Zebrafish buyragida ro'za tutish va ovqatlanishga tug'ma immunitetning javobi

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zongzhen Liao, Dihang Lin, Jirong Jia, Ran Cai, Yang Yu va Vensheng Li *

Bionazorat davlat kalit laboratoriyasi, Guangdong viloyati suv xo'jaligi hayvonlari uchun asosiy laboratoriyasi, Guangdong viloyati muhim iqtisodiy baliqlarni sog'lom ko'paytirish bo'yicha muhandislik texnologiyalari tadqiqot markazi, Sun Yat-Sen universiteti Hayot fanlari maktabi, Guanchjou 510275, Xitoy;

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL); lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL); jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ); Alan6382@163.com (RC); yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (YY)

* Muloqot: lsslws@mail.sysu.edu.cn

Cistanche buyraklar faoliyati uchun juda yaxshi

Abstrakt: Hayvonlar o'sish va organizm salomatligi o'rtasidagi muvozanatga erishish uchun oziqlantirish orqali ozuqa moddalari va energiya oladi. Oziq moddalarni olishda o'zgarish bo'lsa, o'sish holati o'zgaradi va ichki immunitet tizimida ham o'zgarishlarga olib kelishi mumkin. Kompensatsion o'sish (CG), o'ziga xos o'sish hodisasi, o'sishdagi o'zgarishlar tug'ma immunitetning o'zgarishi bilan birga bo'lishi mumkinmi degan savolni o'z ichiga oladi. Mashhur baliq modeli organizm bo'lgan zebrafish (Danio rerio) mos model bo'lib xizmat qilishi mumkin. Ushbu tadqiqotda zebrafish 3 hafta davomida 3 dan 7 kungacha ro'za tutish va qayta ovqatlanishdan o'tdi. Zebrafishlarda CG ga erishish mumkinligi aniqlandi. Zebrafishlarning Streptococcus agalactiae ga sezuvchanligi ochlikdan keyin oshdi. Bundan tashqari, ro'za tutishdan keyin melanomakrofag markazlarining soni ko'paydi va 3 va 5 kun davomida qayta ovqatlanishdan keyin shikastlangan kanalchalar ulushi ortdi. Bundan tashqari,buyraklarOchlikdan aziyat chekkan zebrafishlar oksidlovchi stress ostida bo'lgan va ochlikdan keyin bir qancha antioksidant fermentlarning, jumladan katalaza, glutation peroksidaza va superoksid dismutaza faolligi oshgan. Tug'ma immunitet parametrlariga ochlik ta'sir ko'rsatdi. Bundan tashqari, ochlikdan keyin ishqoriy fosfataza va lizozimning faolligi oshdi. Il-1 kabi immun bilan bog'liq genlarning mRNK ifodasi lipopolisakkaridlar (LPS) bilan yoki bo'lmagan holda ro'za tutishdan keyin boshqa darajada oshdi. Ushbu tadqiqot zebrafishdagi tug'ma immunitet tizimining funktsiyasi ovqatlanish holatiga ta'sir qilishi mumkinligini ko'rsatdi.

Kalit so'zlar: tug'ma immunitet tizimi; buyrak; oksidlovchi stress; kompensatsion o'sish; zebrafish

1.Kirish

Asosiy hayot faoliyati organizmning energiya ta'minotiga bog'liq. Hayvon tanasining ozuqaviy holati immunitet tizimining ishlashiga ta'sir qilishi mumkin [1,2]. Kompensatsion o'sish (CG) - oziq-ovqat etishmovchiligi va boshqa atrof-muhit omillari tufayli o'sishni bostirish bosqichidan keyin tez o'sish davri [3,4]. Bu hodisa birinchi marta sutemizuvchilarda qayd etilgan va oxir-oqibat qushlarda [3] va teleostlarda [5] topilgan. CG ikki fazaga bo'linadi: katabolik faza va giperanabolik faza [6]. CG ning asosiy namunalaridan biri ro'za tutish va ovqatlanishdir. Qayta oziqlantirishdan keyin baliq qisman, to'liq yoki ortiqcha kompensatsiyani boshdan kechirishi mumkin [4]. CG ning maxsus oziqlantirish rejimi dehqonchilik turlarida ishlab chiqarish samaradorligini oshirishning potentsial usuli sifatida qaraladi [7].

Tug'ma immunitet reaktsiyasi organizmlarni patogenlardan himoya qiluvchi xost himoyasining birinchi chegarasi hisoblanadi. Baliqlarda immunitet tizimining organlari timus,boshbuyrak, kaudal buyrak, gillalar, jigar,va ichak [8,9]. Hujayra turlarining keng doirasi baliqning o'ziga xos bo'lmagan hujayrali mudofaa reaktsiyalarida ishtirok etadi, shu jumladan monotsitlar/makrofaglar, o'ziga xos bo'lmagan sitotoksik hujayralar va granulotsitlar (neytrofillar). Immunometabolizm - bu immunologik va metabolik jarayonlar o'rtasidagi o'zaro bog'liqlikdir [10]. Baliqlarning metabolik holati ularning immun funktsiyasiga ta'sir qilishi mumkin. Odamlarda oziqlanish holati immunitet hujayralari soniga va ularning faoliyatiga ta'sir qiladi [11]. Sichqonlarning immun tizimining funktsiyasi ularning metabolik holatiga ta'sir qilishi mumkinligi aniqlandi [12-14]. Cho'chqa sazanida (Carassius auratus) intervalgacha ro'za tutish ichakdagi bakterial jamoalarni o'zgartirdi va superoksid dismutaza (SOD) va lizozim faolligini oshirdi [15]. Ochlik, shuningdek, qizil ikra [16] jigarida tug'ma immunitet reaktsiyalarining gen ifodasini o'zgartiradi. Bundan tashqari, metabolik holatning immunitet tizimiga ta'siri bo'yicha tadqiqotlarni boshqa teleostlarda topish mumkin [17-19]. Biroq, teleostlarda metabolik holatning immunitet tizimiga ta'siri hali ham yaxshi tushunilmagan. Oksidlanish stressi tug'ma immun tizimining funksionalligini cheklashi va pullik retseptorlar kabi komponentlarni qo'zg'atishi mumkin [20,21]. Shu bilan birga, ochlik ROS ishlab chiqarishni ko'paytirishi va autofagiyaga olib kelishi mumkin [22,23]. Oksidlanish stressi ochlik va immunitet o'rtasidagi munosabatlarga vositachilik qiladimi yoki yo'qligini o'rganishga arziydi.

