Fukalesdagi florotanninlarning tarkibiy qismlariga umumiy nuqtai 2-qism

5. uchun usullarXarakterlash va miqdorni aniqlash

PTlarning biologik faolligiga va bir qator terapevtik strategiyalarda potentsial qo'llanilishiga bo'lgan qiziqish tobora ortib borayotganiga qaramay, bu birikmalar bilan ishlashda asosiy kurashlardan biri ularning kimyoviy tavsifi va strukturasini tushuntirishdir. Tijoriy standartlarning cheklanganligi bilan bog'liq holda, PTlarning ulkan kimyoviy o'zgaruvchanligi va murakkabligi sababli, PTlarni tahlil qilish hozirda juda qiyin vazifa bo'lib qolmoqda. Kolorimetrik usullardan foydalangan holda PTni baholashdan tashqariga chiqmaydigan ishlarni topish odatiy holdir [56,72,73]. Shunga qaramay, PT ning strukturaviy xususiyatlarini aniqlash uchun ko'p harakat qilindi, ular allaqachon ushbu birikmalar kimyosi bo'yicha tegishli ma'lumotlarni taqdim etgan.

Sistanx glikozidi, shuningdek, yurak va jigar to'qimalarida SOD faolligini oshirishi va har bir to'qimalarda lipofusin va MDA tarkibini sezilarli darajada kamaytirishi, turli xil reaktiv kislorod radikallarini (OH-, H₂O₂ va boshqalar) samarali tozalash va DNKning shikastlanishidan himoya qilishi mumkin. OH-radikallar tomonidan. Cistanche feniletanoid glikozidlari erkin radikallarni kuchli tozalash qobiliyatiga ega, S vitaminiga qaraganda yuqori darajada kamaytirish qobiliyatiga ega, sperma suspenziyasida SOD faolligini yaxshilaydi, MDA tarkibini kamaytiradi va sperma membranasi funktsiyasiga ma'lum bir himoya ta'siriga ega. Cistanche polisaxaridlari D-galaktoza sabab bo'lgan eksperimental qarigan sichqonlarning eritrotsitlari va o'pka to'qimalarida SOD va GSH-Px faolligini oshirishi, shuningdek o'pka va plazmadagi MDA va kollagen miqdorini kamaytirishi va elastin miqdorini oshirishi mumkin. DPPHga yaxshi tozalash ta'siri, qarigan sichqonlarda gipoksiya vaqtini uzaytirish, sarumdagi SOD faolligini yaxshilash va eksperimental qarigan sichqonlarda o'pkaning fiziologik degeneratsiyasini kechiktirish Hujayra morfologik degeneratsiyasi bilan tajribalar Cistanche yaxshi antioksidant qobiliyatiga ega ekanligini ko'rsatdi. va terining qarish kasalliklarini oldini olish va davolash uchun dori bo'lish potentsialiga ega. Shu bilan birga, Cistanchedagi echinacoside DPPH erkin radikallarini tozalashning muhim qobiliyatiga ega va reaktiv kislorod turlarini tozalash va erkin radikallar keltirib chiqaradigan kollagen degradatsiyasini oldini olish qobiliyatiga ega, shuningdek, timin erkin radikal anionining shikastlanishiga yaxshi ta'sir ko'rsatadi.

Cistanche Tubulosa qo'shimchasini bosing

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ushbu sohada suyuqlik xromatografiyasi massa spektrometriyasi bilan birgalikda ushbu birikmalarni tezkor tahlil qilish uchun kuchli analitik vosita bo'lib qolmoqda, garchi quruqlik fenoliklari bilan solishtirganda ba'zi nuanslar mavjud. Ushbu mavzu o'tgan yillar davomida PTlarni Fukalesdan ajratish va aniqlash uchun qo'llaniladigan usullar bo'yicha qilingan kashfiyotlarni ilgari suradi.

