Obacunone GPx-4 ning anti-oksidant ta'sirini kuchaytirish va EMTni inhibe qilish bilan jigar fibrozini susaytiradi

Iltimos, murojaat qilingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

Annotatsiya:Obakunone, Phellodendronchinense Schneid yoki Dic-tamnus dasycarpusb Turcz o'simliklaridan olingan limonin triterpenoidi yallig'lanishga qarshi, o'smaga qarshi, oksidlanishga qarshi va o'pka fibroziga qarshi turli xil farmakologik ta'sirlarni keltirib chiqaradi. Biroq, oba-konusning anti-fibrotik ta'siri va jigar fibrozining batafsil asosiy mexanizmi noaniqligicha qolmoqda. Jigar fibrozi - bu inson salomatligiga tahdid soladigan zaif kasallik. Transformatsiya qiluvchi o'sish omili (TGF) - / P-Smad - bu epiteliya-mezenximal o'zgarishlar (EMT) va ortiqcha kislorodsiz radikallar bilan birga keladigan kollagen cho'kmalari bilan ajralib turadigan fibrozning asosiy yo'lidir. Nrf-2 antioksidant bilan bog'liq bo'lgan turli genlarni ifodalovchi asosiy antioksidlovchi regulyator sifatida ishlaydi. Glutation peroksidaza-4(GPx-4) glutation peroksidazalar oilasining a'zosi bo'lib, oksidlovchi stressni yumshatish uchun fosfolipid oksidlanishini bevosita inhibe qiladi. Ushbu tadqiqotda biz uglerod tetraklorid (CCl4) va TGF- bilan bog'liq bo'lgan jigar yulduzsimon hujayralari (LX2 hujayra liniyasi) tomonidan qo'zg'atilgan sichqonchaning jigar fibrozi modelida orqa miya rolini o'rganishni maqsad qildik. Obacunone faollashtirilgan LX2 va sichqonlarning jigar to'qimalarida -SMA, kollagen1 va vimentin miqdori kamaygan jigar fibroziga kuchli yaxshilovchi ta'sir ko'rsatdi. Obacunone, shuningdek, TGF-/P-Smad signallari va EMT jarayonini sezilarli darajada bostirdi. Shu bilan birga, obacunone ikkala modelda ham reaktiv kislorod turlari (ROS) darajasini pasaytirish orqali kuchli oksidlanishga qarshi ta'sir ko'rsatdi. Orqa miyaning antioksidant ta'siri GPx-4 va Nrf-2 faollashuvi bilan bog'liq. Bundan tashqari, orqa miyaning LX2 hujayralariga terapevtik ta'siri in vitro plyus GPx-4 antagonisti RSL3 bilan, ROSning qayta ko'tarilgan darajalariga parallel ravishda sezilarli darajada olib tashlandi.puritans vitamin CShunday qilib, biz orqa miya GPx{0}} signalini kuchaytirish va TGF-/P-Smad yo'li va EMT jarayonini inhibe qilish orqali jigar fibrozini susaytirishi mumkinligini ko'rsatamiz.

Kalit so‘zlar:orqa miya;jigar fibrozi; EMT;jigar yulduzsimon hujayralari; GPx-4;TGF- ;oksidlanish stressi

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

1.Kirish

Surunkali gepatit odatda virusli gepatit, alkogolsiz steatoz, alkogolli gepatit va otoimmün gepatit tufayli yuzaga keladi. Jigarning doimiy shikastlanishi jigar fibrozi yoki hatto jigar saratoni bilan yakunlanishi mumkin, bu esa inson salomatligiga halokatli ta'sir ko'rsatadi [1]. Jigar fibrozi - bu hujayradan tashqari matritsaning (ECM) haddan tashqari ko'p to'planishi va chandiq shakllanishi bilan tavsiflangan doimiy shikastlanish omillari ostida yaraning davolanmaydigan javob turi. Jigar stellat hujayralari (HSCs) odatda normal sharoitda dam olish holatida bo'ladi, ular surunkali jigar shikastlanishi ostida aberrant tarzda faollashadi va miofibroblastlar deb ataladigan ECM ning yuqori ko'payishi va sekretsiyasi bilan ajralib turadi [3]. HSC faollashuvi mexanizmini tushunish jigar fibrozini davolash uchun yangi terapevtik vositalarni ishlab chiqish uchun katta ahamiyatga ega.