Zebrafish (Danio rerio) hududi immunitet va kasalliklarni o'rganishda keng qo'llaniladigan model. Zebrafishlarning tug'ma immun tizimi embriogenezning 1-kunida rivojlana boshlaydi va adaptiv immun tizimi urug'lantirilgandan keyin 4-6 haftagacha yo'q. Bu zebrafishni tug'ma immunitet tizimini o'rganish uchun ajoyib modelga aylantiradi [9]. Buyrak zebrafishlarning asosiy limfoid organidir [24]. Havcr1 geni deb ataladigan transmembran quvurli oqsilni kodlaydibuyrak shikastlanishi molekulasi-1 (KIM-1) [25]. KIM-1 buyrakdagi to‘qimalarning shikastlanishining ko‘rsatkichidir va KIM-1 ning haddan tashqari ko‘payishi zebra baliqlarida buyrak shikastlanishiga olib keladi [26]. Ro'za zebrafishdagi metabolik holatni o'zgartirishi mumkinligi aniqlandi [27]. Ro'za kislorod iste'moli va jigar lipidlari va glikogen tarkibining pasayishiga olib keldi. Shuningdek, jigarda 8-oksidlanish va glyukoneogenez faolligini oshirdi. Shu bilan birga, reaktiv kislorod turlari (ROS) zebrafishlarda CGda ishtirok etdi [28]. Jigarda ishlab chiqarilgan ROS zebrafishlarda CG uchun zarur edi, chunki ular AMPK yo'lini qo'zg'atgan. Ushbu tadqiqotda biz zebrafishdagi CG naqshini o'rganish uchun ro'za tutish va ovqatlantirish strategiyasini qabul qildik. Streptococcus agalactiae zebrafishlarda og'ir sepsis va meningitni keltirib chiqardi va 30 dan ortiq baliq turlarini yuqtirishi mumkin edi [29]. Biz immunitet bilan bog'liq parametrlar va gen ekspressiyasidagi o'zgarishlar bilan birgalikda CG ning tug'ma immunitet tizimiga ta'sirini o'rganish uchun Streptococcus agalactiae va lipopolisaxaridlarni (LPS) in'ektsiya uchun tanladik.

2. Materiallar va usullar

2.1. Zebrafish, oziqlantirish rejimlari va tana vazni

Tajribada foydalanilgan katta yoshli zebrafish Yuehe Fish-Bird- Flower bozoridan (Guanchjou, Xitoy) sotib olindi va ikki hafta davomida iqlimga moslashtirildi. Barcha baliq yetishtirish Xitoyning Guangdong viloyati, Sun Yat-sen universiteti qoshidagi baliq yetishtirish tajriba stansiyasida amalga oshirildi. Hayvonlar bo'yicha barcha tajribalar Sun Yat-Sen universiteti hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish qo'mitasining ko'rsatmalari va tasdiqlashiga muvofiq amalga oshirildi. Tajriba davrida pH 7,8 dan 7,9 gacha, erigan kislorod 6,95 dan 7,23 mg/l gacha, suv harorati esa 26,5 dan 28 oS gacha. Ammiak-N va nitrat azot kontsentratsiyasi mos ravishda 0,2 va 0.{{20}}05 mg/L dan past darajada saqlanib qoldi. Suvning sho'rligi 0,2 ppt edi. Zebrafish 12:{23}} soat yorug‘lik-qorong‘u tsiklda saqlangan. Ro'za tutish va ovqatlanish paytida tana vaznidagi o'zgarishlarni o'rganish uchun tana vazni haftada bir marta qayd etilgan. Tajribadagi zebrafishning dastlabki tana vazni 0,35 ± 0,06 g edi va ular taxminan 3 oylik edi. Zebrafishlar tasodifiy ravishda 24 litrli tanklarga ajratildi va har bir tankda 30 ta baliq bor edi. Ularga kuniga ikki marta to'yingan ovqatlanish bilan tijorat dietasi taklif qilindi. Har bir tajriba uchun oziqlantirish rejimlari 1-jadvalda ko'rsatilgan. Davolanishdan so'ng, zebra baliqlari haddan tashqari dozada MS-222 (Sigma, Burlington, MA, AQSh) bilan behushlik qilingan va qurbon qilingan. Keyin buyrak Eppendorf trubkasiga olib tashlandi va darhol suyuq azotga joylashtirildi. Namuna suyuq azotdan olingan va -80 oC da saqlangan.

