Feniletanoid glikozidlarning Cistanche Tubulosa dan MTT tahliliga aralashuvi

1.Kirish

Parazit o'simlikSitstanche tubulosa(Shrenk) R. Uayt (Orobanchaceaeoila) Shimoliy Afrika, Arab va Osiyo mamlakatlarida keng tarqalgan [1]. dan kelib chiqadiC. tubulosavaC. deserticolaan'anaviy xitoy tabobatida muhim ahamiyatga ega bo'lib, yo'g'on ichak inertsiyasi tufayli iktidarsizlik, bepushtlik, lumbago va qabziyatni davolashda ishlatilgan [2]. Bundan tashqari, etanolik ekstraktiC. tubulosasichqonlarda miya gipoksiyasiga qarshi sezilarli himoya ta'siriga ega ekanligi ko'rsatilgan [3].

Endotelial hujayralar gipoksik o'pka gipertenziyasining patogenezida hal qiluvchi rol o'ynaydi. EA.hy926 endotelial hujayra chizig'i birlamchi endotelial hujayralarga sezilarli darajada o'xshaydi. C. tubulosa etanolik ekstraktining EA.hy926 endotelial hujayralariga antigipoksik ta'sirini o'rganishimiz davomida biz 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){{7} }},5-difeniltetrazolium bromid (MTT) tahlili, odatda sitotoksiklik va sitostatik faollikni tadqiq qilishda hujayra hayotiyligini baholash uchun ishlatiladi, davolashdan keyin EA.hy926 hujayra hayotiyligini oshirish orqali qarama-qarshi natijalarni keltirib chiqardi.

Dori vositasining potentsial sitotoksik yoki sitoprotektiv ta'sirini aniqlash uchun hujayra hayotiyligini to'g'ri baholash juda muhimdir. Shuning uchun biz C. tubulosa etanolik ekstraktida mavjud bo'lgan qaysi komponentlar MTT tahlili bilan kuzatilgan qarama-qarshi natijalar uchun javobgar bo'lishi mumkinligini tekshirdik. Biz ikkita asosiy narsani ajratib oldikfeniletanoid glikozidlar (PhGs)C. tubulosa etanolik ekstraktidan,echinacoside (keyingi o'rinlarda 1-birikma) va akteozid (bundan buyon matnda 2- birikma). Biz ularning EA.hy926 hujayra hayotiyligiga ta'sirini turli usullar yordamida aniqladik. Bundan tashqari, 1 va 2 birikmalarining qaysi o'rnini bosuvchi qarama-qarshi natijalar uchun javobgar bo'lishi mumkinligini aniqlashtirish uchun biz ularning aglikonlari, kofein kislotasi (bundan buyon matnda 3 birikma) va 34-dihidroksifeniletanolni (bundan buyon matnda birikma 4) EAda sinab ko'rdik. Xuddi shu usullardan foydalangan holda .hy926 hujayra hayotiyligi.

APOPTOZNI INHIBITOTISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. Natijalar va muhokama

2.1. Murakkablarni aniqlash

dan ajratilgan ikkita birikmaning tuzilmalariC. tubulosa etanolik ekstrakti1-rasmda ko'rsatilganidek, yadro magnit-rezonansi (NMR) va massa spektrometriyasi (MS) tahlillari bilan aniqlangan. 1-birikma avval xabar qilingan NMR (1-jadval) va MS (m/z 785 [M−H) bilan solishtirganda echinakozid sifatida aniqlangan. ]− ) ma’lumotlar [4]. Murakkab 2 NMR spektrlari 1-birikmaning spektrlariga juda o'xshash edi, faqat -D-glyukopiranosil guruhi yo'qligidan tashqari (1-jadval). Murakkab 2 (m/z 623 [M−H]−) sifatida aniqlandiakteozid[5]. Muhimi shundaki, ikkala birikma ham bir xil aglikonga ega bo'lib, ular tarkibida kofein kislotasi (3-birikma) va 34-dihidroksifeniletanol (4-birikma) mavjud.