Transformatsiya qiluvchi o'sish omili (TGF- ) monotsitlarda interleykin-1 (IL-1) va interleykin-6(IL-6) ifodasini rag'batlantirish orqali yallig'lanish reaktsiyalarini rag'batlantiradi [5]. Bundan tashqari, u epitelial-mezenximal transformatsiya (EMT) va o'simta immunitetidan qochish orqali saraton metastazini qo'zg'atadi [6-8]. EMT dinamik fiziologik jarayonga ishora qiladi, bunda epiteliya hujayralari o'z qutblarini yo'qotadi va fibroblastlar va miofibroblastlar kabi mezenximal hujayralarga aylanadi, bu esa fibrozning rivojlanishiga olib keladi [9]. EMT paydo bo'lishi har doim E-kaderinning regulyatsiyasi va N-kaderin va salyangoz [10] kabi mezenximal hujayra belgilarining yuqori regulyatsiyasi bilan bog'liq. TGF- -Smad faollashuvi EMTdagi asosiy hujayra ichidagi yoʻllardan biri hamda miofibroblast hosil boʻlishidir [11].

Oksidlanish stressi reaktiv kislorod turlarining (ROS) ortiqcha ishlab chiqarilishi bilan birga fibrozning asosiy sabablaridan biri hisoblanadi [12]. ROSning yuqori darajasi oqsil, lipidlar va DNK kabi biomolekulalarning strukturaviy shikastlanishiga olib keladi, natijada hujayra shikastlanishiga va fibrozning rivojlanishiga olib keladi [13]. Oksidlanish stressi ostida Nrf-2-Keep-1 dimeri dissotsiatsiyalanadi, nafas olishning yadro omili-2(Nrf-2) yadroga tashiladi va turli xil birikmalarning ifodalanishini keltirib chiqaradi. antioksidant fermentlarni antioksidant javob elementlari (ARE) bilan bog'lash ROS darajasini pasaytiradi [14]. Glutation peroksidaza-4 (GPx-4) ​​glutation peroksidaza faolligiga ega antioksidant oqsil vazifasini bajaradi, asosan ferroptoz jarayonida fosfolipid oksidlanishini va ROS ishlab chiqarishni inhibe qilish uchun javobgardir [15].sistancheSichqonlar ustida olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Nrf-2 yoki GPx-4 [16,17] yo'qolganidan keyin fibroz kuchayadi.

Cistanche qarishga qarshi bo'lishi mumkin

Hozirgi vaqtda jigar fibrozini davolash uchun bir nechta dorilar mavjud, ular orasida yallig'lanishga qarshi [18], antioksidant [19] va peroksizoma proliferatori bilan faollashtirilgan retseptorlari (PPAR) agonisti [20]. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotda, professor Yu jigar sirrozi bilan og'rigan bemorlarda klinik namunalardagi sog'lom nazoratga qaraganda yuqori lipid oksidlanish darajasi borligini aniqladi [21]. Resveratrol [19] va ursolik kislota |13] kabi bir qancha antioksidant dorilar fibrozga yaxshi ta'sir ko'rsatdi. Ushbu dalillar to'plangan ravishda antioksidlanish anti-fibrozni davolash uchun istiqbolli strategiya ekanligini ko'rsatadi.

