoxondriyalar) GFP guruhida. (E) GFP yoki GRP78 oqsillarini haddan tashqari ifodalovchi va Tun bilan yolg'iz yoki CCCP, CSA yoki BAPTA-AM bilan birgalikda ishlangan yashovchan hujayralar foizi (± SEM degani) shtrixli grafigi, MTT tahlili bilan 24 soat o'tgach, nazorat vositasida ishlov berilgandan keyin aniqlanadi. hujayralar. (F) CCCP (GFP-Veh nazorat guruhi) bilan tapsigargin (THA) bilan davolash qilingan hujayralar uchun hujayra hayotiyligining o'xshash chiziqli grafigi (n=4–8, 3 xil tajribada, * p < 0,05 vs. nazorat-Veh;# p < 0,05 va GRP78-Tun).

Parkin har doim ham mitofagiyada qatnashmaydi, chunki u muqobil mexanizmlar orqali ham qo'zg'alishi mumkin [46]. Parkinning GRP{1}}vositachilik ta'sirida ishtirok etishini aniqlash uchun biz ER stressi bo'lgan va bo'lmagan NSC34 hujayralarida ifodalangan HA-belgili Parkinning hujayra ichidagi joylashuvini aniqladik.

Konfokal mikroskop yordamida biz Parkinning 5 soatlik transport vositasi yoki Tun bilan davolashdan keyin NSC34 hujayrasi bo'ylab tarqalishini kuzatdik (4B-rasm). Aksincha, GRP78 ni haddan tashqari ifodalovchi hujayralarda Parkinning HSP60, mitoxondriyal oqsil bilan birgalikda lokalizatsiyasi ortdi. , bu organella formitofagiyasini nishonga olishni taklif qiladi (4B, C-rasm).

Bundan tashqari, biz GFP yoki GRP78ni haddan tashqari ifoda etgan hujayralardan mitoxondriyal va sitozolik fraktsiyalarni ajratib oldik va haqoratdan keyin 5 soatdan keyin nazorat sifatida Tun yoki transport vositasi bilan davolandik. Birlashtirilgan mitoxondriyal fraktsiyalarning tozaligi OPA1 va CV mavjudligini va ER-rezident oqsili, proteindisulfid izomeraza (PDI) yo'qligini tahlil qilish orqali tasdiqlandi (4D-rasm).

Qizig'i shundaki, biz nazorat bilan solishtirganda ER-stressli hujayralarning yig'ilgan mitoxondrial fraktsiyalarida GRP78 ko'pligini oshirish tendentsiyasini kuzatdik. Shuni esda tutingki, Tun stimuli sitozolda GRP78 darajasining oshishiga olib kelishi mumkin bo'lsa-da, bu mitoxondriyal fraktsiyada ko'rinmadi.

GRP78 ning majburiy haddan tashqari ko'payishi mitoxondriyal fraktsiyada PINK1 va Parkin to'planishini oshirish tendentsiyasini kuchaytirdi (4D-rasm va S4-rasm). Parkin mavjudligi Ub to'planishini kuchaytiradi va faqat PINK mavjudligi bilan solishtirganda mitofagiyani kuchaytiradi [42,47]. Shunga ko'ra, Ubiquitin (Ub) immunoblotting GFP guruhiga nisbatan GRP{6}}ekspress qiluvchi hujayralardagi mitoxondriyal fraktsiyalardagi uning profilidagi farqlarni aniqladi (4D-rasm).

Stressli sharoitlarda mitoxondriyal oqsilning ubikvitatsiyasi LC3 va LC3II ning lipidlangan izoformasi to'planishi bilan boshlanadigan autofagosoma apparati tarkibiy qismlarini to'plashga olib keladi [42,48].

Mitoxondriyal fraktsiyada ko'p miqdorda LC3II oqsili kuzatildi, bu bilan o'xshash sharoitlarda GFP bo'lganlarga nisbatan GRP78 ni haddan tashqari ifoda etuvchi stressli hujayralarda ko'proq ishtirok etish tendentsiyasi kuzatildi (4D-rasm). Bu ma'lumotlar birgalikda olib borilganda, GRP78 ning majburiy ifodalanishi mitoxondrial translokatsiyani osonlashtirishi mumkinligini ko'rsatdi. mitofagiya uchun teglash.