2.2. Hujayra hayotiyligini tahlil qilish

MTT va CCK{0}} tahlillari 1-4 birikmalarining EA.hy926 hujayra hayotiyligiga ta'sirini tahlil qilish uchun ishlatilgan. MTT tahlili shuni ko'rsatdiki, EA.hy926 hujayralarining hayotiyligi 25 va 5{62}} mkM birikmalar 1, 2 yoki 3 bilan ishlov berilgandan so'ng sezilarli darajada oshgan (166,3% va 174,1%, birikma uchun 205,8% va 224,3%) 2 va 3-aralashma uchun mos ravishda 164,8% va 189,6%, nazorat hujayralari bilan solishtirganda (2A-rasm); Bundan tashqari, hujayralarni morfologik tekshirish 50 mkM birikma 1, 2 yoki 3 bilan ishlov berish tirik hujayralar nisbatining bevosita ko'rsatkichi bo'lgan binafsha rangli formazan kristallarining shakllanishini kuchaytirganligini aniqladi (3-rasm). Aksincha, CCK-8 tahlili shuni ko'rsatdiki, 12,5, 25 va 50 mkM 1, 2 yoki 3 birikmasi (1, 85,5% va 75,5%, 45,1% va 43,7%) bilan davolashdan keyin hujayra hayotiyligi sezilarli darajada pasaygan. 51,8% va 2-aralashma uchun 34,3% va 3-aralashma uchun mos ravishda 64,5%, 48,2% va 36,4% p <0,05), nazorat hujayralari bilan solishtirganda (2B-rasm); 4-birikma MTT yoki CCK-8 tahlilida hujayra hayotiyligiga ta'sir qilmadi. Ikkala tahlil bilan olingan natijalar o'rtasidagi nomuvofiqlik shuni ko'rsatadiki, ikkita tahlildan biri EA.hy926 hujayra hayotiyligiga 1 va 2 birikmalarining ta'sirini to'g'ri aks ettirmasligi mumkin.

2.3. Hoechst tomonidan apoptozni baholash

Hoechst 33342 binoni ultrabinafsha nurlar ta'sirida qo'zg'atiladigan va 460 dan 490 nm gacha bo'lgan ko'k lyuminestsentni chiqaradigan hujayra o'tkazuvchan DNK dog'idir. Apoptotik hujayralarning kondensatsiyalangan kromatini normal hujayralar xromatiniga qaraganda yorqinroq bo'yaladi [6]. Nazorat hujayralari bir xil tarqalgan xromatin, normal organellalar va buzilmagan hujayra membranalarini namoyish qilgan bo'lsa, 50 mkM 1, 2 yoki 3 birikmalari bilan 48 soat davomida inkubatsiya qilingan hujayralar apoptotik hujayralarning odatiy bo'yalishini ko'rsatdi (4A-rasm). Aksincha, hujayralarga 50 mkM 4 birikmasiga ta'sir qilish nazorat bilan solishtirganda apoptotik yadrolar sonini ko'paytirmadi.

2.4. Apoptotik hujayralarning oqim sitometrik tahlili

Anneksin V-FITC / PI ikki marta bo'yash tahlili apoptoz hujayralarini apoptozga uchragan hujayralarda tashqi ko'rinishga ega bo'lgan fosfatidilseringa anneksin V-FITCning yuqori darajada bog'lanishi orqali aniqlaydi [7]. Ushbu tahlilda tirik hujayralar na anneksin, na PI bilan bog'lanmaydi va shuning uchun bo'yalmaydi (pastki chap kvadrant), erta apoptotik hujayralar aneksin V-FITC (pastki o'ng kvadrant) va kech apoptotik hujayralar bilan yashil rangga bo'yalgan. Aneksin V-FITC ning mos ravishda fosfatidilserin va PI ning nekrotik hujayralar bilan bog'lanishi natijasida yashil va qizil rangga bo'yalgan (yuqori o'ng kvadrant). 4B-rasmda ko'rsatilganidek, 50 mkM birikmalar 1, 2 yoki 3 bilan 48 soat davomida inkubatsiya qilingan hujayralar, apoptotik hujayralar ulushi mos ravishda 3,74% dan (nazorat hujayralari) 10,32%, 12,95% va 11,30% gacha ko'tarildi. Nazorat hujayralari bilan solishtirganda, 4 birikmasi apoptotik EA.hy926 hujayralarining foizini oshirmadi.

CCK-8 tahlili va Hoechst 33342 bo'yalishi bilan olingan natijalarga mos keluvchi oqim sitometriyasi tahlili 1, 2 va 3 birikmalari EA.hy926 hujayralarida apoptozni keltirib chiqarishini ko'rsatdi. Umuman olganda, bu kuzatishlar shuni ko'rsatadiki, 1-3 birikmalari bilan davolashdan keyin MTT tahlili bilan kuzatilgan EA.hy926 hujayra hayotiyligining oshishi noto'g'ri-ijobiy natijani ko'rsatdi.

