Feniletanoid glikozidlarning Cistanche Tubulosadan MTT tahliliga aralashuvi

Aloqa: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Vang, Si-Min Chjou, Gang Xu va Yu-Qi Gao

Annotatsiya:

MTT tahlili skrining usuli sifatida hujayralarning hayotiyligi va proliferatsiyasini o'lchash uchun keng qo'llaniladi. Ammo shuni ta'kidlash kerakki, MTT tahlili ta'sirini to'g'ri aks ettirmasligi mumkinCistanche tubulosaEA.hy926 hujayralarining hayotiyligi bo'yicha etanolik ekstrakti. MTT tahlili, echinacoside va acteosidning qarama-qarshi kuzatuvlari uchun mas'ul bo'lgan komponentlarni tekshirish va aniqlash uchun C. tubulosa etanolik ekstraktidan ikkita asosiy feniletanoid glikozidlar ajratildi. CCK-8, Hoechst 33342 va annexin V-FITC/PI tahlillaridan olingan ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, MTT tahlilining qarama-qarshi natijalari uchun ikkala ajratilgan birikmada mavjud bo'lgan kofeol guruhi javobgar bo'lgan. Ushbu ma'lumotlar noto'g'ri natijalarga olib kelmaslik uchun dori vositalarining hujayra hayotiyligiga ta'sirini aniqlash uchun turli xil usullardan foydalanish zarurligini ta'kidlaydi.

Kalit so'zlar: MTT tahlili;feniletanoid glikozid; kofe kislotasi; hujayra hayotiyligi; aralashuv

Kirish

Parazit o'simlikCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceae oilasi) Shimoliy Afrika, Arab va Osiyo mamlakatlarida keng tarqalgan [1]. dan kelib chiqadiCistanche tubulosavaCistanche deserticolaan'anaviy xitoy tabobatida muhim ahamiyatga ega bo'lib, yo'g'on ichak inertsiyasi tufayli iktidarsizlik, bepushtlik, lumbago va qabziyatni davolash uchun ishlatilgan [2]. Bundan tashqari, Cistanche tubulosa etanolik ekstrakti sichqonlarda miya gipoksiyasiga qarshi sezilarli himoya ta'siriga ega ekanligi ko'rsatildi [3].

Endotelial hujayralar gipoksik o'pka gipertenziyasining patogenezida hal qiluvchi rol o'ynaydi. EA.hy926 endotelial hujayra chizig'i birlamchi endotelial hujayralarga sezilarli darajada o'xshaydi. ning anti-gipoksik ta'sirini o'z tadqiqotimiz davomidaCistanche tubulosaEA.hy926 endotelial hujayradagi etanolik ekstrakti, biz 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) ekanligini payqadik. sitotoksiklik va sitostatik faollikni o'rganishda hujayra hayotiyligini baholash uchun keng qo'llaniladigan tahlil, davolashdan keyin EA.hy926 hujayra hayotiyligini oshirish orqali qarama-qarshi natijalarni keltirib chiqardi.

Dori vositasining potentsial sitotoksik yoki sitoprotektiv ta'sirini aniqlash uchun hujayra hayotiyligini to'g'ri baholash juda muhimdir. Shuning uchun biz C. tubulosa etanolik ekstraktida mavjud bo'lgan qaysi komponentlar MTT tahlili bilan kuzatilgan qarama-qarshi natijalar uchun javobgar bo'lishi mumkinligini tekshirdik. Biz C. tubulosa etanolik ekstraktidan ikkita asosiy feniletanoid glikozidni (PhG) ajratib oldik, echinacoside (keyingi o'rinlarda birikma 1) va akteozid (bundan buyon matnda birikma 2) va turli usullar yordamida ularning EA.hy926 hujayra hayotiyligiga ta'sirini aniqladik. Bundan tashqari, 1 va 2 birikmalarining qaysi o'rnini bosuvchi qarama-qarshi natijalarga sabab bo'lishi mumkinligini aniqroq aniqlash uchun biz ularning aglikonlari, kofein kislotasi (bundan buyon matnda 3 birikma) va 3,4-digidroksifeniletanol (bundan buyon matnda 4-birikma deb yuritiladi), xuddi shu usullardan foydalangan holda EA.hy926 hujayra hayotiyligi bo'yicha.

