Herba Cistanche ekstrakti mitoxondrial glutation holatini va kalamush yuraklarida nafas olishni yaxshilaydi, bunda oqsillarni ajratish mumkin.

Kirish

Ilgari ishemik miokardning reperfuziyasi mitoxondriyal o'zgarishlarga olib keladi, shu jumladan reaktiv kislorod turlarini (ROS) ishlab chiqarish, Ca2+ortiqcha yuk va adenozin trifosfat (ATP) ishlab chiqarishning pasayishi, bularning barchasi nekroz va / yoki apoptoz vositachiligida hujayra o'limiga olib kelishi mumkin (Redegeld va boshq., 1992; Lemasters va boshq., 1998). Chunki mitoxondriyalar aniqlashda hal qiluvchi rol o'ynaydiIshemiya/reperfuzion (I/R) muammosidan keyin kardiomiotsitlar taqdirini aniqlash uchun miokard I/R shikastlanishidan himoya qilish mitoxondriyal strukturaviy va funksional yaxlitlikni saqlashga qaratilgan bo'lishi kerak. I/R chaqiruvidan keyin mitoxondrial energiya almashinuvini saqlab turish ayniqsa muhimdir, chunki yurak qisqarish funktsiyasi deyarli butunlay mitoxondriya tomonidan ishlab chiqarilgan ATPga bog'liq. Tirik, lekin qisqarmaydigan kardiomiotsitlar juda kam qo'llaniladi.

Immunitetni oshirish uchun Natural CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, butun quritilgan o'simlikSitstanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), asosan shimoliy va shimoli-sharqiy Xitoyning cho'l hududlarida o'sadigan parazit o'simlik. Xitoy tibbiyotida "Yangni tetiklantiruvchi" o't sifatida tasniflangan Herba Cistanche buyrak etishmovchiligi, ayollarning bepushtligi va keksa bemorlarda ichakning quruqligidan kelib chiqadigan qabziyat uchun buyuriladi (Chen, 1998). Laboratoriyamizdagi avvalgi tadqiqotlar metanol ekanligini ko'rsatdiHerba Cistanche ekstraktimiyokardning ATP ishlab chiqarish qobiliyatini oshiradi (Leung & Ko, 2008) va kalamushlarda miyokard I / R shikastlanishidan himoya qiladi (Leung, 2006). ATP ishlab chiqarish qobiliyatini rag'batlantirish mitoxondrial elektron tashishning kuchayishi bilan parallel ravishda amalga oshirilgan bo'lsa (Leung va Ko, 2008), Herba Cistanche bilan davolash natijasida I / R shikastlanishidan kardioproteksiya miyokard ATP etishmovchiligining pasayishi bilan bog'liq edi (Leung, 2006). Ushbu tadqiqotda Herba Cistanche ning kardioprotektiv ta'sirida mitoxondriyalarning rolini aniqlash uchun biz Herba Cistanche bilan davolashning kalamush yuraklarida mitoxondrial glutation holati, Ca2+ tarkibi, membrana salohiyati va nafas olish tezligiga ta'sirini o'rgandik. .