Immunitetni oshirish uchun NATURAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Munozara

1983 yilda Mosmann hujayra proliferatsiyasi va sitotoksikligini o'lchash uchun kolorimetrik MTT mikroplata tahlilini ishlab chiqdi [8]. Ushbu oddiy tahlil va uning modifikatsiyalari hozir butun dunyo bo'ylab hujayra biologiyasi laboratoriyalarida keng qo'llaniladi. Sutemizuvchilar hujayralarida fraksiyalanish tadqiqotlari shuni ko'rsatdiki, kamaytirilgan piridin nukleotid kofaktori NADH MTTning ko'p qisqarishi uchun javobgardir. Bu butun hujayralar yordamida olib borilgan tadqiqotlar tomonidan qo'llab-quvvatlandi [9]. Shuning uchun MTT qisqarishi metabolik faol hujayralar bilan bog'liq bo'lib, nafaqat mitoxondrial nafas olish, balki sitoplazma va mitoxondriyal bo'lmagan membranalar, shu jumladan endosoma/lizosoma bo'limi va plazma membranasi bilan ham bog'lanadi [10]. MTT molekulasidagi aniq musbat zaryad uning plazma membranasi potentsiali orqali hujayra o'zlashtirilishi uchun asosiy omil hisoblanadi.

Shunisi e'tiborga loyiqki, MTT tahlili vaqti-vaqti bilan tekshirilgan birikmaning ma'lum hujayralarga ta'sirini aniq aks ettirmasligi mumkin. Biroq, MTT tahlilida qarama-qarshi natijalarga olib kelishi mumkin bo'lgan kimyoviy tuzilmalar yoki guruhlar aniqlanmagan. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, MTT tahlili yashil choyda eng ko'p bo'lgan polifenol bo'lgan (−)-epigallokatexin-3-gallatning antiproliferativ ta'sirini kam baholay oladi [11]. O'simta kimyoviy sezgirligini aniqlash uchun MTT tahlilidan foydalangan holda, epirubitsin, paklitaksel, dosetaksel va imatinib mesilat (Gleevec) kabi saratonga qarshi kimyoterapevtik vositalar hujayra hayotiyligini oshirdi [12,13]. Bundan tashqari, bir nechta tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ba'zi o'simlik ekstraktlari va redoks-aktiv polifenollar MTT tahliliga xalaqit berishi mumkin, chunki ular hujayralar bo'lmaganda MTT tetrazolium tuzini to'g'ridan-to'g'ri kamaytiradi [14].

Mikroplata o'quvchida spektrofotometrik tahlil qilishdan oldin MTT formazan kristallarini eritish zarurati va reaktsiyaning o'ziga xos so'nggi nuqtasi MTT tahlilini ma'lum ilovalar uchun ishlatishni cheklaydi. Bu tetrazolium analoglarining rivojlanishiga olib keldi, unda fenil qismlari manfiy zaryadlangan sulfonat guruhlari bilan bezatilgan, masalan, 2,{1}}bis-(2-metoksi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazolium-5-karboksanilid (XTT), manfiy zaryadlangan ichki tuz [15] va 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS), MTT bilan chambarchas bog'liq bo'lgan zaif kislotali ichki tuz [16] . Ushbu o'zgartirishlar natijasida madaniy muhitda eriydigan formazan mahsulotlari ishlab chiqarildi, bu miqdorni aniqlashdan oldin eritish bosqichi talabini yo'q qildi. Shunga mos ravishda, bu molekulalardagi manfiy zaryadning oshishi ularning hujayra membranalari [17] boʻylab harakatlanish qobiliyatini pasaytirganligi sababli, oraliq elektron qabul qiluvchilar (IEA), masalan, 1-metoksi-5-metilfenazin metil sulfat ({{25) }}metoksi PMS) tetrazol bo'yog'ini kamaytirishni osonlashtirish yoki pasayish tezligini oshirish uchun talab qilingan.