Natijalar va muhokama

Murakkablarni aniqlash

C. tubulosa etanolik ekstraktidan ajratilgan ikkita birikmaning tuzilmalari yadro magnit-rezonansi (NMR) va massa spektrometriyasi (MS) tahlillari bilan aniqlangan va 1-rasmda ko'rsatilgan. 1-birikma avval xabar qilingan NMR bilan solishtirganda echinakozid sifatida aniqlangan (jadval). 1) va MS (m/z 785 [M−H]− ) maʼlumotlari [4]. Murakkab 2 NMR spektrlari 1-birikmaning spektrlariga juda o'xshash edi, faqat -D-glyukopiranosil guruhi yo'qligidan tashqari (1-jadval). Murakkab 2 (m/z 623 [M−H]−) akteozid sifatida aniqlandi [5]. Muhimi shundaki, ikkala birikma ham bir xil aglikonga ega bo'lib, ular tarkibida kofein kislotasi (3-birikma) va 34-dihidroksifeniletanol (4-birikma) mavjud.

Hujayra hayotiyligini tahlil qilish

MTT va CCK{0}} tahlillari EA.hy926 hujayra hayotiyligiga 1-4 birikmalarining ta'sirini tahlil qilish uchun ishlatilgan. MTT tahlili shuni ko'rsatdiki, EA.hy926 hujayralarining hayotiyligi 25 va 5{62}} mkM birikma 1, 2 yoki 3 bilan ishlov berilgandan so'ng sezilarli darajada oshgan (166,3 foiz va 174,1 foiz, birikma uchun 205,8 foiz va 224,3 foiz). 2 va 3- birikma uchun mos ravishda 164,8 va 189,6 foiz; nazorat hujayralari bilan solishtirganda p <0,05 (2a-rasm).="" bundan="" tashqari,="" hujayralarni="" morfologik="" tekshirish="" 50="" mkm="" birikma="" 1,="" 2="" yoki="" 3="" bilan="" ishlov="" berish="" tirik="" hujayralar="" nisbatining="" bevosita="" ko'rsatkichi="" hisoblangan="" binafsha="" rangli="" formazan="" kristallarining="" shakllanishini="" kuchaytirganligini="" aniqladi="" (3-rasm).="" aksincha,="" cck{33}}="" tahlili="" shuni="" ko'rsatdiki,="" 12,5,="" 25="" va="" 50="" mkm="" 1,="" 2="" yoki="" 3="" birikmalari="" bilan="" ishlov="" berilgandan="" so'ng="" hujayra="" hayotiyligi="" sezilarli="" darajada="" pasaygan="" (75,5="" foiz,="" 45,1="" foiz="" va="" 43,7="" foiz="" 1,="" 85,5="" foiz,="" nazorat="" xujayralari="" bilan="" solishtirganda="" 51,8="" foiz="" va="" 2-birikma="" uchun="" 34,3="" foiz,="" 3-mustahkam="" uchun="" mos="" ravishda="" 64,5="" foiz,="" 48,2="" va="" 36,4="" foiz;="" p=""><0,05) (2b-rasm).="" 4-birikma="" mtt="" yoki="" cck-8="" tahlilida="" hujayra="" hayotiyligiga="" ta'sir="" qilmadi.="" ikki="" tahlil="" bilan="" olingan="" natijalar="" o'rtasidagi="" nomuvofiqlik="" shuni="" ko'rsatadiki,="" ikkita="" tahlildan="" biri="" ea.hy926="" hujayra="" hayotiyligiga="" 1="" va="" 2="" birikmalarining="" ta'sirini="" to'g'ri="" aks="" ettirmasligi="">