2.2. Streptococcus agalactiae Challenge

Ro'za tutgan va ovqatlanayotgan zebrafishlar Streptococcus agalactiae bilan kurashdi. Streptococcus agalactiae shtammi Sun Yat-sen universitetining Hayot fanlari fakulteti professori Anxing Li tomonidan taqdim etilgan [30]. Har bir guruhdagi zebrafishlar har bir kichik guruhda 15 ta baliqdan iborat bo'lgan to'rtta kichik guruhga bo'lingan. Ushbu guruhlarning uchtasidagi zebrafish 80 mg/L MS-222 bilan behushlik qilindi va qorin bo'shlig'iga 5 uL Streptococcus agalactiae koloniya hosil qiluvchi 5 × 106 birlik bilan AOK qilindi. Qolgan zebrafishlarga 5 uL PBS yuborilgan. Barcha zebrafishlar 4 kun davomida oziqlanmasdan kuzatilgan. O'lim darajasi qayd etilgan.

2.3. LPS in'ektsiyasi

Ro'za tutgan va qayta oziqlanadigan zebrafishlar (F24, S24 va F21R3) LPS (Sigma, Burlington, MA, AQSh) bilan sinovdan o'tkazildi. LPS kukuni steril suvda 1 mg/ml yakuniy konsentratsiyaga qadar eritildi. Ishlatishdan oldin 1 mg/ml LPS PBS bilan suyultirildi va yakuniy konsentratsiya 20 ug/ml ni tashkil etdi. Har bir guruhdagi zebrafish ikkita kichik guruhga bo'lingan va har bir kichik guruhda 12 ta baliq bor edi. Ikki guruhdagi baliqlarga LPS va PBS yuborildi. Zebrafish MS{8}} bilan behushlik qilindi va qorin bo'shlig'iga 5 uL 20 ug/ml LPS yoki PBS yuborildi. 3 soatdan keyin zebrafishlar behushlik qilindi va qurbon qilindi. Shundan so'ng, buyrak olib tashlandi va -80 oC da saqlanadi.

2.4. Gistopatologiya

Zebrafish 21 kun davomida ochlikdan keyin 14 kun davomida qayta oziqlantirish bilan boqilgan. Namunalar 21, 24, 28 va 35-kunlarda olindi. Qurbonlik qilingandan so'ng, zebra baliqlarining buyraklari olib tashlandi va 4 foizli formaldegidga botirildi. Keyin buyraklar parafin bilan kesiladi. Bo'limlar gematoksilin-eozin (HE) bilan bo'yalgan (Beyotime, Shanxay, Xitoy) va yorug'lik mikroskopi (Olimp, Tokio, Yaponiya) bilan kuzatilgan. Shikastlangan tubulalar va melano-makrofag markazlarining (MMC) o'zgarishini aniqlash uchun har bir slayddan 5 ta bir-biriga mos kelmaydigan rasm olingan. Shikastlangan kanalchalar joylari va butun namuna Cellsens dasturi (Olimpus, Tokio, Yaponiya) yordamida o'lchandi. Har bir rasmdan shikastlangan tubulalarning ulushi shikastlangan tubulalar maydonini butun namunaning maydoniga bo'lish orqali hisoblab chiqilgan. Har bir rasmda MMC miqdori hisoblangan, keyin butun namunaning maydoniga bo'lingan. Keyinchalik, standart sifatida F21 guruhi bilan MMClarning katlama o'zgarishlari hisoblab chiqilgan.

2.5. Tegishli biokimyoviy parametr tahlili

Buyrakdagi malondialdegid (MDA) va azot oksidi (NO) va SOD, gidroksidi fosfataza (ALP), katalaza (CAT), glutation peroksidazalar (GSH-Px) va lizozimning fermentativ faolligi tegishli tijorat to'plamlari bilan o'lchandi. ishlab chiqaruvchining protokollariga muvofiq. Qisqacha,buyraklarzebra baliqlaridan olib tashlangan suyuq azotga solingan va -80 oC da saqlanadi. Sinovdan oldin, har bir buyrak chiqariladi va to'qimalarni buzuvchi bilan oldindan sovuq PBSda gomogenatga aylantirildi.Buyrak gomogenati4 oC va 12, 000 × g 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi va supernatant sifatida qabul qilindi.buyrakaniqlash uchun ekstrakti. MDA tarkibi Lipid peroksidatsiyasi MDA tahlil to'plami (Beyotime, Shanxay, Xitoy) bilan aniqlandi va aniqlash MDA va tiobarbiturik kislota o'rtasidagi rang reaktsiyasiga asoslangan. Amaldagi to'lqin uzunligi 535 nm edi. NO tarkibi Griess reagent tizimi (Promega, Madison, WI, AQSh) tomonidan o'lchandi. Griess reaktiv tizimi kislotali sharoitda sulfanilamid va N-1-naftiletilendiamin dihidroxlorid bilan nitrit reaksiyasiga asoslangan. NO miqdori natriy nitrit standarti orqali hisoblab chiqilgan va oqsil tarkibiga normallashtirilgan. Absorbans 490 nm da filtr yordamida o'lchandi. Lizozimning faolligi ishlab chiqaruvchining protokoliga binoan Lizozim tahlil to'plami (Thermo Fisher, Waltham, MA, AQSh) bilan aniqlandi. Buyrak ekstrakti flüoresan bilan konjugatsiyalangan Micrococcus lysodeikticus hujayra devori bilan inkubatsiya qilindi. Floresans 37 oC da, 485 va 535 nm qo'zg'alish va emissiya to'lqin uzunliklarida 45 daqiqa inkubatsiyadan keyin o'lchandi. Lizozimning qiymati standart egri chiziq orqali hisoblab chiqilgan va oqsil tarkibiga normallashtirilgan. SOD, ALP, CAT va GSH-Px ning fermentativ faolligi SOD tipidagi tahlil to'plamlari, gidroksidi fosfataza tahlil to'plamlari, katalaza tahlil to'plamlari va glutation peroksidaza tahlil to'plamlari (Nankin Jiancheng, Nankin, Xitoy) bilan alohida aniqlandi. SOD faolligining birligi 1 ml tizimdagi nitro-ko'k tetrazoliyning 50 foizlik inhibisyoniga to'g'ri keladigan SOD miqdori sifatida aniqlandi. Amaldagi to'lqin uzunligi 570 nm edi. ALP faolligi birligi 37 oC da 30 daqiqada 1 mg fenol hosil qilish uchun substrat bilan reaksiyaga kirishgan va oqsil tarkibiga normallashgan ferment hajmi sifatida belgilangan. Amaldagi to'lqin uzunligi 490 nm edi. CAT faoliyati vodorod periksni iste'mol qilishga asoslangan. Amaldagi to'lqin uzunligi 405 nm edi. GSH-Px faolligi vodorod peroksid va GSH o'rtasidagi katalizlovchi reaktsiya tezligi bilan o'lchandi. Enzimatik bo'lmagan reaktsiyani chiqarib tashlagan holda, GSH-Px faolligining birligi har bir tizimda GSH kontsentratsiyasining 1 mol / L ga kamayishi sifatida aniqlandi. Amaldagi to'lqin uzunligi 405 nm edi. Protein konsentratsiyasi BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanxay, Xitoy) bilan o'lchandi. Amaldagi to'lqin uzunligi 570 nm edi.

