1-QISM Akteozid C-Fos induktsiyasini va NF-KB yo'lini inhibe qilish va ROS ishlab chiqarishni susaytirish orqali RANKL vositachiligida osteoklastogenezni bostiradi.
Mar 07, 2022
Seung-Youp Li1,2., Keun-Su Li3.¤, Sea Xyun Yi2., Sung-Xo Kuk2, Jeong-Chae Li2,3*
1 Chonbuk Milliy universiteti Klinik tibbiyot ilmiy-tadqiqot instituti, Chonbuk milliy universiteti kasalxonasi biotibbiyot tadqiqot instituti, Chonju, Chonbuk, Janubiy Koreya, 2 ortodontiya bo‘limi, Og‘iz bo‘shlig‘i biofanlari instituti va stomatologiya maktabi, Chonbuk milliy universiteti, Chonju, Chonbuk, Janubiy Koreya, 3 Bioaktiv materiallar fanlari boʻlimi, Bioaktiv materiallar tadqiqot markazi, Chonbuk milliy universiteti, Chonju, Chonbuk, Janubiy Koreya
Abstrakt
Ko'pgina tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, yallig'lanish sitokinlari osteoklastogenez uchun muhim vositachilar bo'lib, shu bilan ortiqcha suyak rezorbsiyasi va osteoporozga olib keladi.Akteozidning asosiy faol birikmasiRehmannia glyutinoza, an'anaviy sharq tabobatida keng qo'llaniladigan, yallig'lanishga qarshi va antioksidant salohiyatga ega. Ushbu tadqiqotda biz buni aniqladikakteozidYadro omili-kappaB (NF-kB) ligandining (RANKL) retseptorlari faollashtiruvchisi tomonidan qo'zg'atilgan suyak iligi makrofaglari (BMMs) va RAW264.7 makrofaglaridan osteoklast differentsiatsiyasi va shakllanishini sezilarli darajada inhibe qildi. Akteozidni oldindan davolash, shuningdek, dozaga bog'liq holda etuk osteoklastlar tomonidan suyak rezorbsiyasini oldini oldi.Akteozid(10 mM) p38 kinaz, hujayradan tashqari signal bilan boshqariladigan kinazlar va c-Jun N-terminal kinazning RANKL tomonidan stimulyatsiya qilingan faollashuvini zaiflashtirdi, shuningdek, p65 subunit va inhibitor kBa fosforillanishini inhibe qilish orqali NF-kB faollashuvini bostirdi. Bundan tashqari, RANKL vositachiligida c-Fos va faollashtirilgan T-hujayralarining yadro omili, sitoplazmatik 1 (NFATc1) va o'simta nekrozi omili-a, interleykin (IL)-1b hosil bo'lishida o'sish kuzatiladi. , va IL{15}} akteozid bilan oldindan ishlov berish orqali inhibe qilingan. Keyinchalik, og'zakiakteozidovariektomiya natijasida kelib chiqqan suyak yo'qotilishi va yallig'lanishli sitokin ishlab chiqarish darajasini nazorat qilish uchun kamayadi. Bizning ma'lumotlarimiz shundan dalolat beradiakteozidNF-kB, c-Fos va NFATc1 kabi mitogen faollashtirilgan protein kinazalarning RANKL tomonidan qo'zg'atilgan faollashuvini va transkripsiya omillarini bostirish orqali osteoklastlarning farqlanishini va osteoklastik prekursorlardan kamolotini inhibe qiladi. Umuman olganda, ushbu natijalar shuni ko'rsatadiakteozidosteoklast faollashuvini blokirovka qilish orqali suyak yo'qotilishini kamaytirish uchun rezorbsiyaga qarshi vosita sifatida harakat qilishi mumkin.