Mitofagiya induksiyasining GRP78 haddan tashqari ifodalanishi bilan bog'liq bo'lgan neyroprotektiv ta'sirga bog'liqligini aniqlash uchun biz mitofagiya faollashtiruvchilari va inhibitorlari tomonidan qo'zg'atilgan o'zgarishlarni baholadik. Biz karbonil siyanid m-xlorofenilgidrazindan (CCCP) oksidlovchi fosforillanishni kimyoviy jihatdan ajratish va mitoxondriyal membrana potentsialini [49,50] parchalash orqali mitofagiyani qo'zg'atish uchun, shuningdek, ikkita mitofagiya inhibitori: BAPTA-AM, kalakulyar hujayra o'tkazuvchisi. 2+ va siklosporin A (CSA), mitoxondriyadan Ca2+ chiqishini bloklaydigan mitoxondriyal o'tkazuvchanlikning o'tish g'ovaklari (mPTP) inhibitori [51].

Garchi NSC34 da CCCP davolash hayotiylikni sezilarli darajada kamaytirish uchun etarli bo'lmasa-da, keng tarqalgan xabarlarga ko'ra, biz GRP78 haddan tashqari ifodalanganmi yoki yo'qligidan qat'i nazar, ER-stressli hujayralarga bir xil davolash uning omon qolishini oshirganligini aniqladik (4E-rasm).

Muhimi, ER-stressga uchragan hujayralarga GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi tomonidan qo'llab-quvvatlanadigan neyroprotektiv ta'sir CSA yoki BAPTA-AM ishtirokida bekor qilindi (4E-rasm). Bu topilmalar mitofagiya induksiyasi hujayralarga ER stressi va Ca2+-oqimi bilan kurashishga imkon berishini ko'rsatadi. GRP78 tomonidan qo'llab-quvvatlanadigan neyroprotektiv ta'sir uchun muhimdir.

GRP78 ning mitofagiyani qo'zg'atish imkoniyatlaridan biri Ca2+-vaorativ ta'sirini osonlashtirish bo'lishi mumkin, ehtimol ER-rezident inositol 1,4,5 trifosfat retseptorlari (IP3R) ning ochilishi Ca2+ oqimiga imkon beradi. ER dan mitoxondriyagacha. Biz Ca2+ ATPaz inhibitori bo'lgan thapsigargin (THA) yordamida IP3R faollashuviga to'sqinlik qilib, bu imkoniyatni o'rganmoqchi edik [52].

Thapsigargin hujayralarda ER stressini keltirib chiqarishi ham ma'lum, chunki bu davolash ERdagi Ca2+ zahiralarini yo'q qiladi va shuning uchun kanonik ochilgan oqsil reaktsiyasining bir qismi sifatida GRP78 ifodasini oshiradi [53]. 4F-rasmda thapsigargin GFP-nazorat qiluvchi hujayralardagi tunikamitsin bilan davolash kabi hujayra hayotiyligiga ta'sir qilishini va CCCP bilan birgalikda davolash Tun bilan kuzatilganidek hujayra o'limini oldini olishini ko'rsatadi.

Biroq, GRP78 ni majburiy ravishda haddan tashqari ko'paytirish tunikamitsin bilan bo'lgani kabi, zararli tapsigargin ta'sirini to'sib qo'yishga qodir emas edi. Ushbu kuzatish Ca2+ oqimining GRP78 ning neyroprotektiv ta'sirida, ehtimol IP3R orqali zaruriy ishtirokini tasdiqlaydi.

3.1.4. GRP78 vositachiligida neyroproteksiya PINK1 va IP3R ga bog'liq

GRP78 neyroprotektiv ta'siri mediatorlarini aniqlashni boshlash uchun shRNA texnologiyasidan foydalanildi. Birinchidan, biz tanlangan shRNK mos ravishda GRP78, PINK1 yoki IP3R ifodasini kamaytirganini (S4A-C-rasm) va ular nazorat hujayralarining yashovchanligini buzmasligini tasdiqladik (S4D-rasm). Biz birinchi navbatda GRP78 ifodasi GRP78- va CCCP vositachiligidagi neyroproteksiya uchun Tun-inducedER stressiga qarshi turish uchun zarur ekanligini tasdiqladik (5A-rasm).