Hoechst binoni bilan apoptozni baholash

Hoechst 33342 - ultrabinafsha nurlar ta'sirida qo'zg'atiladigan va 460 dan 490 nm gacha bo'lgan ko'k floresansni chiqaradigan hujayra o'tkazuvchan DNK dog'idir. Apoptotik hujayralarning kondensatsiyalangan kromatini normal hujayralar xromatiniga qaraganda yorqinroq bo'yaladi [6]. Nazorat hujayralari bir xil tarqalgan xromatin, normal organellalar va buzilmagan hujayra membranalarini namoyish etgan bo'lsa, 50 mkM 1, 2 yoki 3 birikmalari bilan 48 soat davomida inkubatsiya qilingan hujayralar apoptotik hujayralarning odatiy bo'yalishini ko'rsatdi (4A-rasm). Aksincha, hujayralarga 50 mkM 4 birikmasiga ta'sir qilish nazorat bilan solishtirganda apoptotik yadrolar sonini oshirmadi.

Apoptotik hujayralarning oqim sitometrik tahlili

Anneksin V-FITC / PI ikki marta bo'yash tahlili apoptotik hujayralarni apoptozga uchragan hujayralarda tashqi ko'rinishga ega bo'lgan V-FITC anneksinning fosfatidilseringa yuqori darajada bog'lanishi orqali aniqlaydi [7]. Ushbu tahlilda tirik hujayralar na anneksin, na PI bilan bog'lanmaydi va shuning uchun bo'yalmaydi (pastki chap kvadrant), erta apoptotik hujayralar anneksin V-FITC (pastki o'ng kvadrant) va kech apoptotik hujayralar bilan yashil rangga bo'yalgan. Aneksin V-FITC ning mos ravishda fosfatidilserin va PI ning nekrotik hujayralar bilan bog'lanishi natijasida yashil va qizil rangga bo'yalgan (yuqori o'ng kvadrant). 4B-rasmda ko'rsatilganidek, 50 mkM birikmalar 1, 2 yoki 3 bilan 48 soat davomida inkubatsiya qilingan hujayralar, apoptotik hujayralar ulushi mos ravishda 3,74 foizdan (nazorat hujayralari) 10,32 foizga, 12,95 foizga va 11,30 foizga ko'tarildi. Nazorat hujayralari bilan solishtirganda, 4 birikmasi apoptotik EA.hy926 hujayralarining foizini oshirmadi.

CCK-8 tahlili va Hoechst 33342 bo'yalishi bilan olingan natijalarga mos keluvchi oqim sitometriyasi tahlili shuni ko'rsatdiki, 1, 2 va 3 birikmalari EA.hy926 hujayralarida apoptozni keltirib chiqardi. Umuman olganda, bu kuzatishlar shuni ko'rsatadiki, 1-3 birikmalari bilan davolashdan keyin MTT tahlili bilan kuzatilgan EA.hy926 hujayra hayotiyligining ortishi noto'g'ri-ijobiy natijani ko'rsatdi.

Munozara

1983 yilda Mosmann hujayra proliferatsiyasi va sitotoksikligini o'lchash uchun kolorimetrik MTT mikroplata tahlilini ishlab chiqdi [8]. Ushbu oddiy tahlil va uning modifikatsiyalari hozir butun dunyo bo'ylab hujayra biologiyasi laboratoriyalarida keng qo'llaniladi. Sutemizuvchilar hujayralarida fraksiyalanish tadqiqotlari shuni ko'rsatdiki, kamaytirilgan piridin nukleotid kofaktori NADH MTTning ko'p qisqarishi uchun javobgardir. Bu butun hujayralar yordamida olib borilgan tadqiqotlar tomonidan qo'llab-quvvatlandi [9]. Shuning uchun MTT qisqarishi metabolik faol hujayralar bilan bog'liq va nafaqat mitoxondrial nafas olish, balki sitoplazma va mitoxondriyal bo'lmagan membranalar, shu jumladan endosoma/lizosoma bo'limi va plazma membranasi bilan ham bog'liqdir [10]. MTT molekulasidagi aniq musbat zaryad uning plazma membranasi potentsiali orqali hujayra o'zlashtirilishi uchun asosiy omil hisoblanadi.