Qo'shimcha ma'lumot olish uchun quyidagi manzilga murojaat qiling:emily.li@wecistanche.com
Kirish
Suyak doimo muvozanatli osteoklast va osteoblast faolligi bilan yangilanadi [1]. Osteoklastlar monotsitlar/makrofaglar avlodining gematopoetik prekursor hujayralaridan, osteoblastlar esa mezenximal nasldan kelib chiqadi [2]. Anormalosteoklast faollashuvi yoki kamaygan osteoblastogenez suyak gomeostazini buzishi mumkin, natijada osteoporoz, artrit va suyak saratoni kabi kasalliklarga olib keladi [3,4]. Osteoporoz keng tarqalgan suyak kasalligi bo'lib, sinish xavfini oshiradi. Osteoporozning eng keng tarqalgan shakli menopauzadagi ayollarda estrogen etishmovchiligi tufayli yuzaga keladi. Kortikosteroidlar va antiepileptiklar kabi dorilar ham suyak rezorbsiyasi va shakllanishi o'rtasidagi muvozanatni keltirib chiqarishi mumkin, bu esa osteoporozga olib kelishi mumkin [5]. Osteoporozni davolash uchun ko'plab anti-rezorbtiv inhibitörler, shu jumladan bifosfonatlar, kalsitonin, estrogen va selektiv estrogen retseptorlari modulatorlari ishlatilgan. Ushbu inhibitorlar osteoklast funktsiyasini inhibe qilish orqali suyak massasini ushlab turadilar [6]. Estrogenlarni almashtirish terapiyasi postmenopozal osteoporozning oldini olish va davolash uchun eng mashhur davolash usuli hisoblanadi. Biroq, uzoq muddatli estrogen almashtirish terapiyasi endometriyal va ko'krak saratoni xavfini oshirishi mumkin. Shu sababli, ko'plab tadqiqotchilar o'z sa'y-harakatlarini nojo'ya ta'sirga ega bo'lmagan yangi rezorbsiyaga qarshi vositani ishlab chiqishga qaratdilar [7-10]. Osteoklastlar suyak rezorbsiyasida ishlaganligi sababli, ko'plab tadqiqotlarda osteoklastlarni ayniqsa inhibe qilish asosiy maqsad sifatida qabul qilingan. Osteoklastlar - monotsitlar/makrofaglar oilasining mononuklear ajdodlari tomonidan gematopoetik prekursor hujayralarining ketma-ket ko'payishi, differentsiatsiyasi va birlashishi orqali hosil bo'lgan ko'p yadroli gigant hujayralar [11]. Makrofag koloniyasini ogohlantiruvchi omil (M-CSF) va yadro omili (NF)-kB (RANK) ligandning (RANKL) retseptorlari faollashtiruvchisi osteoklastlarning differentsiatsiyasi uchun muhim omillardir [12]. Bundan tashqari, o'simta nekrozi omili (TNF) va interleykin (IL){17}}b kabi bir qancha yallig'lanish sitokinlari RANKL, osteoprotegerin va M-CSF [7,13] induktsiyasini modulyatsiya qilish orqali osteoklastogenezga hissa qo'shadi. RANKL ning hujayra yuzasidagi RANK retseptorlari bilan bog‘lanishi RANKL/RANK/TNFRga olib keladi.
NFkB va mitogen bilan faollashtirilgan protein kinazlarni (MAPK), jumladan cJun N-terminal kinaz (JNK), p38 kinaz va hujayradan tashqari signal bilan bog'liq kinaz (ERK) ni ketma-ket faollashtiradigan bog'liq omillar (TRAF) komplekslari [14]. Bu faollashuv osteoklastlarning differentsiatsiyasi, faollashuvi va omon qolishida vositachilik qilishda asosiy rol o'ynaydi. RANKL shuningdek, faollashtirilgan T-hujayralarining yadro omili, sitoplazmatik 1 (NFATc1) va-Fos kabi transkripsiya omillarining ifodasini faollashtiradi, bu osteoklast rivojlanishi uchun zarurdir [ 7,9]. Shuning uchun RANKL signalizatsiyasi osteoklast faollashuvini bostiradigan va suyaksiz bo'lgan anti-rezorbsiya vositalarining asosiy maqsadi hisoblanadi.Akteozidan'anaviy sharq tabobatida keng qo'llaniladigan Rehmannia glutinosa ning asosiy faol birikmasidir [15,16].Akteozidkuchli antioksidant bo'lib, anti-gepatotoksik, yallig'lanishga qarshi va anti-nosiseptiv ta'sirga ega [17-20]. Biz buni ilgari topdikakteozidERK signalizatsiyasini tartibga solish orqali tirozinaz faolligini va melanin biosintezini pasaytiradi [21], reaktiv kislorod turlari (ROS) vositachiligida gingival shikastlanishdan himoya qiladi [22] va mikotoksin vositachiligidagi hujayra shikastlanishini bostiradi [23]. Bu ta'sirlar bilan chambarchas bog'liqakteozidning ROSni olib tashlash va MAPK vositachiligidagi signalizatsiyani tartibga solish qobiliyati. Xususan, ROS RANKL tomonidan qo'zg'atilgan signalizatsiya yo'llari va osteoklastlardagi hujayra hodisalari vositachisi sifatida tavsiya etiladi. Antioksidantlar bilan oldindan davolash NF-kB, ERK va IkBa ning RANKL tomonidan qo'zg'atilgan faollashuvini inhibe qildi va shu bilan osteoklastogenezni bostiradi [24]. Ushbu topilmalar yallig'lanishga qarshi faollik va antioksidant faollikdan tashqari, rezorbsiyaga qarshi vosita uchun juda muhim ekanligini aniq ko'rsatdi.akteozidRANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklastogenezni bostirishi mumkin. Ushbu tadqiqotda biz buni o'rganib chiqdikakteozidsuyak to'kilishiga terapevtik ta'sir ko'rsatadi. ta'sirini ko'rib chiqdikakteozidin vitro va in vivo eksperimental tizimlardan foydalangan holda osteoklastlarning differentsiatsiyasi va suyak rezorbsiyasi va tegishli hujayra mexanizmlari bo'yicha.
Materiallar va uslublar
Axloqiy bayonot
Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish amaliyoti Chonbuk Milliy Universitetining Laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish va ulardan foydalanishda etika bo'yicha qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan (ruxsatnoma № CBU 2010-0007). Ushbu tadqiqotdagi barcha tajribalar universitetning Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish qo'mitasining ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi.
