Rivojlanayotgan buyrakda etuklik bosqichlarini molekulyar aniqlash
Feb 20, 2022
ANTRACTIldiz hujayra biologiyasidagi so'nggi yutuqlar ularni yaratishga imkon berdi buyrakorganoidlar in vitro va bu organoidlarning keyingi etukligi eksperimental transplantatsiyadan keyin kuzatiladi. Biroq, hozirgi organoidlar etuk bo'lib qolmoqda va ularning aniq etilish bosqichlarini aniqlash qiyin, chunki rivojlanish bosqichiga bog'liq bo'lgan gen ifodalari to'g'risidagi ma'lumotlar cheklangan.buyrakin vivo. Tegishli molekulyar koordinatalarni o'rnatish uchun biz bir hujayrali RNK ketma-ketligini (scRNA-seq) ishlab chiqdik.buyraklarsichqonchaning turli bosqichlarida. Embrionning 15,5 kuni bilan solishtirganda tug'ilishda yuqori regulyatsiyani ko'rsatadigan genlarni, shuningdek, hujayra avlodiga xos ifodani tanlab, biz individual hujayra nasllarining rivojlanish bosqichlari bilan bog'liq genlar ro'yxatini yaratdik. Ushbu ro'yxatlarni transplantatsiya qilingan embrionga qo'llashbuyraklar yig'uvchi kanallardan tashqari ko'pgina hujayra turlari ham xuddi shunday kamolotga ega ekanligini aniqladibuyraklarneonatal bosqichda in vivo, hujayra avlodlari bo'ylab sinxron bo'lmagan kamolotni ochib beradi. Shunday qilib, bizning scRNA-seq ma'lumotlarimiz rivojlanayotganlarning etukligini baholash uchun foydali molekulyar koordinatalar bo'lib xizmat qilishi mumkin.buyraklarva oxir-oqibatbuyrakorganoidlar.
Kalit so‘zlar:Buyrak rivojlanishi, bir hujayrali RNK ketma-ketligi, etuklik, in situ gibridizatsiya, buyrak
KirishThebuyrakkamida ikki turdagi prekursorlardan kelib chiqadi: nefron progenitors va ureterik kurtak (Costantini va Kopan, 2010). Nefron ajdodlari, shu jumladan glomerulyarpodotsitlar, proksimal kanalchalar, Henle halqalari (LOH) va distal kanalchalarni o'z ichiga olgan, setonefron beradi, siydik pufagi esa to'plovchi kanallar va siydik yo'llarini hosil qilish uchun keng tarqaladi (Kobayashietal., 2008) (Maroseetal, 2008) siydik yo'lini hosil qiladi. oqim. Nefron ajdodlari va siydik yo'llari kurtaklari embrional kun (E) 11,5 sichqoncha atrofida o'zaro ta'sirini boshlaydilar. E15,5 da umumiy nefron segmentlari aniqlangan, ammo nefron progenitatorlaridan yangi nefronlar hosil bo'lishda davom etmoqda. Glomerulyar vaskulyarizatsiyadan so'ng siydik E16.5-E17.5 da oqib chiqa boshlaydi (Rasouly va Lu, 2013). Shu bilan birga, ichki (medullar) mintaqasibuyrakcho'ziladi, LOH va yig'uvchi kanallarning cho'zilishini aks ettiradi. Ushbu medullar mintaqaning rivojlanishi tug'ilgan kundan keyin davom etadi (P0), nefron progenitatorlari esa o'z-o'zini yangilashni to'xtatadi va tug'ilgandan keyin bir necha kun ichida yo'qoladi (Hartmanet boshq., 2007) (Rumballe va boshq., 2011) ( Volovelskiy va boshqalar, 2018).
Ildiz hujayra biologiyasidagi so'nggi yutuqlar ularni yaratishga imkon berdibuyrakorganoidlar in vitro (Morizane va boshq., 2015; Taguchi va boshq., 2014; Takasato va boshq., 2015). Biz ilgari yaratganmizbuyrakpluripotent ildiz hujayralaridan organoidlar: sichqonning embrion ildiz hujayralari (ESC) va inson tomonidan qo'zg'atilgan pluripotentstemcells (iPSCs) (Taguchietal, 2014). Biroq, in vitro organoidlar etuk bo'lmagan bosqichlarda qolishi aniq bo'lib, unga ekvivalent.buyraklarsichqonlarda taxminan E14.5-E15.5 va insoniy homiladorlikning 10-14 xaftasida (Taguchi va Nishinakamura, 2017; Takasatoet boshq., 2015; Wu va boshq., 2018). Biz va boshqalar ham eksperimental transplantatsiya usullarini ishlab chiqdikbuyrakorganoidlarni immunitet tanqisligi bo'lgan sichqonlarga kiritib, organoid vaskulyarizatsiyaga va mezbon qon aylanishiga ulanishga imkon beradi (Bantounas va boshq., 2018; Sharmin va boshq., 2016; Subramanian va boshq., 2019; Tanigawa va boshq., 2018; van den Berg va boshq., 2018). Transplantatsiyadan so'ng organoidlar ichidagi glomerulyar podotsitlar filtratsiya funktsiyasi bilan bog'liq bo'lgan etuk morfologik xususiyatlarga ega bo'ladi, bu, ehtimol, kislorod bilan ta'minlash va/yoki qon tomir endotelial hujayralari bilan o'zaro ta'sir qilish natijasida yuzaga keladi. Aniq mexanizmlar hal qilinmagan bo'lsa-da, organoidlarning pishib etishini rag'batlantirish uchun transplantatsiya ko'pincha qo'llaniladi. ildiz hujayra biologiyasining tadqiqot sohasi.