Materiallar va usullar

O'simlik materiali

Herba Cistanche mahalliy (Gonkongda joylashgan) o'simliklar sotuvchisidan (Li Hoong Ki) sotib olingan. Oʻt yetkazib beruvchi tomonidan tasdiqlangan va vaucher namunasi (HKUST00301) Gonkong Fan va Texnologiya Universiteti (HKUST) biokimyo boʻlimiga saqlangan. O'tning metanol ekstraktsiyasi oldingi tadqiqotlarga asoslanib, bunday ekstrakt mitoxondriyal ATP hosil bo'lishini kuchaytirgan va kalamush yuraklarida I / R shikastlanishidan himoyalanganligini ko'rsatgan (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Qisqacha aytganda, Herba Cistanche (400 g) kichik bo'laklarga bo'lingan va yuqorida tavsiflanganidek, 300 ml metanolda 60 darajada 2 soat davomida qayta oqim ostida isitish orqali ekstraksiya qilingan (Leung & Ko, 2008). Jarayon ikki marta takrorlandi. Birlashtirilgan ekstrakt erituvchini past bosim ostida bug'lash orqali quritilgan; xom o't miqdori bo'yicha hosildorlik 42% (w/w) ni tashkil etdi. Ekstrakt ishlatilgunga qadar 4 daraja haroratda saqlanadi. Xitoy o'simliklari an'anaviy ravishda og'iz orqali iste'mol qilish uchun suvdan olinadigan bo'lsa-da, namunalarni qayta ishlash va saqlashda qulaylik uchun bizning oldingi tadqiqotimizda metanol ishlatilgan (Yim & Ko, 2002) va biz metanol ekstraktsiyasini har jihatdan qoniqarli deb topdik.

Hayvonlarni parvarish qilish va dori-darmonlarni davolash

Voyaga etgan urg'ochi Sprague-Dawley kalamushlari (8-10 xaftalik; 200-230 g) namlik bilan boshqariladigan xonada, 12 soat qorong'i / yorug'lik aylanishi bilan, taxminan 22 daraja haroratda joylashtirildi va oziq-ovqat va suv ad libitumga ruxsat berildi. Hayvonlar tasodifiy ravishda turli guruhlarga ajratildi, har bir guruhda beshta hayvon bor. Kalamushlar qabul qildiHerba Cistanche ekstraktiintragastral ({0}},2 g/ml suvda) 0,5 g/kg yoki 1,0 g/kg ketma-ket 3 kun. Nazorat qilinadigan (tozalanmagan) hayvonlar faqat suv oldi. Oxirgi dozadan yigirma to'rt soat o'tgach, biokimyoviy tahlil qilish uchun anesteziya qilingan hayvonlardan yurak qorincha to'qimasi olindi. Barcha eksperimental protokollar HKUST tadqiqot amaliyoti qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan.

Mitoxondrial fraksiyalarni tayyorlash

Yurak qorinchalarining maydalangan to'qimalari (~{{0}}},6 g) muzdek sovuq saxaroza tamponining 10- barobar (s/h) ortiqcha miqdorida [0,32M saxaroza, 1mM etilen diamin tetraasetik kislotada gomogenlashtirildi. (EDTA), 50mM Tris/HCl; pH 7.4] teflon-shisha gomogenizator yordamida, 4000 aylanish tezligida, 25-30 zarba bilan. Mitoxondriyal granulalar to'qima gomogenatlaridan 800 × g haroratda 4 daraja 30 daqiqa davomida santrifüj qilish yo'li bilan tayyorlangan va tozalik yuqorida tavsiflanganidek, mos ravishda supernatant va granuladagi suksinat dehidrogenaza va laktat dehidrogenazaning nisbiy o'ziga xos faolligini o'lchash orqali aniqlangan (Evans, 1992). Mitoxondriyal granulalar 1 ml homogenlashtiruvchi buferda to'xtatildi.

Mitoxondriyal pasaytirilgan glutation va oksidlangan glutation darajasini o'lchash