Sichqoncha, kimyoviy moddalar va laboratoriya buyumlari
To'rt haftalik urg'ochi ICR sichqonlari OrientBio Inc.dan (Seul, Koreya) sotib olindi va oziq-ovqat va suvdan erkin foydalanish imkoniyati bilan 12 soat yorug'lik/qorong'u tsiklda 2261uC va 5565 foiz namlikda joylashtirildi. Akteozid (3,4-dihidroksi-b-fenetil-Oa-ramnopiranoza sil-(1R3)-4-O-kaffeol-bD-glukopiranozid; C29H36O15) (S1-rasm) Rehmanniya barglaridan ajratilgan. glyutinoza. Ishlatishdan oldin akteozid fosfat tamponlangan sho'r suvda (PBS) eritildi. RANKL, TNF-a, IL{26}}b, IL-6 va M-CSF AR-GE tizimlaridan (Minneapolis, MN, AQSh) xarid qilingan. c-Fos,p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa va b-aktinga xos antikorlar Santa Cruz Biotexnologiyasidan (Santa Kruz, CA, AQSh) olingan. ). p-p38 va p38 uchun antikorlar Cell Signaling Technology (Danvers, MA, AQSh) dan sotib olingan. Sarum biokimyoviy parametrlarini aniqlash uchun CalciumAssay va Osteocalcin (OC) EIA to'plamlari mos ravishda BioAssay Systems (Hayward, CA, AQSH) va Biomedical Technologies (Stoughton, MA, AQSH) kompaniyalaridan sotib olindi. Sichqoncha tartratiga chidamli kislota fosfatazasi (TRAP) tahlil to'plami (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, AQSH) sarum TRAP5b darajasini o'lchash uchun ham ishlatilgan. Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, qo'shimcha kimyoviy moddalar Sigma Chemical Co. (Sent-Luis, MO, AQSh) dan olingan va laboratoriya buyumlari SPL Life Sciences (Pochun, Janubiy Koreya) dan olingan.
Hujayra madaniyatlari
Suyak iligi hujayralari 6 haftalik urg'ochi ICR sichqonlarining tibia va femoralaridan ilgari tasvirlangan usullarga muvofiq olingan [25]. Suyak iligi suspenziyasi 50 ng/ml M-CSF ishtirokida a100-mm kulturali idishda inkubatsiya qilindi. 3 kundan so'ng, yopishgan hujayralar osteoklastik farqlanishni keltirib chiqarish uchun suyak iligi makrofaglari (BMM) sifatida ishlatilgan. Ba'zi suyak iligi hujayralari ham M-CSFsiz 48 soat davomida inkubatsiya qilindi va yopishgan hujayralar boshqa joyda tasvirlanganidek, osteoblastlarni farqlovchi muhitda yetishtirildi [25]. RAW264.7 makrofag hujayralari 10 foiz homila sigir zardobi (FBS), 2 mM L glutamin va antibiotiklar bilan to'ldirilgan Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhitida (DMEM) o'stirildi. Ushbu hujayralar akteozidning osteoklastogenezga ta'sirini o'rganish uchun BMM uchun hamkasbi hujayra liniyasi sifatida ishlatilgan.
Osteoklastik farqlash va TRAP bo'yash
BMMlar 100 ng/ml RANKL bilan stimulyatsiya qilishdan oldin 2 soat davomida turli konsentratsiyali (0–50 mM) akteozid bilan oldindan ishlov berildi. Madaniyat muhiti 2 va 5 kunlarda yangi muhit bilan almashtirildi. 7 kunlik inkubatsiyadan so'ng kulturalar 4 foizli PBS-buferlangan paraformaldegidda mahkamlandi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq sigma Aldrich to'plamidan foydalangan holda TRAP bilan bo'yaldi. TRAP-musbat hujayralar optik mikroskop yordamida hisoblangan va 3 yoki undan ortiq yadroli hujayralar osteoklastlar hisoblanadi. hujayralar TRAP binoni uchun qayta ishlandi.
Hujayra hayotiyligini o'lchash
Hujayra hayotiyligi suvda eruvchan tetrazoliy tuzi (WST)-8 reagenti yordamida aniqlandi. Qisqacha aytganda, 10% FBS va antibiotiklarni o'z ichiga olgan o'sish muhitida o'stirilgan BMM yoki RAW264.7 hujayralari 10 mM akteozid yoki quercetin, luteolin, apigenin yoki epigallokatexin{6}}gallat (EGCG) kabi fenolik birikmalar bilan ishlov berilgan. WST{7}} reaktivi kulturalarga 48 soat inkubatsiyadan keyin qo'shildi. Qoʻshimcha 4 soat inkubatsiyadan soʻng WST{10}}maxsus absorbansi 450 nm da mikroplata oʻquvchi (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, AQSh) yordamida oʻlchandi.