Shunisi e'tiborga loyiqki, MTT tahlili vaqti-vaqti bilan tekshirilgan birikmaning ma'lum hujayralarga ta'sirini aniq aks ettirmasligi mumkin. Biroq, MTT tahlilida qarama-qarshi natijalarga olib kelishi mumkin bo'lgan kimyoviy tuzilmalar yoki guruhlar aniqlanmagan. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, MTT tahlili yashil choyda eng ko'p bo'lgan polifenol bo'lgan (−)-epigallokatexin-3-gallatning antiproliferativ ta'sirini kam baholay oladi [11]. O'simta kimyoviy sezgirligini aniqlash uchun MTT tahlilidan foydalangan holda, epirubitsin, paklitaksel, dosetaksel va imatinib mesilat (Gleevec) kabi saratonga qarshi kimyoterapevtik vositalar hujayra hayotiyligini oshirdi [12,13]. Bundan tashqari, bir qator tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ba'zi o'simlik ekstraktlari va redoks-aktiv polifenollar MTT tahliliga xalaqit berishi mumkin, chunki ular hujayralar bo'lmaganda MTT tetrazolium tuzini to'g'ridan-to'g'ri kamaytiradi [14].

Mikroplata o'quvchida spektrofotometrik tahlil qilishdan oldin MTT formazan kristallarini eritish zarurati va reaktsiyaning o'ziga xos so'nggi nuqtasi MTT tahlilini ma'lum ilovalar uchun ishlatishni cheklaydi. Bu tetrazolium analoglarining rivojlanishiga olib keldi, unda fenil qismlari manfiy zaryadlangan sulfonat guruhlari bilan bezatilgan, masalan, 2,{1}}bis-(2-metoksi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazoliy{8}}karboksamid (XTT), manfiy zaryadlangan ichki tuz [15] va 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS), MTT bilan chambarchas bog'liq bo'lgan zaif kislotali ichki tuz [16] . Ushbu modifikatsiyalar o'rtacha eruvchan formazan mahsulotlarini ishlab chiqarishga olib keldi, bu miqdorni aniqlashdan oldin eritish bosqichi talabini yo'q qildi. Shunga mos ravishda, bu molekulalardagi manfiy zaryadning ortishi ularning hujayra membranalari [17], 1-metoksi-5-metilfenaziniy metil sulfat ({{25}) kabi oraliq elektron qabul qiluvchilar (IEA) boʻylab harakatlanish qobiliyatini kamaytirdi. }}metoksi PMS) tetrazol bo'yog'ini kamaytirishni osonlashtirish yoki pasayish tezligini oshirish uchun talab qilingan.

Yaqinda suvda eruvchan tetrazoliy tuzlarining yangi avlodi ishlab chiqildi, ularning WST-1 prototipi [18]. WST-1, yod qoldig'ini o'z ichiga olgan manfiy zaryadlangan disulfonatlangan ichki tuz, uning majburiy IEA bo'lgan 1-metoksi PMS mavjudligida XTT va MTSga qaraganda barqarorroqdir. Bu WST-1/1-metoksi PMS ning qulay yagona reagent hujayra proliferatsiyasi to'plami sifatida marketingiga olib keldi. WST turkumidagi yana bir qancha tetrazolium tuzlari ishlab chiqilgan bo'lib, ulardan eng foydalisi WST-8 [19]. WST-8 WST-1 ga juda o'xshash hujayralarni qisqartirish xususiyatlariga ega va CCK-8 tahlili sifatida mustaqil ravishda sotilmoqda. WST-8 hujayra o'tkazmaydi va shuning uchun hujayra ichidagi NADH dan plazma membranasi orqali 1-metoksi PMS vositachiligida elektronlarni WST{13}}ga ​​o'tkazish orqali hujayradan tashqarida kamayadi. MTT va WST-8/1-metoksi PMSni kamaytirish hujayra ichidagi NADH tomonidan boshqarilsa ham, NADH manbai bu ikki usulda farq qiladi. WST-8/1-metoksi PMSni pasaytirish mitoxondrial trikarboksilik kislota sikli-NADH ni ekstramitoxondrial bo'shliq bilan bog'laydigan malat/aspartat shitliga ko'proq bog'liqdir [20].

