Immunitetni rag'batlantiruvchi antikor konjugatlari mustahkam miyeloid faollashuvi va mustahkam o'smaga qarshi immunitetni keltirib chiqaradi (1-qism)

Qo'shimcha ma'lumot olish uchun plz bilan bog'laningdavid.wan@wecistanche.com

Abstrakt

Tug'ma naqshni aniqlash retseptorlari, shu jumladan toll-like retseptorlari (TLR) o'simta mikro muhitini va o'simtaga qarshi asosiy moslashuvchan immunitetni o'zgartirishi mumkin.Biroq, tizimli qo'llashdan keyin keng tarqalgan immun faollashuvi bilan bog'liq toksik ta'sirlar tufayli TLR agonistlari yaxshi muhosaba qilinmagan.Tizimli yetkazib berish uchun mos bo'lgan terapevtik loyihalash vao'simtaga yo'naltirilgan javobni keltirib chiqarishga qodir bo'lgan holda, biz o'simtani nishonga oluvchi antikorlarga konjugatsiyalangan TLR7/8 agonistini o'z ichiga olgan immunitetni ogohlantiruvchi antikor konjugatlarining (ISACs) yangi sinfini ishlab chiqdik.Tizimli ravishda qo'llaniladigan anti-HER2 ISAClar in vivo jonli ravishda yaxshi muhosaba qilindi va intratumoral miyeloid hujayralarining mustahkam faollashuviga olib keldi, bu esa o'smaning tozalanishi va keyingi immunologik xotiraga olib keldi.In vitro potentsial va in vivo samaradorligi fagotsitoz va T-hujayrasi vositachiligida o'simtaga qarshi immunitetni ta'minlash uchun buzilmagan Fc funksionalligi va TLR agonizmi tomonidan boshqariladigan tandem faolligini talab qildi.ISAC vositachiligidagi immunologik xotira HER2 bilan chegaralanib qolmadi, chunki ISAC bilan davolash qilingan sichqonlar HER2-manfiy o'simta bilan qayta tiklanishdan himoyalangan.Ushbu natijalar ISAClarning klinik rivojlanishi uchun kuchli mantiqiy asos yaratadi va Fc R va TLR7/8 signalizatsiyasi o'rtasidagi sinergiya ISAC vositachiligida o'smaga qarshi immunitet mexanizmiga hissa qo'shishini ko'rsatadi.

Cistanche haqida ko'proq ma'lumot olish uchun bu yerni bosing

Kirish

20-asrning oxirigacha saraton kasalligida odatda uchta davolash usuli mavjud edi: jarrohlik rezektsiya, radiatsiya va kimyoterapiya. Saraton immunoterapiyasining paydo bo'lishi kuchli to'rtinchi usulni qo'shdi, bu onkologiya repertuarini Xodgkin bo'lmagan limfoma uchun rituksimabni tasdiqlashdan boshlab va nazorat punkti ingibitorlarini 1,2 keng qo'llashgacha kengaytirdi. Biroq, har qanday terapiya, shu jumladan immunoterapiya, agar u o'simtaning heterojenligi va mutatsion yuk 3-5 ni engib o'tadigan bardoshli biologik va immunologik javoblarni keltirib chiqarmasa, vaqtincha cheklangan. Anti-PD-1 va PD-L1 antikorlari kabi nazorat nuqtasi ingibitorlari bir qancha ko‘rsatkichlar bo‘yicha natijalarni keskin yaxshilaydi, shu jumladan o‘simta mutatsion yuki yuqori bo‘lgan yoki mikrosatellit beqarorligi bo‘lgan bemorlarda va nazorat punkti immunoterapiyasiga o‘simtaning sezuvchanligining hal qiluvchi omillaridan biri bu ko‘rsatkichlar darajasi. - mavjud T hujayralari infiltratsiyasi. T-hujayralarining siyrak infiltrati bo'lgan "sovuq" o'smalari bo'lgan bemorlar o'simta mikromuhitida (TME) immunosupressiv o'simta-reaktiv T hujayralari mavjud bo'lgan "issiq" o'smalari bo'lgan bemorlarga nisbatan nazorat punkti blokadasiga kamroq javob beradilar va yomon prognozlarga ega. . O'simta biopsiyasi va immunohistokimyosi shuni ko'rsatadiki, dendritik hujayralar (DC) kabi professional antigen taqdim qiluvchi hujayralar (APC) ko'pincha T-hujayralarga qaraganda TMEda tez-tez uchraydi, garchi immunosupressiv mexanizmlarga hali ham sezgir bo'lsa 8,9. TMEda miyeloid hujayralar mavjudligini va ularning T hujayralari faollashuvini rag'batlantirishdagi rolini hisobga olgan holda, keng tarqalgan T hujayralari immunitetini va samarali anti-tumoral immun javobini olish uchun o'simta bilan bog'liq APClarni faollashtiradigan terapiyani ishlab chiqish bo'yicha harakatlar kuchaymoqda.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 donor. (d) Rituximab gidroksilamin bilan deatsetillashdan oldin erkin aminlarni himoyalangan sulfgidril guruhlarga aylantirish uchun lizin qoldiqlari orqali SATA bilan reaksiyaga kirishdi va rituksimab-ISAC hosil qilish uchun T785-MCC bilan keyingi reaksiyaga kirishdi. (e) PNGase F davolashdan keyin rituximab-ISACning LC-MS tahlili. DAR 606 g/mol bo'lgan bog'lovchi-agonist massa qo'shilishi asosida hisoblab chiqilgan. (f) Flüoresan yorliqli rituksimab yoki rituksimab-ISAC oqim sitometriyasi orqali tahlil qilishdan oldin CD20 plus Toledo o'simta hujayralari bilan 4 gradusda 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. Ma'lumotlar uch nusxali namunalar bilan 1 ta tajribadan olingan va 2 ta tajribani ifodalaydi.(gh) Yangi izolyatsiya qilingan inson miyeloid APClari rituksimab, T785, rituximab va T785 yoki rituksimab-ISAC bilan CFSE etiketli CD20 va Toledo o'simta hujayralari ishtirokida 3:1 effektorga maqsad nisbatida ekilgan. Rituximab kontsentratsiyasi X o'qida tasvirlangan, bu tahlillarda T785 kontsentratsiyasi T785 miqdoriga mos keladi.