Pirfenidon (PFD) idiopatik o'pka fibrozi (IPF) uchun piridinli preparatdir, shu bilan birga u ko'plab tadqiqotlarda jigar fibroziga yaxshi terapevtik ta'sir ko'rsatadi [22,23]. Shunday qilib, PFD ushbu tadqiqotda ijobiy nazorat dori sifatida tanlangan. Obacunone (Oba) Phellodendri va Dictamnus-dasycarpus [24] kabi chiriyotgan o'simliklardan olingan tabiiy limonoid birikma bo'lib, yallig'lanishga qarshi |25, antioksidant [26] va o'smaga qarshi [27] kabi turli biologik xususiyatlarga ega. Oxirgi hisobotlar shuni ko'rsatdiki, Oba kuchli Nrf{9}} agonisti bo'lib, u o'pka fibrozini CCL4 induksiyasi va H, O2 sabab bo'lgan MDA-MB-231 hujayralarining oksidlovchi shikastlanishi bilan samarali ravishda engillashtiradi. Eng muhimi, Oba sichqonlar uchun toksik emas [28]. Biroq, Oba ning jigar fibroziga ta'siri, ayniqsa GPx-4 vositachiligida fosfolipidlarga qarshi oksidlanish, TGF{18}}Smad signallari va EMT jarayoni haqida hech qanday hisobot berilmagan. Bu erda biz Oba ning jigar fibroziga ta'sirini o'rganish va asosiy molekulyar mexanizmlarni aniqlash niyatidamiz.

2. Natijalar

2.1. Oba TGF- -Induced Lx-2 faollashuvini inhibe qildi

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Qizig'i shundaki, Oba kontsentratsiyasining ortishi bilan a-SMA inhibisyon ta'siri sezilarli darajada oshmadi (1B-rasm).cistanche nimaShunday qilib, biz keyingi tajriba uchun 20 mkM konsentratsiyani tanladik, PFD ijobiy nazorat sifatida xizmat qiladi. Oba aHSClarda [3,4] -SMA, kollagen-1, vimentin va biriktiruvchi to'qima o'sish omili (CTGF) oqsil darajasini samarali ravishda inhibe qildi (1C-rasm). Bundan tashqari, Oba -SMA, kollagen-1 va vimentinning mRNK ifoda darajasini pasaytirdi (1D-rasm). Immunofluoressensiya natijalari Lx-2(1E-rasm) da -SMA ning ijobiy bo'yash signallari Oba tomonidan aniq kamayganligini tasdiqladi (TGF- guruhidagiga nisbatan, Oba bilan davolashdan keyin qizil qon tanachalari soni kamaygan). Bu natijalar Oba Lx-2 faollashuviga yaxshi tormozlovchi ta'sir ko'rsatishini ko'rsatadi.

2.2.Oba inhibe qilingan TGF-/Smad signallari, EMT jarayoni va yallig'lanishga qarshi ta'siri

Yuqoridagi anti-fibroz ta'siri ostida yotgan molekulyar mexanizmlarni aniqlash uchun TGF-retseptorlari, P-Smad va -SMA ning protein ifoda darajalari kuzatildi, ular aHSClarda Oba tomonidan sezilarli darajada inhibe qilindi (2A-rasm). Bundan tashqari, protein N-kaderin va salyangozning ifoda darajalari kamaydi, E-kaderinning protein ifodasi darajasi esa ko'tarildi (2B-rasm), bu EMT yo'li ham bloklanganligini ko'rsatadi [3]. Bundan tashqari, biz Oba IL darajasini pasaytirganini aniqladik-6(2C-rasm).Qarishga qarshi sistancheOba ning yallig'lanishga ta'sirini qo'shimcha baholash uchun biz birinchi navbatda HepG-2 hujayralarini (odamning gepatotsellyulyar karsinoma hujayra liniyasi) 20 nmol CCl4 bilan rag'batlantirdik, so'ngra 20 uM Oba bilan davolashni boshladik. Bu natijalar Oba CCl4-stimulyatsiya qilingan HepG-2da IL-6 ning mRNK va protein ekspresyon darajasini pasaytirishi mumkinligini ko'rsatdi (2D-rasm). Umuman olganda, oba bir nechta antifibroz ta'sir ko'rsatdi. TGF- / Smad signallari va EMT jarayonini inhibe qilish orqali, shuningdek, yallig'lanishga qarshi.