Mitoxondrial qisqartirilgan glutation (GSH) darajalari Griffith (198{{17}) tomonidan o'zgartirilgan protokolda 5,{1}}ditiobis (2- nitrobenzoy kislota) (DTNB) va glutation reduktaza (GR) yordamida fermentativ tarzda aniqlandi. }). Mitoxondriyal fraktsiyaning alikvotu (21{19}} mkl) 9{21} mkl 10% (v/v) 5-sulfosalitsil kislotasi (SSA) bilan aralashtirildi va aralash 10 daqiqa davomida 600 × g da santrifüj qilindi. Oksidlangan glutation (GSSG) darajasini o'lchash uchun 100 µL miqdoridagi SSA supernatantlari mikrofuga naychalarida 10 µL 20% (v/v) 2-vinilpiridin va 10 mkL 60% (v/v) trietanolamin bilan aralashtirildi. Har bir kolba xona haroratida kamida 1 soat turishiga ruxsat berildi. Fosfat tamponida 0,63 mM DTNB va 0,053 mM NADPH (qaytarilgan nikotinamid adenin dinukleotid fosfat) o'z ichiga olgan reaksiya aralashmasi (0,1 M, 5 mM Na2 EDTA bilan; pH7,5) 30 daraja oldindan inkubatsiya qilindi. SSA namunasi supernatantining (umumiy glutation) yoki GSSG namunasining alikvotu (30 mkl) quduq mikrotitr plitasining qudug'iga 96-va 0,525 U/ni o'z ichiga olgan 180 mkL oldindan qizdirilgan reaksiya aralashmasi qo'shildi. ml GR, keyingi qo'shildi. 412 nm da yutilish o'zgarishlari 5 daqiqa davomida spektrofotometrik tarzda kuzatildi. GSH va GSSG kontsentratsiyasi standart sifatida GSH va GSSG [3% (v/v) SSAda erigan] yordamida kalibrlash egri chiziqlaridan hisoblab chiqilgan va nmol/mg oqsil sifatida ifodalangan. GSH darajasi umumiy GSH miqdoridan GSSG miqdorini ikki baravar ayirish yo'li bilan baholandi.

JINSIY FONKSIYONNI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitoxondrial Ca2+ tarkibini o'lchash

Mitoxondrial Ca{0}} miqdori Ca{1}}sezgir flüoresan probi, Fluo-5N AM ester (Molekulyar problar, Eugene, OR) yordamida Victor2 ko'p yorliqli hisoblagich yordamida o'lchandi. (Model 1420; PerkinElmer, Turku, Finlyandiya), Menze va boshq. (2005). Ca2+ dissotsiatsiya konstantalari (Kd qiymatlari) 1–1000 mkM kontsentratsiya oralig'ida amal qiluvchi Ca2+ kalibrlash to'plami yordamida aniqlandi; To'plam ishlab chiqaruvchisi ma'lumotlariga ko'ra, taxminiy Kd qiymatlari yuqori ishonchlilik bilan 90–100 mkM edi. Mitoxondriyal fraksiyaning alikvotu (25 µL) (0,5 mg oqsil/ml yakuniy konsentratsiya) 25 µL inkubatsiya buferi {100 mM KCl va 30 mM MOPS [3- (N-morfolino) propansulfonik kislota] bilan aralashtirildi; pH7,2} 96-qora mikrotitr plastinkasida. Aralash 25 daraja haroratda 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi; Keyin 25 µL digitonin (50 µg/mL) va 25 µL Fluo{29}}NAM esteri (1 µM 0,005% (w/v) Pluronic F-127) qo‘shildi. Membrananing o'tkazuvchanligini osonlashtirish orqali, digitonin vositachilik bilan floresan bo'yoqning mitoxondriga kirishiga yordam beradi. Biz kalamushlarning yurak mitoxondriyal preparatlarida Fluo{34}}N darajasi digitonin borligida 20- barobar ortganini aniqladik. Reaktsiya aralashmalari 25 daraja haroratda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va floresan ko'rsatkichlari 488 nm qo'zg'alish to'lqin uzunligida va 532 nm emissiya to'lqin uzunligida o'lchandi. Mitoxondrial Ca2+ tarkibi kalibrlash egri chizig'i yordamida hisoblangan va mkmol/mg oqsil sifatida ifodalangan.