Yaqinda suvda eruvchan tetrazoliy tuzlarining yangi avlodi ishlab chiqildi, ularning WST-1 prototipi [18]. WST-1, yod qoldig'ini o'z ichiga olgan manfiy zaryadlangan disulfonatlangan ichki tuz, 1-metoksi PMS mavjudligida XTT va MTSga qaraganda barqarorroq, bu majburiy IEA. Bu WST-1/1-metoksi PMS ning qulay yagona reagent hujayra proliferatsiyasi to'plami sifatida marketingiga olib keldi. WST turkumidagi yana bir qancha tetrazolium tuzlari ishlab chiqilgan bo'lib, ulardan eng foydalisi WST-8 [19]. WST-8 WST-1 ga juda o'xshash hujayralarni qisqartirish xususiyatlariga ega va CCK-8 tahlili sifatida mustaqil ravishda sotilmoqda. WST-8 hujayra o'tkazmaydi va shuning uchun hujayra ichidagi NADH dan plazma membranasi orqali 1-metoksi PMS vositachiligida elektronlarni WSTga-8 o'tkazish orqali hujayradan tashqarida kamayadi. MTT va WST-8/1-metoksi PMSni kamaytirish hujayra ichidagi NADH tomonidan boshqarilsa ham, NADH manbai bu ikki usulda farq qiladi. WST-8/1-metoksi PMS kamayishi mitoxondrial trikarboksilik kislota sikli-NADH ni ekstramitoxondrial bo'shliq bilan bog'laydigan malat/aspartat tashuvchisiga ko'proq bog'liqdir [20].

Dastlabki tajribalarda biz 1, 2, 3 va 4 birikmalari MTT tetrazolium tuzini bevosita kamaytira olmasligini tasdiqladik (ko'rsatilmagan). Ushbu tadqiqotda ishlab chiqaruvchining protokollarida ko'rsatilganidek, MTT yoki CCK{5}} eritmasini qo'shishdan oldin mikroplastinkalarni fosfat-buferli fiziologik eritma (PBS) bilan ehtiyotkorlik bilan yuvish orqali aralashmalarning reagentga bevosita ta'siri bartaraf etildi. Shunga qaramay, ikkala usul yordamida olingan natijalar hali ham bir-biriga zid edi (2-rasm). Kutilganidek, hujayralarni 1, 2 va 3 birikmalari bilan inkubatsiya qilish nazorat guruhiga nisbatan tetrazolium tuzining binafsha formazanga qisqarishini oshirdi (3-rasm), bu ma'lum bir birikma ishtirokida tetrazolium tuzini shunchaki kamaytirishni ko'rsatadi. birikmaning MTT tahliliga aralashish qobiliyatini baholash uchun etarli emas.

1, 2, 3 va 4 birikmalari EA.hy926 hujayralarida apoptozni keltirib chiqarishi mumkinligini aniqlash uchun hujayra morfologik o'zgarishlari va fosfatidilserinning tashqi ko'rinishi baholandi. CCK-8 tahlili bilan kuzatilgan hujayra hayotiyligining pasayishiga mos ravishda, V-FITC/PI annexin yordamida Hoechstning bo'yalishi va oqim sitometriyasi tahlili natijalari shuni ko'rsatdiki, 1, 2 va 3 birikmalari bilan davolashdan keyin kuzatilgan o'sishning inhibisyonu hech bo'lmaganda qisman EA.hy926 hujayra apoptoziga bog'liq. Bizning natijalarimiz, shuningdek, 1 va 2 birikmalarida mavjud bo'lgan kofeyl guruhi MTT tahlili bilan olingan qarama-qarshi natijalar uchun javobgar bo'lgan degan fikrni qo'llab-quvvatladi.

Bizning topilmalarimizga o'xshab, kuchli katta o'tkazuvchanlik kaliy kanalini ochuvchi Rottlerin in vitro MTTga nisbatan reaktivlikni ko'rsatmadi. Shu bilan birga, u hujayralar ichida formazan kristallarining shakllanishini kuchli kuchaytirdi, natijada NF-kB ning Rottlerin inhibisyonu va DNKga [3H]-timidin qo'shilishi tahlili natijasida kuzatilgan hujayra proliferatsiyasi bilan aniq ziddiyatli edi [21]. Rottlerinning MTT qisqarishini kuchaytirish mexanizmi uning mitoxondrial ajralish ta'siri bilan bog'liq edi [22]. Rottlerin tarkibida sinnamoil kislota o'rnini bosuvchi guruh mavjud. Sinnamoil kislotasi bilan solishtirganda, 3 birikma C-3 va C-4 da joylashgan ikkita qoʻshimcha gidroksil qoldiqlariga ega. Shu sababli, biz 1 va 2 birikmalarining MTT tahlilida qarama-qarshi natijalarga olib keladigan mexanizmi ularning mitoxondrial ajralish ta'siri bilan ham bog'liq bo'lishi mumkinligini taxmin qilamiz. Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun 1 va 2 birikmalari va triflorokarbonilsiyanid fenilgidrazon (FCCP) kabi kimyoviy ajratuvchi o'rtasida qiyosiy tadqiqotlar o'tkazish kerak.