2.3. Obaning anti-fibroz ta'siri GPXx-ni faollashtirish orqali antioksidant salohiyatini oshirishga bog'liq edi-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{0}}.75 mkM, Lx-2 ning hujayra hayotiyligi sezilarli darajada kamaydi; shuning uchun GPx-4 ifodasiga aralashish uchun 0.75-mM RLS tanlandi. Western blot natijalari shuni ko'rsatdiki, aHSC'larga RSL3 qo'shilganda, GPx-4 protein ifodasi kamayadi va -SMA va vimentinni o'z ichiga olgan profibrotik belgilar sezilarli darajada teskari bo'lib, Oba ning fibrozga qarshi ta'sirida vositachilik qilishda GPx-4 muhimligini ko'rsatadi (3D-rasm). Shu bilan birga, Oba ROS lyuminestsent detektorlari tomonidan aHSClarning ROS darajasini aniq pasaytirdi va bu ta'sir RSL3 tomonidan bloklangan (rasm). Bu ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, GPx-4 vositachiligidagi past fosfolipid ROS darajasi fibrozga qarshi asosiy omil bo'lgan. Oba signali.

2.4. Oba CCl4-Sichqoncha jigarining fibrozini susaytiradi

CCl{0}}induktsiyali jigar fibrozisi jigar fibrozini o'rganish uchun eng ko'p ishlatiladigan sichqoncha modellaridan biridir [3]. Gistologik darajada, Oba jigar patologiyasini sezilarli darajada engillashtirdi, bu Masson binoni va anti-SMA bo'yash bilan ko'rsatilgan yaxshilangan kollagen cho'kmalaridan dalolat beradi. (4A-D-rasm). Keyin, CCL4 sichqonlari bilan solishtirganda, alanin transaminaza (ALT) / aspartat transaminaza (AST) ning sarum darajalari jigarning shikastlanish darajasini aniqlash uchun aniqlandi, past dozali Oba guruhi va PFD guruhi ALT darajasini sezilarli darajada kamaytirdi (p).<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba GPx-4 ifodasini kuchaytirdi, yallig'lanishni, EMT bilan bog'liq oqsillarni ifodalashni va CCl4-induktsiyalangan jigar fibrozining lipid oksidlanish darajasini pasaytirdi

5A-rasmda ko'rsatilganidek, Oba IL -6 protein ifodasini va sichqonlarning fibrotik jigarida EMT paydo bo'lishini salyangoz va N-kaderin darajasining kamayishi, ammo E-kaderinning yuqori darajalari bilan inhibe qildi. Bundan tashqari, Nrf-2 va GPx-4 ning protein ifodalari Oba ning o'rta va yuqori dozalari bilan davolashdan keyin aniq ortdi (5B-rasm).cistanche beefíciosImmunohistokimyoviy bo'yash (IHC) natijalari shuni ko'rsatdiki, model guruhi bilan taqqoslaganda, yuqori va o'rta dozali Oba guruhlarida GPx-4 musbat hujayralar (jigarrang) soni sezilarli darajada oshgan (5C, E-rasm). Keyinchalik biz sichqon jigarida oksidlovchi stress darajasini sinab ko'rdik va nazorat bilan solishtirganda, model guruhining ROS floresansi intensivligi yuqoriroq ekanligini aniqladik. Boshqa tomondan, Oba bilan davolashdan keyin ROS darajasi sezilarli darajada kamaydi (5D, F-rasm).