Ushbu yutuqlarga qaramay, etilish bosqichlarini aniq aniqlash molekulyar koordinatalarning yo'qligi, ya'ni rivojlanish bosqichiga bog'liq bo'lgan keng qamrovli ma'lumotli gen ekspressiyasi tufayli qiyin.buyrak.Hozirda bu koordinatalar sichqon embrioni uchun ham mavjud emasbuyraklarin vivo. Bu holat asosan hujayralar sonining ko'payishi tufayli yuzaga keladibuyrakrivojlanish, har bir hujayra turida oz miqdorda hujayralar mavjud. Ko'p sonli bir hil hujayralarni talab qiladigan an'anaviy gen ekspresyon tahlillari heterojen etilish uchun mos emas.buyraklar.GUDMAP ma'lumotlar bazasi (www.gudmap.org) rivojlanayotgan genlarning ko'p sonli ekspression tahlillarini to'plagan.buyrak, shu jumladan jami ba'zilaribuyraklarva ba'zilari saralangan yoki mikrodisseksiyalangan hujayralarda (McMahon va boshq., 2008). Biroq, hatto
oxirgi tahlillar ko'pincha ko'p bosqichli hujayralarni o'z ichiga oladi va shuning uchun ma'lumotlar etuklik tahlillari uchun bevosita foydalanilmaydi. Yagona hujayrali RNK ketma-ketligi (scRNA-seq) tahlili murakkab va heterojen organlarda, jumladan, gen ifodalarini tekshirish imkonini berdi.buyrak, va bu ma'lumotlarning ba'zilari GUDMAP ma'lumotlar bazasiga saqlangan (Adam va boshq., 2017a; Combes va boshq., 2019a, 2019b; Lindstr€ om va boshq., 2018; Magella va boshqalar, 2017; Ransick va boshq. , 2019; Wanget boshq., 2018; Wu va boshq., 2018). Biroq, ushbu oldingi tadqiqotlarning aksariyati embrion yoki kattalarni tahlil qildibuyraklarbitta vaqt nuqtasi, yoki solishtiring
jonlibuyraklarin vitro bilanbuyrakorganoidlar. Shunday qilib, bir nechta tadqiqotlar ko'rib chiqildibuyrakCheklangan hujayra turi uchun homiladorlikning o'rtalaridan tug'ilishgacha etuklik (Chen va boshq., 2015). uchun molekulyar koordinatalarni o'rnatishbuyrakUshbu tadqiqotda kamolotga erishish uchun biz sichqonchani ishlab chiqishda scRNA-seq qildikbuyraklarturli bosqichlarda va tanlangan etuklikka bog'liq genlar. Biz ko'chirib o'tkazilgan embrion buyraklarning etuklik holatini RNK-seq ma'lumotlarini va etilishga bog'liq genlarning ifodalarini solishtirish orqali baholadik. Bizning RNK-seq ma'lumotlarimiz va tanlangan genlar ro'yxati rivojlanayotganlarning etukligi uchun mos yozuvlar vositasi bo'lib xizmat qiladibuyraklarva oxir-oqibatbuyrakorganoidlar.
Natijalar
Rivojlanayotgan buyraklarning scRNA-seq tahliliBiz sichqonchani ishlab chiqishda scRNA-seqni amalga oshirdikbuyraklaruch xil bosqichda: E15.5, E17.5 va P0. Har bir hujayrada mos ravishda 4,493, 2,360 va 2467 gen bo'lgan o'rtacha ko'rsatkichlar bilan yuqori sifatli ma'lumotlar olindi. Seurat v3.1.1 (Butler va boshq., 2018; Stuart va boshq., 2019a) yordamida ma'lumotlarni tahlil qilgandan so'ng, hujayralar 45 ta klasterga bo'lindi, ularda P0 da ko'proq qattiq klasterlar mavjud. E15.5 da (1A-rasm). Biz hujayra turiga xos belgilardan foydalangan holda ko'pchilik klasterlar uchun hujayra turlarini aniqladik: nefron progenitors (Six2+, klasterlar 0, 1 va 10), glomerulyar podotsitlar (Nphs1+, klasterlar 8 va 11), glomerulyar parietal epitelial hujayralar (Claudin111) )þ, klaster 20), proksimal kanalchalar (S1 segmenti: Erigan moddalar tashuvchisi oilasi (Slc) 5a2þ, klasterlar 15 va 31; S2 segmenti: Slc5a2?/Slc34a1þ, 13 va 6-klasterlar; S3 segmenti: Aquaporin 1 (Aq1)a3/Sc1 (Li va boshq., 2015; Ransick va boshq., 2019), 37-klaster), LOH (ingichka tushuvchi a'zo: Aqp1þ/Slc39a8þ (Lee va boshq., 2015; Ransick va boshq., 2019), 27-qalin ko'tarilish; a'zolar: Uromodulin (Umod)þ/Slc12a1þ, 28 va 17-klasterlar), distal kanalchalar (Slc12a3þ, 5-klaster), siydik yo'llarining kurtaklari uchlari (Retþ, 22 va 35-klasterlar) va yig'uvchi kanal poyalari (Aqp2s2,6,) 41) (1B-rasm, S1A-rasm). Interkalatsiyalangan hujayralar yig'uvchi kanal klasterlaridan (Atp6v1g3þ, klaster 39) ajratilgan klaster hosil qildi (1B-rasm). Interstitsial hujayralar bir nechta klasterlarga (7, 9, 12, 14, 23, 29, 30, 33 va 34) tasniflangan, ular orasida 9/33, 12 va 34 klasterlar stromal progenitatorlarni ifodalashi mumkin (Foxd1+ (Kobayashi va boshq.). , 2014)), mezangial hujayralar (Nt5eþ) va renin ishlab chiqaruvchi hujayralar (Ren1þ) (rasm S1B). Endotelial hujayralar klasterlari (Pecam1+, klasterlar 3, 19, 24, 25 va 32) Ehd3+ hujayralarini (klaster 32, S1C-rasm) o'z ichiga oladi, bu ehtimol glomerulyar endotelial hujayralarni ifodalaydi (Patrakka va boshq., 2007). Shunday qilib, eng yaqin qo'shnilarni klasterlash uchun integratsiya langarlaridan foydalanadigan Seurat v3.1.1 (Stuartet boshq., 2019b) ko'plab hujayra turlarini muvaffaqiyatli tasnifladi.buyraklarturli rivojlanish bosqichlarida.