5.1. Florotanninlarning spektrofotometrik miqdorini aniqlash

PT miqdorini aniqlashning spektrofotometrik usullari ma'lum bir namuna yoki ekstraktdagi PT tarkibini baholash uchun tez va oddiy yondashuvni taklif qiladi. Fenolik birikmalar sifatida, Folin-Denis yoki Folin-Ciocalteu (FC) usullari umumiy PT tarkibini kuzatish uchun hayotiy yondashuv bo'lib qolmoqda. Ikkala usul ham fosfotungstik-fosfomolibdik reagentni (FC reagenti) taxminan 760 nm yutilish spektriga ega bo'lgan ko'k rang hosil qiluvchi kimyoviy-fenol vositachiligida ma'lum bo'lgan kamaytirishga asoslangan [74]. Biroq, PTlar jigarrang dengiz o'tlarida mavjud bo'lgan asosiy fenolik birikmalar bo'lsa ham, boshqa bir qator florotannin bo'lmagan fenolik birikmalar ham mavjud [75]. Bundan tashqari, bu reaktivning sezgirligi yo'q, chunki u nafaqat fenolik moddalar bilan, balki namunadagi har qanday qaytaruvchi moddalar (masalan, shakar, oqsillar, vitaminlar, tiollar va noorganik ionlar) bilan ham reaksiyaga kirishadi va shu bilan uning umumiy kamaytirish qobiliyatini o'lchaydi [76] . Shuning uchun, agar diqqat markazida PT bo'lsa, bu eng mos yondashuv bo'lmasligi mumkin, chunki bu noaniq reaktsiyalar noto'g'ri ko'rsatkichlarga va noto'g'ri baholarga olib kelishi mumkin. Aniqroq usul Stern va boshqalar tomonidan ishlab chiqilgan. [77] 2,{13}} dimetoksibenzaldegid (DMBA) yordamida 1,{15}} va 1,3,{18}}almashtirilgan fenollar, masalan, floroglyuksinol va PTlar bilan reaksiyaga kirishadi va trifenilmetan pigmentlarini hosil qiladi. 510 nm oralig'ida kuzatilishi mumkin. Biroq, bu reaktsiya birikmalarning dallanish darajasiga yoki qo'shimcha gidroksil guruhlarning mavjudligiga bog'liq, masalan, halos. DMBA bilan reaktsiya gidroksil guruhlari o'rtasida ikki, to'rt yoki olti pozitsiya orqali sodir bo'lishi kerakligi sababli, bu pozitsiyalarni almashtirish xromofor shakllanishiga to'sqinlik qiladi va natijada kam baholanadi.

Ushbu usullar ko'plab namunalardagi PT tarkibini tez va dastlabki baholash uchun foydali deb hisoblansa-da, ularning asosiy kamchiliklari alohida birikmalarning aniq miqdorini aniqlash va identifikatsiya qilish qobiliyatining yo'qligi bo'lib, bu ularni faollashtirish uchun yanada murakkab va kuchli ajratish va analitik usullarga murojaat qilishni talab qiladi. PTning strukturaviy xususiyatlarini to'g'ri yoritish.