Mitoxondriyal membrana potentsialini o'lchash

Membran potentsiali (Dm) Bonavita va boshqalarnikidan o'zgartirilgan usul bilan baholandi. (2003), lyuminestsent bo'yoq yordamida, lipofil katyonik prob 5,596, 69- tetraxloro-1,193,39-tetraetilbenzimidazolilkarbosiyanin yodid, odatda JC-1 deb ataladi. Mitoxondriyal fraksiyalarning alikvotlari (50 µL) (1 mg protein/ml ga sozlangan) 50 µL substrat eritmasi (tarkibida 6 mM piruvat va 6 mM malat bo‘lgan), 25 µL oldindan ishlangan adenozin difosfat (ADP30 m) eritmasi bilan 37 gradusda inkubatsiya qilindi. va 25 µL 3 µM JC-1, qorong‘uda. DM qiymatlari Victor2 MultiLabel Counter yordamida 535nm (FL1) va 580nm (FL2) da flüoresansni o'lchash yo'li bilan olingan. JC-1 mitoxondriyalarda agregatlar hosil qiladi, natijada yuqori FL2 floresans qiymatlari hosil bo'ladi va normal mitoxondriyal potentsialni ko'rsatadi. Dm ning yo'qolishi FL2 floresansining pasayishiga (JC-1 agregatlari kamroq darajada) va FL1 floresansining (JC-1 monomerlaridan) bir vaqtda oshishiga olib keladi. Ma'lumotlar FL1/FL2 floresans qiymatlarining nisbati sifatida ifodalangan. Tahlilni tasdiqlash uchun karbonil siyanid m-xlorofenilgidrazon (CCCP), DHm-yiqituvchi vositadan foydalanildi.

Mitoxondriyal nafas olishni o'lchash

Mitoxondriyal nafas olish tezligi Klark tipidagi kislorod elektrodi bilan jihozlangan Hansatech Oxygraph-Plus asbobi (Sarasota, FL, AQSh) yordamida 37 darajada o'lchandi. Mitoxondriyal fraktsiyalar (0,6 mg protein/ml) 125 mM KCl, 2 0 MOPS, 10 mM Tris, 0,5 mM etilen glikol tetraasetik kislota (EGTA) va 2 mM K; H ni o'z ichiga olgan nafas olish tamponida to'xtatildi. pH 7,2. 2 daqiqa davomida 37 daraja inkubatsiyadan so'ng, har bir namuna 50 mkL substrat eritmasi (5 mM piruvat va 5 mM malat) oldi. Nafas olish tezligi 1 mM ADP mavjudligida (3-holat) va barcha ADP ning ATP ga fosforlanishidan keyin (4-holat) o'lchandi. Davlat 3: Davlat 4 nafas olish tezligining nisbati nafas olish nazorati indeksidir, bu nafas olish va fosforlanish o'rtasidagi bog'lanishning qattiqligini ko'rsatadi (Javadov va boshq., 2005; Kuwabara va boshq., 1997). Substrat eritmasi qo'shilishidan oldin 1-holat nafas olish tezligi 2-holat nafas olish boshlanishiga qadar o'lchandi va ADP qo'shilishidan oldin 2-holat nafas olish tezligi hisoblandi.

Statistik tahlil

Ma'lumotlar bir nechta guruhlarni taqqoslash uchun bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) orqali tahlil qilindi. Eng kam ahamiyatli farq (LSD) qiymatlari p qiymatlari < 0 bo'lganda ikki guruh o'rtasidagi sezilarli farqlarni aniqlash uchun ishlatilgan.05.

JINSIY FONKSIYONNI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Natijalar

1 va 2-rasmlarda ko'rsatilganidek, metanol bilan ishlov berishHerba Cistanche ekstrakti({0}},5 yoki 1,0g/kg/kun×3) kalamush yuraklarida mitoxondrial glutation holatini sezilarli darajada oshirdi, bu GSH darajasining dozaga bog'liq ortishi (11-30%) va glutatyonning pasayishi bilan tasdiqlanadi. GSSG darajalari (31%).

Herba Cistanche bilan davolash dozaga bog'liq ravishda kalamush yuraklarida mitoxondriyal Ca2+ darajasini nazorat guruhiga nisbatan kamaytirdi; 1.0 g/kg dozada bostirish 41% ni tashkil etdi (3-rasm).