Transkripsiya omili ifodalarida vaqtinchalik o'zgarishlar va rivojlanish signalizatsiya faoliyati davomidabuyraketuklik
Nefron ajdodlari uchta klasterga bo'lingan (S1D-rasm): klaster 0 tarkibida Six2þ/Cited1þ naif hujayralar, 10-klasterda Six2þ/Cited1þ/Top2a þ ko'payuvchi naif hujayralar va 1-klasterda Six2þ/Cited{2þ/C mavjud }/Wnt4þ astarlangan hujayralar (Boyle va boshq., 2008; Kobayashiet boshq., 2008; Self va boshq., 2006). Nefron segmentining spetsifikatsiyasi paytida nefron progenitori populyatsiyasi birinchi navbatda Mafb þ podotsit shoxini hosil qildi,
oxir-oqibat Nphs1+ podotsitlarga differensiallashgan (1B va 2A-rasm). Proksimal kanalchalar va LOH / distal kanalchalar uchun shoxlar podotsit shoxchasidan alohida hosil bo'ladi. Proksimaltubulalar uchun prekursor hujayralar
Osr2 va keyin Hnf4a transkripsiya faktor genlarini ifodaladi (2B-rasm), ikkinchisi proksimal kanalchalarda kamolotga bog'liq genlarni tartibga soladi (Deacon va boshq., 2019; Marable va boshqalar, 2018, 2020; Martovetskiy
va boshq., 2013). LOH / distal tubulalar uchun umumiy prekursor hujayralar Pou3f3 (Nakai va boshq., 2003) va Sim1 ni ifodalagan, keyinchalik LOH va distal tubulalar spetsifikatsiyasidan so'ng Sim2 va Gata3 ning keyingi ifodasi bilan ifodalangan (2C-rasm). Yaqinda distal nefron rivojlanishi uchun muhim bo'lgan Tfap2b (Marneros, 2020) LOH va distal tubulalarda ham aniqlangan (S1E-rasm). Shunday qilib, transkripsiya omili ifodalarida vaqtinchalik siljishlar davomida individual nefron segmentlarida sodir bo'ladibuyrakyetilish va shoxlarning periferik uchlaridagi klasterlar (5,6, 8, 17, 31 va 37-klasterlar) har bir naslning eng etuk bosqichini ifodalaydi.
Rivojlanish signallari nuqtai nazaridan, WNT signalizatsiya yo'lining faolligi ko'rsatkichi Axin2, asosan, ilgari xabar qilinganidek, rivojlanayotgan distal tubulalarda aniqlangan (Jho va boshq., 2002). Fgf8 va Etv4, an
FGF signalizatsiya faolligi ko'rsatkichi (Maoetal., 2009), distal tubulalarning rivojlanishida ham ifodalangan, ammo etuk bo'lmagan bosqich bilan cheklangan. Aksincha, Bmp7 (Oxburgh va boshq., 2005) distal tubulalarda ham etuk, ham etuk bosqichlarda, shuningdek podotsitlarda ifodalangan, Bmp4 (Miyazaki va boshq., 2000) esa asosan proksimal tubulalarda aniqlangan. Shuningdek, biz asosiy signalizatsiya yo'llarining faoliyati pasayganligini ta'kidladik.
ko'pchilik nefron segmentlarida etuk hujayralarda tartibga solinadi. Misol uchun, Axin2 (WNTsignalingindicator) va Etv4 (FGFsignalingindicator) etuk podotsitlarda, proksimal va distal kanalchalarda yo'q edi (2D-rasm). Xuddi shu tendentsiya Hey1 (Notch signalizatsiya ko'rsatkichi) uchun kuzatildi, Hes1 esa faqat podotsitlar va proksimal tubulalarda pastga tushirildi (2E-rasm). BMP signalizatsiya ko'rsatkichi, Id1 (Korchynskyi va Ten Dijke, 2002; L? opez-Rovira va boshqalar, 2002), etuk podotsitlar va distal tubulalarda kamaydi (2F-rasm). Shunday qilib, nefron segmentiga xos rivojlanish signalizatsiyasining faollashuvi, so'ngra pastga regulyatsiya paytida kuzatiladi.buyraketuklik.
Alohida hujayra avlodlari uchun rivojlanish bosqichiga bog'liq genlar ro'yxati
Bizning scRNA-seq tahlilimiz shuni ko'rsatdiki, ba'zi o'rnatilgan nasl-nasab bilan cheklangan differentsiatsiya belgilarini ifodalovchi UMAP klasterlari allaqachon E15.5 da mavjud edi (1B-rasm). Alohida nefronsegmentlar uchun bosqichga bog'liq genlarni aniqlash uchun biz birinchi navbatda har bir naslning eng etuk klasterlarida E15.5 va P0 o'rtasidagi gen ifodalarini solishtirdik va E15 bilan solishtirganda P0da sezilarli darajada yuqori yoki pastga regulyatsiya qilingan genlarni tanladik. 5. Biroq, biz ushbu ro'yxatlarga issiqlik zarbasi oqsili genlari, Jun/Fos oilasi genlari va Gadd45 genlari (Adam va boshq., 2017a) kabi hujayra stressi bilan bog'liq genlarni o'z ichiga olganligini aniqladik. P0 uchun ishlatiladigan qattiqroq hujayra dissotsiatsiya jarayonlaribuyraklar. Because these genes were ubiquitously expressed, it was difficult to discriminate them from maturation-dependent genes that were ubiquitously expressed. Thus, we decided to select cell-type specific genes and picked up the upregulated or downregulated genes in the corresponding clusters between the two stages. Most of the upregulated genes at P0 showed consistent results in UMAP plots, while the downregulated genes showed less prominent differences between the two stages. In addition, the downregulated genes were detected in more immature cell clusters at P0, reflecting the repetitive differentiation processes from nephron progenitors. Therefore, we decided to focus on the upregulated genes (fold change, >2.5) va har bir nomzod genini UMAP uchastkalari asosida fazoviy-vaqt ifodasi uchun tuzatdi. Yakuniy tanlangan genlarning skripka chizmalari o'zlarining bosqichga bog'liq ifodalarini alohida hujayra avlodlarida ko'rsatdi (3A-rasm, S2, S3, S4A, S1-jadval). Nuqtali chizmalar ularning hujayra turiga xos ifodalarini tasdiqladi (3B-rasm), garchi proksimal tubulalarning S2 segmenti uchun tanlangan ko'plab genlar S1 va S3 segmentlarida ham ifodalangan. Ushbu tanlangan genlar ro'yxatiga podotsitlar uchun kollagen turi 4 alfa3 zanjiri (Col4a3) va Semaphorin (Sema) 3g, Slc5a12 (laktat tashuvchisi) va Sitokrom P450 oilasi (Cyp) 27b1 (D vitamini alfa gidroksilazasi), proksimal tubulglar va E proksimal tubulglar kiradi. LOH uchun retseptor 3 (Ptger3), yig'ish kanallari uchun Aqp2 va Aqp3 va siydik yo'llarining kurtaklari uchlari uchun Lipocalin2 (Lcn2). Genlarning aksariyati allaqachon E17.5 da yuqoriga ko'tarilgan
va P0 bilan taqqoslanadigan ifoda darajalarini ko'rsatdi, bu E15.5 va E17.5 orasida sezilarli kamolotga erishish mumkinligini ko'rsatdi. Biz distal kanalchalar uchun faqat bir nechta genlarni aniqladik (jadval S1), chunki bu hujayra naslidagi yuqori tartibga solingan genlarning aksariyati yig'ish kanallarida ham ifodalangan. Birgalikda, rivojlanayotganlarning scRNA-seq tahlilibuyraklarko'p etuklik bosqichlarida ko'pchilik nefron segmentlarida bosqichga bog'liq va naslga xos genlarni aniqlash imkonini berdi.