5.2. Florotanninlarni ajratish va aniqlash usullari

5.2.1. HPLC-DAD

Ularning strukturaviy o'xshashligi va murakkabligi tufayli PTni tahlil qilish va alohida birikmalarni aniqlash juda qiyin vazifa bo'lib qolmoqda. PTni tahlil qilishda duch keladigan asosiy muammolardan biri bu ularni xromatografik ajratishdir. Murakkab tuzilmalarning yaqin o'xshashligi va bir nechta izomerlarni hosil qilish imkoniyati HPLC va hatto uning yangilangan varianti UHPLC dan foydalanganda alohida PTlarni to'g'ri ajratishga erishishni qiyinlashtiradi. Ushbu sohada adabiyot ikkita asosiy yondashuvga bo'linadi: teskari va normal fazali xromatografiya. Bir tomondan, teskari xromatografiya murakkab namunalar ichida o'xshash tuzilishga ega birikmalarni ajratish uchun foydali bo'lsa-da, PT ning yuqori qutbli tabiati ularga mobil fazaga o'ziga xos yaqinlik beradi, bu esa juda tez elutsiyaga olib keladi va tipik, yomon erigan "dumlar" hosil qiladi. " [78]. Biroq, bu usul Fucus (F. vesiculosus, F. Aguirre, F. serratus va F. spiralis), Cystoseira (C. nodi caulis) jinsidan bir nechta turlarni o'z ichiga olgan bir nechta fukallarning PTlarini tahlil qilish uchun keng qo'llaniladi. , C. tamariscifolia va C. usneoides), A. nodosum va B. bifurcate va boshqalar; va odatda 8-10 birlikdan uzunroq birikmalarni ajratishga imkon bermasa ham, bu dengiz o'tlarining PT profilining past polimerizatsiya darajasiga oid qimmatli tushunchalarga erishish uchun juda foydali bo'ldi [16,47,48,50,79]. Boshqa tomondan, normal faza bu yuqori qutbli birikmalarni yaxshiroq ushlab turadigan polar-statsionar fazadan foydalanishni o'z ichiga oladi. PTlarni ajratish va izolyatsiya qilish uchun ushbu texnikadan foydalanish o'tmishda tez-tez bo'lgan, mualliflar birikmalarni oldindan atsetilatsiya qilishni qo'llashgan. Haqiqatan ham, Glombitsa va uning hamkasblari ushbu texnikadan foydalangan holda Cystophora, Sargassum va Carpophyllum [80-83] avlodlaridan bir nechta PTlarni ajratib olish va tavsiflash, hatto Carpophyllum angustifolium [84] va turli xil turlarda halogenlangan PTlarni aniqlashga muvaffaq bo'lishdi. jinsi, Cystophora [85,86]. Yaqinda Koivikko va boshqalar. [87] RP-HPLC bilan solishtirganda F. vesiculosus PTlarni polimerlanish darajasiga ko'ra, oldingi atsetilatsiya bosqichini talab qilmasdan ajratish uchun mos bo'lgan NP-HPLC usulini ishlab chiqdi va RP-HPLC bilan solishtirganda yaxshilangan saqlash vaqtlari va eng yuqori aniqlanishi bilan xromatogramma ishlab chiqarishga qodir. Ushbu usul, shuningdek, A. nodosum tomonidan boshqariladigan inson ko'ngillilarining siydik namunalarida PT metabolitlarini tahlil qilish uchun ham ishlatilgan [88]. NP-HPLC ning asosiy muammosi shundaki, ko'proq gidroksi guruhlari bo'lgan yuqori PTlar qutbli statsionar fazalar bilan kuchli o'zaro ta'sir o'tkazadi, bu esa ularni ajratishni juda qiyinlashtiradi. Bundan tashqari, tipik NP erituvchilarni ESI bilan o'zaro bog'lash 100 foiz polar bo'lmagan erituvchilarda zaif ionlanish samaradorligi tufayli sezgirlikning pasayishi tufayli qiyin bo'lishi mumkin [78].

Yaqinda ushbu muammolarni bartaraf etishning muqobil usullari o'rganildi. Bu oddiy fazali suyuqlik xromatografiyasining o'zgarishi hisoblangan gidrofil o'zaro ta'sirli suyuqlik xromatografiyasi (HILIC) holatidir va gidrofil statsionar fazalarning teskari fazali past suvli elimentlar bilan kombinatsiyasi bilan tavsiflanadi, bu esa harakatchan suyuqlikda ikki qatlam hosil bo'lishiga yordam beradi. faza, ya'ni qutb-statsionar faza yuzasida suvga boy qatlam va uning ustida boshqa organik moddalarga boy qatlam hosil bo'ladi (3-rasm), ustun ichida suyuqlik/suyuqlik ekstraktsiyasiga o'xshash tizim hosil qiladi [89] ]. Ushbu xromatografik rejimda analitlar ushbu ikki qatlam o'rtasida taqsimlanadi va bu ikki faza o'rtasida sodir bo'ladigan bo'linish muvozanatining siljishiga qarab elutsiya qilinadi, ammo boshqa o'zaro ta'sirlar, masalan, dipol-dipol, vodorod aloqasi va elektrostatik kuchlar ham muhim rol o'ynaydi [90]. ].