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 donor (o'rtacha va SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Klinikadan oldingi modellarda immunostimulyatsiya qiluvchi vositalarni mahalliy etkazib berish bostirilgan o'simta rezident APClarni o'simta bilan bog'langan antijenlarni, shu jumladan neoantigenlarni qayta ishlash va keyinchalik o'simtaga qarshi immunitetni vositachilik qiladigan T hujayralariga taqdim etish qobiliyatiga ega faollashtirilgan hujayralarga qayta dasturlashi mumkinligi yaxshi hujjatlashtirilgan. . Carmi va boshqalar tomonidan ilgari surilgan bunday strategiyalardan biri toll-like retseptorlari (TLR)-3 agonisti yoki TNF va CD40L bilan funktsional ravishda qutqarilgan o'simta bilan bog'liq APClar bilan allogenik o'simtaga mo'ljallangan antikorlarning intratumoral yuborilishi antigenni qabul qilishning kuchayishiga olib kelishini ko'rsatdi. o'simtaga qarshi T hujayra immunitetining keyingi induktsiyasi. TLR agonisti bilan antikor effektor funktsiyasini qo'llagan ushbu kombinatsiya strategiyasi birlamchi o'smalarni va metastatik lezyonlarni yo'q qilishga olib keldi va xostni o'smaning qaytalanishidan himoya qildi 11,14. Xuddi shunday, o'simta ichidagi TLR9 agonisti, CpG, faollashtirilgan APC va T hujayralari bilan birgalikda agonistik anti-OX40 antikori, bu sichqonlarda bir nechta o'sma turlariga qarshi ta'sirchan samaradorlikka olib keladi 13. Klinikaga APC faollashtirish strategiyalarining samarali tarjimasi qilinmoqda. melanoma bilan og'rigan bemorlarda klinik ma'lumotlarga ega bo'lgan ko'plab ko'rsatkichlar bo'yicha tekshirildi, bu esa TLR9 agonistlarini anti-PD-1 antikorlari bilan birgalikda o'simtaning qisqarishiga va in'ektsiya qilinmagan lezyonlarda abskopal javoblarga olib kelishi mumkinligini ko'rsatadi. 15. Xuddi shunday, bir nechta Guruhlar o'simta immunoterapiyasi uchun TLR7/8 agonistlarini izlamoqda, chunki odamning APClarida TLR7/8 ning ifodalanish modeli sichqon APClarida16-18 TLR7 va TLR9 ifoda naqshini yanada yaqinroq aks ettiradi. Oxir oqibat, agar samarali bo'lsa, o'simta ichidagi yuborish strategiyalarini qabul qilish o'simtaga kirish imkoniyati bilan cheklanadi, chunki APClarga qaratilgan immun agonistlarni tizimli etkazib berish toksiklik, qisqa yarim umr va maqsadli joylarga sub-optimal etkazib berish bilan cheklangan.Bizning maqsadimiz o'simtaga qarshi mustahkam immunitetni yaratish uchun yangi terapevtik yondashuv sifatida immun agonist bilan konjugatsiyalangan o'simtaga mo'ljallangan monoklonal antikordan iborat immunitetni ogohlantiruvchi antikor konjugatini (ISAC) loyihalash edi. ISACning tizimli boshqaruvi Fc ga bog'liq bo'lgan TMEda mahalliylashtirilgan APC faollashuvini keltirib chiqardi.TLR agonistlarini tizimli yuborish bilan bog'liq bo'lgan tipik toksikliklarni chetlab o'tishda effektor funktsiyasi va TLR faollashuvi. Bundan tashqari, ushbu konjugatlarni o'simtaga olib keladigan sichqonlarga tizimli qo'llash antigenni qayta ishlash va T hujayralariga taqdim etish imkonini berdi, bu esa konjugatsiyalanmagan o'simtaga mo'ljallangan antikorga chidamli bo'lgan bir nechta modellarda o'simtaga qarshi immunitetni mustahkamlaydi.

Natijalar

ISAC dizayni va xarakteristikasi TLR agonistini antikorga konjugatsiya qilish uchun molekulyar biriktiruvchi vositalar antikorga erituvchi bilan bog‘lanish nuqtasi bo‘lib xizmat qilgan butil-aminli yangi TLR7/8 agonistini (T785) loyihalashda foydalanilgan. 1A-rasm, 1A-C qo'shimcha rasm). T785 EC50 0,643 mkM bo‘lgan inson TLR7 va HEK293 hujayra qatorlarida EC50 qiymati 1,60 mkM bo‘lgan inson TLR8 ni NF-kB-induktsiyali sekretsiyali gidroksidi fosfataza yoki TLR17ure (TLR17ure) bilan birgalikda ifodalaydi. ). T785 ning TLR7/8 uchun o'ziga xosligi T785 ning TLR7/8 ifodasi bo'lmagan HEK293 reportyor hujayralarida NF-kB faolligini keltirib chiqara olmasligi bilan tasdiqlangan (Qo'shimcha rasm 2A). Birlamchi hujayralardagi agonistik faollikni tasdiqlash uchun miyeloid APClar (~96 foiz monotsitlar, 4 foiz DC; qo'shimcha rasm 3A) deb ataladigan yangi ajratilgan monositlar va DClar bir kechada 1 mkM T785 yoki R848 bilan rag'batlantirildi. yaxshi tashkil etilgan va xarakterli TLR7 / 8 agonisti 19. T785 va R848 xuddi shunday darajada miyeloid APClarni rag'batlantirdi (1C-rasm) 20,21. T785 ning faolligi, shuningdek, TLR8 emas, balki TLR7 ni ifodalovchi yangi ajratilgan inson plazmatsitoid DClarida (pDC) tasdiqlangan (Qo'shimcha rasm 2B). ISAClarning inson in vitro madaniyatiga ta'sirini o'rganish uchun ko'p bosqichli reaktsiyada T785 ga konjugatsiya qilish yo'li bilan B hujayrali malign o'smalarini davolashda qo'llaniladigan klinik tasdiqlangan anti-CD20 monoklonal antikor bo'lgan rituksimab (1D-rasm) bilan ISAC yaratildi. mos keluvchi geterobifunktsional oʻzaro bogʻlovchilar bilan 22. T785-ISAC konjugatsiya samaradorligi PNGase F bilan deglikozillanishdan soʻng LC-MS bilan oʻlchandi, natijada oʻrtacha dori-antikor nisbati (DAR) 1,71 ga teng (1E-rasm). Toledo o‘simtasi hujayra chizig‘ini ifodalovchi CD20-, diffuz yirik hujayrali limfomasi bo‘lgan bemordan olingan yaxshi tavsiflangan hujayra chizig‘i (1F-rasm) 23. T 785-ISACning inson Fc retseptorlari bilan bog‘lanishi (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) Biacore tomonidan baholandi va rituksimab bilan solishtirish mumkin edi (1-qo‘shimcha jadval). }} ISAC 18 soat davomida CFSE etiketli CD20 plus Toledo o'simta hujayralari bilan yangi izolyatsiya qilingan inson miyeloid APClarining kokulturasidan so'ng baholandi. Rituximab T785-ISAC bilan yetishtirilgan miyeloid APClar DC morfologiyasiga mos keladigan tez morfologik oʻzgarishlarga uchradi, DC morfologiyasi esa oʻzgarmadi. rituksimab, T785 yoki rituksimabning ekvimolyar aralashmasi va T785 bilan inkubatsiya qilingan kokulturalarda kuzatiladi (1G-rasm). Rituksimab T785-ISAC bilan stimulyatsiya qilingan APClar sakkiz kungacha morfologiyada yashovchan va dendritik bo'lib qoldi, aralashma bilan rag'batlantirilgan APClar esa sakkizinchi kungacha hayotiy bo'lmagan (1H-rasm). Ko'p rangli oqim sitometriyasini tahlil qilish18 soatdan so'ng, rituksimab T785-ISAC bilan stimulyatsiya qilingan APClar CD14 va CD16 ni tartibga solishni pasaytirganini va CD123 ni bir vaqtning o'zida yuqori tartibga solishni ko'rsatdi.24. Aksincha, rituksimab bilan stimulyatsiya qilingan APClar,T785 yoki aralash ushbu belgilarning ifodasini modulyatsiya qilmadi (1I-rasm, qo'shimcha rasm 4A, qo'shimcha shakllar 3BCda tasvirlangan eshik strategiyasi).