Suyak rezorbsiyasi tahlili
BMMlar (16105 hujayra/ml) 50 ng/ml M-CSF va 100 ng/ml RANKLni o'z ichiga olgan a-MEMda to'xtatildi, so'ngra kaltsiy fosfat nanokristallari (OAAS{{6}) bilan qoplangan a24-quduq plastinkasiga bo'lindi. }; Osteoklast faolligini tahlil qilish substrati, Oscotec Inc., Choongnam, Janubiy Koreya) 26104 hujayra/sm2 zichlikda akteozidli va akteozidsiz. 7 kun davomida inkubatsiya qilingandan so'ng, hujayralar 5 foizli natriy gipoxlorit bilan plitalardan olib tashlandi va optik mikroskop ostida chuqur shakllanishi kuzatildi. Rezorbsiyalangan maydon ham tasvir analizatori tomonidan o'lchandi va nazorat qiymatining foizi sifatida ifodalandi.
Western Blot tahlili
Butun protein lizatlari boshqa joyda ta'riflanganidek lizis buferida tayyorlangan [26]. Sitozolik va yadro oqsillari ilgari ta'riflanganidek tayyorlangan [25]. Protein ekstraktining teng miqdori 12-15 foiz SDS-PAGE bilan ajratilgan va polivinil diflorid membranalariga yopishtirilgan. Blotlar birlamchi antikorlar bilan bir kecha-kunduzda 4uC haroratda tekshirildi va 1 soat davomida blokirovka qiluvchi buferda ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi. Blotlar yaxshilangan kimilyuminesans (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Bukingemshire, Buyuk Britaniya) bilan ishlab chiqilgan va rentgen plyonkasiga ta'sir qilgan (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, AQSH).
MAPK faoliyatini tahlil qilish
Hujayralar 2 soat davomida akteozid bilan oldindan ishlov berildi va keyin qo'shimcha -30 daqiqa davomida RANKL bilan stimulyatsiya qilindi. MAPK faolligi p-p38kinaz tahlil to'plami (Assay Designs, Inc., MI, AQSH), p-ERK enzim tahlili to'plami (Assay Designs) va p-SAPK/JNK sendvich ELISA to'plami kabi immunometrik tahlil to'plamlari yordamida aniqlandi. Cell Signaling Technology, MA, AQSH). Barcha protseduralar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga amal qildi va absorbans mikroplata o'quvchi tomonidan o'lchandi.
Elektroforetik harakatchanlikni o'zgartirish tahlili (EMSA)
DNK-oqsil bilan bog'lanish reaktsiyalari xona haroratida 30 daqiqa davomida, 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli (dI-dC), 5 foiz glitserin o'z ichiga olgan 20 ml buferda 10-15 mg protein bilan amalga oshirildi. ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM [a-32P] dCTP etiketli oligonukleotidlar va Klenow fragmenti DNK polimeraza. Namunalar 6 foizli poliakrilamid jellarda ajratilgan, ular quritilgan va rentgen plyonkasi (Eastman Kodak Co.) 270 ° C da 12-24 soat davomida ta'sirlangan. NF-ga xos oligonukleotid primer ketma-ketliklari 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 va 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30} edi. }}.
NF-kB lusiferaza tahlili
24-Quduq plitalaridagi RAW264.7 makrofaglari ishlab chiqaruvchining koʻrsatmalariga muvofiq 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, AQSH) yordamida0.8 mg kB-lusiferaza muxbir vektori bilan transfektsiya qilindi. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar mavjud va yo'qligida RANKL bilan rag'batlantirildi.akteozid24 soat davomida. Hujayralar 100 ml reporter lizis buferida qayta suspenziya qilindi (Promega, Madison, WI, AQSh). Teng miqdorda protein namunalari 96-quduq mikroplastinkalariga joylashtirildi va lusiferaza substrati bilan aralashtirildi. Luminesans mikroplastinkali luminometr yordamida o'lchandi (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germaniya). Ushbu tajribada ijobiy kB inhibitori sifatida o'tkazuvchan NF-B inhibitori peptid (BIOMOL, Butler Pike, PA, AQSh) ishlatilgan.
Sitokinlarni o'lchash
BMM yoki RAW264.7 hujayralari 24-quduq madaniyati plastinkalarida akteozid borligida RANKL bilan rag'batlantirildi. 48 soatlik inkubatsiyadan so'ng madaniyat supernatantlari yig'ildi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq TNF-a-, IL{6}}b- va IL-6-maxsus OptEIATM to'plamlari yordamida Elishay tomonidan baholandi.