 JINSIY FUNKSIYANI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Eksperimental bo'lim

3.1. Reaktivlar va kimyoviy moddalar

Murakkab 3 (kofein kislotasi – kukun, tozaligi=98,6%) Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd.dan (Chengdu, Xitoy) xarid qilingan. 4-birikma (3,{6}}dihidroksifeniletanol-moy, tozaligi=98,5%) Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Xitoy) dan olingan. MTT va dimetil sulfoksid (DMSO) Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSh) olingan. CCK-8 tahlili Dojin Laboratories (Kumamoto, Yaponiya) dan xarid qilingan. Hoechst 33342 va annexin V-FITC/PI apoptozni aniqlash to'plamlari Beyotime Biotexnologiya institutidan (Xaymen, Xitoy) sotib olingan.

3.2. O'simlik moddasi

C. tubulosapoyalari Xitoyning Shinjon-Uyg‘ur avtonom rayoni, Yutyan prefekturasidan yig‘ilgan. Vaucher namunalari Uchinchi harbiy tibbiyot universiteti (Chongqing, Xitoy) yuqori balandlikdagi tibbiyotning asosiy laboratoriyasiga saqlangan va Chengdu an'anaviy xitoy tibbiyot universitetidan (Chengdu, Xitoy) Yi Chjan tomonidan tasdiqlangan.

3.3. O'simlik materialining ekstraktsiyasi va izolyatsiyasi

Havoda quritilgan C. tubulosa (0,6 kg) poyalari kukunga aylantirildi va 50% etanol bilan 70 daraja haroratda 2 soat davomida ekstrakt qilindi. Past bosim ostida erituvchini olib tashlangandan so'ng, etanolik ekstrakt (212,5 g) eritildi va suvda (2 L) to'xtatildi va n-butanol (2 L × 3) bilan ekstraksiya qilindi. N-butanol ekstrakti (110 g) poliamid ustunida xromatografdan o'tkazildi va etanol/suv (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) bilan elut qilindi va besh fraksiya (A-E) hosil bo'ldi. . B fraksiyasi (65 g) ODS ustunida fraksiyalangan; etanol bilan elutsiya: suv (1:9) ajratilgan birikma 1 (3 g). D fraksiyasi (10,5 g) ODS ustunida fraksiyalangan; etanol/suv (1:4) bilan ajratilgan 2 birikma (1 g) bilan elutsiya.

NMR spektrlari Bruker Avance 600 spektrometrida CD3ODda ichki standart sifatida tetrametilsilan (TMS) bilan qayd etilgan. Mass spektrlari BioTOF-Q massa spektrometrida o'tkazildi.

3.4. Hujayra madaniyati

EA.hy926 hujayra liniyalari American Type Culture Collection (Manassas, VA, AQSh) dan olingan. Hujayralar RPMI 1640 muhitida 10% (v/v) homila sigir zardobida va 1% (h/v) penitsillin-streptomitsin bilan 37 darajada 5% CO2 bilan namlangan muhitda ekilgan.

3.5. Hujayra hayotiyligi

Hujayra hayotiyligi MTT va CCK{0}} tahlillari yordamida baholandi. 1 va 2 birikmalar va ularning aglikonlari, kofein kislotasi (3) va 34-dihidroksifeniletanol (4) DMSO da DMSO ning yakuniy konsentratsiyasi <0,1% (v/v) ga qadar madaniy muhitda eritildi.

EA.hy926 xujayralari 96-quduq plitalariga 4 × 103 hujayra/quduqqa ekilgan. 24 soat davomida inkubatsiyadan so'ng hujayralar 24 soat davomida 6,25-50 mkM 1, 2, 3 yoki 4 birikmasi bilan ishlov berildi. Madaniyat muhiti olib tashlandi va hujayralar fosfat tamponlangan sho'r suv (PBS) bilan ikki marta yuvildi. 100 mkl muhitni o'z ichiga olgan har bir quduqqa MTT eritmasining (5 mg·mL-1) alikvotlari (10 mL) qo'shildi va hujayralar bilan 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Inkubatsiyadan so'ng, vosita olib tashlandi va formazan kristallarini eritish uchun har bir quduqqa 150 mkL DMSO alikotlari qo'shildi. Absorbsiya 490 nm da mikroplata o'quvchi (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, AQSh) yordamida o'lchandi. Hujayra hayotiyligi MTTni pasaytirish ulushi sifatida ifodalangan va nazorat hujayralarining absorbsiyasiga 100% qiymatini belgilashgan. Barcha tajribalar uch marta o'tkazildi va o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida taqdim etildi.