Vakil genlarning bosqichga bog'liq gen ifodalarini gistologik tekshirish
Gistologik tekshiruv orqali genlar ro'yxatining haqiqiyligini tasdiqlash uchun biz tanlangan genlarning E15.5 va P0 ifodalarini aniqladik.buyraklaran'anaviy digoksigeninga asoslangan in situ gibridizatsiya yoki juda sezgir RNKscope texnologiyasi (Vang va boshq., 2012). In situ gibridizatsiya va ayniqsa RNAscope texnologiyasi signalni keng ko'lamli kuchaytirishni o'z ichiga olganligi sababli, genlarni ifodalash darajasidagi nozik farqlarni aniqlash dargumon. Shunday qilib, biz E15.5 da minimal ifodani ko'rsatgan va UMAP uchastkalarida P0 da bitta nasl bilan cheklangan genlarni tanladik. Bunday genlar, shuningdek, gistologik bo'limlar yordamida etuklik bosqichlarini iqtisodiy jihatdan samarali baholash uchun foydali bo'ladi. Podositlarda tekshirilgan barcha to'rtta gen (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) P0 da osongina aniqlangan va ularning E15.5 da ifodalanish darajalari P0dagidan pastroq edi (4A-rasm). ). Aksincha, Nphs1 ikki bosqichda taqqoslanadigan ifodani ko'rsatdi (4A-rasm). Proksimal tubulalarda uchta gen (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) E15.5 da zaif yoki minimal signallarni va P0 da kuchli ifodani ko'rsatdi (4B-rasm), Slc34a1 esa har ikki bosqichda ham taqqoslanadigan ifodani ko'rsatdi (4B-rasm). Slc12a1 ning nisbatan doimiy ifodasidan farqli o'laroq, LOH (Umod, Ptger3, Car15) da uchta genning bosqichga bog'liq ifodalari tasdiqlangan (5A-rasm). Shuningdek, biz yig'ish kanallarida uchta gen (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) uchun in situ gibridizatsiyasini amalga oshirdik va ularning bosqichga bog'liq ifodalarini tasdiqladik (5B-rasm). Bular orasida Aqp2 va Cdkn2b kanal poyalarini yig'ishda ifodalangan, Lcn2 esa uretericbudtipsda aniqlangan. Aksincha, Retand Wnt7b nisbatan doimiy ifoda darajalarini ko'rsatdi (5B-rasm). In situ gibridizatsiya ma'lumotlari UMAP uchastkalari bilan mos edi, bu bizning scRNA-seq ma'lumotlarimizning ishonchliligini qo'llab-quvvatladi.
Vakil genlarning bosqichga bog'liq gen ifodalarini gistologik tekshirish
Gistologik tekshiruv orqali genlar ro'yxatining haqiqiyligini tasdiqlash uchun biz tanlangan genlarning E15.5 va P0 ifodalarini aniqladik.buyraklaran'anaviy digoksigeninga asoslangan in situ gibridizatsiya yoki juda sezgir RNKscope texnologiyasi (Vang va boshq., 2012). In situ gibridizatsiya va ayniqsa RNAscope texnologiyasi signalni keng ko'lamli kuchaytirishni o'z ichiga olganligi sababli, genlarni ifodalash darajasidagi nozik farqlarni aniqlash dargumon. Shunday qilib, biz E15.5 da minimal ifodani ko'rsatgan va UMAP uchastkalarida P0 da bitta nasl bilan cheklangan genlarni tanladik. Bunday genlar gistologik bo'limlar yordamida kamolotga etish bosqichlarini iqtisodiy jihatdan samarali baholash uchun ham foydali bo'ladi. Podositlarda tekshirilgan barcha to'rtta gen (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) P0 da osongina aniqlangan va ularning E15.5 da ifodalanish darajalari P0dagidan pastroq edi (4A-rasm). ). Aksincha, Nphs1 ikki bosqichda taqqoslanadigan ifodani ko'rsatdi (4A-rasm). Proksimal tubulalarda uchta gen (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) E15.5 da zaif yoki minimal signallarni va P0 da kuchli ifodani ko'rsatdi (4B-rasm), Slc34a1 esa har ikki bosqichda ham taqqoslanadigan ifodani ko'rsatdi (4B-rasm). Slc12a1 ning nisbatan doimiy ifodasidan farqli o'laroq, LOH (Umod, Ptger3, Car15) da uchta genning bosqichga bog'liq ifodalari tasdiqlangan (5A-rasm). Shuningdek, biz yig'ish kanallarida uchta gen (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) uchun in situ gibridizatsiyasini amalga oshirdik va ularning bosqichga bog'liq ifodalarini tasdiqladik (5B-rasm). Bular orasida Aqp2 va Cdkn2b kanal poyalarini yig'ishda ifodalangan, Lcn2 esa uretericbudtipsda aniqlangan. Aksincha, Retand Wnt7b nisbatan doimiy ifoda darajalarini ko'rsatdi (5B-rasm). In situ gibridizatsiya ma'lumotlari UMAP uchastkalari bilan mos edi, bu bizning scRNA-seq ma'lumotlarimizning ishonchliligini qo'llab-quvvatladi.