Haqiqiy vaqtda teskari transkripsiya-polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-PCR)
c-Fos, NFATc1 va TNF-a kabi osteoklastik belgilarning mRNK ifodasi real vaqtda RT-PCR yordamida aniqlandi. Qisqacha aytganda, ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Trizolreagent bilan jami RNK makrofaglardan ajratildi (Invitrogen). cDNK SuperScriptReverse Transkriptaza II va primerlar (Invitrogen) yordamida 1 mg umumiy RNK bilan sintez qilindi. Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, AQSH) ABI 7500 ketma-ketlikni aniqlash tizimi (AppliedBiosystems) bilan velosipedda yurish paytida PCR mahsulotining to'planishini aniqlash uchun ishlatilgan. 95uC da 10 daqiqa davomida denatürasyondan so'ng PCR o'tkazildi
Hujayra ichidagi ROSni o'lchash
DMSOda 29,79-diklorodihidrofluoresein-diatsetat(DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmshtadt, Germaniya) dan iborat eritma tayyorlandi va qorong'i joyda 220uC da saqlanadi. Qisqacha aytganda, BMMlar ({7}}quduq plastinkalarida 106 hujayra/ml) 24 soat davomida 50 ng/MLM-CSF bilan o‘stirildi va keyin 100 lik stimulyatsiyadan 2 soat oldin turli konsentrasiyalarda (0-10 mM) akteozid bilan ishlov berildi. ng/mlRANKL. 1 soatlik birgalikda inkubatsiyadan so'ng, bu hujayralar 30 daqiqa davomida 25 mM DCFH-DA bilan inkubatsiya qilindi. FACS VantageH tizimi (Becton-Dikkinson, San-Xose, CA, AQSH) yordamida 515 nm (FL 1) da 29,79-diklorofloressein (DCF) yashil floresansi va 10,{26}} hodisa qayd etilgan. har bir namuna uchun hisoblangan.
Ovariektomiya bilan bog'liq osteoporozning paydo bo'lishi
Ushbu tadqiqot uchun ayol ICR sichqonlari (6 haftalik) ishlatilgan. Sichqonlar behushlik ostida soxta operatsiya (Sham, n=10) yoki jarrohlik ovariektomi (OVX, n=20) oldilar. Operatsiyadan bir hafta o'tgach, OVX sichqonlari tasodifiy ravishda har biri 10 ta sichqondan iborat 2 guruhga bo'lingan: ikki tomonlama OVX va ikki tomonlama OVX og'iz orqali 1 mM akteozidni o'z ichiga olgan 200 ml PBS bilan to'ldirilgan (AC guruhi). Og'zakiakteozidoperatsiyadan keyin 8 hafta davomida har 3 kunda bir marta qo'llanildi va Sham va OVX guruhlariga bir xil miqdordagi PBS yuborildi. Oxirgi qabul qilinganidan 1 kun o'tgach, sichqonlar qurbon qilindi, so'ngra qon zardobidagi biokimyoviy ko'rsatkichlar va 3-o'lchovli suyak tuzilishi tahlil qilindi.
Sarumning biokimyoviy parametrlarini aniqlash
Qon namunalari yurak ponksiyoni orqali, sarum esa santrifüj orqali yig'ildi. Sarum namunalari biokimyoviy ko'rsatkichlarni tahlil qilish uchun 280 ° C da saqlanadi. Sarumdagi IL-1b va IL-6 darajalari yuqorida tavsiflanganidek Elishay to'plamidan foydalangan holda, ishqoriy fosfataza (ALP) faolligi esa p miqdorini o'lchaydigan biokimyoviy kolorimetrik tahlil yordamida aniqlangan. -nitrofenol, boshqa joyda ta'riflanganidek, p-nitrofenol fosfat substratidan ishlab chiqariladi [27]. Suyak shakllanishi va rezorbsiyasi biomarkerlarini baholash uchun zardobdagi OC, kaltsiy va TRAP5b darajalari ham ishlab chiqaruvchilarning ko'rsatmalariga muvofiq aniqlandi.
Suyak tuzilishi va morfometrik parametrlarini tahlil qilish
Sichqonlarning femorasi (Sham, OVX va AC guruhlari) parchalanib, mexanik sinov uchun fiziologik sho'r suv bilan to'ldirilgan. Femurning mexanik kuchi boshqa joyda ta'riflanganidek o'lchandi [28]. Singan yuki o'ng son suyagining o'rta mili singan nuqtada nyutonlarda eng yuqori kuch sifatida qayd etilgan. Bundan tashqari, har bir hayvonning engil son suyagi mikrokompyuter tomografiyasi (mikro-KT) tizimi (SkyScan 1076 mikrofokusli rentgen tizimi, Kontich, Belgiya) yordamida histomorfometrik tahlil qilindi. Qisqacha aytganda, 4 foizli formaldegid omboridagi suyaklar skanerlashda qurib ketmasligi uchun plastik “yopishqoq plyonka” yoki parafilmga o‘ramasdan oldin qog‘oz to‘qimada yuzaki quritilgan. Har bir plastik o'ralgan suyak mikro-KT tasvirlash uchun 1076 skaner namunasi kamerasiga vertikal gorizontal ravishda o'rnatilgan plastik/polistirol ko'pikli naychalarga joylashtirildi. Skanerlash 100 kV manba kuchlanishi va 35 mm o'lchamdagi 140 mA manba oqimi yordamida amalga oshirildi. Femurning trabekulyar suyaklarining uch o'lchovli modellari SkyScan CT Analyzer 1.11 versiyasi yordamida qayta tiklandi. Trabekulyar suyakning mineral zichligi (BMD, g/sm3), foiz suyak hajmi (suyak hajmi (BV)/to'qima hajmi (TV), foiz), qalinligi (Tb.Th, mm), ajralish (Tb.Sp) kabi strukturaviy parametrlar. , mm) va raqam (Tb.N, 1/mm) keyin o'lchandi.