Herba Cistanche bilan davolash mitoxondriyal DM ni oshirdi, bu FL1/FL2 nisbatining pasayishi (14-16%) bilan tasdiqlanadi. CCCP (100 µM) FL1/FL2 nisbati ortishi bilan ko‘rsatilganidek, Dm yiqilishiga olib keldi (4-rasm).

Herba Cistanche bilan davolashmitoxondriyal nafas olishni kuchaytirdi, bu nazorat hayvonlarga nisbatan sinovdan o'tgan hayvonlarda 3-Shtat nafas olishning sezilarli darajada yuqoriligi (84%) bilan tasdiqlanadi (1-jadval). 2-holat va 4-holat nafas olish darajalari mos ravishda 47 va 80% ga oshdi, ammo 4-holat nafas olishning stimulyatsiyasi 2/3 proteinning ajratuvchi inhibitori bo'lgan 1mM guanozin-5'-difosfat tomonidan to'liq bostirildi. Herba Cistanche bilan davolash nafas olish nazorati indeksiga ta'sir ko'rsatmadi, chunki 3-davlat/4-davlat nafas olish tezligi nisbati bo'yicha baholanadi.

Munozara

Herba Cistanche bilan davolash qilingan kalamush yuraklaridan ajratilgan mitoxondriya glutation holatining yaxshilanganligini ko'rsatdi, bu GSH darajasining oshishi va GSSG darajasining pasayishi bilan ko'rsatilgan. Mitoxondriyal glutation redoks holatini saqlash I/R shikastlanishiga qarshi kardioproteksiya uchun juda muhimdir (Chiu va Ko, 2003). Miyokard ishemiyasi vaqtida sitozolik Ca2+ miqdori ko'payib, ichki membranani Ca2+ uniporter tomonidan o'zlashtiriladi (Ataka va boshq., 1992; Grover va boshq., 1990), bu esa mitoxondriyal Ca{{6} hosil bo'lishiga olib keladi. } to'plash. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, Herba Cistanche ekstrakti bilan davolash mitoxondrial glutation-qaytarilish holatini yaxshilaydi va mitoxondriyal Ca2+ darajasini pasaytiradi, bu esa miyokard I/R shikastlanishidan himoyalanishi mumkin (Leung, 2006). 1,0 g/kg yuqori dozada Herba Cistanche bilan davolash GSSG va Ca2+ darajasini yanada pasaytirishga qodir emasligi glutation-qaytarilish potentsiali va kaltsiy holatiga ta'sir qiluvchi o'z-o'zini cheklovchi tartibga solish mexanizmining mavjudligi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. mitoxondriyalarda.

Mitoxondriyalar elektron tashish orqali ichki membrana bo'ylab elektrokimyoviy proton gradientini hosil qiladi. Bu gradient ATP sintaza tomonidan ADP ni ATP ga fosforillash uchun ishlatiladi. Mitoxondriyal membrana potentsialining pasayishi, madaniy kardiyomiyositlarning shikastlanishidan keyin gipoksiya / reoksigenatsiyada bo'lgani kabi (Chiu va boshq., 2008), ATP hosil bo'lishining pasayishiga olib keladi. Miyokardiyal mitoxondriyal membrana potentsialini oshirishi mumkin bo'lgan Herba Cistanche bilan davolash, ayniqsa, ishemik reperfuziyadan keyingi davrda ATP hosil bo'lishini kuchaytirishi mumkin. Shunga qaramay, o'z-o'zini cheklovchi tartibga solish mexanizmining mavjudligi, nega Herba Cistanche davolashning mitoxondriyal membrana potentsialiga ta'siri dozaga bog'liq emasligini tushuntirishi mumkin.

Herba Cistanche bilan davolash kislorod iste'moli bilan baholanganidek, kalamush yurak mitoxondriyalarida nafas olish tezligini sezilarli darajada oshirdi. Ushbu topilma mitoxondrial ATP ishlab chiqarish qobiliyatini in vitro va situ o'lchovlaridan olingan natijalarga mos keladi (Leung & Ko, 2008). Ajablanarlisi shundaki, Herba Cistanche bilan davolash miyokard ATP ning barqaror darajasini pasaytirgan bo'lsa-da (ma'lumotlar ko'rsatilmagan), davolash mitoxondriyal ATP hosil bo'lishini kuchaytirdi. Bir-biriga bog'lanmagan nafas olishning ishtiroki bu xilma-xil kuzatuvlarni tushuntirishi mumkin. Bog'lanmagan oksidlovchi fosforillanish protonlar mitoxondriyal ichki membrana bo'ylab mitoxondriyal matritsaga qaytarilganda sodir bo'ladi va shu bilan elektron tashish zanjiri tomonidan hosil bo'lgan membrana potentsialini yo'qotadi. Bu ATP hosil bo'lishini qo'zg'atuvchi proton-harakatlantiruvchi kuchning pasayishiga olib keladi (Garvey, 2003). Natijada, mitoxondriyalarda Ca2+ kontsentratsiyasi va ROS ishlab chiqarish keskin pasayadi (Teshima va boshq., 2003). Ushbu taklif Herba Cistanche bilan davolash qilingan yuraklarda mitoxondriyal Ca2+ darajasining pasayishini ko'rsatgan ushbu tadqiqot natijalariga mos keladi. Ajralmagan nafas olishga kelsak, Herba Cistanche bilan davolashda ajratilmaydigan oqsillar (UCP) sintezi qo'zg'atilishi mumkin. UCPlar oksidlovchi fosforillanishni ajratishi va transgen sichqonlarning yuraklarida UCP1 ning ifodalanishi I / R tomonidan qo'zg'atilgan miokard shikastlanishidan himoyalanganligi ma'lum (Hoerter va boshq., 2004). UCPlarning ajratuvchi ta'siri purin nukleotid difosfatlar va trifosfatlar (masalan, ADP, ATP, guanozin difosfat (GDP) va GTP) tomonidan inhibe qilingan (Echtay va boshq., 2002). Ushbu tadqiqotda membrana salohiyati va nafas olish tezligi kabi mitoxondriyal parametrlar ADP (substrat sifatida) ishtirokida o'lchandi; shuning uchun UCPlarni ajratish ta'siri inhibe qilindi. Biroq, mitoxondrial holat 4 nafas olish tezligi ADP yo'qligida o'lchanganda, bu ko'rsatkich Herba Cistanche bilan davolash qilingan yuraklardan tayyorlangan mitoxondriyalarda davolanmagan nazoratchilar yuraklariga qaraganda yuqori bo'lgan. 4-holat nafas olish tezligi protonlar F1 F0 -ATPase (Garvey, 2003) ishtirok etmaydigan mexanizm orqali mitoxondriyal matritsaga qaytib oqib chiqsa, mitoxondriya tomonidan kislorod iste'molini aks ettiradi. UCP larning Herba Cistanche tomonidan qo'zg'atilgan 4-davlat nafas olishidagi o'sishiga mumkin bo'lgan ishtiroki, bu yaxshilanish YaIM tomonidan bostirilganligi haqidagi xulosa bilan tasdiqlanadi (Bento va boshq., 2007).

Xulosa qilib aytganda, Herba Cistanche bilan davolash mitoxondrial glutation holatini yaxshilashi, mitoxondriyal Ca2+ darajasini pasaytirishi va kalamush yuraklarida mitoxondriyal membrana potentsialini va nafas olish tezligini oshirishi mumkin. Mitoxondriyal glutation holati va funktsional qobiliyatining oshishi va UCPlarning taxminiy induksiyasi yurak himoyasi bilan bog'liq bo'lishi mumkin.Herba Cistanche bilan davolashI/R jarohatidan keyin.

TABIY CISTANCHE TUBULOSA O'simlik CISTANCHE EKSTRAKT PHGS75% ECH 30% ACT 12%