Bu xususiyatlar HILIC ustunlarini PTlarni ajratish uchun eng mos holga keltiradi, bu ularga qutb-statsionar faza bilan kuchli o'zaro ta'sir o'rnatishga imkon beradi, natijada ularni ushlab turish va ajralish vaqtini oshiradi. Ushbu usul PTlarni turli xil Fukales ekstraktlaridan, xususan F. vesiculosus, F. spiralis, A. nodosum, S. longicorns va P. canaliculata ajratish uchun qo'llanilgan, bu polimerlanish darajasi 3 dan 3 gacha bo'lgan birikmalarni ajratish va aniqlash imkonini beradi. 49 birlik [78], bu Tierney va boshqalar tomonidan xabar qilinganidan ancha uzoqdir. [45], F. spiralis, A. nodosum va P. canaliculata profilini aniqlash uchun RP ustunidan foydalangan holda xuddi shunday tadqiqot o'tkazgan va faqat 16 birlikgacha bo'lgan DP bilan birikmalarni aniqlashga erishgan [45].

Yaqinda 2D LC texnikasi (4-rasm) dengiz o'tlari ekstraktidagi PTlarning murakkab aralashmalarini baholash uchun muvaffaqiyatli qo'llanilib, sezilarli darajada yaxshilangan ajratishga erishildi. Ushbu yondashuvda namunalar ketma-ket ulangan ikkita ajratuvchi ustunni o'z ichiga olgan apparatga AOK qilinadi, shunda birinchi ustundan chiqadigan eliment ikkinchi ustunga o'tkaziladi, u turli sharoitlarda ishlaydi. Odatda, ikkinchi ustun birinchi ustunni to'ldiruvchi ajratish mexanizmiga ega, shuning uchun birinchi ustundan yomon hal qilingan cho'qqilarni ikkinchisida to'g'ri ajratish mumkin [91]. PTning alohida holatida, eng tez-tez xabar qilingan o'rnatishlar HILIC ustunlari (birinchi o'lchov) birikmalarini polimerlanish darajasiga ko'ra, RP ustunlari (ikkinchi o'lchov) bilan birikmasini tavsiflaydi, bu ularning hidrofobikligiga ko'ra ajratish imkonini beradi. Ushbu texnikadan foydalanib, Montero va boshqalar. turlaridagi 50 dan ortiq birikmalarni, Cystoseria abies-marina [4] va Sargassum muticum [92] dagi 70 dan ortiq birikmalarni ajratish va aniqlashga muvaffaq boʻldi. 2-jadvalda Fukalesdagi PTlarni ajratish va aniqlash uchun vaqt o'tishi bilan foydalanilgan turli xil xromatografik konfiguratsiyalar va shartlar jamlangan.

Tabiiyki, ishlatiladigan ustunlardan qat'i nazar, U/HPLC har doim birikmalarni elutsiyalashda kuzatish uchun aniqlash tizimiga ulanishni talab qiladi. UV-Vis detektorlari, ayniqsa fotodiodli massivlar (PDA) HPLC bilan defislangan eng keng tarqalgan detektorlardir, chunki qiziqish uyg'otadigan ko'plab tabiiy birikmalar UV-Vis hududida (190-600 nm dan) so'riladi [93]. Ayniqsa, fenolik moddalar odatda 270-280 nm atrofida kuchli absorbanslarni namoyon qiladi va PTlar bundan mustasno emas, chunki ularning maksimal absorbsiyasi 270 nm ga yaqin [94]. HPLC-PDA yordamida birikmalarni aniqlashga ma'lum birikmaning UV spektri va saqlash vaqtini uning tijorat standarti bilan solishtirish orqali erishish mumkin. Bundan tashqari, ushbu usul murakkab namunalardagi alohida birikmalarning tarkibini aniqlash uchun juda foydali, chunki absorbans sifatida chiqarilgan bunday birikmalarning konsentratsiyasini Pivo qonuni yordamida miqdoriy o'lchash mumkin [95]. Biroq, PTlarni aniqlash va miqdorini aniqlash uchun ushbu yondashuvni qo'llash juda cheklangan, chunki bu maqsad uchun juda oz miqdordagi tijorat standartlari mavjud. Shuning uchun, PTlarni aniqlash odatda massa spektrometriyasi (MS) yoki yadro magnit rezonansi (NMR) kabi kuchliroq usullarni talab qiladi.