Rituximab T785-ISAC bilan rag'batlantirilgan inson APClari, shuningdek, CD40 va HLA-DR regulyatsiyasida ham xuddi shunday tendentsiyalar faollashtirilgan APC fenotipiga mos keladigan tarzda kuzatilgan holda, CD{1}} kostimulyatsion molekulasini dozaga bog'liq ravishda kuchaytirdi (1I-rasm). & Qo'shimcha 4B-rasm). Yuzaki marker ifodasidagi dozaga bog'liq o'zgarishlar o'rtacha floresan intensivligi (MFI, 1-rasm) yoki tegishli marker uchun ijobiy bo'lgan hujayralar umumiy populyatsiyasining foizi sifatida baholanganmi yoki yo'qmi izchil edi (5-rasm). Hujayrasiz supernatantlarning keyingi tahlili shuni ko'rsatdiki, rituksimab T785-ISAC tomonidan stimulyatsiya qilingan APClar ko'proq miqdorda TNF va IL-1 chiqaradi (2J-rasm va qo'shimcha 4C-rasm). T785-ISAClarning immunostimulyator potentsiali rituksimab bilan cheklanmagan, chunki trastuzumab bilan hosil qilingan T785-ISAC ham miyeloid faollashuvining kuchayishiga olib kelgan (Qo‘shimcha 4D-rasm). ISAC tomonidan qo'zg'atilgan APClarning antigen taqdimotini va CD8 plus T hujayralarining o'zaro to'qnashuvini olish qobiliyati ovalbumin (OVA) modeli antijen tizimi 25,26 yordamida baholandi. Yovvoyi turdagi sichqonlardan ajratilgan taloq CD11c plyus DCs bir kechada OVA va anti-OVA antikori yoki ISAC bilan hosil bo'lgan immun komplekslari bilan o'stirildi. OVA yuklangan DClar miqdori aniqlandi va MHC-I bilan komplekslangan OVA peptid, SIINFEKL uchun TCR o'ziga xos xususiyatiga ega bo'lgan OT-I CD8 plus T hujayralari bilan inkubatsiya qilindi. Anti-OVA ISAC vositachiligida MHC-I, bog'langan SIINFEKL peptid miqdori va CD8 plus T hujayralari proliferatsiyasi bilan o'lchanadigan kengaytirilgan o'zaro faoliyat taqdimot (Qo'shimcha shakllar 6A va 6B). ISAClar kuchaytirilgan TLRni keltirib chiqaradi. va inson miyeloid APClarida Fc R bilan bog'liq hujayra ichidagi signalizatsiya Fc Rs va TLRlarning faollashishi murakkab fosfo-signal kaskadini keltirib chiqaradi va bu javoblarning kattaligi va xarakteristikalari turli xil immun hujayra kichik guruhlarida farqlanadi 27. Biz turli hujayra ichidagi signalizatsiya yo'llarining quyi oqimini tekshirdik. rituksimab T785-ISAC bilan stimulyatsiya qilingan PBMC-tumor kokulturalaridagi hujayra turlari massa sitometriyasi (CyTOF) yordamida ekvimolyar aralashma nazorati bilan solishtirganda 28. Leykotsitlar kichik guruhlari (ya'ni monotsitlar, CD4 va T hujayralari) nasl belgilaridan foydalangan holda SPADE klasteri orqali aniqlangan. CD20 plyus Toledo o'simta hujayralari va sog'lom B hujayralarini o'z ichiga olgan maqsadli hujayralar bilan 29. TLR (pIRF7) va Fc R (pERK1/2) signalizatsiyasi bilan bog'liq fosforlanish hodisalari monotsitlar va cDClarda T785-ISAC bilan stimulyatsiya qilinganidan keyin 15 minut o'tgach, individual komponentlar aralashmasiga nisbatan 30,31 ko'paydi. Hujayra ichidagi signalizatsiya asosan miyeloid kelib chiqadigan hujayralar (monotsitlar va cDClar), shuningdek pDClar bilan cheklangan edi.barchasi zarur Fc Rs va TLR7 va/yoki TLR8 ni ifodalaydi. Monotsitlar va cDClarda ISAC tomonidan qo'zg'atilgan stimulyatsiya, shuningdek, MAPKAPK2, p38, CREB va ribosoma oqsili S6 (RPS6) ning sezilarli darajada yuqori fosforlanishiga olib keldi, bu quyi oqim oqsil sintezini boshlash uchun talab (2A-C-rasm va qo'shimcha rasm 7A). CD141 plyus cDC va CD1c plus cDC ikkala CDC quyi to'plamida pIRF7 ning o'xshash darajalarini ko'rsatdi, RPS6 va pERK1/2 darajalari CD1c bilan solishtirganda CD141 plus cDClarda yuqoriroq tendentsiyaga ega bo'lib, ular CD8 plus T hujayralarini tayyorlash va antigen o'zaro taqdimotida ustunlik qiladi. plyus cDCs (Qo'shimcha rasm 7B).

T785-ISAC stimulyatsiyasining kinetikasi kutilgan signal dinamikasiga mos edi: ERK1/2 fosforillanishi 5 daqiqadan so‘ng eng yuqori cho‘qqiga chiqdi, uning quyi oqimidagi hamkori RPS6 esa 15-daqiqagacha (qo‘shimcha) fosforlanishning eng yuqori cho‘qqisiga chiqmadi. 7C-rasm). Ushbu kinetika kutilgan dinamikani qo'llab-quvvatlaydi, chunki signalizatsiya vaqt o'tishi bilan tarqaladi va APClarning ISAC stimulyatsiyasiga barqaror va kuchaytirilgan signal reaktsiyasi mavjudligini ko'rsatadi. Fc R va TLR signalizatsiya yo'llari bilan bog'liq bo'lgan ISAC stimulyatsiyasidan keyin kuzatilgan kuchaytirilgan javobni hisobga olgan holda, biz o'zaro ma'lumotlarning shartli zichligi qayta namunali smetasi (DREMI) va shartli-zichlikni qayta o'lchovli vizualizatsiya (DREVI) algoritmlaridan foydalanib, ichidagi juftlik munosabatlarining kuchini aniqladik. Fc R va TLR signalizatsiya yo'llari 32. Ushbu algoritmlar vizualizatsiya uchun DREVI chizmalarini yaratadi, bunda egri chiziq ostidagi maydon (AUC) signalning umumiy intensivligi ko'rsatkichi, burilish nuqtasi (IP) faollashtirish chegarasi o'lchovidir va DREMI balli ko'rib chiqilayotgan ikkita fosfoproteinning juft bog'liqligini aniqlaydi. Bu tahlil ekvimolyar aralashma nazorati bilan solishtirganda T785-ISAC stimulyatsiyasidan keyin Fc R va TLR signalizatsiya yo‘llari bilan bog‘langan oqsillar o‘rtasidagi juftlik bog‘liqligini ko‘rsatadigan DREMI ko‘rsatkichlarining ortishi aniqlandi (2D-rasm). PERK1/2 va pIRF7 o'rtasidagi kuchli o'zaro bog'liqlik T785-ISAC bilan stimulyatsiyadan so'ng noyob tarzda kuzatildi, ammo aralashma emas, bu DREMI ballining ortishi, kuchaytirilgan signal intensivligi va IRF7 fosforillanishi uchun zarur bo'lgan faollashuv chegarasining pasayishi bilan ko'rsatilgan (2D-rasm). ). Ushbu tahlil shuningdek, ISAC stimulyatsiyasidan so'ng oqsil translyatsiyasini (RPS6 fosforillanishi) boshlash uchun zarur bo'lgan faollashuv chegarasining pasayishini ko'rsatdi, chunki bu DREMI ko'rsatkichlarining ortishi va perERK1/2-pRPS6 va pIRF7-pRPS6 juft birikmalari uchun pasaytirilgan IP bilan belgilanadi. . Bundan tashqari, RPS6 fosforillanish darajasi ERK1/2 yoki IRF7 fosforillanishi natijasida ortib borayotgan AUC juftliklari bilan aniqlangan (2D-rasm). Ushbu birlashtirilgan natijalar nafaqat kutilgan Fc R va TLR yo'llari orqali ISAC signalizatsiyasini tasdiqlaydi, balki ikkita yo'l o'rtasidagi sinergiyani qo'llab-quvvatlaydi, bu esa faollashtirish chegaralarining pasayishiga va signal intensivligini oshiradi.