3. Munozara

Fibroz - bu dunyodagi intim kasallikdir. Etiologiyasi qanday bo'lishidan qat'i nazar, virusli infektsiya, alkogolli yoki alkogolsiz gepatit va otoimmün reaktsiyalar, surunkali jigar shikastlanishi tufayli fibroz bilan yakunlanadi [1]. HSClarning faollashishi jigar fibrozining asosiy hodisasidir. HSClar turli xil fibrogenik omillarning aberrant ishlab chiqarishlari va ECM cho'kmalari bilan faollashadi [2,3]. Yuqoridagi jarayonlarda TGF- -bog'liq kanonik Smad faollashuv signalizatsiyasi, EMT jarayoni va IL-6-bog'liq surunkali yallig'lanish ishtirok etishi xabar qilingan [3,4]. Oba ning jigar fibroziga qarshi fibroz ta'sirini baholash uchun biz birinchi navbatda uning TGF- tomonidan qo'zg'atilgan Lx{8}} faollashuviga ta'sirini aniqlashga, so'ngra uning in-vivo anti-fibroz ta'sirini tekshirishga e'tibor qaratamiz. Oxir-oqibat, CCl{12}}qo‘zg‘atgan jigar fibroz sichqonlari modeli.

Oba tabiiy limonoid birikma [24] va uning biologik ta'siri asosan yallig'lanishga qarshi [25], antioksidant [26] va o'smaga qarshi [27] funktsiyalarini o'z ichiga oladi. Yaqinda Oba kuchli va samarali Nrf{6}} agonisti ekanligi va sichqonlarda o'pka fibroziga qarshi ta'sir ko'rsatishi aniqlandi [28]. Biroq, uning jigar fibroziga qarshi ta'siri va tegishli molekulyar mexanizmlari haqida hali ham dalillar yo'q. Bu erda -SMA, kollagen 1 va CTGF ning haddan tashqari ifodalanishi TGF- bilan stimulyatsiya qilingan Lx-2 modellarida Oba tomonidan inhibe qilingan. Kengaytirilgan EMT signalizatsiyasi ham Oba tomonidan samarali ravishda bostiriladi.

Oksidlanish stressi fibrozning muhim hissasi ekanligi tasdiqlandi [12]. Reaktiv kislorod turlari (ROS) biologik faollikka ega oksidlangan molekulalar yoki ionlar uchun umumiy atama bo'lib, gepatotsitlarda turli xil ROS ning ortiqcha ishlab chiqarilishi uning o'limiga olib kelishi va jigar fibrozini keltirib chiqarishi mumkin [13]. Aksincha, tinch HSClar jigar hujayralari shikastlanishidan keyin faollashadi va haddan tashqari ROS ko'proq HSC faollashishini kuchaytiradi va jigar fibrozi bilan yakunlanadi [12]. Shu sababli, haddan tashqari oksidlovchi stressni yumshatish fibrozni samarali davolashga aylanadi.

Nrf-2 antioksidlovchi stressning muhim regulyatoridir, faollashtirilgan fosforlangan Nrf-2 quyi oqimdagi antioksidant oqsillar, GST, HO1[15] ning yuqori regulyatsiyasini ta'minlash uchun yadroga joylashadi. Nrf2 ning ko'plab tabiiy kimyoviy faollashtiruvchilari tert-butilhidrokinon va curcumin kabi anti-fibroz ta'sirga ega ekanligi xabar qilinadi. Barcha antioksidant oqsillar orasida glutation peroksidaza-4(GPx-4) glutation peroksidazalar oilasiga (GPx1-8) kiradi va glutationni kamaytirish orqali oksidlanish-qaytarilish muvozanatini osonlashtiradi. 30-32]. Glutation peroksidazaning yuqori ifodasi-7 ROS ishlab chiqarishni kamaytirish orqali jigarning alkogolsiz yog'li kasalligini inhibe qilgani isbotlangan [33]. GPx{17}} hujayralarni oksidlanish shikastlanishidan himoya qilish uchun lipid membranasidagi fosfolipid peroksidni kamaytirdiJ15]. Kazuya Tsubouchi va boshqalar. Sichqoncha o‘pkasining fibroz to‘qimalarida GPx-4 ifodasi bleomitsin qo‘zg‘atganida kamayishi va GPx-4 geni nokaut qilinganda fibroz yanada og‘irlashishini aniqladi. Bundan tashqari, GPx{23}} geni tugashi bilan o'pka fibroblastida lipid peroksidatsiyasi va TGF-/P-Smad yo'li sezilarli darajada kuchayadi [17]. So'nggi paytlarda fosfolipidlardan olingan ROS ferroptoz deb ataladigan maxsus hujayra o'limida ishtirok etishi haqida ko'proq dalillar tasdiqlandi. GPx{26}} inhibitori RSL3 ham ferroptoz induktori sifatida qo'llaniladi [21,34].