Dastlabki tajribalarda biz 1, 2, 3 va 4 birikmalari MTT tetrazolium tuzini bevosita kamaytira olmasligini tasdiqladik (ko'rsatilmagan). Ushbu tadqiqotda, ishlab chiqaruvchining protokollarida ko'rsatilganidek, MTT yoki CCK-8 eritmasini qo'shishdan oldin mikroplastinkalarni fosfat-buferli fiziologik eritma (PBS) bilan ehtiyotkorlik bilan yuvish orqali aralashmalarning reagentga bevosita ta'siri yo'q qilindi. Shunga qaramay, ikkala usul yordamida olingan natijalar hali ham bir-biriga zid edi (2-rasm). Kutilganidek, hujayralarni 1, 2 va 3 birikmalari bilan inkubatsiya qilish nazorat guruhiga nisbatan tetrazolium tuzining binafsha formazanga qisqarishini oshirdi (3-rasm), bu o'ziga xos birikma ishtirokida tetrazolium tuzini shunchaki kamaytirishdan dalolat beradi. birikmaning MTT tahliliga aralashish qobiliyatini baholash uchun etarli emas.

1, 2, 3 va 4 birikmalari EA.hy926 hujayralarida apoptozni keltirib chiqarishi mumkinligini aniqlash uchun hujayra morfologik o'zgarishlari va fosfatidilserinning tashqi ko'rinishi baholandi. CCK-8 tahlili bilan kuzatilgan hujayra hayotiyligining pasayishiga mos ravishda, V-FITC/PI annexin yordamida Hoechstning bo'yalishi va oqim sitometriyasi tahlili natijalari shuni ko'rsatdiki, 1, 2 va 3 birikmalari bilan davolashdan keyin kuzatilgan o'sishning inhibisyonu hech bo'lmaganda qisman EA.hy926 hujayra apoptoziga bog'liq. Bizning natijalarimiz, shuningdek, 1 va 2 birikmalarida mavjud bo'lgan kofeol guruhi MTT tahlili bilan olingan qarama-qarshi natijalar uchun javobgar bo'lgan degan fikrni qo'llab-quvvatladi.

Bizning topilmalarimizga o'xshab, kuchli katta o'tkazuvchanlik kaliy kanalini ochuvchi Rottlerin in vitro MTTga nisbatan reaktivlikni ko'rsatmadi. Biroq, u hujayralar ichida formazan kristallarining shakllanishini kuchli kuchaytirdi, natijada NF-kB ning Rottlerin inhibisyonu va [3H]-timidinning DNKga qo'shilishi tahlili natijasida kuzatilgan hujayra proliferatsiyasi bilan aniq ziddiyatli edi [21]. Rottlerinning MTT qisqarishini kuchaytirish mexanizmi uning mitoxondrial ajralish ta'siri bilan bog'liq edi [22]. Rottlerin tarkibida sinnamoil kislota o'rnini bosuvchi guruh mavjud. Sinnamoil kislotasi bilan solishtirganda, 3 birikma C-3 va C-4 da joylashgan ikkita qoʻshimcha gidroksil qoldiqlariga ega. Shuning uchun, biz 1 va 2 birikmalarining MTT tahlilida qarama-qarshi natijalarga olib keladigan mexanizmi ularning mitoxondrial ajralish ta'siri bilan ham bog'liq bo'lishi mumkinligini taxmin qilamiz. Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun 1, 2 birikmalar va triflorokarbonilsiyanid fenilgidrazon (FCCP) kabi kimyoviy ajratuvchi o'rtasida qiyosiy tadqiqotlar o'tkazish kerak.