Keyinchalik, PINK1 yoki IP3R ovozini o'chirish GRP78 haddan tashqari ifodasi yoki CCCP bilan davolash natijasida kelib chiqqan neyroprotektiv effektni blokladi (5A-rasm). Bundan tashqari, biz yadro atrofida silliq dog'li taqsimotda odatda taqsimlangan GRP78 siljishi, haddan tashqari ifodalanganida, nuqta o'choqlarida IP3R ga birgalikda lokalizatsiya qilinishini aniqladik (5B-rasm).

Bu natijalar birgalikda GRP78 bizning in vitro modelimizda himoya mitofagiyani modulyatsiya qilishini va bu neyroproteksiyani PINK1- va IP3R-ga bog'liq holda amalga oshirishini ko'rsatdi.

4. Munozara

Neyroproteksiyaning endogen mexanizmlarini kuchaytirish travmatik lezyonlar yoki kasallikdan keyin neyrodegenerativ jarayonlarning oldini olish uchun samarali terapevtik vositalarni berishi mumkin [3,54,55]. ER rezidenti GRP78 bir nechta kasalliklarda haddan tashqari namoyon bo'lganda neyroproteksiyani rag'batlantiradigan ushbu mexanizmlarning chorrahasida joylashgan. modellar [4].

Asosiy mexanizmlarni aniqlash uchun biz retrograd neyrodegenerativ jarayonni keltirib chiqaradigan motoneyron ulanishini buzadigan o'murtqa ildiz avulsiyasi modelidan foydalandik [55].

Ushbu modeldagi motoneyron o'limi ER stressi, bloklangan avtofagiya oqimi bilan tavsiflanadi va apoptotik emas, chunki kaspaza 3 yoki 12 ning faol shakllari kuzatilmagan, bu apoptoz neyronlarning o'limining yakuniy ijrochisi emasligini ko'rsatadi [20]. Shunga ko'ra, biz ilgari proteomik yondashuvlar yordamida antiapoptotik xususiyatlar RA dan keyin apoptotiklarga parallel ravishda yuzaga kelishini va apoptozning samarali bajarilishini blokirovka qilishini tasdiqladik [25].

Ushbu neyrodejenerativ kontekstda GRP78 ning haddan tashqari ifodalanishi vosita neyroproteksiyasini amalga oshirdi [20,26,27]. Bu erda, dastlab, biz ushbu neyroproteksiyaning asosiy asosini ochish uchun proteomaning xolis qiyosiy va miqdoriy tahlilidan foydalandik.

Kutilmaganda, mitoxondriyalar asosiy maqsad bo'ldi, ularda organoid oqsillari miqdori ortib bordi, ular GRP78 ni haddan tashqari oshirib yuboradigan shikastlangan motoneyronlar ichidagi pufakchalarga o'ralgan mitoxondriyalarning bezaklari bilan birga edi.

Ushbu kuzatishlar neyroproteksiyaning asosiy elementi sifatida mitofagiya mavjudligini ko'rsatdi. Deeperin vitro tajribalari bu gipotezani tasdiqladi, chunki GRP78 vositachiligida neyroproteksiya (i) mitoxondriyalarning nafas olishi va ROS darajasini tiklash, (ii) PINK1/PARKINmitoxondriya translokatsiyasini rag'batlantirish, mitofagiya uchun organellani belgilash va (iii) muhim vosita sifatida IP3R funktsiyasiga bog'liq.

Bizning ma'lumotimizga ko'ra, bu GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi himoya mitofagiyaga yordam berishini ko'rsatadigan birinchi tadqiqotdir. GRP78 noto'g'ri qatlamli oqsillarni va boshqa oyni yoritish funktsiyalarini kaltsiy bilan bog'laydigan oqsil sifatida [4,56] chaperionlashdagi rolidan tashqari, biz uning faol ta'sirini qo'shdik. mitofagiyani rag'batlantirish. Bundan tashqari, bizning tadqiqotimiz ER stressini mitoxondrial disfunktsiyani bog'laydigan so'nggi tadqiqotlar to'plamiga qo'shiladi [57-59].