5.2.2. Mass-spektrometriya

U/HPLC asboblari bilan toʻgʻridan-toʻgʻri bogʻlangan MS dan foydalanish murakkab ekstraktlarning xarakteristikasida inqilob qildi, bu nisbatan qisqa vaqt ichida yuqori sezuvchanlikni taʼminladi va analitik imkoniyatlarni oshirdi. Shu sababli, ushbu uslub fenolik birikmalarni, shu jumladan PTlarni tavsiflash va aniqlash uchun barqaror amaliyotga aylandi. Tandem MS yoki MS/MS birikmalarning psevdomolekulyar ionlarining (odatda elektrosprey ionizatsiyasi orqali hosil bo'lgan) massa-to-zaryad nisbatini (m/z) ustundan elutsiyalanganda aniqlash imkonini beradi va keyinchalik ularning tegishli parchalanishini oladi. to'qnashuvdan kelib chiqqan dissotsiatsiya (CID) orqali naqshlar [118]. Bu PTlarni tayinlashda hal qiluvchi qadamdir, chunki hosil bo'lgan fragmentlar ularni yaratgan asosiy ionning strukturaviy xususiyatlari haqida muhim ma'lumot berishi mumkin. Odatda, deyarli har bir PT MS2 da bir yoki ikkita suv qismining yo'qolishiga to'g'ri keladigan tayanch cho'qqisini taqdim etadi [46]. Xuddi shunday, 126 Da ni yo'qotish bu birikmalarning umumiy xususiyatidir, chunki bu PT ning qurilish bloki bo'lgan floroglyuksinol qismiga to'g'ri keladi [119]. Boshqalar zarariga ma'lum bir neytral yo'qotishning paydo bo'lishi floroglyuksinol birliklari o'rtasida o'rnatilgan aloqalar turini tushunish uchun muhimdir. Misol uchun, C-C aloqalari odatda C-O-C bog'lanishlariga qaraganda ko'proq energiya talab qiladi deb faraz qilsak, bir xil polimerlanish darajasiga ega fukollar, floretollar va fukofloretollar bir xil molekulyar og'irlikni ko'rsatadi, lekin oxir-oqibat turli xil parchalanish naqshlarini keltirib chiqaradi. Floretollarda parchalanish efir bog'ining har ikki tomonida sodir bo'lib, floroglyuksinol, tetragidroksibenzol yoki rezorsinolga to'g'ri keladigan 126, 142 yoki 110 Da neytral yo'qotishlarni hosil qiladi (5A-rasm), shuningdek, ularning qo'shimcha suv floroglyusinol yoki birliklar. Aksincha, yoqilg'ilarga xos bo'lgan CC bog'larining uzilishi faqat 126 Da (phloroglyucinol) neytral yo'qotishlarga olib kelishi mumkin va bu aloqalarni uzish uchun ko'proq energiya talab qilinganligi sababli, yoqilg'ilar ham ko'pincha 14, 28, 44 va 84 Da neytral yo'qotishlarni keltirib chiqaradi. (5B-rasm), shuningdek, ularning qo'shimcha floroglyuksinol yoki suv qismlari bilan birikmalari, ular o'zaro halqali bo'linishlarni ko'rsatadi. Ikkala turdagi bo'linishlarni ko'rsatadigan birikmalar fukofloretollar bo'lishi mumkin (5A, B-rasm) [48]. Boshqa tomondan, fuhalollarni ajratish biroz osonroq, chunki bu birikmalar kamida bitta qo'shimcha gidroksil guruhini o'z ichiga olgan xloroetilga o'xshash tuzilishga ega. Shuning uchun, ma'lum polimerlanish darajasiga ega bo'lgan zalning psevdomolekulyar ioni floretin ekvivalentiga nisbatan har doim m/z 16 Da yuqori bo'ladi (5C-rasm). Bundan tashqari, ushbu birikmalarning MS / MS spektrlari ko'pincha tetragidroksibenzol va uning floroglyuksinol bilan birikmasiga mos keladigan bir nechta mahsulot ionlari va / yoki neytral yo'qotishlarni taqdim etadi (masalan, [MH] - m / z 265, 389, 513 va boshqalar). [92].

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】