Transplantatsiya qilingan embrion buyraklar neonatal bosqichga yaqin etuklikni ko'rsatadi
Transplantatsiya qilinganligini aniqlash uchunbuyraklarfiziologik etuklik jarayonini kuzatdik, biz embrion sichqonchasi yordamida transplantatsiya tajribalarini o'tkazdikbuyraklardonor to'qimalar sifatida. Chunki transplantatsiya
izolyatsiya qilingan embrionbuyraklarsiydik yo'llarining noto'g'ri ulanishi natijasida yuzaga kelishi mumkin bo'lgan gidronefrozga sabab bo'lgan (S5A-rasm), biz siydik oqimini potentsial ravishda saqlaydigan ilgari xabar qilingan protokoldan foydalandik (Yokote va boshq., 2015). Buning uchun biz E12.5 ko'chirib o'tkazdikbuyraklarqovuqning kashshofi kloaka bilan bog'langan, kattalar sichqonlarining epididimis yog'iga kiradi (6A-rasm). Transplantatsiya qilinganidan keyin 12 kun ichida yig'ib olingandabuyraklarhajmi kattalashgan (3,29 ? 0,35 mm 2 ga nisbatan 0,23 ? 0.02 mm 2, n¼ 3, p < 0,05) va siydik pufagida aniqlangan (6A-rasm), bu siydik pufagi orqali siydik oqimini ko'rsatadi.buyrak -siydik pufagi aloqasi saqlanib qoldi. Gistologik tahlil shuni ko'rsatdiki, buyrak medullasi kortikomedulyar naqsh bilan shakllangan (6A-rasm). Hujayra turiga xos belgilarni bo'yash LTL+ proksimal kanalchalari, SLC12A1+ LOH va KRT8+ siydik kurtaklarining umumiy taqsimoti saqlanib qolganligini ko'rsatdi (6B-rasm) va NPHS1+ podotsitlari bo'lgan glomerullar PECAM1+ endotel5B hujayralari bilan tomirlanganligini ko'rsatdi. , bu embrion buyraklarning in vitro madaniyatida kamdan-kam kuzatiladi (Halt va boshq., 2016). Keyinchalik, transplantatsiya qilingan embrionning scRNA-seq tahlilini o'tkazdikbuyraklarva ma'lumotlarni in vivo embrion buyraklardan olingan ma'lumotlar bilan solishtirdi. Transplantatsiya qilingan buyraklarning UMAP uchastkalari in vivo jonli neonatal buyraklarga o'xshash klaster naqshlarini ko'rsatdi (6C-rasm), lekin nefron progenitatorlari va siydik yo'llarining kurtaklari uchlarini ifodalovchi klasterlar transplantatsiya qilingan buyraklarda yo'q edi (6C-rasm, S5C-rasm va). D). Nefrogen bo'shliqning kutilmagan tarzda kamayishi sababi noma'lum bo'lib qolsa-da, bu keyingi bo'limda muhokama qilganimizdek, in vivo jonli buyraklar bilan solishtirganda transplantatsiya qilingan buyraklarning kichikroq hajmini tushuntirishi mumkin. Shunga qaramay, boshqa hujayra populyatsiyalari neonatal bosqichda buyraklardagiga o'xshash naqshlarga to'plangan (6C-rasm). Transplantatsiya qilingan buyraklardagi podotsitlar va proksimal kanalchalardagi ko'pchilik kamolotga bog'liq genlarning ifoda darajalari P0 buyraklardagi bilan solishtirish mumkin edi (6D-rasm, S6-rasm, S2-jadval). Biroq, yig'ish kanallaridagi ko'plab genlar P{{10}} buyraklardagiga qaraganda pastroq darajada ifodalangan, jumladan, Cdkn2b (6D-rasm, S6-rasm, S2-jadval). Bundan farqli o'laroq, Aqp2 va Aqp3 ifodalari P0 buyraklardagi bilan taqqoslanadigan darajada saqlanib qoldi (6D-rasm). Bundan tashqari, in vivo jonli ravishda P{23}} da tushirilgan Wnt9b va Hoxd3 ko'chirilgan buyraklarda yuqori bo'lib qoldi (S4A-rasm), Shunday qilib, transplantatsiya qilingan buyraklardagi yig'ish kanallari buyraklarga qaraganda ancha etukroq bo'lishi mumkin edi. P0. Shunga o'xshash tendentsiya, ozroq bo'lsa-da, LOHda kuzatildi (6D-rasm, S6-rasm). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, kamolot barcha hujayra avlodlarida sinxron ravishda sodir bo'lmaydi.
MunozaraOrganlarning kamolotga yetishi psixik rivojlanishning eng muhim jihatlaridan biridir. Ildiz hujayrabiologiyasida transplantatsiya ko'pincha pluripotent ildiz hujayralaridan olingan organoidlarning, shu jumladanbuyrakorganoidlar. Biroq, kamolotga erishish uchun molekulyar koordinatalar yo'qligi sababli, etuklik bosqichlarini aniq aniqlash qiyin. Shunday qilib, biz sichqon embrionining scRNA-seq tahlilini o'tkazdikbuyraklarRivojlanishning turli bosqichlarida, bu embrionning etuklikda bosqichga bog'liq ifodasini ko'rsatadigan genlarni aniqlashga imkon berdi.buyraklar. Ushbu ma'lumotni transplantatsiya qilingan embrion buyraklardagi scRNA-seq ma'lumotlariga qo'llash orqali biz transplantatsiyadan keyingi kamolotga etish jarayoni neonatal bosqichga yaqin, lekin hujayra avlodlari bo'ylab sinxron bo'lmaganligini aniqladik. Ommaviy ketma-ketlikdan farqli o'laroq, scRNA-seq har bir hujayra nasl-nasabining eng etuk fraksiyalarida gen ifodalarini baholashga muvaffaq bo'ldi, bu esa rivojlanayotgan buyraklardagi mos keladigan subpopulyatsiyalar bilan, shuningdek, transplantatsiya qilingan bemorlarda aniq taqqoslash imkonini berdi.buyraks. Bosqichga bog'liq ifodalar uchun tanlangan gen ro'yxatlari individual nasllarning etilish bosqichlarini baholash uchun molekulyar koordinatalar sifatida ishlashi isbotlangan. Postnatal buyraklar va kattalar buyraklarida scRNA seq ma'lumotlarini qo'shish kamolotni baholash uchun qo'shimcha foydali resurslarni yaratadi.
Oldindan mavjud ma'lumotlar to'plamlari yordamida shunga o'xshash natijalarga erishish mumkinligini aniqlash uchun biz E14.5 va P1 da chop etilgan scRNA-seq ma'lumotlarini qayta tahlil qildik.buyraklar(Adam va boshq., 2017a; Magella va boshq., 2017). Biroq, UMAP uchastkalari P1 da ko'pgina hujayra turlarining etuk populyatsiyalarini ifodalovchi klasterlar E14.5 ma'lumotlarida yo'qligini ko'rsatdi (S7A va B-rasmlar), bu bizga genlar ifodasini solishtirishga xalaqit berdi.