GRP78 haddan tashqari ifodalangan va neyroproteksiyani kuchaytirganda, biz in vivo mitofagiyaning o'ziga xos belgilarini topdik. Xuddi shu narsa ER stressi kabi RAdan keyin yuzaga keladigan neyrodegenerativ jarayonning ba'zi xususiyatlarini taqlid qiluvchi in vitro modellarida ham kuzatildi [20,26].

Mitoxondriyalarning sifatini mitofagiya orqali nazorat qilish mitoxondrial tarkibni va metabolizm gomeostazini kuzatish uchun juda muhimdir. Adabiyotda mitofagiya induktsiyasi apoptoz signalizatsiyasi bilan keng o'zaro bog'liqligi [60] tufayli bir nechta kasalliklarning omon qolishiga yoki hujayra o'limiga yordam beradimi, degan savol hali ham muhokama qilinmoqda, garchi shikastlangan mitoxondriyalarning tozalanishi Altsgeymer kasalligi kabi neyrodegenerativ kasalliklarda asosiy rolga ega ekanligi tasvirlangan. , Parkinson kasalligi yoki qarish [61].

Ilgari, GRP78 CHOP induksiyasini [62,63], kaspaza 7 faollashishini [5] oldini olish yoki PI3K-AKT-mTOR signalizatsiya o'qini [4] faollashtirish orqali ER stressi bilan qo'zg'atilgan apoptozni inhibe qilishi haqida xabar berilgan edi. Bundan tashqari, oksidlovchi stress va DNK shikastlanishining past darajasini saqlab turishi ko'rsatilgan [4,64]. Xususan, saraton hujayralarida GRP78 protein kinaz RNK-likeendoplazmatik retikulum kinaz (PERK)-NRF2 signallarini [65,66] faollashtirish orqali ROSni susaytirishi, antioksidant bilan bog'liq genlarning yuqori regulyatsiyasiga olib kelishi va oqsil darajasini oshirishi ko'rsatilgan. glikolitik fermentlar [67].

Buning o'rniga, biz GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi glikolitik fermentlarni (masalan, ENO1 va ENO2) pasaytirganini aniqladik (Qo'shimcha jadvallar). Ushbu natijalar bizning modelimizda ROSning kuzatilgan susayishi ko'proq mitofagiyaning kuchayishi bilan bog'liq bo'lishi mumkinligini ko'rsatishi mumkin, ammo bu mexanizmning tafsilotlarini qo'shimcha tekshirish kerak. Mitoxondrial disfunktsiya neyrodegenerativ kasalliklarda keng tarqalgan holat [68] va mitofagiya ishtirok etgan. Parkinson [49,69], Xantington [70,71] va Altsgeymer kasalliklari va tauopatiyalarda [72].

Ba'zi mualliflar mitofagiya yo'llarini to'g'ri tartibga solish orqali organizm zararli oksidlovchi turlardan qochishi va oksidlanish-qaytarilish muvozanati va gomeostazni tartibga solishi mumkinligini ta'kidladilar [73]. Shunday qilib, ushbu nazorat ostida mitofagiya induktsiyasi orqali GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi ushbu kasalliklarda neyroprotektiv strategiya sifatida ko'rib chiqilishi mumkin. GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi vositachiligidagi neyroproteksiya Ca2+ oqimiga bog'liq ko'rinadi, chunki u BAPTA-AM tomonidan bloklangan. Ca2+ ning BAPTA-AM xelatlanishi avtofagik oqim yo'li bo'ylab bir necha xil bosqichlarda aralashib, nafaqat avtofagiyaning qo'zg'alishini bloklaydi, balki avtofagosomalarning shakllanishi va qayta ishlash bosqichlarini ham inhibe qiladi [74].

Bundan farqli o'laroq, Ca2+ oqimiga ta'sir qiluvchi boshqa vositadan, masalan, asthapsigargindan foydalanish hayratlanarli natijalar berdi. Thapsigargin sarkoendoplazmatik retikulumCa2+ ATPazlarni (SERCAs) bloklaydi, sitozolik Ca2+ ko'tarilishini ta'minlaydi, biroq hujayra ichidagi Ca2+ zahiralarining surunkali yo'q bo'lib ketishi va katlanmagan oqsillarning to'planishi orqali ER stressini keltirib chiqaradi.