Tajribalarimiz davomida Oba antioksidant qobiliyatini Nrf-2 va GPx-4 ni yuqori tartibga solish va Nox-2 ni kamaytirish orqali amalga oshirishini aniqladik. Ta'kidlash joizki, GPx{6}} geni GPx-4 inhibitori RSL3 tomonidan inhibe qilinganida, Obaning fibrozga qarshi ta'siri sezilarli darajada zaiflashgan. Doimiy ravishda, Oba bilan davolash orqali ROS darajasining pasayishi ham yoritilgan. Ushbu in vitro kuzatuvlar GPx{9}}vositachilik qilgan antifosfolipid ROS Oba ning himoya ta'siri uchun juda muhim ekanligini tasdiqladi.

LX2 hujayralarida Oba ning yuqoridagi fibrozga qarshi davolash natijalarini tasdiqlash uchun CCl4-qo'zg'atgan sichqonlarning jigar fibrozi ham tekshirildi. CCl4 gepatotropik zaharning bir turi bo'lib, mikrosomal P450 fermenti vositachiligidagi degradatsiya natijasida hujayra membranasining yaxlitligini buzish uchun yuqori reaktiv erkin radikallar hosil bo'ladi, bu o'z navbatida bir qator jigar disfunktsiyasi va shikastlanishiga olib keladi, natijada jigar fibroziga aylanadi [35]. Bizning tajribamizda Oba CCl tomonidan qo'zg'atilgan jigar fibroziga yaxshi shifobaxsh ta'sir ko'rsatdi. Bu jigar shikastlanishini AST darajasining pastligi bilan engillashtirdi, kollagen tolalari to'plamlari maydoni kichraydi va a-SMA, CTGF, kollagen-1, salyangoz, N-kaderin va IL{{10} protein ifodalarini oshirdi. }} hammasi qisqartirildi. Antioksidant signalizatsiyasi, Nrf-2 va GPx-4 ning oqsil ifodalari ham yuqori bo'lsa-da, ROSning yuqori darajalari pasayib ketdi. Ushbu natijalar Oba tomonidan in vitro anti-fibroz ta'sirini va tegishli signalizatsiyani, ayniqsa Nrf-2 va GPx-4 tomonidan EMT va antioksidant ta'sirlarni inhibe qilishni tasdiqladi.

Xulosa qilib aytganda, Oba turli mexanizmlar orqali TGF{0}}induktsiyalangan HSC faollashuvini va CCl4-qo'zg'atgan jigar fibrozini engillashtirgan degan xulosaga keldik. Birinchidan, Oba klassik TGF- / Smad yo'lini, EMT va IL{3}} ishlab chiqarishni inhibe qildi. Ikkinchidan, u Nrf-2 va GPx-4 ifodalarini kuchaytirish orqali mukammal antioksidant qobiliyatini namoyish etdi. GPx{6}}vositachilik qilgan antifosfolipid ROS asosan uning fibrozga qarshi ta'siriga hissa qo'shgan. Shuning uchun Oba fibrozning oldini olish va davolash uchun nomzod kimyoviy regent bo'lib xizmat qilishi mumkin.