Eksperimental bo'lim

Reaktivlar va kimyoviy moddalar

Murakkab 3 (kofein kislotasi – kukun, tozaligi=98,6 foiz ) Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Xitoy) dan xarid qilingan. 4-birikma (3,{6}}dihidroksifeniletanol-moy, tozaligi=98,5 foiz) Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd.dan (Chengdu, Xitoy) olingan. MTT va dimetil sulfoksid (DMSO) Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSh) olingan. CCK-8 tahlili Dojin Laboratories (Kumamoto, Yaponiya) dan xarid qilingan. Hoechst 33342 va annexin V-FITC/PI apoptozni aniqlash to'plamlari Beyotime Biotexnologiya institutidan (Xaymen, Xitoy) sotib olingan.

O'simlik moddasi

C. tubulosa poyalari Xitoyning Shinjon-Uygʻur avtonom rayoni, Yutyan prefekturasidan yigʻilgan. Vaucher namunalari Uchinchi harbiy tibbiyot universiteti (Chongqing, Xitoy) yuqori balandlikdagi tibbiyotning asosiy laboratoriyasiga saqlangan va Chengdu an'anaviy xitoy tibbiyot universitetidan Yi Chjan tomonidan tasdiqlangan (Chengdu, Xitoy)

O'simlik materialini ajratib olish va izolyatsiya qilish

Havoda quritilgan C. tubulosa (0,6 kg) poyalari kukunga aylantirildi va 50% etanol bilan 70 daraja haroratda 2 soat davomida ekstraksiya qilindi. Past bosim ostida erituvchini olib tashlangandan so'ng, etanolik ekstrakt (212,5 g) eritildi va suvda (2 L) to'xtatildi va n-butanol (2 L × 3) bilan ekstraktsiya qilindi. N-butanol ekstrakti (110 g) poliamid ustunida xromatografdan o'tkazildi va etanol/suv (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) bilan elutildi va besh fraksiya (A-E) hosil bo'ldi. . B fraktsiyasi (65 g) ODS ustunida fraktsiyalangan; etanol bilan elutsiya: suv (1:9) ajratilgan birikma 1 (3 g). D fraksiyasi (10,5 g) ODS ustunida fraksiyalangan; etanol/suv (1:4) bilan ajratilgan 2 birikma (1 g) bilan elutsiya.

NMR spektrlari Bruker Avance 600 spektrometrida CD3ODda ichki standart sifatida tetrametilsilan (TMS) bilan qayd etilgan. Mass spektrlari BioTOF-Q massa spektrometrida o'tkazildi.

Hujayra madaniyati

EA.hy926 hujayra liniyalari American Type Culture Collection (Manassas, VA, AQSh) dan olingan. Hujayralar RPMI 1640 muhitida 10 foiz (v/v) homila sigir zardobida va 1 foiz (v/v) penitsillin-streptomitsin bilan to'ldirilgan namlangan muhitda 5 foiz CO2 37 daraja haroratda ekilgan.

Hujayra hayotiyligi

Hujayra hayotiyligi MTT va CCK{0}} tahlillari yordamida baholandi. 1 va 2 birikmalar va ularning aglikonlari, kofein kislotasi (3) va 34-dihidroksifeniletanol (4) DMSO da DMSO ning oxirgi konsentratsiyasi < 0,1="" foiz="" (v/v)="" ga="" qadar="" madaniy="" muhitda="">

EA.hy926 xujayralari 96-quduq plastinkalariga 4 × 103 hujayra/quduqqa ekilgan. 24 soat davomida inkubatsiyadan so'ng hujayralar 24 soat davomida 6,25-50 mkM 1, 2, 3 yoki 4 birikmasi bilan ishlov berildi. Madaniyat muhiti olib tashlandi va hujayralar ikki marta fosfat-buferli tuz (PBS) bilan yuvildi. 100 mkL muhitni o'z ichiga olgan har bir quduqqa MTT eritmasining (5 mg·mL-1) alikvotalari (10 mL) qo'shildi va hujayralar bilan 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Inkubatsiyadan so'ng, vosita olib tashlandi va formazan kristallarini eritish uchun har bir quduqqa 150 mkL DMSO alikotlari qo'shildi. Absorbsiya 490 nm da mikroplata o'quvchi (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, AQSh) yordamida o'lchandi. Hujayra hayotiyligi MTTni pasaytirish ulushi sifatida ifodalangan va nazorat hujayralarining absorbsiyasiga 100 foizlik qiymat bergan. Barcha tajribalar uch marta o'tkazildi va o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida taqdim etildi.