Bunday vaziyatda biz GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi o'layotgan hujayralarni qutqara olmasligini kuzatdik va buning sababi thapsigarginning IP3R ta'siriga ham xalaqit berishiga shubha qildik. mitoxondriyal nafas olish va hujayra bioenergetikasini rivojlantirish uchun zarurdir [75].

GRP78 MAMlarni sigma{1}} retseptorlari (SIGR1) va IP3R tomonidan hosil qilingan kompleks bilan o'zaro ta'sir qiladi [76,77]. ERstressda SIGR{6}}GRP78 o'zaro ta'siri Ca2+ kamayishi natijasida pasayadi, keyin Ca2+ IP3R orqali ERdan mitoxondriyaga oqishini kuchaytiradi [76]. Bundan tashqari, IP3R Parkin tomonidan qo'zg'atilgan mitofagiya uchun, xususan, Parkinni jalb qilishning quyi oqimida mitoxondrial klasterlashishga imkon berish uchun zarur ekanligi ko'rsatildi [78].

Natijalarimiz shu bilan mos keladi, chunki shRNA texnologiyasi orqali IP3R ning kamayishi ER-stressli hujayralarda GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi natijasida yuzaga keladigan neyroproteksiyani bekor qilgan. GRP78 ichki membrananing oraliq bo'shlig'ida va mitoxondriya matritsasida aniqlangan, ammo uning funktsiyasi hali ham aniqlanishi kerak [79].

Shunga qaramay, uning bir qancha funksiyalariga kelsak, u Ca2+ buferlanishi mumkin deb taxmin qilamiz. Agar shunday bo'lsa, ER-stressga uchragan hujayralardagi mitoxondriyadagi ko'payishi apoptozni qo'zg'atmaslik uchun haddan tashqari ifodalangan Ca2+ oqimini susaytirishi mumkin. Bu borada keyingi tajribalar juda qimmatli bo'lar edi.

O'qish cheklovlari va kelajakdagi tadqiqotlar

Ushbu tadqiqot neyrotravmadan keyin neyronlarning o'limida GRP{0}}bog'liq mitofagiyaning neyroprotektiv roli bo'yicha kelgusi tahlillar uchun yo'l ochadi. Ushbu tadqiqotning birinchi cheklovi shundaki, mitofagiya RA dan keyin ma'lum bir vaqt oynasida tahlil qilingan va mitofagiya dinamik jarayon bo'lganligi sababli, uning oqimini va qaysi molekulalar ishtirok etishini tushunish qiziqarli bo'ladi.

Shunday qilib, in vivo jonli ravishda kuzatilgan ta'sirlar faqat mitofagiyaga bog'liqmi yoki yo'qligini aniqlash uchun mitofagiyani modulyatsiya qiluvchi keyingi tajribalar (farmakologik yoki genetik yondashuvlar orqali) talab qilinadi.

Bu bizga GRP78 ning haddan tashqari ifodalanishi mitofagiya orqali MNning omon qolishiga yordam berishini tasdiqlash imkonini beradi. Mitoxondriya va apoptoz o'rtasida yaxshi tavsiflangan o'zaro bog'liqlik mavjud bo'lganligi sababli, bizning modelimizda qaysi o'lim mexanizmi MN o'limini qo'zg'atayotganini aniqlash uchun in vitro va in vivo manipulyatsiyalar muhim ahamiyatga ega. Bu GRP78 to'g'ridan-to'g'ri hujayra o'lim mexanizmini blokirovka qilish orqali modulyatsiya qiladimi yoki uning mavjudligi MN larga uni engish va omon qolishga imkon beradimi yoki yo'qligini aniqlashga yordam beradi.

5. Xulosalar

Ushbu tadqiqot GRP78 ning motoneyronal himoyaga erishish uchun mitofagiyani modulyatsiya qilishdagi yangi rolini tavsiflovchi birinchi tadqiqot bo'ldi. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, GRP78 og'ir travmatik asab shikastlanishidan keyin degeneratsiyalangan motor neyronlarining neyroproteksiyasini rag'batlantirish, neyron hujayralarida buzilgan mitoxondriyal funktsiyani tiklash uchun mitofagiyani qo'zg'atishi mumkin. Bundan tashqari, ushbu GRP{2}}vositachilik neyroproteksiyasi PINK1 va IP3R ga bog'liq. Shuning uchun GPR78 yoki boshqa nomzodlar bilan gen terapiyasi orqali nozik sozlangan mitofagiyani faollashtirish asab tizimining travmatik shikastlanishlari uchun yangi terapevtik yondashuv sifatida ishlatilishi mumkin. .

Qo'shimcha materiallar: Quyidagilar https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines9081039/s1 saytida mavjud. Shakl S1: Bioinformatik tahlil. Shakl S2: Tun bilan davolashdan keyin endogen GRP78 darajalari. S3-rasm: Tun va EFV NSC34 hujayralarida mitoxondrial disfunktsiyani keltirib chiqaradi. S4-rasm: Sarlavha yo'q. Shakl S5: shRNK nukleofektsiyasidan so'ng hujayra hayotiyligini tahlil qilish Qo'shimcha materiallar shuningdek, proteomik tahlilda aniqlangan barcha oqsillarni o'z ichiga olgan jadvallarni o'z ichiga oladi.

Muallif hissalari: TL-R. va DR-G. tajribalarni ishlab chiqdi va amalga oshirdi, natijalarni tahlil qildi va qo'lyozmaning bir qismini yozdi. MH-G. va JF in vivo tajribalarda yordam berdi.PM-G. va JML mitoxondriyal tozalashni amalga oshirdi. MP, CB va NA mitoxondriyalarning funktsional tahlilida yordam berdi. VP va AB barcha ishlatiladigan GRP78 plazmidlari va virus vektorlarini tayyorladi. CC barcha tajribalarni o'ylab topdi, loyihalashtirdi, nazorat qildi va tahlil qildi va qo'lyozmani yozdi. Barcha mualliflar qo'lyozmaning nashr etilgan versiyasini o'qib chiqdilar va rozi bo'ldilar.

Moliyalashtirish: Bu ish asosan Ispaniyaning Iqtisodiyot va raqobat vazirligi (#SAF 2014-59701) va Marató de TV3 (#201607.10) tomonidan qo'llab-quvvatlandi. Shuningdek, biz CIBERNED va Generalitat de Catalunya tomonidan moliyalashtirilgan ko'mak uchun minnatdormiz. CB Karlos III sog'liqni saqlash institutidan Migel Servet shartnomasini (CP19/00077) oluvchi hisoblanadi.

Institutsional ko'rib chiqish kengashi bayonoti: Hayvonlar bilan bog'liq barcha protseduralar Universitat Autònoma de Barselona va Generalitat de Catalunya tomonidan tasdiqlangan va Yevropa Hamjamiyat Kengashining 2010/63/EU direktivasiga amal qilgan.

Axborotlangan rozilik bayonoti: qo'llanilmaydi.

Ma'lumotlar mavjudligi to'g'risidagi bayonot: Ushbu tadqiqot davomida yaratilgan yoki tahlil qilingan barcha ma'lumotlar ushbu nashr etilgan maqolaga va uning qo'shimcha ma'lumotlar fayllariga kiritilgan.

Minnatdorchilik: Marta Monserrat, Ariadna Aransanz, Migel Chillon, Julia Lorenzo, Sara Marmolexo va UABdagi Neyroplastiklik va Regeneratsiya guruhiga minnatdorchilik bildiramiz. Karlos Gilemga (University Complutense de Madrid) PARK2-HAplazmidi hamda antikorlar uchun UABdagi Elena Galea va Ester Dalfoga minnatdorchilik bildiramiz.

Manfaatlar to'qnashuvi: Mualliflar manfaatlar to'qnashuvi yo'qligini e'lon qilmaydi.

Maxsus bayonot: Mualliflar 54 yoshida bevaqt vafot etgan nufuzli olim, ajoyib va ​​jasur inson Keti Kasas xotirasiga alohida eslashni istaydi. U bilan baham ko'rish sharaf va sharaf edi hayoti, kasbiy salohiyati, axloqiy va insoniy qadriyatlari.