ikki bosqich o'rtasida mos keladigan klasterlar. Istisno faqat siydik yo'llarining kurtaklari edi. Ret þ klasterlari ikkala bosqichda ham aniqlandi va Lcn2 P1 da (S7C-rasm) yuqoriga ko'tarildi, bu bizning natijalarimizga mos keladi. Shunday qilib, ilgari mavjud bo'lgan ma'lumotlar cheklangan foydalanishga ega bo'lib, ushbu tadqiqotda scRNA-seq ma'lumotlari va gen ro'yxatlarining muhimligini ta'kidladi. Biz ko'chirilgan podotsitlar va proksimal tubulalarni ko'rsatdikbuyraklarneonatal bosqichga yaqin pishgan, yig'ish kanallari esa nisbatan etuk bo'lmagan. Yig'ish kanallarining pishib etish buzilishining asosiy sabablari hali ham aniqlanmagan. Siydik chiqarish orqali yuzaga keladigan jismoniy kuchning kamayishi mumkin bo'lgan sabablardan biri bo'lishi mumkin, chunki yig'ish kanallari siydik yo'llarining eng past oqimida joylashgan. Biz embrionni transplantatsiya qildikbuyraklarIzolyatsiya qilingan buyraklarni an'anaviy transplantatsiya qilish bilan solishtirganda siydik oqimini yaxshiroq saqlash maqsadida kloaka bilan (S5-rasm). Shu bilan birga, siydik oqimi nefron segmentlarining pastki qismining kamolotini rag'batlantirish uchun etarli bo'lmagan bo'lishi mumkin. Shu bilan bir qatorda, yig'ish kanallari siydik pufagidan teskari oqim tufayli mexanik shikastlangan bo'lishi mumkin, ammo tahlil paytida aniq gidroureter yoki gidroefroz kuzatilmagan. Xost siydik pufagi bilan donordan olingan siydik pufagining keyingi ulanishi
6-rasm. Transplantatsiya qilinganlarning etukligibuyraklarneonatal bosqichga yaqin. (A) E12.5 ning to'liq o'rnatilgan ko'rinishibuyraktransplantatsiyadan oldin kloaka bilan (0 kun). Transplantatsiyadan keyin 12-kuni yig'ib olingan siydik pufagi bilan transplantatsiya qilingan buyrakning gematoksilin va eozin bilan bo'yalishi bilan butun montaj va gistologik tahlil. Qizil o'q: siydik pufagida siydik mavjudligi. O'lchov paneli: 500 m m. B) Immunitetni mustahkamlashbuyraktransplantatsiyadan keyingi 12-kuni proksimal tubulalar (LTL: yashil), Henle halqalari (SLC12A1: qizil) va yig'ish kanallari (KRT8: kulrang) uchun markerlar bilan. Masshtab satri: 200 m m. (C) in vivo embrion buyraklarning UMAP uchastkalari (E15.5 va P0) va transplantatsiya qilingan embrion buyraklar (transplantatsiyadan keyingi 12-kun). Ok: nefron progenitori (NP); strelka uchi: ureter kurtak uchi (UB). POD: podotsit; PEC: glomerulyar parietal epiteliya hujayrasi; DN: farqlovchi nefron; PT: proksimal tubula; LOH: Henle halqasi; DT: distal tubula; CD: yig'ish kanali; CD-IC: yig'ish kanalining interkalatsiyalangan hujayrasi; TUSHUNARLI; interstitsial hujayra; EK: endotelial hujayra; UT: siydik chiqarish yo'llari; BC: qon hujayrasi. (D) Transplantatsiya qilinganda bosqichga bog'liq genlarning skripka syujetlaribuyraklarin vivo embrion buyraklar bilan solishtirganda (E15.5 va P0).
gidronefrozni inhibe qilgani va keyingi rivojlanishga yordam bergani xabar qilingan (Yokot va boshq., 2015), shuning uchun bunday transplantlarda bizning etuklik marker genlarining ifodalarini tahlil qilish ma'lumotli bo'ladi. Qo'shimcha tadqiqotlar zarur bo'lsa-da, bizning genlar ro'yxatlarimiz rivojlanishdagi individual nasllarning etuklik holatini baholash uchun foydali ekanligi isbotlangan.buyraklarshuningdek, transplantatsiya qilinganidabuyraklar. Bizning RNK-seq ma'lumotlarimiz, shuningdek, etuklik holatini baholash uchun foydali koordinatalar bo'lib xizmat qiladibuyrakpluripotent ildiz hujayralaridan olingan organoidlar. Hozirgi buyrak organoidlari embrion bosqichlarida bo'lganlarni ifodalaydi (Taguchi va Nishinakamura, 2017; Takasato va boshq., 2015; Wu va boshq., 2018) va kasallikni modellashtirish va oxir-oqibat transplantatsiya qilinadigan buyraklarni yaratish uchun keyingi etuklik talab etiladi. Hozirgi vaqtda organoidlarning etilish bosqichlarini o'lchash uchun bir nechta usullar mavjud, morfologik tahlillar bundan mustasno. Shunday qilib, bizning natijalarimiz organoid kamolotini molekulyar aniqlash uchun asos bo'lib xizmat qiladi. An'anaviy bo'lsa-dabuyrakorganoidlar asosan nefronlardan (glomeruli vabuyraktubulalar), biz yaqinda siydik yo'llarining kurtaklari uchlari atrofida taqsimlangan nefronlari bo'lgan shox-shabbali ureter kurtaklarini o'z ichiga olgan yuqori darajadagi buyrak tuzilmalarining paydo bo'lishi haqida xabar berdik (Taguchi va Nishinakamura, 2017). Biz bunga sichqonchaning ESC-dan olingan nefron progenitatorlari va siydik yo'llari kurtaklarini embrion stroma progenittorlari bilan birlashtirish orqali erishdik va yaqin kelajakda organotipik hosil qilish nazariy jihatdan mumkin bo'lishi kerak.buyraktuzilmalar faqat sichqonchaning ESC-laridan va oxir-oqibat inson iPSC-laridan. Shunday qilib, keyingi qadam organoidlarni keyingi pishib etish uchun transplantatsiya qilishdir. Bizning scRNA-seq ma'lumotlarimiz transplantatsiya qilingan organoidlarning etilish bosqichlarini baholash uchun foydali mos yozuvlar vositasi bo'lib xizmat qiladi.