Osteogenik differentsiatsiya va mineralizatsiya tahlili
{{{10}}}} quduq madaniyati plastinkalarida yetishtirilgan suyak iligi hujayralari 10 mM akteozid ishtirokida DAG (10 nM deksametazon, 50 mM askorbin kislota va 20 mM b-gliserofosfat) bilan ishlov berildi. 2 haftalik farqlashdan so'ng, hujayralar 1 soat davomida muzli sovuq 70 foiz (hajm / hajm) etanol bilan mahkamlangan va xona haroratida 30 daqiqa davomida 0,2 foiz alizarin qizil Sin distillangan suv bilan bo'yalgan. Hujayralar to'xtatilgandan va havoda quritilganidan so'ng, hujayra madaniyati plitalari teskari mikroskop (Nikon TS100, Yaponiya) yordamida yorug'lik mikroskopida baholandi. Qizil bo'yoq miqdorini aniqlash uchun dog '10% asetil piridiniy xlorid bilan 20 daqiqa davomida silkitib, 560 nm da yutilish o'lchandi. Hujayra qatlamlarida to'plangan kaltsiy miqdori ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Kaltsiy to'plami (Wako Chemical Inc. Osaka, Yaponiya) yordamida ham o'lchandi. Bundan tashqari, suyakka xos mRNK markerlarining ifodasi, masalan, runt bilan bog'liq transkripsiya omili-2(Runx2), osteriks, suyak sialoproteini (BSP) va OC real vaqtda RT-PCR orqali aniqlandi. Ushbu markerlarning oligonukleotid primerlari boshqa joyda ta'riflanganidek PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) yordamida 200 bp dan kam mahsulot o'lchamlari bilan ishlab chiqilgan [27].
Statistik tahlil
Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, barcha ma'lumotlar 3 yoki undan ortiq mustaqil tajribalarning o'rtacha6 standart og'ishi (SD) sifatida ifodalanadi. Bir tomonlama ANOVA SPSS 12.0 dasturiy taʼminotidan foydalangan holda bir nechta taqqoslash uchun ishlatilgan. p-qiymati ,0.05 statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblanadi.
Natijalar
Akteozid dozaga bog'liq holda makrofaglar tomonidan osteoklast shakllanishini inhibe qiladi.
Akteozidning BMM ning osteoklastlarga differensiatsiyasiga ta'sirini tekshirish uchun hujayralar 50 ng/ml M CSF va 100 ng/ml RANKL ishtirokida 7 kun davomida turli konsentratsiyalarda (0–20 mM) akteozid bilan o'stirildi. . Akteozid osteoklastlar sonini dozaga bog'liq holda kamaytirdi. Hujayralar 2 soat davomida 10 mM akteozid bilan oldindan ishlov berilganda, osteoklastlar soni M-CSFand RANKL bilan to'ldirilgan hujayralarga nisbatan 43 foizga kamaydi (1A-rasm). 1B-rasmda RANKL vositachiligida osteoklastlarning differentsiatsiyasi va akteozid bilan birgalikda davolash orqali uning inhibisyonu ko'rsatilgan. Ushbu natijaga muvofiq, akteozidni oldindan davolash RAW264.7 hujayralarining RANKL tomonidan stimulyatsiya qilingan differentsiatsiyasini va osteoklast shakllanishini kamaytirdi (1C va D-rasm). BMM lardagi akteozidning anti-osteoklastik potentsiali bir xil konsentratsiyadagi (10 mM) bir nechta fenolik birikmalarning anti-osteoklast potentsiallari bilan taqqoslanganda, luteolin eng yuqori faollikni ko'rsatdi (2A-rasm). Biroq, luteolin, quercetin yoki apigeninning o'zi hujayralarning hayotiyligini pasaytirdi (2B-rasm). Barcha birikmalar RAW264.7 makrofaglari tomonidan osteoklastik farqlanishni quyidagi nisbiy faollik bilan inhibe qildi: luteolin. quercetin=apigenin .EGCG=akteozid (2C-rasm). Luteolin, quercetin yoki apigeninning o'zi ham hujayralarning hayotiyligini pasayishini ko'rsatdi (2D-rasm). Aksincha, quercetin bilan davolash BMM va RAW264.7 hujayralarida yashovchanlikning sezilarli darajada pasayishiga olib keldi, bu hujayralar 2 kun davomida har bir birikmaning 10 mM 50 ng / ml M-CSF, 100 ng / ml RANKL bilan ta'sirlanganda, yoki ikkalasi ham (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Ushbu birikmalarning kontsentratsiyasining 50 foizini inhibe qilish kerak bo'lganda
BMMlarda (IC50) osteoklast shakllanishi konsentratsiyali faollik egri chiziqlari yordamida hisoblab chiqilgan, akteozid, quercetin, luteolin, apigenin va EGCG ning IC50 darajasi mos ravishda 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 va 6,6 mM bo'lgan (2E-rasm). Bu natija RAW264.7 makrofaglari tekshirilgan holatga o'xshardi. Ushbu ma'lumotlar luteolin va quercetinning antiklastojenik ta'siri akteozidga qaraganda yuqori ekanligini ko'rsatdi. Aksincha, IC50 da quercetin ham hujayralarga engil toksik ta'sir ko'rsatdi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).