Ma'lumotnomalar

1. Konforti, L.; Gilli, J.; Coleman, MP Vallerian degeneratsiyasi: shikastlanish va kasallikni bog'laydigan rivojlanayotgan akson o'lim yo'li. Nat.Rev. Nevrologlar. 2014, 15, 394–409. [CrossRef]

2. Romeo-Gitart, D.; Fores, J.; Herrando-Grabulosa, M.; Valls, R.; Leyva-Rodriges, T.; Galea, E.; Gonsales-Pérez, F.; Navarro, X.;Petegnief, V.; Bosch, A.; va boshqalar. Nerv shikastlanishi uchun neyroprotektiv dori sun'iy intellekt yordamida kashf qilindi. Sci. Rep. 2018, 8,1879. [CrossRef]

3. Romeo-Gitart, D.; Fores, J.; Navarro, X.; Casas, C. NeuroHealin tomonidan regeneratsiyani kuchaytirdi va denervatsiya qilingan mushaklar atrofiyasini kechiktirdi reimplantatsiya bilan bel ildizi avulsiyasining klinikgacha bo'lgan modeli. Sci. Rep. 2017, 7, 12028. [CrossRef]

4. Casas, C. Grp78 Neyrodegeneratsiya va saraton bosqichining markazida. Old. Nevrologlar. 2017, 11, 1–15. [CrossRef]

5. Reddy, RK; Mao, C.; Baumeister, P.; Ostin, RC; Kaufman, RJ; Li, AS Endoplazmatik retikulum chaperon oqsili GRP78 hujayralarni topoizomeraz inhibitörleri tomonidan qo'zg'atilgan apoptozdan himoya qiladi. Kaspaza{2}}faollashuvini bostirishda ATP bog'lovchi saytning roli. J. Biol. Kimyo. 2003, 278, 20915–20924. [CrossRef] [PubMed]

6. Vang, M.; Kaufman, RJ Endoplazmatik retikulumdagi oqsilning noto'g'ri qatlamlanishi inson kasalliklari uchun kanal sifatida. Tabiat 2016, 529,326–335. [CrossRef] [PubMed]7. Printsev, I.; Kuriel, D.; Carraway, KL Endoplazmatik retikulumda membrana oqsillari miqdorini nazorat qilish. J. Membr. Biol. 2016,250, 1–14. [CrossRef] [PubMed]

8. Shu, C.-V.; Sun, F.-C.; Cho, J.-H.; Lin, C.-C.; Liu, P.-F.; Chen, P.-Y.; Chang, MD-T.; Fu, H.-V.; Lay, Y.-K. GRP78 va Raf{11}}birgalikda endoplazmatik retikulum stressi tufayli kelib chiqqan apoptozga qarshilik ko'rsatadi. J. Hujayra. Fiziol. 2008, 215, 627–635. [CrossRef]

9. Kuk, KL; Clarke, R. Issiqlik zarbasi 70 kDa protein 5 / glyukoza bilan boshqariladigan protein 78 "AMP" ni avtofagiyaga aylantiradi. Autofagiya 2012, 8,1827–1829. [CrossRef]

10. Li, Z.; Vang, Y.; Nyuton, IP; Chjan, L.; Ji, P.; Li, Z. GRP78 IKK ning autofagik degradatsiyasini rag'batlantirish orqali o'simta aerob glikolizini modulyatsiya qilishda ishtirok etadi. Hujayra. Signal. 2015, 27, 1237–1245. [CrossRef]

11. Cha-Molstad, X.; Yu, J.E; Li, SH; Kim, JG; Sung, KS; Xvan, J.; Yoo, YD; Li, YJ; Kim, ST; Li, DH; va boshqalar. HSPA5/GRP78/BiP endoplazmatik retikulum chaperonining N-terminal arginilatsiyasi orqali SQSTM1/p62 faolligini modulyatsiya qilish. Autofagiya 2016,12, 426–428. [CrossRef]

12. Cha-Molstad, X.; Sung, KS; Xvan, J.; Kim, KA; Yu, J.E; Yoo, YD; Jang, JM; Xan, DH; Molstad, M.; Kim, JG; va boshqalar. Amino-terminal arginillanish p62 bog'lanishi orqali autofagiya uchun endoplazmatik retikulum chaperone BiP ni maqsad qiladi. Nat. Cell Biol.2015, 17, 917–929. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com