Bu-Shen-Huo-Xue ekstraktining PC12 hujayralarida yuqori glyukoza sabab bo'lgan apoptozga qarshi neyroprotektiv ta'siri

Qo'shimcha ma'lumot uchun:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Chjao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Vu Zeng, Syue-Mey Vang

1 An'anaviy va G'arbiy tibbiyot integratsiyasi tadqiqot studiyasi, Birinchi kasalxona, Pekin universiteti, Pekin, Xitoy.

2Tabiiy va biomimetik dori vositalarining asosiy davlat laboratoriyasi, Farmatsevtika fanlari maktabi, Pekin universiteti, Pekin, Xitoy.

Eng muhimlar

Yuqori glyukoza (HG) bilan bog'liq neyrotoksiklik patologiyasi bilan bog'liqqandli diabetensefalopatiya (DE). Bizning tadqiqotimizda Bu-Shen-Huo-Xue ekstrakti (BSHX), poli o'simlik formulasineyroprotektivHG tomonidan qo'zg'atilgan PC12 hujayralaridagi faollik va mumkin bo'lgan mexanizmlar reaktiv kislorod turlarini (ROS) ishlab chiqarishni, shuningdek, mitoxondriya vositachiligidagi kaspaza va JNK / p38 MAPK signalizatsiya yo'llarini bostirish bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Ushbu tadqiqot klinik ilovalarda DE ni davolash uchun istiqbolli vositani taqdim etadi.

Cistanche ekstrakti foydalari va buyrak uchun Cistanche uchun bosing

Cistancheoziqlantiruvchi va himoya qila oladigan taniqli tonik o't hisoblanadibuyraklar. Xitoy an'anaviy tibbiyot nazariyasida,Cistancheuchun eng yaxshi o'simlik hisoblanadibuyraklar.CistancheEkinakozid, akteozid va flavonoidlarga boyCistanchekamaytirishi mumkinbuyrakhujayra apoptozi va kuchayishibuyrakhujayra proliferatsiyasi. Shuning uchun,Cistancheatabiiy buyrak qo'shimchasi.

Abstrakt

Maqsad: PC12 hujayralarida yuqori glyukoza (HG) keltirib chiqaradigan neyrotoksiklikka qarshi poli o'simlik formulasi bo'lgan Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) ekstraktining neyroprotektiv ta'sirini o'rganish. Usullari: Hujayra hayotiyligini tahlil qilish, laktat dehidrogenaza (LDH) tahlili, Reaktiv kislorod turlarini (ROS) aniqlash, Hoechst 33258, Akridin apelsin (AO)/Etidiy bromid (EB) qo‘sh dog‘i va mitoxondrial membrana salohiyati (MMP) tahlili o‘tkazildi. Bundan tashqari, Bax, Bcl-2, kaspaza-3, ajralgan kaspaza-3, PARP, ajralgan PARP, sitoxrom c va mitojen bilan faollashtirilgan oqsil kinazlari (MAPK) western blot orqali aniqlandi. Natijalar: BSHX ekstrakti hujayra hayotiyligini oshirdi va HG-induktsiyali PC12 hujayralarida kontsentratsiyaga bog'liq holda LDH oqishini kamaytirdi. Bundan tashqari, BSHX ekstrakti hujayra ichidagi ROS darajasini pasaytirdi, mitoxondriyal membrana potentsialini oshirdi, Bax va Bcl-2 ifodalarini tartibga soldi va mitoxondriyadan sitoxrom c ning chiqarilishini inhibe qildi. Bundan tashqari, BSHX ekstrakti kaspaza-3 va PARP faollashuvini susaytirdi va c-Jun N-terminal kinaz (JNK) va p38 MAPK fosforillanishini inhibe qildi. Xulosa: BSHX ekstrakti PC12 hujayralarida HG-induktsiyalangan apoptozga sezilarli neyroprotektiv ta'sir ko'rsatdi. Bu ta'sir ROS generatsiyasini, shuningdek, mitoxondriya vositachiligidagi kaspaza va JNK / p38 MAPK signalizatsiya yo'llarini bostirish bilan bog'liq bo'lishi mumkin.

Kalit so‘zlar:diabetik ensefalopatiya, an'anaviy xitoy tibbiyoti, Bu-Shen-Huo-Xue ekstrakti,neyroprotektiv, yuqori glyukoza

Qisqartirish: AO: akridin apelsin; BSHX: Bu-Shen-Xuo-Xue; DE: diabetik ensefalopatiya; DM: qandli diabet; DMSO: dimetil sulfoksid; EB: Etidium bromidi; ERK: hujayradan tashqari tartibga solinadigan protein kinazlari; HG: yuqori glyukoza; JNK: c-Jun N-terminal Kinaz; LDH: laktat dehidrogenaza; MAPKlar: mitojen bilan faollashtirilgan protein kinazlari; MWP: Wu-Zi-Yan-Zong retsepti; MTT: 3-[4, 5-Dimetiltiazol-2-il] 2, 5-difeniltetrazolium bromid; PBS: Fosfat tampon tuzi; PBST: Fosfat-buferli tuz, 0,1 foiz Tween 20; ROS: Reaktiv kislorod turlari; T2DM: 2-toifa qandli diabet; TCM: an'anaviy xitoy tibbiyoti

Fon

So'nggi yillarda diabetik ensefalopatiya (DE), diabetes mellitus (DM) ning markaziy asab tizimida (CNS) paydo bo'ladigan asoratlari keng e'tiborga sazovor bo'ldi. DE diabetning yoshi, davomiyligi va glyukemik nazorati kabi bir qancha xavf omillari bilan bog'liq bo'lishi mumkin [1, 2]. DE ning klinik ko'rinishi miyadagi morfologik va fiziologik o'zgarishlar va natijada kognitiv disfunktsiyadir. Giperglikemiya, oksidlovchi stress va surunkali yallig'lanish DE ning muhim patogen sabablari bo'lishi mumkin [3]. Ko'payib borayotgan tajribalar uzoq muddatli giperglikemiya miya qarishini tezlashtirishi mumkinligini ko'rsatgan bo'lsa-da, DE ning aniq patogenezi o'rganilmagan.