AkteozidMakrofaglar tomonidan suyak rezorbsiyasini inhibe qiladi Akteozid, shuningdek, in vitro model tizimi bilan o'lchanadigan dozaga bog'liq holda RANKL vositachiligida suyak rezorbsiyasini oldini oldi (3A-rasm). BMMs 1 mM akteozid bilan inkubatsiya qilinganida suyak rezorbsiyasi sezilarli darajada inhibe qilingan (3B-rasm). 10 mM akteozid bilan ishlov berish BMMlar tomonidan RANKL tomonidan qo'zg'atilgan chuqur shakllanishini deyarli butunlay susaytirdi. Xuddi shunday, akteozid RANKL bilan stimulyatsiya qilingan RAW264.7 hujayralarida suyak rezorbsiyasini kamaytirdi (S2A va B-rasmlar). ning qobiliyatiakteozidsuyak rezorbsiyasini inhibe qilish RANKL stimulyatsiyasiga nisbatan davolash vaqtiga bog'liq. RANKL stimulyatsiyasidan 4 kun o'tgach qo'shilgan akteozid (10 mM) BMMlarda chuqur shakllanishini kamaytirmadi, shu bilan birga u hosil bo'lgan osteoklastlar sonini bostirdi (3C-rasm). Bu turli xil natija qisman RANKL stimulyatsiyasi shakllanishidan 4 kun keyin allaqachon hosil bo'lgan chuqur maydoniga bog'liq edi (3D-rasm).
AkteozidErta RANKL signalizatsiya yo'llarini pastga tartibga soladi
RANKL osteoklast prekursorlarida 3 ta taniqli MAPK va NF-kB faollashuvini keltirib chiqaradi va bu faollashuv osteoklastlarning erta farqlanishi uchun talab qilinadi. Akteozidning osteoklastogenezni inhibe qilishining mumkin bo'lgan mexanizmlarini tushunish uchun biz akteozidning MAPKlarga ta'sirini va makrofaglarda NF-B faollashuvini tekshirdik. BMM va RAW264.7 hujayralari 2 soat davomida 10 mM akteozid bilan oldindan ishlov berildi va keyin 30 daqiqa davomida 100 ng / ml RANKL bilan stimulyatsiya qilindi. MAPK fosforillanishi Western blotting va immunometrik tahlil orqali tekshirildi. RANKL induktsiyasi p38, ERK va JNK inBMMs fosforillanishi (4A-rasm) va RAW264.7 hujayralari (4B-rasm). Akteozid p-p38, p-ERK va p-JNKda RANKL tomonidan qo'zg'atilgan bu o'sishni oldini oldi. Bu natija immunometrik tahlil bilan tasdiqlandi, bu 10 mM akteozid bilan oldindan ishlov berish ushbu makrofaglardagi fosforlangan MAPK darajasini sezilarli darajada inhibe qildi (4C-rasm). RANKL bilan davolash NF-kB ning DNK bilan bog'lanishini kuchaytirdi, akteozid esa NF-kB-DNK ulanishining RANKL tomonidan induktsiyasini inhibe qildi (5A-rasm). Bu inhibisyon RAW264.7 hujayralariga qaraganda BMMlarda ko'proq namoyon bo'ldi. Akteozid, shuningdek, BMM va RAW264.7 hujayralarida RANKL tomonidan stimulyatsiya qilingan p65 va IkBa fosforillanishini kamaytirdi (5B va C-rasm). 10 mMakteozid qo'shilishi BMMlarda IkBa ning degradatsiyasi va faollashuvini deyarli butunlay inhibe qildi (5B-rasm). NF kB faollashuvi akteozid ta'sirida ishtirok etishini qo'shimcha tasdiqlash uchun kB promotor-lusiferaza konstruktsiyalari vaqtinchalik RAW264.7 hujayralariga transfektsiya qilindi. 100 ng/ml RANKL bilan inkubatsiya qilingan hujayralar 3-katta yuqori kB promouter faolligiga ega bo'lib, bu faollik 10 mM akteozid tomonidan sezilarli darajada susaytirildi (5D-rasm).
Akteozid yallig'lanish sitokinlarini ishlab chiqarishni va TNF-a, c-Fos va NFATc1in RANKL tomonidan stimulyatsiya qilingan makrofaglarning ifodasini bostiradi.
TNF-a, IL-1b va IL-6 osteoklastlarning shakllanishi va funktsiyasida muhim ahamiyatga ega, bu RANKL-stimulyatsiya qilingan makrofaglarda NF-kB signalizatsiyasi orqali vositachilik qiladi. RANKL ushbu sitokinlarni ishlab chiqarishni rag'batlantirdi va bu ishlab chiqarish BMMlarda 10 mM akteozidni oldindan davolash bilan sezilarli darajada kamaydi (6A-rasm). Xuddi shunday, akteozid RAW264.7 makrofaglarida IL-6 bundan mustasno, RANKL tomonidan ishlab chiqarilgan sitokinlarni ishlab chiqarishni susaytirdi (S3-rasm). Osteoklastogenezda akteozid ta'sirining molekulyar mexanizmlarini tushunish uchun biz akteozidning TNF-a, c-Fos va NFATc1 ifodasiga ta'sirini ko'rib chiqdik. RANKL BMM va RAW264.7 hujayralarida ushbu omillarning mRNK ifodasini yuqori tartibga soldi (6B va C-rasm). 10 mM akteozid bilan oldindan ishlov berish ikkala omilda ham ushbu omillarning RANKL tomonidan qo'zg'atilgan ifodasini sezilarli darajada inhibe qildi.
