Ishige Okamuradan ajratilgan Ishofloroglyuksin A -MSH tomonidan qo'zg'atilgan melanogenezni bostiradi: In Vitro va In Vivo 2-qism

3. Munozara

sdasdad

IOE dan ajratilgan DPHC birikmasi allaqachon tirozinaz inhibitori haqida xabar bergan edifaollik va himoya ta'siriUV-B radiatsiyasidan kelib chiqqan hujayra shikastlanishiga qarshiin vitro[8]; ammo,melanogenezga qarshi ta'sirbilan o'zaro ta'sir qilish orqali silikodagi IOE dan olingan komponentlarningtirozinaza,in vivohayvonlar modellarida fenotip tadqiqotlarida va ularning asosiy molekulyar mexanizmlarida,hali tekshirilmagan. Ushbu tadqiqotda biz anti-melanogenez va tirozinazni aniqladikzebrafish umurtqali modelida IO va IOE dan ajratilgan florotannin IPA ning inhibitiv faoliyatiin vivo va in vitro B16F10 melanoma hujayralarida, bilan indüksiyondan keyin -MSH.

bilan davolash -MSH melanin sintezi va tirozinaz faolligini qo'zg'atishi ma'lum.20]. Bundan tashqari, tirozinaza melanogenez uchun zarur ekanligi isbotlangan.29]. Oldingi tadqiqotlarmolekulyar docking tirozinaza inhibitiv faolligini baholash uchun ishlatilishi mumkinligini ko'rsatdi.30,31]. Shunday qilib, IPA ning bog'lanish modelini tushunish uchun molekulyar docking hisob-kitoblari amalga oshirildiva DPHC, IO dan ajratilgan ma'lum polifenol bo'lib, u yuqori bog'lanish energiyasini aniqladiijobiy nazorat sifatida arbutinga qaraganda melanogenezga qarshi faollik. Natijalarga ko'ra (rasm1), IPA o'rnatishning eng past ko'rsatkichlarini aniqladi, bu IPA ning maqsad bilan o'zaro ta'sirini ko'rsatdiprotein tirozinaza boshqa ikkita birikma, DPHC va arbutinga qaraganda kuchliroq edi. Biroq,Qo'ziqorin tirozinaza faolligining inhibisyonu bilan hujayra faolligini bog'lashda cheklov mavjud.yetishtirilgan melanotsitlarda tirozinaza yoki melanin ishlab chiqarish32]. Shunday qilib, inhibitiv ta'sirIPA kunizebra baliqlarida tirozinaz faolligi va melanogenez tekshirildiin vivomodel va murin B16F10melanoma hujayralari.

Melanin pigmentlari zebrafish yuzasida to'planib, ularni mikroskopik kuzatish imkonini beradi.murakkab eksperimental protseduralarsiz pigmentatsiya jarayoni, ularni mos modelga aylantiradimelanogenez inhibitörlerini skrining uchun33,34]. Biz melaninning inhibitiv ta'sirini baholadikIPAtomonidan rag'batlantirilgan zebrafish lichinka modelida IOE va -MSH melanin tarkibini aniqlash orqali.Barcha sinovdan o'tgan namunalar chuqur inhibitiv ta'sir ko'rsatdihech qanday ahamiyatga ega bo'lmagan zebrafish pigmentatsiyasi bo'yichazaharliligi (S2-rasm). Inhibe qiluvchi ta'sirlarmorfologik tahlil qilish orqali pigmentatsiya kuzatildizebrafish lichinkalari turli bilan bog'liqmuolajalar (rasm2). Bundan tashqari, erta bosqichdagi lichinkalardan foydalanishkattalar bosqichi emas, balki teri osti ta'sirini tekshirishda yana bir afzallik beradidorivoryoki kosmetik aralashmalar [33,35]. Bunday holda, biz tanladik -MSH in vivo zebra baliqlarida ham induktor sifatidava B16F10 melanoma hujayralaridain vitro. Ikkala natijalarga ko'ra zebrafish embrionlari va B16F10melanoma hujayralari, melanin miqdori ortdi - MSH stimulyatsiyasi.