3-rasm: ISACs miyeloid faollashuviga vositachilik qilish uchun Fc effektor funksiyasi va TLR agonistini talab qiladi. Yangi izolyatsiya qilingan inson miyeloid APClari 18 soat davomida CD20 plus Toledo o‘simta hujayralari ishtirokida 3:1 effektor/maqsad nisbatida va (a) 80 nMda ekilgan. rituksimab-ISACning 1 mM R406 bilan yoki bo'lmasdan, (b) ko'rsatilgan antikor izotipidagi rituksimab-ISACs, (c) rituksimab-ISAC yoki deglikosillangan rituksimab-ISAC (ISAC-deglikosillangan). (ac) Hujayralar oqim sitometriyasi orqali tahlil qilindi va ma'lumotlar o'rtacha floresan intensivligi sifatida xabar qilinadi. (d) HEK-Blue-TLR7 yoki TLR8 reportyor hujayralari NF-kB tomonidan induktsiya qilingan SEAP faolligini baholashdan oldin T785 yoki TLRnull ishtirokida 18 soat davomida ekilgan. Ko'rsatilgan ma'lumotlar1 ta tajribadan va kamida 3 ta tajribaning vakili. (e) Yangi izolyatsiya qilingan inson miyeloid APClari CD20 plyus Toledo o'simta hujayralari va ko'rsatilgan rituksimab-ISAClar ishtirokida 18 soat davomida ekilgan va oqim sitometriyasi bilan tahlil qilingan (ma'lumotlar o'rtacha ko'rsatilgan).floresan intensivligi). (ae) Ko‘rsatilgan ma’lumotlar 1-4 ta qo‘shimcha tajribani ifodalaydi va har bir tajriba uchun 3 donordan katta yoki unga teng (o‘rtacha va SEM). Statistik ahamiyatlilik *P sifatida aniqlanadi<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISACs miyeloid APClarning faollashuviga vositachilik qilish uchun Fc effektor funktsiyasini talab qiladi. Fc faolligining ISAC funktsiyasiga qo'shgan hissasi Syk ning kichik molekulali kinaz inhibitori R406 bilan quyi oqim Fc R signalining ablatsiyasidan so'ng o'rganildi, bu faollashtiruvchi Fc Rs 33,34 ning quyi oqimida signal uzatilishini oldini oladi. . R406 qo'shilishi T785-ISAC vositachiligidagi miyeloid faollashuvini bekor qildi, bu CD{6}} kostimulyatsion molekulasining yuqori regulyatsiyasi yo'qligidan dalolat beradi, lekin T785 tomonidan TLR7/8 faollashuviga hujayra javobini o'zgartirmadi (3A-rasm). & Qo'shimcha 8-rasm). T785-ISAC stimulyatsiyasidan keyin monotsitlarda R406 bilan Syk inhibisyonu ham bekor qilingan signalizatsiya kuzatildi.o'lchangan fosforlangan MAPKAPK-2, ERK1/2 va IRF7 darajalari sezilarli darajada kamaydi (Qo'shimcha rasm 7D).Ushbu ma'lumotlarni hisobga olgan holda, T785-ISAC faolligi ma'lum Fc R bilan bog'lanish yaqinliklari 35,36 bilan o'zgarishini aniqlash uchun rituximab T785-ISAClar to'rtta tabiiy izotipning har birida solishtirma DARlar bilan tuzilgan. Aglikosillangan va fukozillangan rituksimab ISAClar ham tekshirildi, chunki glikozillanish Fc R bilan bog‘lanishni yo‘qotadi, fukozillanish esa FCGR3A 37 ga bog‘lanish yaqinligini oshiradi. Rituximab T785-ISACning immunostimulyatsiya qobiliyati Fc R bilan bog‘lanish qobiliyatini oshiradi. 3B). Aksincha, fukozillangan IgG1 (IgG1-AF), yovvoyi IgG1 va IgG3 T785-ISACs miyeloid faollashuviga olib keldi, IgG1-AF T785-ISAC eng yuqori koʻrsatkichni keltirib chiqardi. CD{15}} darajasini oshirish (3B-rasm). Yovvoyi tipdagi rituksimab T785-ISACning PNGase F bilan deglikozillanishi, Fc-Fc R bilan bog‘lanish afinitesini kamaytiradigan in vitro ISAC immun stimulyator faolligining pasayishiga olib keldi, bu funksional faol Fc hududining ahamiyatini qo‘llab-quvvatladi (3C-rasm).

ISACs miyeloid faollashuviga vositachilik qilish uchun TLR agonizmini talab qiladi. TLR faolligining ISAC funktsiyasiga qo'shgan hissasi T785 dan aminopiridinni 2- olib tashlash orqali TLR agonizmi ablatsiyasidan so'ng tekshirildi, bu bog'lanishda kritik aspartat qoldiqlari bilan tuz ko'prigi hosil qiladi. TLR7 va TLR8 38 cho'ntaklari (TLRnull, 3D-rasm). TLRnull birikmasi rituksimab (TLRnull ISAC) bilan konjugatsiya qilindi va in vitro CD20 plus o'simta hujayralari ishtirokida miyeloid faollashuv potentsialiga baholandi. TLRnull ISAC CD86 kostimulyatsion molekulalarning yuqori regulyatsiyasini keltirib chiqarmadi yoki CD14 yoki CD123 ifodasini modulyatsiya qilmadi, bu T785-ISAClar bilan kuzatilgan faollashuv fenotipi uchun TLR agonizmi zarurligini ko'rsatadi (3E-rasm). Bundan tashqari, TLRnull ISAC monotsitlarda IRF{11}} fosforlanishiga olib kelmadi, bu uning TLR7/8 ni qo'llash qobiliyatiga mos kelmadi (7E-rasm). Insonning ksenograft o'simta modellarida B, T yoki NK hujayralarining faolligi B, T va NK hujayralari faolligi yo'q bo'lganda, ISAClarning miyeloid va neytrofil vositachiligida qattiq o'smalarning yo'q qilinishini qo'zg'atish qobiliyati inson ksenograft modellari yordamida baholandi 39,40. Klinik jihatdan tasdiqlangan HER maqsadli antikori2-Trastuzumab trastuzumab T785-ISAC HER2 plus qattiq oʻsmalar modellarida trastuzumabga oʻsimta chidamliligini yengib oʻta oladimi yoki yoʻqligini aniqlash uchun tadqiqot uchun tanlangan (4-rasm va 9-rasm). ) 41,42. Birinchidan, trastuzumab T785-ISACning tizimli qo‘llanilishi trastuzumab va T785 aralashmasini o‘simta ichiga yuborish bilan solishtirildi. Trastuzumab T785-ISAC o'simta regressiyasi va klirensini qo'zg'atdi, shu bilan birga komponentlarning ekvimolyar aralashmasini yuborish faqat trastuzumab bilan solishtirganda minimal terapevtik foyda keltirdi (4A-rasm). O'simtaga mo'ljallangan ISAClarni tegishli izotip nazorati bilan solishtirgan keyingi tadqiqotlar o'smaga qarshi faollik o'simtani nishonga olishni talab qilishini tasdiqladi (4B-rasm va 10-rasm). Muhimi, trastuzumab T785- ISACni tizimli qo‘llash va uning izotipini nazorat qilish yaxshi muhosaba qilingan va tana vazniga minimal ta’sir ko‘rsatgan (Qo‘shimcha 11-rasm).In vivo ISAC samaradorligiga hissa qo'shadigan ta'sir mexanizmi in vitro tasvirlanganga o'xshash yoki o'xshashligini aniqlash uchun Fc-qobiliyatsiz (trastuzumab N297A-ISAC) va trastuzumab TLRnull-ISACs bir xil ko'krak shishi ksenograft modelida sinovdan o'tkazildi.yovvoyi turdagi trastuzumab T785-ISAC bilan parallel.Trastuzumab T785-ISAC o'simta regressiyasi va klirensiga olib kelgan bo'lsa-da, Fc-qobiliyatsiz va TLRnull ISAC ham o'simtaga qarshi faollikni keltirib chiqara olmadi (4C-rasm).Bu ma'lumotlar birgalikda ISAC o'simtaga qarshi faolligi uchun o'simtani nishonga olish va Fc R va TLR bilan bog'lanish talabini ko'rsatadi.