BMM va RAW264.7 hujayralari. Akteozidni oldindan davolash, shuningdek, RANKL bilan stimulyatsiya qilingan BMMlarda c-Fos va NFATc1 ning protein darajasini sezilarli darajada kamaytirdi (6D-rasm). Bu natijalar shundan dalolat beradiakteozidgen va oqsil darajasida osteoklast hosil bo'lishining RANKL induktori mediatorlarini pasaytiradi.
Akteozid dozaga bog'liq holda BMMlarda hujayra ichidagi ROS hosil bo'lishini kamaytiradi
Hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarilishi RANKL tomonidan stimulyatsiya qilingan osteoklastogenez bilan bog'liqligi ma'lum bo'lganligi sababli, biz akteozid hujayra o'tkazuvchan, oksidlanishga sezgir bo'yoq, DCFH-DA yordamida RANKL vositachiligida osteoklast differentsiatsiyasi paytida ROS ishlab chiqarishni inhibe qiladimi yoki yo'qligini tekshirdik. Oqim sitometriyasi tahlili shuni ko'rsatdiki, BMMlarda DCF ga xos bo'lgan o'rtacha floresans signali, ishlov berilmagan nazorat hujayralari bilan solishtirganda, RANKL bilan stimulyatsiya qilingandan keyin o'ng tomonga siljigan (7A-rasm). Ushbu siljish RAW264.7 makrofaglari RANKL stimulyatsiyasidan keyin kuzatilgan holatga o'xshardi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). BMMlarni akteozid bilan davolash DCF ning signal intensivligini dozaga bog'liq holda pasaytirdi. 10 mM akteozid bilan dastlabki ishlov berish osteoklastlarning differentsiatsiyasi paytida hosil bo'lgan hujayra ichidagi ROS darajasini ishlov berilmagan nazorat darajalariga deyarli butunlay kamaytirdi (7B-rasm).
Og'iz orqali akteozidni qabul qilish tuxumdonga o'tkazilgan sichqonlarda osteoporotik biokimyoviy belgilarning o'zgarishini va suyaklarning yo'qolishini inhibe qiladi.
Akteozidning suyak yo'qotilishiga ta'sirini o'rganish uchun biz ovariektomiya orqali osteoporotik hayvon modelini tayyorladik. Tajriba davrida OVX va Shammice o'rtasida tana vaznida sezilarli farq yo'q (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Guruhda Sham guruhiga qaraganda IL-1b va IL-6 ning sarum darajasi sezilarli darajada yuqori edi (8-rasm). Ovariektomiya bilan bog'liq bu yallig'lanish sitokinlarining ko'payishi akteozidni og'iz orqali yuborish (AC guruhi) bilan susaytirildi. ALP, kaltsiy, TRAP5b va OC kabi suyak almashinuvi belgilarining sarum darajasi OVX guruhida sezilarli darajada oshdi. Ushbu osteoporotik belgilardan OVX sichqonlarida kaltsiy, TRAP5b va OC ning ko'tarilgan darajalari akteozid bilan davolash orqali inhibe qilingan, ALP ning sarum darajasi esa davolash bilan o'zgarmagan. O'ng son suyagining o'rtasiga o'rtacha maksimal sinish yuki OVX guruhida Sham guruhiga qaraganda sezilarli darajada past edi (9A-rasm). Akteozid bilan davolash sinishning maksimal zaxirasini Sham guruhiga ko'tardi. Femurning kortikal suyagi parchalanib, optik mikroskop bilan kuzatilganda, OVX guruhida ko'rsatilgan osteoporotik xususiyatlar AC sichqonlarida deyarli butunlay yo'qolgan (9B-rasm). Akteozidning OVX tomonidan qo'zg'atilgan osteoporoz modeliga ta'sirini tekshirish uchun engil proksimal femurning trabekulyar qismidagi BMD va suyak morfologik parametrlari mikro-KT yordamida tahlil qilindi. 9C-rasmda ko'rsatilganidek, OVX sichqonlarida femoral trabekulyar arxitekturaning o'zgarishi aniqlangan, bu o'zgarish esa akteozid bilan davolash orqali kamaygan. Mikro-KT tahlili natijalari shuni ko'rsatdiki, OVXmice-da suyak kuchining o'lchovi bo'lgan BMD keskin kamaygan (9D-rasm). Sham guruhi bilan solishtirganda, OVX sichqonlari ham BV / TV, Tb da sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi. Sp, va Tb. N, lekin Tb.Th emas. OVX sichqonlarini akteozid bilan og'iz orqali davolash BMD, shuningdek, BV / TV va Tb.N dagi o'zgarishlarni sezilarli darajada oldini oldi.