Melanin tarkibi tirozinaza faolligi va oqsil darajasi bilan bevosita bog'liq.36]. Shuning uchun,inhibitiv ta'sirlarni aniqladiktomonidan qo'zg'atilgan tirozinaz faolligi bo'yicha IPA va IOE - MSH yoqilganB16F10 hujayralari. Biz IPA bilan davolash qilingan guruhda tirozinaz faolligi va melaninning pasayishi borligini aniqladiktomonidan rag'batlantirilgan tarkib -MSH, taxminan 35 foiz tirozinaz faolligi va 40 foizga kamayishi bilanmelanin tarkibi (rasm4A, C). IOE tirozinazning faolligini dozaga bog'liq holda inhibe qildi vaB16F10 hujayralarida melanogenezni sezilarli darajada kamaytirdi (rasm4B, D). Arbutin, IPA va bilan solishtirgandaIOE sezilarli inhibitiv ta'sirga egamelanin ishlab chiqarish va tirozinaz faolligi bo'yichaoldingi molekulyar docking tadqiqotlari natijalari.

Inhibitor ta'sir mexanizmini o'rganishyoqilgan - MSH tomonidan qo'zg'atilgan melanin sintezihujayralar, Western blotting amalga oshirildi. Melanin bilan bog'liq oqsillarning ifoda darajalari, shu jumladanIPA yoki IOE bilan davolashdan keyin ERK, JNK va p38 baholandi. Faollashtirilgan fosforlanishERK ning ubiquitin-proteazomaga bog'liq yo'l orqali MITF degradatsiyasiga yordam berishi mumkin.28]. Bu potentsial melanogenez inhibitörleri melanin sintezini rag'batlantirish orqali bostirishi mumkinligini ko'rsatadiERK signalizatsiyasining faollashuvi bilan bog'liq bo'lgan MITF ning proteasomal degradatsiyasiyo'llar [37]. ERK, JNK va p38 MAPKlar MAPK oilasiga tegishli [38–40]. Bunga qo'chimcha,p38 MAPK yo'lining faollashuvi natijasida MITF ifodasi [41]. Ushbu tadqiqotda Western blotTahlil shuni ko'rsatdiki, IPA p-JNK va p-p38 ni targ'ib qiladi (rasm5B, C). Bundan farqli o'laroq, p-ERK darajalariIPA va IOE davolash bilan o'zgarmadi (rasm5A). Ushbu natijalar inhibitiv ta'sir ko'rsatadiIPA va IOE ning tirozinaz faolligi va melanogenez bo'yicha JNK va p38 bilan bog'liq bo'lishi mumkin.signalizatsiya yo'llari.

4. Materiallar va usullar

4.1. Kimyoviy moddalar va reagentlar

Dimetilsulfoksid (DMSO), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT),L-DOPA, alfa-melanotsitlarni ogohlantiruvchi gormon ( -MSH) va fosfat-buferlangansho'r suv (PBS)Sigma-Aldrich Chemical Co.dan (Sent-Luis, MO, AQSH) xarid qilingan. Dulbecco o'zgartirilganBurgut muhiti (DMEM) va homila sigir zardobi (FBS) Invitrogen-Gibco dan olingan.(Grand-Aylend, NY, AQSh). Hujayradan tashqari signal bilan boshqariladigan kinaz (ERK1/2), fosforlangan ERK1/2 (p-ERK1/2), c-Jun N-terminal kinaz (JNK), fosforlangan JNK (p-JNK), p38, fosforlanganp38 (p-p38), cAMP javob elementini bog'lovchi oqsil (CREB), fosforlangan CREB (p-CREB),mikroftalmiya bilan bog'liq transkripsiya omili (MITF), tirozinaz bilan bog'liq protein-1 (Trp-2),tirozinaza bilan bog'liq protein-1 (Trp-1), tirozinaza (TYR), sichqoncha va quyonga qarshi IgG antikorlariCell Signaling Technology kompaniyasidan (Beverli, MA, AQSh) xarid qilingan. Boshqa barcha reagentlar, shu jumladan -MSH, Sigma-Aldrich Chemical Co.dan sotib olingan.