2.6. ROS ishlab chiqarish

ROS tarkibibuyrak2/,7/- dixlorofloressein diasetat (DCF-DA) (Sigma, Burlington, MA, AQSH) lyuminestsent probi bilan aniqlangan [28]. Qisqacha aytganda, zebrafishdan olib tashlangan buyrak oldindan sovuq 100 uL PBSga joylashtirildi va to'qimalarni buzuvchi bilan homogenatga aylantirildi. 10 daqiqa davomida 10,{9}} × g 4 oC, 20 uLbuyrakekstrakti96-quduqqa qora mikroplastinkalar qo‘shildi va har bir quduqqa 25 umM DCF-DA qo‘shildi. Mikroplastinka 30 daqiqa davomida 37 oC da inkubatsiya qilindi. Floresans ko'p yorliqli plastinka o'quvchida (PerkinElmer Victor X5, Waltham, MA, AQSh) 485 va 535 nm da o'rnatilgan qo'zg'alish va emissiya filtrlari bilan o'lchandi. Buyrak ekstraktidagi protein miqdori BCA Protein Assay Kit yordamida o'lchandi. Har bir namuna uchun ROS tarkibi floresans qiymatini oqsil tarkibiga normallashtirish orqali hisoblab chiqilgan. Protein konsentratsiyasi BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanxay, Xitoy) bilan o'lchandi. Amaldagi to'lqin uzunligi 570 nm edi.

2.7. Nafas olish yorilishi tahlili

Ro'za tutgan va qayta oziqlanadigan zebrafishlar (F24, S24 va F21R3) nafas olish yo'llari faolligini o'lchash uchun ishlatilgan. Nafas olish portlashi tahlili protokoli avval chop etilgan usulga muvofiq amalga oshirildi [31,32]. Qisqacha aytganda,buyraklarular behushlik qilingan zebra baliqlaridan ajratildi va 100 uL Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhiti (DMEM)/F-12 bilan {0}}quduq mikroplastinkalariga joylashtirildi. Plitani 28 oC da 30 daqiqa inkubatsiya qilgandan so'ng, DCF-DA, dimetilsulfoksid (DMSO) va forbol miristat asetat (PMA) o'z ichiga olgan 100 uL DMEM/F-12 (Thermo Fisher, Waltham, MA, AQSh) har bir aniqlangan quduqqa qo'shiladi. Shu bilan birga, har bir nazorat qudug'iga DMSO ni o'z ichiga olgan 100 uL DMEM/F-12 qo'shildi. Turli xil eritmalarning yakuniy kontsentratsiyasi quyidagicha edi: 500 ng/ml DCF-DA, 0,2 foiz DMSO va 200 ng/ml PMA. Floresans 485 va 535 nm da o'rnatilgan qo'zg'alish va emissiya filtrlari bilan ko'p yorliqli plastinka o'quvchida o'lchandi. Har bir quduqning floresansi

quduqqa eritmalar qo'shilgandan so'ng darhol va har 15 daqiqada 150 daqiqa davomida o'lchandi. Floresans qiymatlarini solishtirish vaqti 150 minut edi. Induktsiya qilinmagan nazorat guruhining floresans qiymatlari floresansdan ayirildi.

individual PMA tomonidan qo'zg'atilgan guruhlarning qiymatlari. Normallashtirilgan floresans qiymatlari hisoblab chiqildi. Ushbu normallashtirilgan floresan qiymatlari uchta ustunga ajratildi.