CCK{0}} tahlili biroz oʻzgartirishlar kiritilgan [23] adabiyotlardan soʻng oʻtkazildi. Xususan, hujayralar 24 soat davomida 6,25–50 mkM birikmalar 1, 2, 3 yoki 4 bilan ishlov berildi va 10 mkl CCK-8 eritmasi va 100 mkl madaniy muhit qo‘shilishidan oldin ikki marta PBS bilan yuvildi. Mikroplastinkani 37 daraja haroratda 2 soat davomida inkubatsiya qilgandan so'ng, absorbans mikroplata o'quvchi yordamida 450 nm da o'lchandi. Hujayra hayotiyligi nazorat hujayralariga nisbatan tirik hujayralar ulushi sifatida ifodalangan (100%). Barcha tajribalar uch marta o'tkazildi va o'rtacha ± SD sifatida ifodalandi.

3.6. Hoechst 33342 binoni bo'yicha apoptozni baholash

Apoptotik morfologik o'zgarishlar Hoechst 33342 bo'yash orqali kuzatildi. Qisqacha aytganda, EA.hy926 xujayralari 48-quduq plitalari (2 × 104 hujayra/quduq) ustiga ekilgan va 37 darajada 48 soat davomida 50 mkM birikma 1, 2, 3 yoki 4 bilan ishlov berilgan, ikki marta PBS bilan yuvilgan, va xona haroratida 15 daqiqa davomida 4% (v/v) paraformaldegid bilan mahkamlanadi. PBS bilan ikki marta yuvilgandan so'ng, hujayralar xona haroratida 5 daqiqa davomida Hoechst 33342 (10 ug · mL-1) bilan bo'yalgan va ikki marta PBS bilan yuvilgan. Hoechst bilan bo'yalgan yadrolar lyuminestsent mikroskop (Olimp, Tokio, Yaponiya) yordamida tasvirlangan.

3.7. Oqim sitometriyasi orqali apoptoz tahlili

Apoptotik hujayralar anneksin V-FITC / PI ikki marta bo'yash va oqim sitometriyasi tahlili bilan aniqlandi. Qisqacha aytganda, 48 soat davomida 50 mkM birikma 1, 2, 3 yoki 4 bilan ishlov berilgandan so'ng, hujayralar yig'ilib, PBSda 1 × 105 hujayra · ml-1 da qayta suspenziya qilindi. 500 × g da 5 daqiqa davomida 25 gradusda santrifüj qilingandan so'ng, 195 mkL anneksin V-FITC bog'lovchi bufer va 5 mL anneksin V-FITC qo'shildi. Yumshoq vorteks bilan aralashtirilgandan so'ng, aralash qorong'i joyda xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. 25 gradusda 5 minut davomida 500 × g santrifüjdan so'ng, 190 mkl FITC-konjugatsiyalangan anneksin V bog'lovchi bufer va 10 mkl PI qo'shildi. Yumshoq vorteks aralashtirishdan so'ng, namunalar 30 daqiqa ichida FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San-Xose, CA, AQSH) yordamida tahlil qilindi.

3.8. Statistik tahlil

Barcha eksperimental ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ifodalangan. Eksperimental namunalar va tegishli nazorat o'rtasidagi farqlarning ahamiyati SPSS dasturi (11.5-versiya) yordamida bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) orqali baholandi. Statistik ahamiyatlilik p < 0.05 da o'rnatildi.

4. Xulosalar

Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, MTT tahlilida kuzatilgan hayotiy hujayralar sonini haddan tashqari baholash ba'zi birikmalarning sitotoksikligini maskalashi mumkin. Shuning uchun, giyohvand moddalarni skrining jarayonlarida chalg'ituvchi natijalarga olib kelmaslik uchun maxsus birikmaning hujayra hayotiyligiga ta'sirini aniqlash uchun turli usullardan foydalanishni tavsiya etamiz (masalan, CCK-8 va 3 H-TdR tahlili).

TESTOSTERON sekretsiyasini rag'batlantirish uchun TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%