Transplantatsiya qilinganda nefrojenik joyning kamayishibuyraklarkutilmagan edi. Ushbu tadqiqotning asosiy ko'lami kamolotga qaratilgan bo'lmasa-da, bu kamayishi in vivo jonli buyraklar bilan solishtirganda transplantatsiya qilingan buyraklarning kichikroq hajmini tushuntirishi mumkin. Sichqonlardagi nefron nasl-nasabi tug'ilgandan bir necha kun o'tgach, tug'ilgan nefronlarni keltirib chiqarishda davom etadi (Hartman va boshq., 2007; Rumballe va boshq., 2011; Volovelskiy.
va boshq., 2018) va nefron progenitatorlarining muddatidan oldin tugashi kichikroq o'lchamdagi buyraklarga olib keladi (Kanda va boshq., 2014; Self va boshq., 2006). Transplantatsiyada qaysi parvarishlash omillari etishmayotganligini aniqlash kerakbuyraklarva nefron nasl-nasablarining yo'qolishi yoki siydik yo'llari kurtaklari uchlari bu hodisaning asosiy sababidir. Ushbu jumboqlarni hal qilish oxir-oqibat transplantatsiya qilinganlarning o'sishiga olib keladibuyrakorganoidlar a
bilan solishtirish mumkin bo'lgan o'lchambuyraklarin vivo. Birgalikda biz scRNA-seq ma'lumotlarimiz va gen ro'yxatlarimiz embrion va transplantatsiya qilingan buyraklarning etuklik bosqichlarini baholash uchun molekulyar asos bo'lib xizmat qilishi mumkinligini va iPSC'lardan olingan buyrak organoidlariga qo'llanilishini ko'rsatdik. Garchi biz ushbu tadqiqotda nefron rivojlanishi va kamolotiga e'tibor qaratgan bo'lsak-da, scRNA-seq ma'lumotlarimizdan foydalangan holda stromal va endotelial hujayralar kabi boshqa nasllarni batafsil tahlil qilish bizga ko'proq ma'lumot beradi.buyraketuklik.
Materiallar va uslublar
scRNA-seq tahlillariBuyraklar ilgari tasvirlangan usuldan (Tanigawa va boshq., 2016) o'zgartirilgan protokol orqali ajratilgan va scRNA-seq tahlillari uchun ishlatilgan. C57BL / 6N sichqonlari (CLEA Japan Inc.) E15.5 va E17.5 tahlillari uchun ishlagan va Foxd1GFPCreER; tdTomato va Tbx18MerCreMer: C57BL/6N va ICR ning aralash genetik fonida tdTomato sichqonlari P0 tahlillari uchun ishlatilgan (Grisanti va boshq., 2013; Kobayashi va boshq., 2014). OltibuyraklarE15.5 da 10 daqiqa davomida 0.25 foiz tripsin/EDTAda hazm qilingan. E17.5 va P0 ayolbuyraklar were minced roughly with forceps, digested with dissociation buffer comprising 2 mg/ml collagenase (Sigma; Cat# 9407), 2.4 U/ml dispase (Gibco; Cat# 17105-041), 2 mM CaCl 2 (Wako; Cat# 031–00435), 50 μ g/ml DNase I (Sigma; Cat# 11284932001), and 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma; Cat# 172012) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Sigma; Cat# D5796) for 15 min at 37? C, washed with phosphate-buffered saline (PBS), and treated with 0.25% trypsin/EDTA for 10 min. Trypsin was inactivated by addition of DMEM/10%FCS containing50 μ g/mlDNaseI,andthecells werewashed with HEPES-buffered saline solution (Thermo; Cat# 14185-052) containing 2% FCS, 50 μ g/ml DNase I, 1 mM CaCl 2 , and 0.035% NaHCO 3 (Wako; Cat# 191–01305). Cells were resuspended in 0.04% BSA/PBS, filtered through a 40- μ m-pore strainer (Falcon; Cat# 352340), and evaluated for their cell number and viability (>90 foiz ) Countess avtomatlashtirilgan uyali hisoblagich yordamida (Thermo; Cat# C10227). E15.5 va E17.5 dan jami 5{17}} dissotsiatsiyalangan hujayra va P0 dan ikkita namuna (har bir namunaga 5{24}} hujayra) Chromium Controller (10x Genomika) ga qoʻllanildi. . Chromium Single Cell 3 0 Library & Gel Beads Kit v2 (10x Genomics) oligo-dT-astarlangan cDNK kutubxonalarini yaratish uchun ishlatilgan, keyinchalik ular Illumina HiSeq 3000 (E15.5 uchun 14 000 o'qish; 7000 o'qish) tomonidan ketma-ketlashtirilgan. E17.5 uchun; P0 uchun 14000 o'qish). Namunalarning Q30 asosiy RNK ko'rsatkichlari (ketma-ketlik sifatini ko'rsatuvchi Q-ballari) E15.5 uchun 86.2 foiz, E17.5 uchun 63.8 foiz va P0 uchun 93.6 foizni tashkil etdi.
Xom ketma-ketlik ma'lumotlari har bir gen uchun noyob molekulyar identifikatorlarni (UMI) hisoblash jadvallarini yaratish uchun Cell Ranger (versiya 3.0.2; 10x Genomics) ning hujayra ranger soni buyrug'i yordamida qayta ishlandi. har bir hujayra uchun. Birinchidan, bitta P0 namunasini yaratish uchun Cell Rangerning cell ranger aggr buyrug‘i yordamida ikkita P0 namunasini birlashtirdik. Ushbu nuqtada biz E15.5, E17.5 va P0 namunalari uchun mos ravishda har bir hujayra uchun 4,493, 2,360 va 2467 genlarning o'rtacha ko'rsatkichlari bilan 4,158, 5,551 va 10,810 hujayralarni oldik. Ushbu uchta alohida-alohida yaratilgan ma'lumotlar to'plami cell ranger agg buyrug'i yordamida birlashtirilgan. Barcha keyingi tahlillar R statistik dasturlash tilida (R Core Team, 2018) amalga oshirildi. Seurat to'plami (3.1.1 versiyasi) sifat nazorati, ma'lumotlarni normallashtirish, ma'lumotlarni masshtablash va vizualizatsiyani o'z ichiga olgan tahlillar uchun ishlatilgan (Butler va boshq., 2018) (Stuart va boshq., 2019a). Sifat nazorati uchun, ifodalangan hujayralar<200 genes,="">8000 genes (possibly representing doublets), or >Mitoxondriyal genlarning 20 foizi filtrlangan. Yakuniy ma'lumotlar to'plami mos ravishda E15.5, E17.5 va P0 namunalarida 20,672 gen va 3,441,4,592 va 8161 hujayradan iborat (jami: 16,194 hujayra). JackStrawPlot funktsiyasi (Chung va Storey, 2015) tomonidan aniqlangan o'lchov qiymati 74 bo'lgan o'lchamlarni kamaytirish uchun asosiy komponent tahlili ishlatilgan. Top 2000 ta yuqori oʻzgaruvchan genlar FindVariableFeatures funksiyasi tomonidan tanlab olindi va klasterlash uchun oʻlchovli maʼlumotlar bilan birgalikda foydalanildi. Klaster segmentatsiyasi 2.4 rezolyutsiya qiymati yordamida amalga oshirildi. FindClusters buyrug'i Seuratpackage-ning FindMarkers funksiyasi yordamida olingan klasterga xos marker genlari bilan osongina ajratiladigan jami 45 ta klasterni yaratdi. Cluster26, ehtimol, filtrlash parametrlaridan qochib qutulgan o'layotgan hujayralardan iborat bo'lgan, chunki unda o'ziga xos marker genlari va past genlar, past genlar, xususiyatlarning nisbatan kamligi. Yagona manifold yaqinlashuvi va o'lchamlarni kamaytirish uchun proyeksiya (UMAP) chizmalari uwot paketi yordamida yaratilgan (Becht va boshq., 2019). Olingan UMAP koordinatalari, Seurat klaster koordinatalari va klasterga xos belgilar Loupe Cell Browser dasturi (10x Genomics) yordamida tasdiqlash tahlili uchun csv fayllari sifatida eksport qilindi. scRNA-seq ma'lumotlari Milliy Biotexnologiya Axborot Gen Ekspresi Omnibus markaziga (GSE149134) saqlandi.