CCK{0}} tahlili biroz oʻzgartirishlar kiritilgan [23] adabiyotlardan soʻng oʻtkazildi. Xususan, hujayralar 24 soat davomida 6,25–50 mkM birikmalar 1, 2, 3 yoki 4 bilan ishlov berilgan va 10 mkl CCK-8 eritmasi va 100 mkl madaniy muhit qo‘shilishidan oldin ikki marta PBS bilan yuvilgan. Mikroplastinkani 37 daraja haroratda 2 soat davomida inkubatsiya qilgandan so'ng, absorbans mikroplata o'quvchi yordamida 450 nm da o'lchandi. Hujayra hayotiyligi nazorat hujayralariga nisbatan tirik hujayralar ulushi sifatida ifodalangan (100 foiz). Barcha tajribalar uch marta o'tkazildi va o'rtacha ± SD sifatida ifodalandi.

Hoechst 33342 binoni bo'yicha apoptozni baholash

Apoptotik morfologik o'zgarishlar Hoechst 33342 bo'yash orqali kuzatildi. Qisqacha aytganda, EA.hy926 xujayralari 48-quduq plitalari (2 × 104 hujayra/quduq) ustiga ekilgan va 50 mkM birikma 1, 2, 3 yoki 4 bilan 37 darajada 48 soat davomida ishlov berilgan, ikki marta PBS bilan yuvilgan, va xona haroratida 15 daqiqa davomida 4 foiz (v/v) paraformaldegid bilan mahkamlanadi. PBS bilan ikki marta yuvilgandan so'ng, hujayralar xona haroratida 5 daqiqa davomida Hoechst 33342 (10 ug · mL-1) bilan bo'yalgan va ikki marta PBS bilan yuvilgan. Hoechst bilan bo'yalgan yadrolar lyuminestsent mikroskop (Olimp, Tokio, Yaponiya) yordamida tasvirlangan.

Oqim sitometriyasi yordamida apoptoz tahlili

Apoptotik hujayralar anneksin V-FITC / PI ikki marta bo'yash va oqim sitometriyasi tahlili bilan aniqlandi. Qisqacha aytganda, 48 soat davomida 50 mkM birikma 1, 2, 3 yoki 4 bilan ishlov berilgandan so'ng, hujayralar yig'ib olindi va PBSda 1 × 105 hujayra · ml-1 da qayta suspenziya qilindi. 25 gradusda 5 daqiqa davomida 500 × g santrifüjdan so'ng, 195 mkL anneksin V-FITC bog'lovchi bufer va 5 mL anneksin V-FITC qo'shildi. Yumshoq vorteks bilan aralashtirilgandan so'ng, aralash qorong'i joyda xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. 25 gradusda 5 daqiqa davomida 500 × g santrifüjdan so'ng, 190 mkL FITC-konjugatsiyalangan anneksin V bog'lovchi bufer va 10 mkl PI qo'shildi. Yumshoq vorteks aralashtirishdan so'ng, namunalar 30 daqiqa ichida FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San-Xose, CA, AQSH) yordamida tahlil qilindi.

Statistik tahlil

Barcha eksperimental ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ifodalangan. Eksperimental namunalar va tegishli nazorat o'rtasidagi farqlarning ahamiyati SPSS dasturi (11.5-versiya) yordamida bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) orqali baholandi. Statistik ahamiyatlilik p < 0.05="" da="">

Xulosa

Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, MTT tahlilida kuzatilgan hayotiy hujayralar sonini haddan tashqari baholash ba'zi birikmalarning sitotoksikligini maskalashi mumkin. Shuning uchun, giyohvand moddalarni skrining jarayonlarida, noto'g'ri natijalarni keltirib chiqarmaslik uchun maxsus birikmaning hujayra hayotiyligiga ta'sirini aniqlash uchun turli usullardan foydalanishni tavsiya etamiz (masalan, CCK-8 va 3 H-TdR tahlili).