Neytrofillarning boshqa miyeloid hujayralarga nisbatan o'simtaga qarshi ta'sirida vositachilik qilishdagi differensial hissasi hujayralarga xos bo'lgan yo'qotishlar bilan baholandi.Neytrofillar Ly6G antikoridan foydalangan holda, neytrofillar va etuk bo'lmagan APC (monotsitlar) kamaygan.anti-Gr1 antikori bilan erishildi.Fagotsitik hujayralar klodronat yuklangan lipozomalar yordamida yo'q qilindi.Biz fagotsitar hujayralar, ehtimol makrofaglar, ISAC davolashdan so'ng o'simtaga qarshi faollikni oshirishga sezilarli hissa qo'shganini aniqladik (4D-rasm).Biroq, anti-Ly6G bilan neytrofillarning kamayishi ISAC samaradorligiga ta'sir qilmadi.Gr1ning kamayishi ISAC vositachiligida samaradorlikka darhol ta'sir ko'rsatmadi, ammo o'smani nazorat qilish muddatini qisqartirdi (4D-rasm).T785-ISAClarning pastroq modellarda o'simta o'sishini nazorat qilish qobiliyatini tekshirishHER2 ifodasi, biz trastuzumabga chidamli, HER2-o'rta o'simtani ifodalovchi JIMT-1 modelida samaradorlikni modellashtirdik.JIMT-1 saraton hujayralari qatori HER2 sirtining taxminan 6,5 x105 nusxasiga ega ekanligi taxmin qilinmoqda va uning kamaygan darajasini ifodalaydi.HER2 oqim sitometriyasi bo'yicha HCC1954 o'simta hujayralari liniyasiga nisbatan 43.esatrastuzumab T785-ISAC ISAC izotipi yoki trastuzumab nazorati bilan solishtirganda o‘simta o‘sishini sezilarli darajada sekinlashtirdi, o‘sma regressiyasi yoki klirensi kuzatilmadi (4E-rasm).Biz faraz qildikki, trastuzumabning bog'lanish joyidan farqli bo'lgan HER2 epitopini bog'laydigan pertuzumab Fc-klasterlashuvini oshiradi va keyinchalik JIMT-1 modelida ADCP va ISAC samaradorligini oshiradi.Trastuzumab T785-ISAC va pertuzumabning kombinatsiyasi samaradorlikni sezilarli darajada oshirishga va o'smaning sezilarli regressiyasiga olib keldi (4F-rasm).Trastuzumab T785-ISAC immun stimulyatsiyasisiz pertuzumabning trastuzumab bilan kombinatsiyasi hech qanday foyda keltirmadi.

Keyinchalik biz trastuzumab T785-ISAC tomonidan qo'zg'atilgan molekulyar va hujayrali hodisalarni o'rganib chiqdik va natijada o'simtaga qarshi samaradorlikka erishdik.O'smalarda erta gen ifodasi o'zgaradiNanoString sichqonchasi pan-saratonga qarshi immunitetni aniqlash paneli bilan o'lchandi, bu davolashdan keyingi 24 soat ichida genlarning 13,7 foizida sezilarli darajada o'sishini aniqladi, shu jumladan TLR7 signalizatsiyasi va faollashuvi bilan bog'liq genlar (IRF-7, NF-kB bilan bog'liq genlar)trastuzumab yoki izotip T785-ISAC bilan davolashdan keyingi 0-0,1 foizga nisbatan (4G-rasm) 44.nSolver Advanced Analysis Pathway Score tomonidan baholangan gen ekspresyon yo'llarining tahlili immun bilan bog'liq asosiy gen imzolarining (Makrofag funktsiyalari, DC funktsiyalari, Antigenni qayta ishlash va taqdim etish) sezilarli darajada ko'tarilishini aniqladi.Fc-Fc R o'zaro ta'siri ISAC vositachiligidagi faollik uchun juda muhim ekanligi in vitro va in vivo topilmalariga mos keladi (4H-rasm va qo'shimcha 12-rasm).Trastuzumab T785-ISAC bilan davolashdan so‘ng kimokinlar va sitokinlar bilan bog‘liq bo‘lgan gen imzosi ko‘rsatkichlari juda yuqori bo‘ldi, bu qabul qilinganidan keyin 24 soat ichida o‘simtada sitokin va kimyokin sekretsiyasini o‘lchagan holda amalga oshirilgan oqsil miqdorini aniqlashga mos keladi (4H-rasm).va qo'shimcha 13-rasm).Ushbu topilmalar in vitro va in vivo samaradorlik ma'lumotlariga muvofiq, ISAC tomonidan kuchli TLR va Fc R vositachiligidagi javobni ko'rsatadi.