4.2. Tirozinazning molekulyar birikishi

Docking tadqiqoti uchun tirozinazning kristall tuzilishi (PDB: 3NM8) olingan.Protein ma'lumotlar banki. Docking tadqiqotlari CDOCKER yordamida amalga oshirildiAccelrys Discovery Studio 3 da.0 (Accelrys, Inc., San-Diego, CA, AQSH). Qachon butun nukleotidketma-ketlik retseptorlari tarmog'i bilan qoplangan, ligandlar eng yaxshi o'rnatish pozitsiyasini tanlash uchun taxmin qilinadi [42]. O'rnatish tartibi avvalgi tadqiqotda aytib o'tilgan. Qisqacha aytganda, uchta qadam bajarildi: (1)2D strukturani 3D strukturaga aylantirish; (2) to'lovlarni hisoblash; va (3) qo'shilishivodorod atomlarini moslashuvchan ulash dasturidan [31,43].

4.3. IOE ni tayyorlash va IPA izolyatsiyasi

IO 2018 yil iyun oyida Koreyaning Jeju orolining sharqiy qirg'og'ida yig'ib olindi. Yosun ikki marta yuvilganyuzasiga biriktirilgan tuz, epifitlar va qumni olib tashlash uchun musluk suvi bilan. Keyinchalik, ehtiyotkorlik bilantoza suv bilan yuviladi va tibbiy muzlatgichda saqlanadi−20 ◦C. Shundan so'ng, muzlatilganalg ekstraksiyadan oldin maydalagich bilan liyofillangan va gomogenlashtirilgan. IOE 50 foizda qazib olindietanol (v/v, suvda) xona haroratida 24 soat davomida aralashtiriladi, keyin filtrlanadi. filtratekstrakti dekompressiya ostida konsentrlangan va muzlatilgan quritilgan kukun (IOE). 50% etanolIO ekstrakti Shinwoo Co. Ltd. tomonidan amalga oshirildi (lot № SW9E29SA, Gyeonggi-do, Koreya). IPA ediYuqorida tavsiflanganidek IOE dan ajratilgan [9]. Qisqacha aytganda, IOE santrifüj yordamida fraktsiyalanganbo'linish xromatografiyasi. Barcha fraktsiyalar yig'ildi va IPA oxir-oqibat a tomonidan tozalandiyarim tayyor HPLC ustuni (YMC-Pack ODS-A, 10 mm, 250 mm, 5 m). IPA sifatida belgilandipolifenol va uning kimyoviy tuzilishi (S1-rasm, qo'shimcha materiallar) LC orqali aniqlandi/XONIMmassa bilan tahlil qilishm/z ning 992.1315, bu C ning molekulyar formulasini ko'rsatadi96H66O48 (1986.26hisoblangan molekulyar og'irlik,∆0.6, [M − 2H] 2−).

4.4. Ota-ona zebrafishlarining kelib chiqishi va parvarishi

Voyaga yetgan zebrafish savdo dilerdan (Seul akvariumi, Seul, Koreya) va 10 tadan olingan.baliqlar 3-L akril idishda 28,5 da saqlangan◦C, 14:10 soat yorug'lik bilan: qorong'u tsikl. Zebrafish edikuniga ikki marta, 6 kun davomida ovqatlantiriladi⁄hafta, qo'shimcha Tetramin yormasi oziq-ovqat bilan (SEWHAPET Food Co.,Seul, Koreya). Embrionlar 30 daqiqa ichida tabiiy urug'lantirish yo'li bilan yig'ilib, ertalab induktsiya qilinganchiroqni yoqish orqali. Zebrafish tajribasi Hayvonlarga g'amxo'rlik va foydalanishdan ruxsat oldiJeju Milliy Universiteti qo'mitasi (Tasdiqlash raqami: 2017-0001).