Apoptoz - mikromuhitning barqarorligini ta'minlash uchun genlar tomonidan boshqariladigan dasturlashtirilgan hujayra o'limi. Apoptozda ishtirok etadigan oqsillarga Bcl-2 oilasi, kaspazlar, p53 va boshqalar kiradi. Bcl{2}} oilasi ikki toifaga bo'linadi, biri hujayra o'limini kuchaytiradi, masalan, Bax, ikkinchisi esa apoptozga qarshilik ko'rsatadi. Bcl-2 kabi. Ular apoptozni kaspaza signalizatsiya yo'li orqali tartibga solishi mumkin, bu kaspazaning qaytarilmas chekli gidroliz substratining kaskadli kuchaytirish reaktsiyasi [4-6]. Bundan tashqari, tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, yuqori glyukoza (HG) tufayli apoptoz mitoxondriyal disfunktsiya, DNKning shikastlanishi va reaktiv kislorod turlarining (ROS) haddan tashqari ishlab chiqarilishi bilan bog'liq. Qandli diabetga chalingan sichqonlarni o'rganish shuni ko'rsatdiki, adenozin 5'-monofosfat (AMP) bilan faollashtirilgan protein kinaz (AMPK), hujayra ichidagi energiya va stress retseptorlari ROS vositachiligida apoptozni inhibe qilishi mumkin. Bundan tashqari, ortib borayotgan dalillar Mitogen-faollashtirilgan protein kinazlarini (MAPK) inhibe qilish neyron apoptozni inhibe qilish uchun foydali bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi. Boshqa bir hisobot shuni ko'rsatdiki, c-Jun N-terminal Kinaz (JNK), Hujayradan tashqari tartibga solinadigan protein kinazlari (ERK), p38 MAPK signalizatsiya yo'llari neyron apoptozni potentsial ravishda tartibga solishi mumkin [8,9].

Xitoy an'anaviy tibbiyot nazariyasiga asoslanib,buyrakEssensiya etishmovchiligi va qonning turg'unligi DE ning asosiy patogenezi hisoblanadi. Shuning uchun, oziqlantirish strategiyasibuyraklarva faollashtiruvchi qon odatda DE uchun klinik ilovalarda qo'llaniladi. Oldingi tadqiqotlar o'zgartirilgan Vu-Zi-Yan-Zong retsepti (MWP), oziqlantirishga qaratilgan retsept ekanligini tasdiqlashi mumkin edi.buyraklar, kognitiv buzilishlarni yaxshilash va A ning toksikligini kamaytirish orqali neyronlarni himoya qilishi mumkin [10, 11]. MWP asosida zuluk qo'shiladigan Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) retsepti maxsus ishlab chiqilgan.oziqlantirishbuyraklarva qonni faollashtiradi. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, BSHX retsepti DM bilan og'rigan bemorlarda xotiraning yomonlashuvi sindromini yaxshilashi mumkin, bu kuchli neyroprotektiv xususiyatlarni ko'rsatadi [12]. Biroq, BSHX ning batafsil farmakologik mexanizmi noaniqligicha qolmoqda. Ushbu tadqiqotda biz BSHX ekstraktining HG-induktsiyali PC12 hujayralariga himoya ta'sirini kuzatish va potentsial molekulyar mexanizmlarni o'rganishni maqsad qilganmiz.

Usullari

Materiallar va reaktivlar

Barcha o'tlar Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Pekin, Xitoy) dan sotib olingan va Xitoy farmakopeyasiga ko'ra, farmakognozist doktor PF Tu tomonidan tasdiqlangan (XXR Farmakopeya komissiyasi, 2010). 3- [4, 5-Dimetiltiazol-2-il] 2, 5-difeniltetrazolium bromid (MTT) Sigma Chemical Co. (Sent-Luis, MO, AQSh) kompaniyasidan edi. Laktat dehidrogenaza (LDH) tahlil to'plami Nankin Jiancheng biomuhandislik institutidan sotib olindi. (Nankin, Jiangsu, Xitoy). Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB) ikki tomonlama bo'yash to'plami va Hoechst 33258 Solar Co., Ltd. (Pekin, Xitoy) dan olingan. JC-1, 2, 7-diklorofloressein diasetat (DCFH-DA) bo'lgan mitoxondriyal membrana potentsialini tahlil qilish to'plami Beyotime Biotexnologiya institutidan (Shanxay, Xitoy) sotib olindi. Kaspaza-3, ajralgan kaspaza-3, PARP, ajralgan PARP, sitoxrom C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p uchun asosiy antikorlar -JNK va -tubulin Cell signaling Technology (Boston, MA, AQSh) dan olingan.

BSHX ekstraktini tayyorlash

BSHX yettita dorivor komponentdan iborat (1-jadval). BSHX ekstrakti tayyorlash uchun Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Vuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizji ( Hirudo nipponica Whitman.) va Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) 8:8:4:1:2:1:8 nisbatda aralashtirildi va 30 daqiqa davomida umumiy hajmi 10 marta (v/w) distillangan suvga botirildi. , keyin 1 soat qaynatiladi va yana 1 soat davomida umumiy hajm 5 marta (v/w) distillangan suvda qaynatiladi. Supernatantlar birlashtirildi va liyofilizatsiya orqali quritildi. Yakuniy quritilgan ekstrakt xom o'tlar og'irligining 25 foizini (w/w) tashkil etdi va vaucher namunasi Pekin universiteti sog'liqni saqlash fanlari markazi, Pekin, Xitoy an'anaviy xitoy tabobati zamonaviy tadqiqot markazida saqlangan.

Hujayra madaniyati

Kalamush feokromotsitoma hujayra liniyalari (PC12 hujayralari) Pekin Union Medical College Cell Bank (Pekin, Xitoy) dan olingan va Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Pekin, Xitoy) da 10 foiz homila sigir zardobida (Biowest, Frantsiya) o'stirilgan. ) va 1 foiz Penitsillin-Streptomitsin (100 ×, Macgene, Pekin, Xitoy) 37 daraja haroratda 95 foiz havo va 5 foiz CO2 bo'lgan namlangan inkubatorda.

Namuna davolash

Dastlabki sinovda PC12 hujayralari sitotoksiklikni baholash uchun faqat BSHX ekstrakti (20, 50, 100 mg/L) bilan 48 soat davomida davolandi. BSHX ekstraktining yuqori glyukoza (HG) sabab bo'lgan neyrotoksiklikka qarshi neyroprotektiv ta'sirini tahlil qilish uchun PC12 hujayralari 48 soat davomida BSHX ekstrakti (20, 50, 100 mg / L) va HG (75 mM) bilan birgalikda davolandi, keyin MTT tahlili o'tkazildi. hujayra hayotiyligi uchun. Boshqa barcha tahlillar BSHX ekstrakti konsentratsiyasining 20 dan 100 mg/L gacha bo'lgan diapazoni bilan bir xil sharoitda amalga oshirildi.

Hujayra hayotiyligini tahlil qilish

PC12 xujayralari har bir quduqqa 3,5 × 103 hujayra zichligidagi 96-quduq plastinkalariga ekilgan. 48 soat davomida BSHX ekstrakti (HG bilan yoki bo'lmasdan) bilan inkubatsiya qilingandan so'ng, supernatant olib tashlandi va MTT eritmasi (0,5 mg / ml) qo'shildi. 4 soat davomida 37 daraja inkubatsiyadan so'ng, MTT eritmasi olib tashlandi va hujayralar 5 daqiqa chayqash uchun dimetil sulfoksidda (DMSO) eritildi. Optik zichlik (OD) mikroplata o'quvchi yordamida 570 nm da o'lchandi. Hujayra hayotiyligi (foiz)=[OD (davolash) – OD (boʻsh)]/ [OD (tozalanmagan nazorat) – OD (boʻsh)] × 100 foiz .

LDH tahlili

PC12 xujayralari ekilgan va yuqorida aytib o'tilganidek, HG va BSHX ekstrakti bilan davolash uchun rag'batlantirilgan. Keyin hujayralardan chiqarilgan LDH ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq tijorat LDH to'plami yordamida aniqlandi. Absorbans 450 nm da o'lchandi. LDH (U/L)=[OD (davolash) - OD (bo'sh)] / [OD (standart) - OD (bo'sh)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Hoechst 33258 bo'yash va AO/EB bo'yash

Hoechst 33258 bo'yash uchun hujayralar 30 daqiqa davomida 4 foizli paraformaldegid bilan mahkamlangan. Keyin hujayralar fosfat tampon tuzi (PBS) bilan 3 marta yuvildi va xona haroratida 30 daqiqa davomida qorong'i joyda Hoechst 33258 ishchi eritmasi (1 ug/ml) bilan inkubatsiya qilindi. Tasvirlar qo'zg'alish to'lqin uzunligi 352 nm / emissiya to'lqin uzunligi 461 nm ostida floresan mikroskop (IX73, Olympus, Yaponiya) yordamida olingan. AO/EB bo'yash uchun 96-quduq plastinkalaridan muhitni olib tashlang va xona haroratida qorong'i joyda 5 daqiqa davomida AO/EB aralashmasini (100 ug/ml AO va 100 ug/ml EB aralash) qo'shing. Keyin hujayralar PBS bilan 3 marta yuvildi. Hujayralar qo'zg'alish to'lqin uzunligi 490 nm / emissiya to'lqin uzunligi 530 nm AO binoni uchun va qo'zg'alish to'lqin uzunligi 520 nm / emissiya to'lqin uzunligi 590 nm EB binoni uchun ostida floresan mikroskop yordamida vizualizatsiya qilindi.

Hujayra ichidagi ROSni aniqlash

Hujayra ichidagi ROSni aniqlash uchun PC12 xujayralari 5×105 zichlikdagi 6-quduq plitalariga ekilgan va 24 soat davomida HG va BSHX ekstrakti bilan ishlov berilgan. 24 soat inkubatsiyadan so'ng, PC12 xujayralari sarumsiz Dulbecco modifikatsiyalangan burgut muhiti bilan 3 marta yuvildi va floresan 2', 7'-dixlorofitga oksidlangan 10 mkl 2', 7'-diklorofloressein diasetatga (DCF-DA) qo'shildi. (DCF) gidroperoksidlar bilan, qorong'ida 30 daqiqa davomida 37 daraja. Keyin hujayralar 3 marta sovuq PBS bilan yuvildi va PBSda qayta suspenziya qilindi. ROS ning hujayra ichidagi darajasi oqim sitometriyasi (BD FACSCaliburTM, AQSh) orqali o'rtacha floresans intensivligini o'lchash orqali aniqlandi. Qo'zg'alish/emissiya to'lqin uzunliklari 488 / 525 nm edi. Har bir namunada kamida 10,000 hodisa hisoblangan. Qiymatlar nazorat qiymatining foiziga normallashtirilgan o'rtacha absorbans sifatida ifodalangan.

Mitoxondriyal membrana potentsialini tahlil qilish

Mitoxondriyal depolarizatsiya tijorat JC-1 tahlil to'plami yordamida baholandi. HG va BSHX ekstrakti bilan ishlov berilgandan so'ng, hujayralar JC{1}} ishchi eritmasi (1 ×) bilan 37 gradusda 15 daqiqa davomida qorong'i joyda inkubatsiya qilindi. Keyin supernatantni olib tashlang va hujayralarni JC-1 bufer eritmasi (1 ×) bilan 2 marta yuving. Hujayralar lyuminestsent mikroskop yordamida 460 nm/emissiya toʻlqin uzunligi 530 nm JC{10}} monomeri (depolarizatsiyalangan mitoxondriyali hujayralarda aniqlangan) va qoʻzgʻalish toʻlqin uzunligi 520 nm/emissiya toʻlqin uzunligi 59C J{{10} -1 ostida koʻrsatilgan. }} polimer (qutblangan mitoxondriyalarda mavjud). Yashil (monomerik) floresansi bo'lgan hujayralar depolarizatsiyalangan mitoxondriyaga ega deb hisoblangan; qizil (polimerik) floresansi bo'lgan hujayralar normal mitoxondriyaga ega deb hisoblangan.

Western blot tahlili

PC12 xujayralari to'plangan va 1 × kokteyl proteaz inhibitori bilan sovuq RIPA buferida lizing qilingan. Supernatant yuqori tezlikda 12,{4}} rpm tezlikda 10 daqiqa davomida 4 darajadan yuqori tezlikda santrifüjlash orqali yig'ildi. Protein kontsentratsiyasi Bredford tahlili bilan aniqlandi. Sitozol va mitoxondriya bilan boyitilgan fraktsiyalar sitoxrom c tahlili uchun Mitoxondriya izolyatsiyasi to'plami (Pirs, Rokford, AQSh) bilan ajratilgan. Boshqa oqsillar uchun umumiy hujayra lizatlari SDS-PAGE (10 foiz -15 foiz) bilan ajratilgan va Poliviniliden Ftorid (PVDF) membranalariga o‘tkazilgan. Keyin poliviniliden ftorid membranalari 5 foizli yog'siz sut bilan to'sib qo'yildi va ko'rsatilgan asosiy antikorlar bilan bir kechada 4 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. Membranalar PBST (fosfat tamponli sho'r suv, 0,1 foiz Tween 20) bilan uch marta yuvilgan va xona haroratida ikkilamchi antikorlar bilan 2 soat davomida inkübe qilingan. Keyin membranalar yana uch marta PBST bilan yuvildi va kengaytirilgan kimyoluminesans substrat yordamida vizuallashtirildi va Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, AQSh) yordamida skanerdan o'tkazildi.

Statistik tahlil

Barcha qiymatlar o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida ifodalanadi. O'rtacha qiymatlar orasidagi farqlarning ahamiyati Ijtimoiy fanlar uchun statistik paket (SPSS 16.0 dasturi) yordamida dispersiyaning bir tomonlama tahlili (ANOVA) orqali aniqlandi. Nazorat guruhi bilan solishtirganda P < 0.05="" statistik="" jihatdan="" ahamiyatli="" deb="">

Natijalar

BSHX ekstrakti PC12 xujayralarini HG dan kelib chiqqan hujayra shikastlanishidan himoya qiladi

BSHX ekstrakti PC12 hujayralarini HG insultidan himoya qila oladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz PC12 hujayralarini HG (75 mM) sharoitida 48 soat davomida BSHX ekstrakti konsentratsiyasi (20, 50 va 100 mg / L) bilan davolashdik. MTT tahlili yordamida hujayra hayotiyligini baholash shuni ko'rsatdiki, HG insulti PC12 hujayralarining hayotiyligini sezilarli darajada pasayishiga olib keldi (hujayra hayotiyligi taxminan 56,9 ± 6,7 foiz edi) va BSHX ekstrakti bilan davolash konsentratsiyaga bog'liq holda hujayra o'limini sezilarli darajada oldini oldi. Hujayralarga BSHX ekstrakti (100 mg/L) bilan birgalikda ishlov berilganda hujayra hayotiyligi 87,8 ± 9,2 foizgacha oshdi (1A-rasm). Laktat dehidrogenaza (LDH) zararlangan hujayralardan chiqariladi va shuning uchun hujayra toksikligining ko'rsatkichi sifatida ham foydalanish mumkin. MTT tahlili natijalariga muvofiq, biz HG insult PC12 hujayralaridan LDH chiqishini sezilarli darajada oshirganligini va BSHX ekstrakti bilan davolash konsentratsiyaga bog'liq holda LDH chiqishini oldini olganligini aniqladik (1B-rasm), Bu natijalar BSHX ekstrakti hujayra hayotiyligini oshirishini ko'rsatadi. HG-induktsiyali PC12 hujayralarida.

BSHX ekstrakti kaspaza-9/3-bog'liq yo'l orqali PC12 hujayra apoptozini inhibe qiladi.

BSHX ekstraktining hujayra apoptoziga ta'sirini aniqlash uchun biz apoptoz uchun sezgir tahlil sifatida Hoechst 33258 DNK bo'yog'idan foydalandik. Hoechst 33258 tomonidan bo'yalgan normal hujayralar yadrolari bir xil ko'k floresansini ko'rsatdi, yadroviy xromatin bulutli piknozli apoptotik hujayralar esa giperkromatik va zich floresan zarralarni ko'rsatdi. Apoptoz ulushi apoptotik hujayralar soniga va hujayralarning umumiy soniga qarab hisoblab chiqilgan. Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, HG (75 mM) insult apoptotik hujayralar ulushini keskin oshirdi (51,7 ± 4,3 foiz) va BSHX ekstrakti bilan davolash PC12 hujayralarida HG-induktsiyali apoptozdan sezilarli darajada himoyalangan (2A-rasm). Ushbu natijalar AO / EB ikki marta bo'yash tahlili bilan qo'llab-quvvatlandi. AO normal va apoptotik hujayralarga kiradi va yashil floresans chiqaradi, EB esa faqat apoptotik hujayralarga kiradi va qizil flüoresans chiqaradi [13]. AO/EB tahlili shuni ko'rsatdiki, apoptotik hujayralar ulushi HG (75 mM) insultidan keyin sezilarli darajada oshgan (47,8,7 ± 2,6 foiz) va PC12 hujayralarida BSHX ekstrakti bilan ishlov berishdan keyin pasaygan (2B-rasm), bu BSHX ekstrakti samarali bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. HG tomonidan qo'zg'atilgan PC12 hujayralarining apoptozini inhibe qiladi.

Keyin, biz BSHX ekstraktining mitoxondriya bilan bog'liq apoptozning muhim yo'li bo'lgan kaspaza-3/PARP yo'liga ta'sirini o'rgandik [14]. Western blot shuni ko'rsatdiki, HG (75 mM) insulti kaspaza -3 va PARP ning faol shakllarining ifodasini sezilarli darajada oshirdi va PC12 hujayralarida jami kaspaza-3 va PARP ifodalarini kamaytirdi va bu ta'sir sezilarli darajada teskari bo'ldi. BSHX ekstrakti bilan davolash (2C-rasm), bu BSHX ekstrakti PC12 hujayralarini mitoxondriyal bog'liq kaspaza-3/PARP yo'lini tartibga solish orqali apoptozdan samarali himoya qilishini ko'rsatadi.

BSHX ekstrakti HG-induktsiyalangan PC12 hujayralarida hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarishni inhibe qiladi

HG hujayra ichidagi ROS [15] shakllanishini kuchaytirishi mumkinligi sababli, biz BSHX ekstrakti ROS hosil bo'lishini inhibe qilishi mumkinligini aniqlash uchun hujayra ichidagi ROS darajasini sinab ko'rdik. Nazoratga nisbatan 48 soat davomida 75 mM HG taʼsirida boʻlgan PC12 hujayralarida oʻrtacha flüoresan intensivligining 3.23-baravar ortishi kuzatildi. Aksincha, BSHX ekstrakti bilan birgalikda davolash floresansning o'rtacha intensivligini taxminan 0.76-, 0.{{10}} va 0 ga sezilarli darajada pasaytirdi.{ {12}}modellar guruhining barobari, bu BSHX ekstrakti HG tomonidan induktsiya qilingan ROS ishlab chiqarishni inhibe qilishi mumkinligini ko'rsatadi (3A, B-rasmlar).

BSHX ekstrakti Bax va Bcl{2}} ifodasini tartibga solish orqali HG-induktsiyali PC12 hujayralarida mitoxondrial gomeostazni saqlaydi.

Mitoxondriyal membrana potentsiali hujayra salomatligi ko'rsatkichi sifatida ishlatiladigan mitoxondrial funktsiyaning muhim parametridir. JC-1 lipofil, katyonik boʻyoq boʻlib, mitoxondriyaga tanlab kirib, membrana potentsiali ortishi bilan rangini yashildan qizilga teskari ravishda oʻzgartira oladi. Mitoxondriyal membrana salohiyati yuqori bo'lgan sog'lom hujayralarda JC-1 o'z-o'zidan qizg'in qizil floresan bilan J-agregatlar deb nomlanuvchi komplekslarni hosil qiladi. Boshqa tomondan, mitoxondriyal membrana salohiyati past bo'lgan apoptotik hujayralarda JC{3}} monomerik shaklda qoladi, bu faqat yashil floresansni ko'rsatadi [16, 17]. Yashil floresansning qizil floresansga nisbati shuning uchun mitoxondriyal depolarizatsiyani aks ettirishi mumkin. Bizning tadqiqotimizda depolarizatsiyalangan mitoxondriyaga ega bo'lgan hujayralar soni (yashil floresans) 48 soat davomida HG (75 mM) dan keyin sezilarli darajada oshdi va bu o'sish konsentratsiyaga bog'liq bo'lgan tarzda BSHX ekstrakti bilan ishlov berish orqali qaytarildi (4A-rasm).

Keyinchalik biz kaspazaga bog'liq apoptoz yo'lining faollashuvining asosiy o'yinchisi bo'lgan sitoxrom c ning mitoxondriyal va sitoplazmatik taqsimotini aniqladik. Biz 48 soat davomida HG (75 mM) insulti sitoxrom c ning mitoxondriyadan sitoplazmaga dramatik translokatsiyasini keltirib chiqarganini aniqladik va bu ko'chirish BSHX ekstrakti bilan ishlov berish orqali sezilarli darajada oldini oldi (4B-rasm), bu BSHX ekstrakti chiqarilishini inhibe qilishi mumkinligini ko'rsatadi. mitoxondriyadan sitoxrom c.

Bundan tashqari, Bcl{0}} oilasi oqsillari turli apoptotik yo'llarning muhim regulyatorlari hisoblanadi. Bcl-2 turli sitotoksik omillar ta'sirida yuzaga kelgan hujayra apoptozini inhibe qilishi mumkin va mitoxondriyadan sitoplazmaga sitoxrom c ajralishining inhibitori hisoblanadi. Biroq, Bax, Bcl-2 oilasining a'zosi sifatida, pro-apoptoz omilidir. Apoptoz qo'zg'atilganda, Bax sitoplazmadan mitoxondriyaga o'tadi va mitoxondriyal yaxlitlikni buzadi [5, 18]. Bizning tadqiqotimizda Bcl-2 ning protein darajasi pastga tushirildi va Bax 48 soat davomida HG (75 mM) insult bilan yuqoriga ko'tarildi, bu ta'sir konsentratsiyaga bog'liq ravishda BSHX ekstrakti bilan qaytarildi (4C-rasm). Yuqoridagi barcha natijalar BSHX ekstrakti PC12 hujayralarini Bax va Bcl-2 ifodasini tartibga solish orqali HG-induktsiyali mitoxondrial depolarizatsiyadan himoya qilishini ko'rsatdi.

BSHX ekstraktining JNK/p38 MAPK signalizatsiya yo'llari orqali hujayra apoptoziga ta'siri

Ba'zi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ROS ishlab chiqarishning ko'payishi hujayra apoptozini qo'zg'atish uchun MAPK yo'llarining faollashishi bilan bog'liq [19, 20]. Shunday qilib, biz BSHX ekstraktining mitojen bilan faollashtirilgan protein kinaz (MAPK) signalizatsiya yo'liga ta'sirini o'rganib chiqdik, bu BSHX ekstrakti HG tomonidan qo'zg'atilgan apoptozni susaytirishi mumkinligini aniqlash uchun. 5-rasmda ko'rsatilganidek, 48 soat davomida HG (75 mM) insulti PC12 hujayralarida c-Jun NH2-terminal kinaz (JNK) va p38 fosforillanishini oshirdi, bu konsentratsiyada BSHX ekstrakti tomonidan sezilarli darajada inhibe qilingan. bog'liq usul. Biroq, hujayradan tashqari tartibga solinadigan protein kinaz (ERK) MAPK bilan shunga o'xshash natija kuzatilmadi. Natijalar shuni ko'rsatadiki, BSHX ekstrakti JNK/p38 MAPK signalizatsiya yo'llari orqali HG-induktsiyalangan hujayra apoptozini inhibe qilishi mumkin.

Munozara

Diabetik ensefalopatiya (DE) 2-toifa qandli diabetning (T2DM) keng tarqalgan asoratidir. Bu miyaning kognitiv buzilishiga olib kelishi mumkin va butun dunyo bo'ylab 2-toifa diabetes mellitusli bemorlarda o'lim va nogironlikning muhim xavf omilidir [3]. Shunday qilib, DE mexanizmini, shuningdek, uning oldini olish va davolash strategiyasini o'rganish juda muhimdir.

Xitoyda an'anaviy xitoy dori-darmonlari (TCM) ko'p yillar davomida DMni davolash uchun ishlatilgan va shifobaxsh ta'sir ko'rsatgan. Ba'zi klinik tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, buyraklarni oziqlantirish va qon strategiyalarini faollashtirishga asoslangan TCMlar qon glyukoza darajasini pasaytiradi, qon aylanishini rag'batlantiradi va miyaning kognitiv disfunktsiyasini yaxshilaydi. BSHX retsepti ushbu TCMlarning vakili hisoblanadi. Bizning dastlabki klinik tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, BSHX retsepti qon zardobidagi glyukoza, homosistein (HCY) va yuqori sezgir C-reaktiv protein (hs-CPR) ni samarali ravishda yaxshilashi va engil kognitiv buzilish (MCI) bo'lgan diabetli bemorlarning kognitiv funktsiyasini yaxshilashi mumkin. [12]. Shu bilan birga, hozirgacha samaradorlik va farmakologik mexanizmni isbotlovchi dalillar yo'q.

Ushbu tadqiqotda biz BSHX ekstrakti MTT, LDH tahlili bilan o'lchangan HG tomonidan qo'zg'atilgan hujayra hayotiyligini pasaytirishi mumkinligini aniqladik. BSHX ekstraktining hujayra hayotiyligiga himoya ta'sirini yanada o'rganish uchun biz Hoechst 33258 va AO / EB bo'yash tahlili bo'yicha apoptozni o'rgandik. Natijalar BSHX ekstrakti HG tomonidan qo'zg'atilgan apoptozni sezilarli darajada kamaytirishi mumkinligini ko'rsatdi. Apoptoz belgisi sifatida kaspaza -3 va PARP HG bilan davolashdan keyin sezilarli darajada oshdi, ammo bu proapoptotik omillarning faollashishi BSHX ekstrakti tomonidan konsentratsiyaga bog'liq tarzda inhibe qilindi. Yuqoridagi natijalar BSHX ekstrakti HG tomonidan qo'zg'atilgan PC12 hujayra shikastlanishiga himoya ta'siriga ega ekanligini ko'rsatdi.

ROS hujayralarning oksidlovchi fosforillanishi jarayonida hosil bo'ladi va uni ishlab chiqarishning ko'payishi yoki antioksidant tizimlarning shikastlanishi hujayralardagi oksidlovchi stressga olib kelishi mumkin [21]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, yuqori glyukoza hujayra ichidagi ROS to'planishiga va natijada faol apoptotik signalizatsiya yo'liga olib kelishi mumkin. Va diabetik asoratlarning umumiy mexanizmi oksidlovchi stressdir [22, 23]. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, yuqori glyukoza PC12 hujayralarida ROS ko'payishiga olib kelishi mumkin, bu avvalgi tadqiqotlarga mos keladi [24]. Taxminlarga ko'ra, yuqori glyukozaning hujayralar uchun toksikligiga ROS-induktsiyali apoptoz orqali erishish mumkin. Mitoxondriyalar hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarishning asosiy joylari va ROS hujumi uchun asosiy maqsad organdir [25]. Patologik sharoitda ROS ning tez o'sishi mitoxondriyal disfunktsiyaga, mitoxondriyal membrana potentsialining qulashiga va oxir-oqibat hujayra apoptoziga olib kelishi mumkin [26]. Shunday qilib, biz mitoxondriyaning yaxlitligini aniqladik. Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, yuqori glyukoza mitoxondriyal membrana potentsialini sezilarli darajada pasaytirdi, mitoxondriyal o'tkazuvchanlik o'tish g'ovaklarining (MPTP) o'tishini boshqaradigan Bax/Bcl-2 nisbatini oshirdi va sitoxrom c ning oqib ketishiga yordam berdi, BSHX ekstrakti esa: bu o'zgarishlarni bekor qiling. Bular BSHX ekstraktining HG tomonidan qo'zg'atilgan PC12 hujayralariga qarshi neyroprotektivi mitoxondriyaning yaxlitligini saqlab qolishdan kelib chiqishi mumkinligini ko'rsatadi.

MAPK signalizatsiya yo'li ham hujayra apoptozida muhim rol o'ynaydi. JNK, ERK va p38 MAPK MAPK oilasining eng ko'p o'rganilgan a'zolaridir. Ularning asosiy ta'sir qilish usuli - o'ziga xos joylarni fosforillash va shu bilan hujayra apoptozini tartibga solishdir [8, 27, 28]. Bundan tashqari, tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ROS ning haddan tashqari ishlab chiqarilishi p38MAPK fosforillanishini [29-31] qo'zg'atishi mumkin va ROS MAPK yo'llarining faollashuviga olib kelishi yoki vositachilik qilishi mumkin [32]. ROS ishlab chiqarishni qo'zg'atadigan bir nechta uyali stimullar bir nechta hujayra turlarida MAPK yo'llarini faollashtirishi mumkin [32, 33]. ROS tomonidan MAPK faollashuvining potentsial mexanizmlari MAPK fosfatazalarining inaktivatsiyasi va degradatsiyasini o'z ichiga olishi mumkin, bu yo'lni nofaol holatda saqlaydi [19]. Boshqa tomondan, MAPK yo'llari ROS hosil bo'lishi bilan faollashtirilganligini qo'shimcha tasdiqlash uchun hujayralar ROS to'planishining oldini olish uchun antioksidantlar (masalan, NAC, ROS tozalash vositasi) bilan oldindan ishlov berildi. Va natijalar shuni ko'rsatdiki, MAPK faollashuvi hujayra stimulyatorlari bilan hujayra stimulyatsiyasidan keyin deyarli inhibe qilingan [32, 33], bu MAPK yo'llarining ROS inaktivatsiyasining ishtirokini ko'rsatadi. Bundan tashqari, tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, hujayralar maxsus JNK inhibitori SP600125 bilan davolash qilinganida, kardiotoksin III tomonidan qo'zg'atilgan apoptoz bloklanishi mumkin [34]. Bizning oldingi tadqiqotimiz o'zgartirilgan Wu-Zi-Yan-Zong retsepti (MWP) A faollashtirilgan BV2 mikrogliyasida ERK/p38 MAPK faollashuvini inhibe qilishi mumkinligini aniqladi [10]. Biroq, ushbu tadqiqotda biz BSHX ekstrakti JNK va p38 MAPK ning fosforillanishini inhibe qilishi mumkinligini aniqladik va biz p-ERK bilan bir xil natijaga erisha olmadik. Biz taxmin qilamizki, zuluklar BSHX ekstraktida boshqacha rol o'ynaydi. Natijalar shuni ko'rsatadiki, BSHX ekstraktining HG tomonidan qo'zg'atilgan PC12 hujayralarida apoptozga qarshi boshqa himoya mexanizmi JNK/p38 MAPK signalizatsiya yo'llarini tartibga solish orqali bo'lishi mumkin.

Xulosa

BSHX ekstrakti, poli o'simlik formulasi, HG insultiga qarshi PC12 hujayralariga neyroprotektiv ta'sir ko'rsatadi. BSHX ekstrakti hujayra ichidagi ROS hosil bo'lishini kamaytirish, mitoxondriyal membrananing yaxlitligini saqlab qolish va kaspaza -3 va JNK/p38 MAPK signalizatsiya yo'llarini blokirovka qilish orqali HG tomonidan qo'zg'atilgan PC12 hujayra apoptozini samarali ravishda inhibe qildi (6-rasm). Birgalikda bizning topilmalarimiz shuni ko'rsatadiki, BSHX ekstrakti klinik ilovalarda DE ni davolash uchun istiqbolli vositadir.

Muallif hissalari

Tajribalarni o'ylab topdi va ishlab chiqdi: Zeng KW, Vang XM. Tajribani o'tkazdi: Zhao SY. Ma'lumotlarni tahlil qildi: Zhao SY, Zeng KW va Wang XM. Hissa qoʻshgan reagentlar/materiallar/tahlil vositalari: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW va Wang XM. Ota yozgan: Chjao SY.

Ma'lumotnomalar

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS va boshqalar. Diabetik miya va idrok. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Qandli diabet bilan miya shikastlanishi: dalillar, mexanizmlar va davolash oqibatlari. Ekspert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F va boshqalar. "Metabolik xotira" nazariyasi va diabetik asoratlarning oldini olishda giperglikemiyani erta davolash. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Apoptozdagi mitoxondriyal membrana potentsiali (Dsm); yangilanish. Apoptoz 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Bcl-2 oilasi oqsillari orqali mitoxondrial dinamika va hayot yoki o'lim hodisalarini ulash. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R va boshqalar. Mitoxondriya va hujayra o'limi. Mexanik jihatlar va uslubiy masalalar. Fevral J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Vu L, Du S va boshqalar. 1,25-(OH)2D3 MAPK/P38 yo'li orqali inson peritoneal mezotelial hujayralarida yuqori glyukoza sabab bo'lgan apoptoz va ROS ishlab chiqarishni inhibe qiladi. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E va boshqalar. Nerv o'sish omilini oldindan davolash kislorod va glyukoza etishmasligidan kelib chiqqan c-Jun amino-terminal kinaz 1 va stress bilan faollashtirilgan p38 va p38 kinazalarini faollashtiradi va feokromotsitoma PC12 modelida neyroproteksiyani ta'minlaydi. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou V, Zeng J, Zhuo M, Xu V, Sun L, Vang J va boshqalar. Kaspaza -3 va p38 mitogen bilan faollashtirilgan protein kinazning PC12 hujayralarida kobalt xlorid bilan qo'zg'atilgan apoptozda ishtirok etishi. J Neurosci Res 2002, 67: 837-843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF va boshqalar. O'zgartirilgan Wu-Zi-Yan-Zong retseptining NF-kB va ERK/p38 MAPK signalizatsiya yo'llari orqali -Amiloid-stimulyatsiyalangan BV2 Microglia-da antineyroinflamatuar ta'siri. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H va boshqalar. Modifikatsiyalangan Wu-Zi-Yan-Zong retsepti, an'anaviy xitoylik poli o'simlik formulasi, NF-kB va JNK / p38 MAPK signalizatsiya yo'llari orqali kalamush astrositlarida lipopolisakkaridlar keltirib chiqaradigan neyroinflamatuar jarayonlarni bostiradi. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Vang H va boshqalar. Bushen Huoxue retseptining 2-toifa diabetning engil kognitiv buzilishlarini davolashga ta'siri. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P va boshqalar. Odam leykotsitlarida sikloheksimid tomonidan qo'zg'atilgan apoptozning tahlili: Akridin apelsin/etidiy bromidga nisbatan anneksin V/propidiy yodid yordamida floresan mikroskopiya. Hujayra Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S va boshqalar. Kaspazlar hujayra o'limi signalini organizm gomeostazi bilan bog'laydi. Immunitet 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Azot oksidi: diabetes mellitus turidagi endotelial progenitor hujayralar disfunktsiyasining asosiy omili-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M va boshqalar. JC-1: Muqobil qo'zg'alish to'lqin uzunliklari mitoxondriyal membrana potentsial sitometriyasini osonlashtiradi. Hujayra o'limi Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J va boshqalar. Mitoxondriyal membrana potentsial zondlari va proton gradienti: amaliy qo'llanma. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. BCL-2 oqsillari mitoxondriyal tashqi membrana o'tkazuvchanligini qanday keltirib chiqaradi? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH va boshqalar. Mitogen bilan faollashtirilgan protein kinazalari va reaktiv kislorod turlari: ROS MAPK yo'llarini qanday faollashtirishi mumkin? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Chjan L, Zhang Z, Chen F va boshqalar. Podofillotoksinning aromatik geterotsiklik efirlari ROS/MAPK signalizatsiya yo'li orqali inson leykemiyasi K562/ADR hujayralarida anti-MDR ta'sir ko'rsatadi. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J va boshqalar. Altsgeymer kasalligida oksidlovchi stressga qarshi terapevtik foyda uchun glikogen sintaza kinazini-3 maqsad qilish: Nrf2-ARE yo'lining ishtiroki. Int J Alzheimer Dis 2011, 2011: 985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV va boshqalar. Diabetik neyropatiyada oksidlovchi stressning roli: glikatsiya reaktsiyasida erkin radikal turlarning paydo bo'lishi va I turdagi diabetli bemorlar populyatsiyasida diabetik neyropatiyaga genetik moyillikka antioksidant fermentlarni kodlovchi gen polimorfizmi. Hujayra biokimyosi biofizi 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA va boshqalar. Hujayra o'limi, reaktiv kislorod turlari (ROS) va diabetik asoratlar. Hujayra o'limi Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD va boshqalar. Ginkgolide B yuqori glyukoza bilan stimulyatsiya qilingan inson kindik venasi endotelial hujayralarida apoptozni inhibe qiladi. Xitoy farmakologik byulleteni 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T va boshqalar. Mitoxondriyal membranalararo bo'shliqda superoksid dismutazaning zararli roli. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Storey KB. Mitogen bilan faollashtirilgan protein kinazlar: atrof-muhit stressiga hujayra javoblarida ishlaydigan yangi signalizatsiya yo'llari. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Vu N, Lin X, Zhao X va boshqalar. MiR-125b glioblastoma hujayralarida onkogen rolini o‘ynaydi va p53 va p38MAPK-dan mustaqil yo‘llar orqali hujayra apoptozini inhibe qiladi. Brit J Saraton 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H va boshqalar. Ilg'or glikatsiyaning yakuniy mahsulotlari reaktiv kislorod turlarini yaratish va JNK va p38 MAPK yo'llarini faollashtirish orqali inson shox pardasi epitelial hujayralari apoptozini qo'zg'atadi. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Li DH va boshqalar. Ghrelin kislorod-glyukoza etishmovchiligi paytida gipotalamus neyron hujayralarida apoptozni inhibe qiladi. Endokrinologiya 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrukarin A hujayra siklini tartibga soluvchi oqsillarni o'zgartiradi va inson ko'krak saratoni hujayra liniyasi MCF -7 da reaktiv kislorod turlariga bog'liq p38MAPK faollashuvi orqali apoptozni keltirib chiqaradi. O'simta biologiyasi 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L va boshqalar. P38 MAPK faollashuvi orqali qo'ziqorin keratitining patogenezida ishtirok etgan ROS-induktsiyali oksidlovchi shikastlanish. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. MAP kinaz signalizatsiya yo'llarining reaktiv kislorod turlari tomonidan faollashishi. Antioksid redoks signali 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redoks signalizatsiyasi va MAP kinaz yo'llari. Biofaktorlar 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Kardiotoksin III HL-60 inson leykemiya hujayralarida c-jun N-terminal kinazaga bog'liq apoptozni keltirib chiqaradi. Hujayra biokimyoviy funktsiyasi 2008, 26: 111-118.