Rivojlanish bosqichiga bog'liq bo'lgan gen nomzodlarini tanlash
Har bir klasterda rivojlanish bosqichiga bog'liq bo'lgan gen nomzodlarini tanlash uchun biz FindMarkers funksiyasidan E15.5 bilan solishtirganda P0 da yuqori tartibga solingan genlarni tanlash uchun foydalandik (masalan, klaster o'rtasidagi taqqoslash).
8 at P0 and cluster 8 at E15.5 for podocytes). Subsequently, we utilized the AverageExpression function to add the average gene expression data for each cluster at each stage for stage-dependent comparisons (log-fold change >1 va p-qiymati<0.05). to="" determine="" segment-specific="" genes,="" we="" compared="" the="" target="" cluster="" with="" all="" other="" clusters="" at="" p0="" and="" selected="" the="" genes="" with="" low="" p-values="" (p="" <="" 0.05)="" and="" low="" expression="" rates="" in="" other="" clusters="" (pct2=""><0.11). after="" selecting="" the="" overlapping="" genes,="" we="" verified="" them="" in="" umap="" plots="" to="" finalize="" the="" lineage-specific="" stage-dependent="">
Immunogistokimyoviy tahlilParafin bo'laklari sitrat tamponida antigen olishdan o'tkazildi, PBS bilan uch marta yuvildi va xona haroratida 1 soat davomida PBSda 1 foiz BSA bilan inkubatsiya qilish orqali bloklandi. Keyin bo'limlar bir kechada 4 da asosiy antikorlar bilan inkubatsiya qilindi? C, so'ngra xona haroratida 90 daqiqa davomida Alexa Fluor bo'yoqlari bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya. Yadrolar 4,6-diamidino-2-fenilindol bilan bo'yalgan (Roche; Cat# 10236276001). Quyidagi asosiy antikorlardan foydalanilgan: biotinillangan LTL (Vector Laboratories; B-1325), quyonlarga qarshi anti-SLC12A1 (StressMarq Bioscience; SPC-401D), kalamush anti-KRT8 (Rivojlanish-aqliy tadqiqotlar gibridoma banki, Ayova universiteti; Troma-I), gvineya cho'chqasi anti-NPHS1 (Progen; GP-N2); va quyonga qarshi CD31 (Abcam; ab28364). Floresan tasvirlari LSM780 konfokal mikroskop (Karl Zeiss) yoki FV3000 konfokal mikroskop (Olympus) tomonidan olingan.
In situ gibridizatsiya10 foiz formalin bilan mahkamlangan kerosin bo'laklarining RNAscope tahlili RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 (ADC; Cat # 323100) yordamida amalga oshirildi. Signalni kuchaytirish TSA plus floroforlar (Thermo Fisher Scientific) bilan amalga oshirildi. RNAscope zondlarining tafsilotlari S3-jadvalda keltirilgan. Kapning digoksigenin asosida in situ gibridizatsiyasi ishlab chiqaruvchining protokollariga muvofiq avtomatlashtirilgan Discovery System (Roche) yordamida tavsiflanganidek (Kaku va boshq., 2013) amalga oshirildi. Kap probi maxsus primerlar yordamida PCR orqali klonlangan (jadval S3) va RNK polimeraza yordamida digoksigenin bilan etiketlangan. Har bir embrion bosqichida ikki-uch namunalar har bir zond uchun tekshirildi va izchil natijalarni ko'rsatdi.
Sichqoncha embrion buyraklarini transplantatsiya qilishC57BL / 6N homilador urg'ochi sichqonlar (E12.5) va kattalar erkak sichqonlari (8-12 hafta) CLEA Japan Inc.dan sotib olingan va ma'lum bir patogensiz hayvonlarga joylashtirilgan. Xost kattalar sichqonlari periton orqali anesteziya qilingan, tarkibida 0,75 mg/kg medetomidin, 4,{{10}} mg/kg midazolam va 5,{18}} mg bo‘lgan oddiy sho‘r eritmasi yuborilgan. /kg butorfanol. E12.5 da kloakaga ega sichqon embrion buyraklari mezbon sichqonlarning epididimis yog'iga ko'chirildi (Yokote va boshq., 2015). Jarrohlikdan so'ng atipamezol anestezik antagonist sifatida kiritildi. Transplantatsiya qilingan embrion buyraklar transplantatsiyadan keyin 12 kun ichida yig'ib olindi. ScRNA-seq tahlili uchun buyraklar P0 buyraklariga o'xshash tarzda ajratilgan. Hayvonlar ustida o‘tkazilgan barcha tajribalar bizning institutsional ko‘rsatmalarimizga muvofiq amalga oshirildi va Kumamoto universiteti Etika qo‘mitasi tomonidan tasdiqlangan (#A2019-113).
Hammaga ochiq scRNA-seq ma'lumotlarini qayta tahlil qilishE14.5 sichqon embrioni uchun scRNA-seq ma'lumotlaribuyrakva P1buyrak(Adam va boshq., 2017b; Magella va boshq., 2017) Gen ifodasi Omnibusidan yuklab olingan (mos ravishda kirish raqamlari, GSE94333 va GSE104396). Ushbu ma'lumotlarning keyingi barcha tahlillari R statistik dasturlash tilida (R Core Team, 2018) amalga oshirildi va Seurat to'plami (3.2.2 versiyasi) sifat nazorati, ma'lumotlarni normallashtirish, ma'lumotlarni masshtablash va tavsiflangan vizualizatsiya kabi tahlillar uchun ishlatilgan. 4.1-bo'limda.