Oqim sitometriyasi va IHC T785-ISAC vositachiligidagi faollashuv va kimyokin ekspressiyasining kuchayishi oxir-oqibat immun effektor hujayralarini jalb qilishga olib kelganligini baholash uchun ishlatilgan.Miyeloid immun infiltratlar trastuzumab T785-ISAC yoki trastuzumabning bir dozasi qabul qilinganidan keyin 24 soat va 7 kun ichida oqim sitometriyasi yordamida profillangan va davolanmagan nazorat guruhlari bilan solishtirilgan.Davolanishdan 24 soat o'tgach o'smalarni tahlil qilish aniqlanditrastuzumab yoki trastuzumab T785-ISAC bilan davolash qilingan o‘smalarda CD11b plyus Ly6C plyus monotsitlar va CD11b plyus Ly6G plyus granulotsitlarning infiltratsiyasi davolanmagan nazorat guruhlariga nisbatan (4I-rasm).Davolanishdan 7 kun o'tgach, CD11b plyus CD11c va F4/80 va musbat miyeloid APClar trastuzumab T785-ISAC bilan davolash qilingan guruhdagilarga nisbatan sezilarli darajada oshdi.trastuzumab yoki davolanmagan nazorat vositalari (4I-rasm) 45,46.Miyeloid APClarning bu o'sishi bo'lishi mumkintrastuzumab T785-ISAC bilan davolashdan keyin miyeloid bilan bog'liq kimyokinlar ishlab chiqarishning sezilarli o'sishi bilan bog'liq.24-soat vaqtida miyeloid APC chastotasida sezilarli o'sish kuzatilmagan bo'lsa-da, bu fenotipdagi hujayralar trastuzumab T785-ISAC bilan davolashdan so'ng faollashdi, bu hujayra yuzasida CD40 ning ko'tarilishi bilan o'lchandi. , trastuzumab yoki davolanmagan nazoratdan olingan bir xil populyatsiya bilan solishtirganda (4I-rasm).Ushbu topilma, NanoString ma'lumotlari bilan birga, trastuzumab T785-ISACning o'simta mikromuhitidagi miyeloid hujayralarni jalb qilish va faollashtirish qobiliyatini yanada ko'rsatadi.Davolanishdan bir hafta o'tgach kuzatilgan miyeloid APClarning CD11b pozitivligini hisobga olgan holda, monotsitlarning erta infiltrati ISAC bilan davolash qilingan o'smalarda etuk bo'lgan miyeloid APC populyatsiyasining prekursorlari bo'lishi mumkin, ammo trastuzumab bilan davolash qilingan o'smalarda emas.Biroq, NanoString va MSD tomonidan ISAC stimulyatsiyasidan 24 soat o'tgach o'lchangan yallig'lanishga qarshi proksimal hodisalar, oxir-oqibatda, kunning keyingi 6-o'zgaruvchan o'simta mikro muhitida miyeloid hujayralarining etukligi kabi distal hodisalarga qanday ta'sir qilganini aniqlash kerak. , va oxir-oqibat, o'smaning regressiyasi va tozalanishiga ta'sir ko'rsatdi.
Nihoyat, IHC trastuzumab T785-ISAC bilan davolashdan so'ng o'simtadagi asosiy immun hujayra populyatsiyalarining mavjudligi va joylashishini uning nazorati bilan solishtirganda baholash uchun o'tkazildi.7-kundagi oqim sitometriyasiga mos keladi, F4/80 hujayralarni ifodalaydio'simta va peritumoral mintaqa trastuzumab T785-ISAC bilan bitta davolashdan so'ng 9-kuni ko'tarildi (4J-rasm).Bundan tashqari, maqsadli ISAC davolash peritumoral hududdagi CD11c plyus hujayralarining keskin o'sishiga olib keldi, bu rHER2 antikorlari bilan davolash yoki izotip yoki izotip-ISAC bilan davolashdan keyin kuzatilmadi (4J-rasm).CD11c plyus hujayralardagi oqim sitometriyasi va IHC tomonidan ko'tarilganligi NanoString ma'lumotlarida ham isbotlangan, unda ITGAX ning mRNK ifodasi trastuzumab T785-ISAC qo'llanganidan keyin 6 va 9-kunlarda sezilarli darajada oshgan (Qo'shimcha rasm 14).

5-rasm: T785-ISAClar MMC singenik o'simta modelida kuchli o'smaga qarshi ta'sirlarni keltirib chiqaradi. (ah) FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) sichqonlari MMC o'simta hujayralari liniyasi bilan implantatsiya qilingan. (a) O'simta hajmi taxminan 500 mm3 ga etganida, urg'ochi sichqonlar randomizatsiyalangan. Keyin sichqonlarga 5 mg/kg q5d x 2 sichqonchaga qarshi kalamush HER2 antikori, sichqonchaga qarshi kalamush HER2 T785-ISAC yoki T785-ISAC (TA99) izotipi bilan qorin bo‘shlig‘iga yuborish orqali davolash qilindi (n) =4-7 sichqon boshiga). (b, c) Erkak sichqonlar o'simta hajmi taxminan 500 mm3 ga yetganda randomizatsiyalangan va dastlabki davolash sanasidan bir kun oldin fagotsitlar kamayishi uchun klodronat yuklangan yoki nazorat qiluvchi lipozomalar bilan oldindan davolash qilingan (6 tsikl, 15-kungacha) yoki antibakterial - CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >Oxirgi davolanishdan 60 kun o'tgach, MMC o'simta hujayralari chizig'i bilan e'tiroz bildirildi. O'simtasi bo'lmagan sichqonlar implantatsiya nazorati sifatida xizmat qildi (har bir guruh uchun n=5 ta sichqon). (ad) Ma'lumotlar kamida 2 ta tajribani ifodalaydi. Sichqonlar o'smalari paydo bo'lgandan keyin insoniy ravishda evtanizatsiya qilindi2,000 mm3 ga yetdi. Ma'lumotlar shish paydo bo'lmagan guruhlar uchun ko'rsatilgan2,000 mm3. (ei) MMC o'smalari o'simtalari hajmi taxminan 500 mm3 ga yetganda va 5 mg/kg ISAC yoki 0 va 5-kunlarda dozalangan nazorat antikorlari bilan davolash qilinganida sichqonlar kogortalari randomizatsiyalangan. Shishlar MSD orqali sitokin o'lchash uchun qayta ishlandi. , oqim sitometriyasi tahlili, NanoString mRNK miqdorini aniqlash yoki formalin bilan biriktirilgan va kerosin bilan o'rnatilganko'rsatilgan vaqtlarda immunohistokimyo. (e) Vulkan syujetlarida 24 soat ichida NanoString tomonidan o'lchangan (har bir guruh uchun n=5 ta sichqon) davolash qilingan va boshqariladigan izotip o'smalarida gen ekspressiyasining log2 marta o'zgarishi tasvirlangan. < 0.05="" p-qiymati="" sozlangan="" oʻzgarishlar="" qizil="" rangda="" koʻrsatilgan.="" (f)="" davolanishdan="" 24="" soat="" o'tgach="" tahlil="" qilingan="" o'smalar="" uchun="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" tomonidan="" aniqlangan="" gen="" imzo="" ballari="" (har="" bir="" guruhda="" n="5" ta="" sichqon).="" (g,="" h)="" davolanish="" boshlanganidan="" keyin="" 24="" soat="" va="" 6="" kun="" o'tgan="" o'sma="" hujayra="" tarkibi="" va="" faollashuv="" holatini="" oqim="" sitometriyasi="" tahlili="" (har="" bir="" guruhda="" n="4" sichqon).="" ma'lumotlar="" kamida="" 2="" ta="" tajribani="" ifodalaydi.="">Vakil tasvirlar, shuningdek, F4/80, CD11c va CD8 IHC o'smalarining miqdorini aniqlash har bir ko'rsatilgan davolashdan 6 kun o'tgach. O'lchov chiziqlari 50 mkm. (ai) Ma'lumotlar o'rtacha va SEM sifatida taqdim etiladi; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

O'simtaga mo'ljallangan T785-ISACs singenik MMC o'simta modelida o'simta regressiyasini keltirib chiqaradi.
ISAClarning B, T va NK hujayralari mavjudligida o'simtaga qarshi samaradorligini vositachilik qilish qobiliyatini baholash uchun biz o'z-o'zidan paydo bo'lgan sut bezidan olingan singenik kalamush HER2 (rHER2) - sichqon suti karsinomasi (MMC) hujayra liniyasidan foydalandik. FVB sichqonlarini ifodalovchi rHER2- karsinomasi.MMCda rHER2 ifodasi bilan bog'liq turdagi o'zaro bog'liq immunogenlikni kamaytirish uchun, nazorat ostida Her2 kalamushini endogen tarzda ifodalovchi transgenik sichqonlar.Xost sifatida MMTV promouteridan foydalanilgan (15-rasm) 47. To'liq immunitet tizimi mavjudligidan foydalanib, biz ISACning katta o'sma yuki 500 mm3 bo'lgan o'smalarga qarshi kurashish qobiliyatini baholashni maqsad qildik, chunki odatda kattaroq o'smalar klinikadan oldingi modellarda davolash qiyinroq 48. rHER2 T785-ISACni o'z ichiga olgan barcha muolajalarni tizimli qo'llash tana vazniga minimal ta'sir ko'rsatgan holda yaxshi muhosaba qilingan (Qo'shimcha rasm 16A). Biroq, faqat rHER2 T785-ISAC sichqonchani katta o'smalar bilan davolashga muvaffaq bo'ldi (5A-rasm). Ksenograft modelida ko'rinib turganidek, hujayralarni yo'qotish bo'yicha tadqiqotlar fagotsitar hujayralar klodronat yuklangan lipozomalar bilan tugashi bilan sezilarli darajada o'smaga qarshi faollik yo'qolganligini ko'rsatdi (5B-rasm). ISAC to'g'ridan-to'g'ri T hujayralariga ta'sir qilishi kutilmasa-da, CDni yo'qotuvchi antikor bilan oldindan davolangan sichqonlar rHER2 T785-ISAC ni ikki marta yuborishdan so'ng o'smalarni tozalash qobiliyatini yo'qotdi (5C-rasm). Bu shuni ko'rsatadiki, o'simtaga yo'naltirilgan ISAClar o'simta bilan bog'liq antigenlarni taqdim etgandan so'ng, bilvosita T hujayralari orqali harakat qilishlari mumkin. Immunologik xotira, sichqonlar mavjudligi bilan mos keladirHER2 T785-ISAC davolashdan so'ng MMC o'smalaridan davolanganlar o'smaning qayta tiklanishidan himoyalangan (5D-rasm).

Singenik modeldagi ISAC samaradorligini ta'minlovchi mexanizmni qo'shimcha tekshirish uchun biz ISAC dozasidan so'ng o'simta mikromuhitidagi hujayrali, transkripsiyaviy va sitokin o'zgarishlarini o'rganib chiqdik. Katta MMC o'smalari bo'lgan sichqonlarning ikkita kogortasi rHER2 T785-ISAC yoki nazorat bilan davolandi. Birinchi kogortadagi o'smalar dozalashdan 24 soat o'tgach (1-kun) barcha o'smalar bir xil o'lchamda bo'lganda yig'ib olindi (Qo'shimcha rasm 16B). Boshqa kogortaga birinchi dozadan 5 kun o'tgach, ikkinchi doza berildi, so'ngra 24 soatdan keyin (6-kun) yig'ib olindi, bu vaqtda T785-ISAC bilan davolanganlardan tashqari barcha davolash guruhlaridagi o'smalar o'lchovli darajada o'sdi (qo'shimcha rasm 16B). ). O'smalar IHC, mRNK ifodasi va protein lizatlarida sitokin sekretsiyasi bilan tahlil qilindi. ISAC faolligi uchun o‘simtani nishonga olish zarurligi haqidagi ksenograft modellaridagi kuzatishlarimizni qo‘llab-quvvatlagan holda, rHER2 T785-ISAC davolashdan 24 soat o‘tgach, o‘simtalarning mRNK tahlili NanoString sichqonchasidagi pan-saratonga qarshi immunitetning 34,1 foizida keskin ko‘tarilganligini ko‘rsatdi. izotip bilan davolash qilingan o'smalarga nisbatan profillash paneli. Faqatgina anti-rHER2 antikori gen ekspressiyasiga ozgina ta'sir qilgan (tahlil qilingan genlarning 3,5 foizi), maqsadli bo'lmagan T{22}}ISAC izotipi esa gen ekspressiyasiga ta'sir qilmadi (5E-rasm). HCC1954 ksenograft modelida ko'rinib turganidek, TLR vositachiligidagi signalizatsiya va faollashuv bilan bog'liq genlar o'simtaga mo'ljallangan rHER2 T785-ISAC tomonidan sezilarli darajada yuqori tartibga solindi, bu TLR vositachiligidagi mustahkam javobdan dalolat beradi (5E-rasm). Gen ekspresyon yo'li tahlili yana immun bilan bog'liq bo'lgan asosiy gen imzolarining sezilarli darajada ko'tarilganligini, shu jumladan gen ekspresyon yo'li tahlili uchun imzolarni aniqladi, rHER2 T785-ISAC davolashdan so'ng immun bilan bog'liq asosiy gen imzolarining sezilarli darajada ko'tarilishi, shu jumladan kimyokinlar bilan bog'liq bo'lganlarni aniqladi. va sitokinlar (5F-rasm). Protein miqdori NanoString tomonidan tahlil qilingan bir xil o'smalarda o'tkazildi va gen imzosi topilmalariga muvofiq, rHER2 T785-ISAC davolashdan keyin 24 soat ichida yallig'lanishga qarshi sitokinlar va kimyokinlarning sezilarli darajada ortishi o'lchandi (qo'shimcha rasm 17). ). Antigenni qayta ishlash va taqdim etish, dendritik hujayra funktsiyasi va makrofag funktsiyasi uchun gen imzosi ballari ham sezilarli darajada oshdi, bu esa rHER2 T785-ISACdan 24 soat keyin anFc-Fc R vositachiligi va fagotsitozga asoslangan javobni qo'llab-quvvatladi.davolash (5F-rasm va 18-rasm). Kuchli TLR va Fc R-vositachilik javobi bilan bog'liq bo'lgan sezilarli darajada yuqori bo'lgan gen imzosi ballari bilan bir qatorda, T hujayra funktsiyalari uchun gen imzo balli ham rHER2 T785-ISAC bilan davolashdan so'ng 24 soat ichida sezilarli darajada oshdi, bu esa qo'shimcha ta'sirni qo'llab-quvvatladi. ISAC vositachiligida samaradorlik uchun T hujayralari zarurligini aniqlash (5F-rasm va qo'shimcha 18-rasm).

Yallig'lanishga qarshi sitokin va kimyokin ishlab chiqarishning erta ko'payishiga hissa qo'shishi mumkin bo'lgan immunitet hujayralarini tavsiflash uchun o'smalar rHER2 T785-ISAC ning birinchi dozasidan yoki nazoratdan 24 soat o'tgach va davolash boshlanganidan keyin 6 kundan keyin oqim sitometriyasi bilan tahlil qilindi. davolash, ikkinchi dozadan keyin 24 soat o'tgach. 1-kuni o'smalarni tahlil qilish rHER2 T785-ISAC bilan davolash qilingan o'smalarda CD11b plyus Ly6C va monotsitlarning infiltratsiyasini va rHER2 mAb yoki rHER2 T785-ISAC bilan davolash qilingan o'smalarda CD11b plyus Ly6G va granulotsitlarning infiltratsiyasini aniqladi. , lekin ISAC izotipi yoki izotip antikor nazorati emas (5G-rasm). 6 kundan keyin rHER2 T785-ISAC bilan davolash qilingan o'smalarda monotsitlar darajasi yanada oshdi. HCC1954 ksenograft modelida kuzatganimiz kabi, miyeloid APClar (CD11b plyus CD11c plyus F4/80 plyus) rHER2 T785-ISAC bilan davolashdan keyingi 6-kuni boshqaruv elementlariga nisbatan sezilarli darajada oshgan (5G-rasm va 19-rasm). ). Bundan tashqari, miyeloid APClar rHER2 T785- ISAC bilan davolash qilingan guruhda har ikkala vaqtda ham faollashgani aniqlandi, bu hujayra yuzasida CD40 ning ko'tarilishi bilan o'lchanadi (5H-rasm). Muhimi shundaki, klodronat yuklangan lipozomalar yordamida fagotsitlar kamayganidan keyin o'sma miyeloid APClarning ko'payishi o'lchanmadi (Qo'shimcha rasm 20). Nihoyat, rHER2 T785-ISAC bilan davolashdan keyin MMC modelidagi asosiy immun hujayra populyatsiyalarining mavjudligi va joylashishini baholash uchun IHC oʻtkazildi. HCC1954 ksenograft modelida ko‘rinib turibdiki, rHER2 T785-ISAC bilan davolash peritumoral hududdagi CD11c plus va F4/80 plus hujayralarining keskin ko‘payishiga olib keldi, bu esa rHER2 antikorlari bilan davolash yoki izotip bilan davolashdan keyin kuzatilmadi. yoki T785-ISAC izotipi (5I-rasm). T-hujayra kimokinlarining erta ifodalanishi va T-hujayra funktsiyasi uchun gen imzosi ballining ortishi bilan mos ravishda, CD8 plyus hujayralarining sezilarli infiltratsiyasi IHC tomonidan rHER2 T785-ISAC bilan davolash qilingan sichqonlarning 6-kuni o'simtalarida kuzatildi, holbuki Anti-rHER2 antikori yoki izotip nazorati bilan davolash qilingan sichqonlarda CD8 bo'yalishi pastligicha qoldi (5I-rasm). CD8 plyus IHC bo'yalishining kuchayishi, T hujayralari funktsiyasi bilan bog'liq genlarning kuchaytirilgan gen ekspressiyasi va CD8-bog'liq o'simta klirensi T785-ISACning sovuq o'simtani qizdirish potentsialini qo'llab-quvvatlaydi.CL{ {58}}ISAClar HER2-oʻrta ifodalovchi ksenograft oʻsimta modelida oʻsimta regressiyasini keltirib chiqaradi ISAClar immun stimulyatori koʻp yuklamalar boʻyicha mustahkam platforma ekanligini koʻrsatish uchun DAR bilan mashhur TLR7 agonisti CL264 yordamida ISAC ishlab chiqdik. trastuzumab T785-ISAC bilan solishtirish mumkin (6A-rasm va 21-rasm). CL264 yoki T785 bilan ishlab chiqarilgan trastuzumab ISAClarining intra-tumoral miyeloid faollashuviga vositachilik qilish qobiliyati HCC1954 ksenograft modelida trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC yoki trastuzumab TISAC785-bir marta yuborilganidan keyin 24 soat o'tgach baholandi. . Trastuzumab CL264-ISAC bilan miyeloid faollashuvining kuchayishi kuzatildi, buning isboti, trastuzumab yoki trastuzumab T785-ISAC bilan solishtirganda oʻsimtaga infiltratsiya qiluvchi CD11b va CD11c va F4/80 va miyeloid APClarda CD40 ifodasining ortishi (6B-rasm) ).CL264-ISAC ning miyeloid faollashuv qobiliyatining kuchayishi in vivo jonli ravishda o'simtaga qarshi faollikni oshirish yoki yo'qligini aniqlash uchun trastuzumab CL264-ISAC bilan solishtirildi.T785-ISAC HER2High HCC1954 va HER2Med JIMT-1 o‘simta modellarida. Ikkalasi esatrastuzumab ISACs HCC1954 HER2High modelida o'simtaning to'liq regressiyasiga vositachilik qildi, CL{2}}ISAC JIMT-1 HER2Med modelida o'smaga qarshi faollikni oshirdi, bu ISAC quvvati va antigen zichligi pastroq bo'lgan o'smalarni nishonga olish qobiliyatini ko'rsatishi mumkin. bog'langan bo'lishi kerak (6C-D-rasm).

Ikkala ISAC ham yaxshi muhosaba qilingan, biroq biz trastuzumab CL264-ISAC yoki rituximab CL264-ISAC bilan davolangan hayvonlarda tana vaznining vaqtinchalik 5-10 foizga kamayishini kuzatdik, bunda tana vazni tiklangan. yoki uchinchi dozada boshlang'ich darajadan yuqori (Qo'shimcha rasm 16A). Tizimli sitokin sekretsiyasi T785-ISAC yoki CL264-ISAC bilan davolashdan keyin oʻlchandi. TNF ning past darajalari T785-ISAC kiritilgandan keyin to'rt soat o'tgach hayvonlar zardobida o'lchandi, shu bilan birga maqsadli va CL{8}} izotiplari tizimli ravishda TNF sekretsiyasining yuqori darajasini keltirib chiqardi (11-rasm). . T785 va CL264 ISAC o'rtasidagi bu ta'sirlar ISAC ning o'simta hujayralari o'sishiga bevosita ta'siri bilan bog'liq bo'lishi ehtimoldan yiroq emas, chunki ISAC in vitro saraton hujayralari ko'payishini inhibe qilmadi (Qo'shimcha rasm 9).

CL264-ISACs singenik o'simta modellarida o'simta klirensi va immunologik xotirani keltirib chiqaradi. Turli xil HER2 antigen zichligi bo'lgan odam o'simtasi ksenograft modellarida CL264-ISAC bilan kuzatilgan kuch va samaradorlikning ortishi hisobga olinib, biz keyingi navbatda CL faolligini tavsifladik. 264-Singenik oʻsma modellarida ISAC. MMC modelidagi T785-ISACga oʻxshab, CL{5}}ISAC oʻsimta regressiyasi va T-hujayraga bogʻliq holda tozalanishiga olib keldi, bu esa mustahkam immunologik xotiraga olib keldi (Qoʻshimcha rasm 22A). Antigen ifodasi kamaygan singenik o'sma modelida ISAC samaradorligini baholash uchun biz kalamush HER2 (CT{10}}rHER2) ni barqaror ifodalovchi CT26 hujayra liniyasini ishlab chiqdik. Muhimi, CT26 hujayralarining taxminan 8,5 foizi o'simta implantatsiyasidan keyin rHER2 ni ifoda etmaydi (6E-rasm). rHER2 CL264-ISAC bilan davolash qilingan Wildtype Balb/c sichqonlari o‘simtaga qarshi sezilarli immunitetni ko‘rsatdi, chunki sichqonlarning 75 foizi (8 tadan 6 tasi) o‘smalarini tozalab, tajriba davomida o‘simtasiz qolishdi. anti-rHER2 antikori bilan davolangan sichqonlarning hech biri to'liq regressiyaga ega emas edi (6F-rasm). rHER2 CL264-ISAC davolashdan so‘ng tana vaznining taxminan 10 foizga vaqtinchalik vazn yo‘qotishi kuzatildi, tadqiqot boshlanganidan keyin sakkiz kun ichida tana vazni tiklandi (Qo‘shimcha rasm 22B). Biz rHER2 CL264-ISAC maqsadli antigen, rHER2 ekspressiyasi bo‘lmagan o‘simtaga qarshi immunologik xotira vositachiligini, ilgari rHER2 bo‘lmagan CT26-rHER2 o‘simtalarini ota-ona CT26 hujayra chizig‘i bilan davolagan sichqonlarni sinovdan o‘tkazish orqali baholadik. ifoda. Ilgari CT{39}}rHER2 o'smalaridan rHER2 ISAC bilan davolangan sichqonlar ota-ona CT26 hujayra chizig'i bilan bog'lanishdan to'liq himoyalangan (6I-rasm). O'simtani qayta tiklashdan oldin CD4 va CD8 T hujayralarining kamayishi himoya qilish uchun T hujayralari kerakligini ko'rsatdi. Nihoyat, biz ilgari ISAC bilan davolangan sichqonlarda ishlab chiqilgan immunologik xotira davolangan asosiy o'simtaning o'simta bilan bog'liq antijenlariga xosligini tekshirdik. Ota-ona CT26 o'simtasini qayta tiklash paytida sichqonlar bir vaqtning o'zida boshqa o'simta, 4T1, qarama-qarshi qanotga implantatsiya qilingan. Ma'lumotlar immunologik xotira rivojlanishi ekanligini ko'rsatadirHER2 dan farq qiluvchi CT26 o'simta bilan bog'liq antigenlarga xos, chunki 4T1 o'simtalarining o'sishi ta'sir qilmagan (6G-rasm).