Oba C57 sichqonlarida CCl{0}}qo'zg'atgan jigar fibroziga qandaydir davolovchi ta'sir ko'rsatdi. Oba fibroz oqsili biomarkerlarining ifodasini pastga tushirishi mumkin edi, masalan: -SMA, CTGF va boshqalar. Shu bilan birga, Oba I-6, E-kaderin va boshqalarning protein ifodasini kamaytirdi. Mid-Oba qiziqarli edi. Bu oqsillarning nisbiy ifodasi bo'yicha past-Oba va yuqori-Obaga nisbatan yaxshiroq natijalar belgilarini ko'rsatadi, garchi bu statistik jihatdan ahamiyatli emas. Biroq, u optimal dozani ushbu jarayonda hal qiluvchi omil bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi va biz bu hodisani keyingi tajribada o'rganamiz. Bundan tashqari, biz Nrf-2 va GPx-4 ning yuqori tartibga soluvchi ifodalari bilan past ROS va jigar fibrozi darajasini aniqladik. Shunday qilib, Oba Nrf-2 va GPx-4 ni tartibga solish orqali jigar fibrozini engillashtirishi mumkinligiga ishonamiz. Biroq, PFD in vivo va vitro Obaga qaraganda yaxshiroq terapevtik ta'sirga ega bo'lishi mumkin. Biroq, Oba antioksidant ta'siri bo'yicha PFD dan yaxshiroq edi, bu anti-oksidant tomondan jigar-fibrogenik ta'sirga ega yangi dori topish imkoniyatini oshirishga yordam beradi va inson salomatligiga ozgina hissa qo'shadi.

4. Materiallar va usullar

4.1. Kimyoviy moddalar va reagentlar

Oba (no.B20553, tozaligi 98 foizdan katta yoki unga teng) va RSL3 (no. S81241, tozaligi 98 foizdan katta yoki unga teng) YUANYE Bio-Technology Co., Ltd.dan (Shanxay, Xitoy) xarid qilingan va eritilgan. dimetil sulfoksidda (DMSO) (no.R21950; YUANYE) mos ravishda 72,64 mg/ml va 6 mmol konsentratsiyasiga. Filtrni sterilizatsiya qilgandan so'ng, hosil bo'lgan eritma -20 daraja C da saqlanadi. Eritma DMSO yakuniy konsentratsiyasiga erishish uchun madaniy muhitga qo'shildi.<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Hujayra madaniyati va eksperimental dizayn

Odamning jigar yulduzsimon hujayrasi Lx-2 va inson jigari saraton hujayralari qatori Hepg-2 (barchasi Xitoyning Toʻrtinchi harbiy tibbiyot universiteti farmatsiya boʻlimidan olingan) Dulbekkoning oʻzgartirilgan burgut muhitida yetishtirilgan. DMEM) 10% homila sigir zardobi va 1% penitsillin (Thermo Fisher Scientific) va streptomitsin (Thermo Fisher Scientific) bilan to'ldiriladi va keyin 5% CO2 va 95% havo namlangan atmosferada 37C da saqlanadi. Oba ning Lx-2 hujayra hayotiyligiga ta'sirini baholash uchun Lx-2 quduq plastinkasiga 1×10* hujayralar bilan qoplangan va qo'shilishdan oldin 24 soat davomida inkubatsiya qilingan. Oba shahri. Keyin Lx{14}} turli konsentratsiyali Oba (10,20, 40,80 va 160 wM) bilan ishlov berildi va 24,48 yoki 72 soat davomida kulturalandi. Hujayra hayotiyligi CCK8 tomonidan sinovdan o'tkazildi. Baholash uchun Oba ning Lx{24}} faollashuviga ta'siri, Lx{25}} 12 soat davomida sarumsiz muhit bilan oldindan kultivatsiya qilingan, so'ngra TGF- (10ng/ml,24 soat) bilan stimulyatsiya qilingan va Oba bilan davolash yoki PFD. Oba ning yallig'lanishga ta'sirini baholash uchun Hepg -2 CCl4 (20 nm, 8 soat) bilan rag'batlantirildi va 20 mkM Oba bilan ishlov berildi. Kultura oxirida hujayralar to'plangan va ta'sirlangan. Western blotting va real vaqtda qPCR tahlili.