4.5. Zebrafish lichinkalarida melanin miqdorini o'lchash

IPA va IOE va stimulyator -MSH kontsentratsiyasi ta'sirlarni tekshirish uchun ishlatilganningembrion rivojlanishiga e'tibor. Har biriga o'n beshta zebrafish embrioni (3-4 hpf) ekilgan1,9 ml embrion muhitni o'z ichiga olgan 12-quduq ekish plastinkasida. Sinov namunalari eritildi1 foiz DMSO da 1 bilan× PBS va yaxshilab aralashtiriladi. Har kuni ertalab birinchi 5 pdf uchun yashovchan embrionlar ediomon qolish chorasini olish uchun sanab o'tilgan. Melanin tarkibini aniqlash uchun embrionlar7–9 hpf har bir quduqda 30 tadan embrion bo'lgan 6-quduq plastinkasiga 2.7-ml embrion muhitga ekildi.3 kundan keyin lichinkalar ikki marta 1 bilan yuviladi× Har qanday qoldiq reagentlarni olib tashlash uchun PBS yokizarralar va shunga o'xshash miqdordagi lichinkalar elektron naychalarga joylashtirildi. Melaninni o'lchashdan oldintarkibi, har bir guruhning bir nechta lichinkalari mikroskop bilan ushlangan va qolganlari santrifüj qilingan.

Santrifüjdan so'ng pellet 1 ml 1 N NaOHda 90 ° C da eritildi.◦C 60 daqiqa davomida. Aralashkeyin melanin pigmentini eritish uchun kuchli vortekslangan. Supernatantning so'rilishi490 nm da o'lchandi. Natija bitta deb hisoblangan nazorat bilan solishtirildiyuz. Melanin tarkibi protein miqdori bo'yicha sozlangan va kuzatishlar takrorlanganuch nusxada.

4.6. B16F10 hujayralarida IPA va IOE ning sitoksisitesi

B16F10 sichqonchaning melanoma hujayralari ATCC (Amerika tipidagi madaniyat to'plami,) dan olingan.Manassas, VA, AQSH). B16F10 hujayralari 100 U bilan to'ldirilgan DMEMda o'stirildi/ml penitsillin,100 µg/ml streptomitsin va 10 foiz FBS. Keyin hujayralar 5 foiz CO li atmosferada inkubatsiya qilindi2 da37 ◦C va keyin har 3-5 kunda subkultura qilingan. B16F10 ga qarshi IPA va IOE ning sitotoksikligihujayralar kolorimetrik MTT tahlili orqali tekshirildi. Qisqacha aytganda, hujayralar 24-quduq plastinkalariga a

konsentratsiyasi 2× 104hujayralar/ml. Ekishdan taxminan 16 soat o'tgach, hujayralar IPA va IOE bilan inkubatsiya qilindiboshqacha72 soat davomida kontsentratsiyaga erishildi va ularning hayotiyligi aniqlandi.

4.7. Hujayradagi melanin tarkibini aniqlash

Hujayradagi melanin miqdori yuqorida tavsiflangan usul yordamida o'lchandi.33]. Hujayralar(2 × 104 hujayralar/ml) 72 soat davomida IPA va IOE ning turli konsentratsiyasi bilan inkubatsiya qilindi; shuning uchun,ular muzdek sovuq PBSda yuvilgan. Qisqacha aytganda, hujayralar 80 da inkubatsiya qilindi◦C 1 ml 1 N dan 1 soat davomidaNaOH/10 foiz DMSO va keyin melaninni eritish uchun vortekslangan: absorbans o'lchangan450 nm. Tekshirishda inhibisyonun optik zichligi 100 foiz deb qabul qilindi. Ma'lumotlaro'rtacha foizlar shaklida taqdim etilgan va natijalar uch nusxada takrorlangan.