2.8. RNK ekstraktsiyasi va real vaqtda PCR

MuzlaganbuyraklarTRIzolda (Omega, Norcross, GA, AQSh) maydalangan va umumiy RNK protokol [33] bo'yicha ajratilgan. DNase1 (NEB, Ipswich, MA, AQSh) bilan hazm qilingandan so'ng, cDNK Random Hexamer Primer bilan RevertAid First Strand cDNK sintezi to'plami (Thermo Fisher, Waltham, MA, AQSh) tomonidan ishlab chiqarilgan. qRT-PCR 5 uL 2× SYBR Green qPCR Master Mix (Bike, Xyuston, TX, AQSh) o‘z ichiga olgan 10 uL reaksiya aralashmalarida o‘rnatildi. Barcha namunalar ikki nusxada ishga tushirildi va eEF1a1a ifodasiga normallashtirildi. Ushbu tadqiqotda foydalanilgan oligonukleotid primerlarining ketma-ketligi S1 qo'shimcha jadvalida tasvirlangan. Maqsadning havolaga nisbatan mRNK miqdorini aniqlash 2-AACTmethod [34] yordamida aniqlandi.

2.9. Statistik tahlil

Miqdoriy ma'lumotlar o'rtacha qiymat ± SD sifatida ko'rsatilgan. Statistik tahlillar SPSS 24 versiyasi (SPSS Inc., Chikago, IL, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Ikki guruh o'rtasidagi statistik taqqoslashlar normallik testi natijasiga qarab Student's t-testi yoki noparametrik test yordamida amalga oshirildi. Oddiy taqsimotga ega bo'lgan bir nechta guruhlar uchun tahlillar bir tomonlama ANOVA yordamida, qolganlari esa parametrik bo'lmagan testlar yordamida amalga oshirildi. Barcha statistik ma'lumotlar va usullarni S2-jadvalda tekshirish mumkin.

3. Natijalar

3.1. Ro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafishning tana vazni va antibakterial xususiyatlarining o'zgarishi

To'liq kompensatsion o'sish zebrafishda amalga oshirildi. 7 dan 14 kungacha ro'za tutgandan so'ng, zebrafish tana vaznining kamida 15 foizini yo'qotdi. 14 kunlik qayta ovqatlanishdan so'ng, ro'za tutish guruhidagi zebrafishning tana vazni nazorat guruhinikiga yetdi (1A-C-rasm). Ro'za tutish va ovqatlantirishdan so'ng, zebrafishlarning patogenlarga chidamliligini o'rganish uchun ularga Streptococcus agalactiae intraperitoneal in'ektsiya qilindi. Ro'za tutuvchi guruhdagi zebrafishlar nazorat guruhiga nisbatan o'lim darajasi yuqori bo'lgan. Qayta oziqlantirishning kengayishi bilan o'lim darajasi pasayishda davom etdi (1D-rasm).

1-rasm. Zebra baliqlarining kompensatsion o'sishi modeli. A dan C gacha: ro'za tutish va ovqatlanish paytida zebrafishning tana vaznining o'zgarishi. (A) Zebrafish 7 kun ro'za tutdi va 28 kun davomida ovqatlandi. (B) zebrafish 14 kun ro'za tutdi va 21 kun davomida ovqatlandi. (C) zebrafish 21 kun ro'za tutdi va 14 kun davomida ovqatlandi. n=21–22. (D) S. agalactiae intraperitoneal in'ektsiya qilingan zebrafishlarning yashash darajasi; F: oziqlantirish; S: ochlik; R: qayta oziqlantirish. n=3, *: p < {{10}}.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.2. Ro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafish buyraklarining morfologik o'zgarishlari

Thebuyrakzebrafishlarda asosiy immun to'qima hisoblanadi. Ochlik morfologik o'zgarishlarga olib keldibuyraklar. 21 kunlik ro'za tutgandan so'ng, buyraklar aniq morfologik o'zgarishlarni ko'rsatdi. 3 va 5 kun davomida qayta ovqatlanishdan keyin gialin tomchilari bilan ko'proq shikastlangan tubulalar paydo bo'lganligini aniqladik. Bu holat 7 kundan keyin yaxshilandi. Bundan tashqari, melanomakrofag markazlari (MMC) sonining ko'payishi kuzatildibuyrakochlikdan keyin ortdi (2A-C-rasm). Qayta oziqlantirish bilan birga, bu alomat qutqarildi. Havcr1 ning mRNK ifodasi ro'za tutishdan keyin oshdi (2D-rasm), bu ochlik sabab bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.buyrakjarohat.

Shakl 2. morfologik o'zgarishlarbuyraklarro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafish. (A) ning HE-bo'yalishibuyrakro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafishlarda. Qora uchburchak shikastlangan tubulalarni bildiradi. Qizil o'q MMClarni bildiradi. Qizil yulduz gialin tomchilarini bildiradi. (B) Shikastlangan kanalchalar nisbatini statistik tahlil qilishbuyrak. (C) Buyraklardagi MMClarning statistik tahlili. n=3–4. (D) havcr1 genining mRNK nisbiy ifodasibuyrakro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafish. n {0}}–10. F: oziqlantirish; S: ochlik; R: qayta oziqlantirish. *: p <>

3.3. Ro'za tutish va qayta ovqatlanish paytida oksidlovchi stress paydo bo'ldi

MDA tarkibi 21 va 24 kunlik ro'za tutishdan keyin sezilarli darajada oshdi va 3 kunlik qayta ovqatlanishdan keyin kamaydi (3A-rasm). Shu bilan birga, ROS tarkibi 24 kunlik ochlik bilan kamaydi va 7 kun davomida qayta ovqatlanish bilan tiklandi (3B-rasm). 21 kunlik ro'za tutishdan keyin NO ning tarkibi ortdi (3C-rasm). SOD, GSH-Px va CATni o'z ichiga olgan antioksidant fermentlarning faolligi ro'za tutishdan keyin oshdi. GSH-Px va CAT faolligi tez pasayib ketdi va qayta ovqatlanishning 3-kunida tiklandi. SOD faolligi qayta oziqlantirish bilan pasaygan bo'lsa-da, u hali ham nazoratdan yuqori edi (4-rasm).

Shakl 3. Ro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafish buyraklarida oksidlovchi stress. (A) Buyrakdagi MDA ning tarkibi. (B) Buyrakdagi ROS ning o'zgarishi. (C) Buyrakdagi NO ning tarkibi. F: oziqlantirish; S: ochlik; R: qayta oziqlantirish. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Shakl 4. Antioksidant tizimlardagi fermentlarning faolligibuyraklarro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafish. A) Buyrakdagi SOD faolligi. B) Buyrakdagi GSH-Px faolligi. (C) CAT ning buyrakdagi faoliyati. F: oziqlantirish; S: ochlik; R: qayta oziqlantirish. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.4. Zebrafish buyragining tug'ma immun tizimi ro'za tutish va ovqatlantirishdan ta'sirlangan

ALP faolligi ochlikdan keyin buyrakda ortdi va qayta ovqatlanishdan keyin pasaydi (5A-rasm). 7 kun davomida qayta ovqatlanish bilan, qayta oziqlantirish guruhi va nazorat guruhi o'rtasida sezilarli farq yo'q edi. Buyrakdagi lizozimning faolligi ALP ga o'xshash tendentsiyani ko'rsatdi, bu ro'za tutish bilan ortdi (5B-rasm). Qayta oziqlantirishdan keyin u tezda pasayib ketdi. Buyrakdagi respirator yorilish reaktsiyasi turli guruhlarda sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatmadi, ammo och va ovqatlantirish guruhida javob yuqoriroq bo'ldi (5C-rasm). Yallig'lanishga qarshi sitokin il-1ning mRNK ifodasi barcha ochlik guruhlarida sezilarli o'sishni ko'rsatdi, ammo qayta oziqlantirishdan so'ng darhol pasayib ketdi (6A-rasm). tgfb1a va tgfb1b ning mRNK ifodasi il-1 bilan bir xil tendentsiyani ko'rsatdi (6E,F-rasm). Biroq, nfkb1 ning mRNK ifodasi faqat 24 kun davomida ochlikdan keyin sezilarli darajada oshdi va 3 kun davomida qayta ovqatlanishdan keyin kamaydi. Nfkb2 ning mRNK ifodasi nfkb1 ga o'xshash tendentsiyani ko'rsatdi (6B, C-rasm). Arg2 geni proinflamatuar javob bilan bog'liq bo'lgan arginaza II ni kodlaydi. Bundan tashqari, arg2 ning mRNK ifodasi barcha ro'za tutuvchi guruhlarda sezilarli darajada oshdi va qayta oziqlantirishdan keyin kamaydi (6D-rasm). Ro'za tutgan va ovqatlantirishdan o'tgan zebrafish bilan kurashgandan so'ng, ro'za tutuvchilar guruhida javob kuchliroq bo'ldi. LPS bilan davolash qilingan ochlik guruhidagi il-1 va mmp9 ning mRNK ifodasi LPS bilan davolash qilingan nazorat yoki qayta oziqlantirish guruhlaridagiga qaraganda sezilarli darajada yuqori edi (7-rasm).

Shakl 5. Tug'ma immunitet tizimining parametrlaribuyraklarro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafish. (A) Ro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafish buyragida ALP faolligi. B) Lizozim faolligibuyrakro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafish. (C) Ro'za tutgandan va ovqatlangandan keyin zebrafishdagi buyrakning nafas olish yo'li bilan reaktsiyasi. (C1) Turli vaqtlarda buyrakning floresansi / oqsilining qiymati. (C2) ning floresan/oqsil qiymatlaribuyrak150 daqiqada. (C3) 150 daqiqada buyrak oqsili/floresansi qiymatini normallashtirish. F: oziqlantirish; S: ochlik; R: qayta oziqlantirish. n=12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

6-rasm. Ro'za tutish va ovqatlantirish paytida zebrafish buyraklaridagi immun bilan bog'liq genlarning mRNK nisbiy ifodasi. (A–F):il-1 , nfkb1, nfkb2, arg2, tgfb1a va tgfb1b. F: oziqlantirish; S: ochlik; R: qayta oziqlantirish. n=8–1{{10}}. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

Shakl 7. Immunga bog'liq genlarning mRNK nisbiy ifodasibuyraklarzebrafsh ro'za tutish va qayta ovqatlanishdan keyin 5 uL 20 ug/ml LPS bilan sinovdan o'tkazildi. (A–C) il-1 , mmp9 va nfkb1. F: oziqlantirish; S: ochlik; R: qayta oziqlantirish. n=8–12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

4. Munozara

Ushbu tadqiqotda biz to'liq CG zebrafishda turli xil ochlik vaqtlaridan keyin amalga oshirilishi mumkinligini aniqladik. 3 haftalik ro'za tutishdan keyin ham, zebrafishning tana vazni ikki haftadan keyin nazorat guruhiga yetdi. Bu natija oldingi ish bilan mos edi [28]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ochlik va ovqatlanish zebrafishning metabolik holatiga ta'sir qiladi [27,28]. Qishloq xo'jaligi turlarida CG ning ahamiyati shundaki, u ishlab chiqarish samaradorligini oshiradi. Qishloq xo'jaligi turlari uchun ro'za tutish va oziqlantirish paytida antibakterial xususiyatlarni saqlab qolish muhimdir. Bu jarayon davomida zebrafish patogenlardan aziyat chekishi mumkin. Xabar qilinishicha, ochlik kasallangan Piaractus mesopotamicusning immun javobiga ta'sir qilmagan [18]. Afsuski, ro'za tutish zebrafishlarning S. agalactiae ga sezgirligini oshirdi. Shu bilan birga, tug'ma immun tizimining biokimyoviy parametrlari va mRNK ifodasi ochlikdan ta'sirlangan.

Zebrafishlarda limfa tugunlari yo'q, buyrak esa sutemizuvchilarning suyak iligiga teng bo'lgan asosiy limfoid organdir [24]. Voyaga etgan zebrafishlarda buyrak gematopoezning asosiy joyidir [35]. Buyrak iligi populyatsiyalarida ko'plab gematopoetik hujayralar, jumladan makrofaglar, neytrofillar va limfotsitlar mavjud [36,37]. Buyrakning to'g'ri ishlashi zebrafishlarda tug'ma immunitet tizimi uchun muhimdir. Ushbu tadqiqotda biz ochlikka duchor bo'lgan zebrafish buyraklarida ba'zi morfologik o'zgarishlarni kuzatdik. Ochlikdan keyin buyrakda MMC ning cho'kishi sezilarli darajada oshdi. Ilgari ochlik buyrak va taloqda melano-makrofaglarning (MM) cho'kishiga olib kelishi mumkinligi aniqlangan edi [38]. MMClar asosan buyrak, jigar va taloqda paydo bo'ladi va buyrakda diffuz va kamroq tuzilgan [39]. MMClar ham immun mudofaa, ham normal, noimmunologik, fiziologik jarayonlarda ishlaydi deb hisoblanadi. MMClarning asosiy vazifasi fagotsitozdir. MMClar tug'ma va adaptiv immunitet reaktsiyalarida ishtirok etishi mumkin deb taxmin qilinadi. Ochlikdan keyin MMC qo'shilishi gemofagotsitoz va hujayra qoldiqlarini tozalash bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, qayta ovqatlanishning dastlabki kunlarida gialin tomchilarining tuzilishi kuzatildi. Gialin tomchilarining mavjudligi asosan quvurli epiteliya hujayralarida alfa2u-globulin mavjudligini ko'rsatadi deb ishoniladi [40]. Bundan tashqari, gistiyositik sarkoma modelida neoplastik gistotsitlar lizozim ishlab chiqargan va lizozim quvurli epiteliya hujayralarida to'plangan [41]. Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, gialin tomchilarining paydo bo'lishi buyrakning quvurli epiteliya hujayralarida to'plangan oqsilni hazm qila olmasligi sababli sodir bo'ladi. KIM-1 darajasi (havcr1 tomonidan kodlangan) tubulalarning strukturaviy shikastlanishini ko'rsatishi mumkin [42]. Ochlikdan so'ng, havcr1 ning mRNK ifodasi qayta ovqatlanish bilan sezilarli darajada oshdi va kamaydi. Buyrak funktsiyasi ro'za tutish bilan buzilganligini taxmin qilishimiz mumkin va oziqlantirish bilan buyraklar faoliyati tiklanadi. Biroq, qayta ovqatlanishning boshida talablar og'ir.

Fagotsitoz baliqlarda tug'ma immunitet tizimida muhim himoya jarayonidir. Oksidativ stress immunitet reaktsiyasini cheklaydi [20]. Antioksidant himoyasi asosan fermentlarga bog'liq. SOD, GPx va katalaza antioksidant tizimlarning muhim komponentlaridir [43]. SOD superoksid anioni va H2O2 ning konversiyasiga vositachilik qiladi. Katalaza H2O2 ni suvga zararsizlantirishda ishtirok etadi. GPx glutationni (GSH) glutation disulfidiga (GSSH) oksidlash orqali gidroperoksidlarni (masalan, H2O2 va lipid gidroperoksidlarini) H2O ga katalizlaydi [43-45]. MDA asosiy lipid oksidlanish mahsulotlaridan biri bo'lib, kimyoviy reaktsiyalar va fermentlar tomonidan katalizlangan reaktsiyalar natijasida ko'p to'yinmagan yog'li kislotalardan (PUFA) ishlab chiqariladi. ROS MDA hosil qilish uchun PUFAlarni peroksidlashi mumkin. MDA tarkibi oksidlovchi stressni baholash uchun keng tarqalgan biomarkerdir [46]. Hozirgi ishda ROS miqdori kamaygan bo'lsa ham, buyrakdagi MDA miqdori sezilarli darajada oshdi va antioksidant tizimga tegishli barcha fermentlarning faolligi ham oshdi. ROSni aniqlash vaqtinchalik javobdir. Antioksidant ferment faolligining o'zgarishi uzoq muddatli ro'zaning natijasi edi. ROS va antioksidant fermentlar o'rtasidagi qarama-qarshi tendentsiyalar normal hujayra faolligi jarayonlari ROS ishlab chiqarishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, uzoq davom etgan ochlik esa hujayra faolligining pasayishiga olib keladi. Bu natija shuni ko'rsatdiki, ochlik surunkali shaklda buyrakda oksidlovchi stressni keltirib chiqardi. Doimiy oksidlovchi stress hujayralardagi lipidlar va oqsillar kabi moddalarga zarar etkazishi va nihoyat apoptoz va oksidlangan molekulyar agregatlarning to'planishiga olib kelishi mumkin [20]. Teleostlarda ochlik jigar va ichakdagi MDA tarkibini keltirib chiqarganligi va antioksidant fermentlarning faolligini oshirganligi xabar qilingan [47-49]. Bu natijalar shuni ko'rsatdiki, antioksidant tizim faollashtirilgan bo'lsa-da, ochlikdan etkazilgan zararni bartaraf etish uchun etarli emas. Shu bilan birga, oksidlovchi stress NF-kB, Nrf2 va HIF-1a kabi ko'plab transkripsiya omillarini faollashtirishi mumkin. Keyinchalik, bu transkripsiya omillari ko'plab sitokinlar va kimyokinlarning ekspressiyasini keltirib chiqaradi. Shunday qilib, oksidlovchi stress surunkali yallig'lanishga olib kelishi mumkin [44].

Streptococcus agalactiae bilan kurashgan holda, ro'za tutuvchi guruhdagi zebrafishlar nazorat guruhidagilarga qaraganda ko'proq o'limga duchor bo'lgan. Ayni paytda, ALP va lizozimning faolligi ochlik bilan yaxshilandi. Lizozim baliqning tug'ma immunitet tizimining muhim tarkibiy qismi bo'lib, fagotsitoz jarayonida ishtirok etadi [50]. Natijalarga ko'ra, ochlik il-1 , nfkb1, tgfb1a, tgfb1b va arg2 ning mRNK ifodalanishiga sabab bo'lgan. Ushbu o'zgarishlar oksidlovchi stress tufayli yuzaga kelishi mumkin. TGFB1 yallig'lanishga qarshi va yallig'lanishga qarshi ta'sirga ega bo'lgan sitokindir [51]. Rekombinant TGFB1 immunosupressiv faollikni ko'rsatdi va teleostlarning leykotsitlarida yallig'lanishga qarshi sitokinlarning ifodasini pasaytirdi. Zebrafishlarda tgfb1a ifodasi jigarda yallig'lanishni keltirib chiqardi [52]. Surunkali tgfb1a induktsiyasi yallig'lanishni faollashtirdi va uning ifodasi zebrafishdagi erta gepatotsellyulyar karsinomada jigar fibrozini keltirib chiqardi. Arginaza birlamchi ferment bo'lib, L-argininni L-ornitin va karbamidga aylantirish uchun javobgardir. Arginaza ikkita izoenzimga ega (arginaza I va arginaza II) [53,54]. Arginaza II immunitet bilan bog'liq gen bo'lib, mitoxondriyal ROS orqali makrofaglarda yallig'lanishga qarshi reaktsiyalar bilan bog'liq ekanligi aniqlandi. Ushbu ma'lumotlar ochlik buyrakda immunitet reaktsiyasini keltirib chiqarishi mumkinligini ko'rsatdi. Sichqonlarda ochlik LPSga sezgirlikni pasaytirdi va il-1 [55] ifodasiga ta'sir qilmadi. Biroq, LPS bilan qo'zg'atilgan zebrafish LPSga qo'pol javob ko'rsatdi va il-1 va mmp9 ifodasi boshqa guruhlarga qaraganda sezilarli darajada yuqori edi. Sichqonlardan farqli o'laroq, zebrafish ochlikdan keyin LPSga nisbatan sezgir bo'lib qoldi, shuning uchun ochlik ularning patogenlarni tozalash qobiliyatini buzishi mumkin.

5. Xulosalar

Ushbu tadqiqotda biz ro'za tutish va ovqatlanishning zebrafishning tug'ma immunitet tizimiga ta'sirini oldindan o'rganib chiqdik. Ochlikdan keyin qo'zg'atuvchilarga sezgirlikning oshishi bilan birga zebrafishlarda kompensatsion o'sish kuzatildi. Ochlikdan kelib chiqqan oksidlovchi stress va shikastlangan buyrak kanalchalari tomonidan ishlab chiqarilgan xavfli molekulyar naqshlar yallig'lanishga yordam bergan bo'lishi mumkin. Ochlik sezgirlikni qanday oshirishi va metabolik holat turli xil immunitet hujayralariga qanday ta'sir qilishini o'rganish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi.

Qo'shimcha materiallar: Quyidagilar https://www.mdpi.com/article/10 .3390/biom11060825/s1 saytida mavjud, S1-jadval: Ushbu tadqiqotda foydalanilgan primerlar ro'yxati; Jadval S2: Tajribaning statistik natijasi.

Muallif hissalari: Konseptualizatsiya, ZL va WL; Ma'lumotlar kuratsiyasi, JJ; Rasmiy tahlil, ZL va DL; Moliyaviy sotib olish, WL; Tergov, ZL, DL, RC va YY; Metodologiya, ZL; Nazorat, WL; Yozish - asl qoralama, ZL; Yozish - ko'rib chiqish va tahrirlash, WL Barcha mualliflar qo'lyozmaning nashr etilgan versiyasini o'qib chiqdilar va rozi bo'ldilar.

Moliyalashtirish: Bu ish Xitoyning Milliy asosiy ilmiy-tadqiqot dasturi (2018YFD0900101), MOF va MARAning Xitoy qishloq xoʻjaligi tadqiqot tizimi (CARS-46) va qishloq xoʻjaligi ilmiy tadqiqotlaridagi Xitoyning ajoyib isteʼdodlari dasturi ({{3) tomonidan moliyalashtirildi. }}) Wensheng Liga.

Tashkilotlarni ko'rib chiqish kengashi bayonoti: Tadqiqot Xelsinki deklaratsiyasining ko'rsatmalariga muvofiq o'tkazildi va Sun Yat-Sen universiteti hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan.

Axborotlangan rozilik bayonoti: qo'llanilmaydi.

Ma'lumotlar mavjudligi to'g'risidagi bayonot: qo'llanilmaydi.

Manfaatlar to'qnashuvi: Mualliflar o'zlarining manfaatlar to'qnashuvi yo'qligini e'lon qiladilar.