4.3. Hayvonlar va eksperimental dizayn

Og'irligi 20± 0,5 g bo'lgan erkak C57 sichqonlari (To'rtinchi Harbiy Tibbiyot Universitetining Laboratoriya hayvonlar markazi) 25 daraja ± 2 daraja harorat va 12-soat yorug'lik/qorong'u tsikli bo'lgan tegishli sharoitlarda joylashtirilgan. suv va oziq-ovqatdan bepul foydalanish. Ushbu tadqiqotdagi har bir tajriba 4-harbiy tibbiyot universiteti hayvonlarni parvarish qilish bo'yicha qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan protokollarga muvofiq amalga oshirildi. C57 sichqonlari tasodifiy ravishda 6 ta guruhga (har bir guruhda n=6) taqsimlandi: i) soxta nazorat guruhi, i) model guruhi, ii) yuqori Oba guruhi (CCl4 plus 6mg/kg Oba),io )o‘rta-Oba guruhi (CCl4 plyus 3 mg/kg Oba）, ø）past-Oba guruhi (CCl4 plyus 1,5 mg/kg Oba） va vi） PFD guruhi (CCl4＋ PFD). Model guruhi CCl4 (30) bilan ishlandi. foiz CCl4/zaytun moyi, 5 ml/kg qorin bo'shlig'iga in'ektsiya) haftasiga uch marta jigar fibrozini qo'zg'atish uchun 6-hafta. Boshqa guruhlar turli dozalarda Oba yoki PFD va teng miqdorda CCil4 intraperitoneal infektsiyasi bilan oziqlangan. a 6-hafta davri. CCl4 oʻrniga teng hajmdagi zaytun moyi C57ga ipas a sham control tomonidan yuborilgan. Ushbu maqoladagi har bir tajriba IV Harbiy Tibbiyot Universitetining Hayvonlar boʻyicha qoʻmitasi tomonidan tasdiqlangan protokollarga muvofiq amalga oshirilgan. G'amxo'rlik.

4.4.Western Blotting

C57 jigarlari yoki madaniyatli hujayralar to'qimalarni siqish apparati yoki hujayralarni qirib tashlash (Xizmat, KZ-2) yordamida RIPA buferida gomogenlashtirildi yoki lizing qilindi. Protein konsentratsiyasi BCA Protein Assay Kit yordamida o'lchandi. Lizat santrifüj qilindi (4 daraja, 12, 000 rpm, 5 daqiqa) va supernatant yig'ildi. Ishlash bosqichlari avval xabar qilinganidek bajarildi [14]. Namunalar Chemiluminescent Imaging and Analysis tizimi (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610) ostida skanerdan o'tkazildi.

4.5. Real vaqt rejimida qPCR tahlili

C57 jigarlari yoki madaniy hujayralar umumiy RNKni olish uchun trizol reagentida gomogenlashtirildi yoki lizing qilindi. Umumiy RNK RevertAid First Strand cDNA sintezi to'plamidan foydalanib, cDNKga teskari transkripsiya qilindi. -aktin ichki ma'lumot uchun ishlatilgan. RT-qPCR 7500 Real-time qPCR tizimida (Applied Biosystems) SYBR Premix Ex Taq reagentlari bilan amalga oshirildi. Amaldagi inson genlarining primerlari 1-jadvalda keltirilgan.

Ushbu maqola Molecules 2021, 26, 318 dan olingan. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules