Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Iltimos, 2-qismga bu yerni bosing

I-Fang Vang,1,2 Yixan Vang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsay,3,4* va Che-Kun Jeyms Shen1,2,7 ,*

1Neyron regenerativ tibbiyot instituti, Tibbiyot fanlari va texnologiyalari kolleji, Taypey tibbiyot universiteti, Taypey 11031, Tayvan

2Molekulyar biologiya instituti, Academia Sinica, Taypey 11529, Tayvan

3Klinik tibbiyot instituti, Tibbiyot kolleji, Cheng Kung milliy universiteti, Tainan 70403, Tayvan

4Klinik tibbiyot tadqiqot markazi, Cheng Kung milliy universiteti kasalxonasi, Tibbiyot kolleji, Cheng Kung milliy universiteti, Tainan 70403, Tayvan

5 Biotibbiyot fanlari kafedrasi va magistratura instituti, Tibbiyot kolleji, Chang Gung universiteti, Taoyuan 33302, Tayvan

6Neyrologiya tadqiqot markazi, Chang Gung memorial kasalxonasi, Linkou 33302, Tayvan

7 Etakchi aloqa

*Xat yozish: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche xotirani yaxshilashi mumkin

XULOSA

Fenotipik o'zgaruvchanlik tabiiy tanlanish orqali hujayra va organizm evolyutsiyasining asosiy shartidir. Genetik jihatdan bir xil hujayralarning fenotipik xilma-xilligida stoxastik gen ekspressiyasining roli yaxshi o'rganilgan bo'lsa-da, stokastik gen ifodasi va hayvonlarning individual xatti-harakatlari o'rtasidagi bog'liqlik haqida ko'p narsa ma'lum emas. Biz o'ziga xos miRNK (miR{0}}f-3p) Morris suv labirintidagi topshiriqni bajarayotganda individual tug'ilgan sichqonlarning bir qismining gipokampusida yuqori tartibga solinishini ko'rsatamiz. Muhimi, miR- 466f-3p neyron morfologiyasi, funksiyasi va fazoviy o‘rganishni ijobiy tartibga soladi vaxotirasichqonlarning qobiliyati. Mexanik jihatdan miR{0}}f-3p o'rganishning salbiy regulyatori bo'lgan MEF2A tarjimasini bostiradi.xotira. Nihoyat, biz hipokampal miR-466f-3p ning turli xil yuqori regulyatsiyasi odamlarda hipokampal siklik AMP (cAMP) - javob elementini bog'lash (CREB) ning tasodifiy fosforillanishidan kelib chiqqanligini ko'rsatamiz. Bu fazoviy o'rganishning modulyatsiyasi vaxotiraNeyron stimulyatsiyasiga tasodifiy hipokampal signalizatsiya o'qi orqali to'qimalarning gen ifodasidagi o'zgaruvchanlik hayvonlarning turli xil xatti-harakatlariga olib kelishini namoyish etadi.

KIRISH

Shaxslar orasidagi fenotipik o'zgaruvchanlik evolyutsion afzalliklarni beradi, chunki u tabiiy tanlanish ta'sir qiladigan populyatsiya xilma-xilligini ta'minlaydi (Pavlicev va boshq., 2011). Genetik kelib chiqishi va atrof-muhit omillari bunday tabiiy o'zgaruvchanlikni keltirib chiqaradi (Bendesky va Bargmann, 2011). Eksperimental ravishda inbred sichqonlar ko'pincha o'rtacha fenotiplar va xatti-harakatlarning molekulyar va hujayrali asoslarini o'rganish uchun ishlatilgan, shuning uchun sinovdan o'tgan shaxslar o'rtasidagi genetik farqlarning ta'sirini minimallashtirish uchun (Casellas, 2011). Biroq, individual izogen sichqonlar o'rtasida to'qimalar transkriptining ko'pligi o'zgarishi ko'rsatilgan. Juda o'zgaruvchan ifoda darajalarini namoyish qiluvchi genlar ko'pincha immunitet funktsiyasi, stress reaktsiyalari va gormonal tartibga solish, ya'ni atrof-muhit belgilariga sezgir jarayonlar bilan bog'liq (Vedell va boshq., 2011). Ushbu tadqiqotlarning ba'zilari, shuningdek, onaning yalashi, bachadonda oziq moddalar bilan ta'minlanishi yoki sezuvchanlikka nisbatan stressdan kelib chiqqan chidamlilik kabi atrof-muhit omillarining ta'siri bilan yoki ta'sirisiz gen ifodasi yoki hujayra signalidagi farqlar ekanligini ko'rsatdi (Bale, 2015; Danchin va boshq. ., 2011; Lorsch

va boshqalar, 2019; Pedersen va boshq., 2011), fenotiplar va xatti-harakatlardagi farqlarga olib kelishi mumkin (Casellas, 2011; Locke va boshq., 2015; Loos va boshq., 2015; Oey va boshq., 2015).

Fazoviy o'rganish vaxotiramiya tomonidan boshqariladigan shakllanishni ikkita tizimga bo'lish mumkin: (1) o'z-o'zidan harakatlanish va ichki signallardan foydalanadigan egosentrik navigatsiya va (2) organizmlardan tashqaridagi distal signallar bilan qo'zg'atiladigan hipokampus va yaqin atrofdagi miya tuzilmalarini o'z ichiga olgan allotsentrik navigatsiya (Ekstrom). va boshq., 2014). Fazoviy o'rganish qobiliyati vaxotirahayvonlarning ko'p turlariga fazoviy va vaqtinchalik o'zgaruvchan muhitga moslashish uchun o'z xatti-harakatlarini bosqichma-bosqich sozlash imkonini beradi, bu ularning omon qolishi uchun juda muhimdir. Buni laboratoriya hayvonlarida Morris suv labirintisi (MWM) kabi xatti-harakatlar paradigmalarini qo'llash orqali baholash mumkin (Vorhees va Uilyams, 2014). Shunisi e'tiborga loyiqki, genetik jihatdan bir xil tug'ma kemiruvchilar fazoviy o'rganishda fenotipik o'zgaruvchanlikni namoyon etishi vaxotira(Tsai va boshq., 2002), ammo bu xulq-atvor o'zgarishining asosiy mexanizmlari noma'lumligicha qoldi.

Yangi xotiralarning shakllanishi murakkab jarayon bo'lib, faollikka bog'liq bo'lgan genetik transkripsiyani, yangi oqsil sintezini va

Shakl 1. Fazoviy ta'limning o'zgaruvchanligi o'rtasidagi korrelyatsiya vaxotiraqobiliyati va miR-466f-3p induksiyasi

(A) Yovvoyi turdagi inbred C57BL/6J sichqonlarining MWM vazifasi. Chap panel: GLN sichqonlarining (nuqtalar) va PLN sichqonlarining (kvadratchalar) MWM ko'rsatkichlari. Sinovdan oʻtkazilgan jami 289 ta sichqondan 180 tasi GLNand109asPLN deb toifalarga ajratildi. Oʻng panel: probetesoftheMWMtask(n=47and30ineachgroup).Gistogrammada toʻrt kvadrantning har biriga va platforma hududiga sarflangan oʻlchovlar solishtiriladi. P, etishmayotgan platformaning joyi; T, P bo'lmagan maqsad zonasi; R, o'ng zona; O, qarama-qarshi zona; L, chap zona. (B) miRNK ifodasining RT-qPCR tahlili. MiR-466-669 klasteri va miR{10}}p ichida joylashgan oltita miRNKning nisbiy ifoda darajalari, miya bilan boyitilgan musbat nazorat sifatida, GLN va PLN sichqoncha gippokampidan olingan U6 snRNK ichki nazorati bilan tahlil qilindi va normallashtirildi. (n=9–18 ta guruh uchun). I, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3s.

kabi nozik sozlangan maxsus neyron tarmog'ixotirayangi neyron aloqalari va barqaror plastisiyani yaratish uchun engramlar (Asok va boshq., 2019). Tish girusidagi (DG) neyronlarning siyrak populyatsiyasi bo'lgan gippokampal engramlar neyronlarning ansambllarini ifodalaydi.xotirashakllanishi. DG engram neyronlari gen ekspressiyasining juda aniq namunasini namoyish qilsa-da (Rao-Ruiz va boshq., 2019), engramga xos molekulyar mexanizmlarxotirakonsolidatsiya ko'p jihatdan noma'lum bo'lib qolmoqda. Turli omillar va signalizatsiya yo'llari ma'lumki, o'rganishni ijobiy yoki salbiy tartibga soladi vaxotirajarayonlari aniqlangan (Abraham va boshq., 2019; Humeau va Choquet, 2019). Ular orasida siklik AMP (cAMP) - javob elementini bog'lovchi oqsilning (CREB) faollashtirilgan shakli neyronlarda hujayra ichidagi Ca2 plyusning faollikka bog'liq bo'lgan ko'payishiga javoban gen transkripsiyasini rag'batlantiradi (Kandel, 2012). Boshqa tomondan, lager/PKApathway o'zining HDAC5 korepressorining yadroviy eksportini va NFAT ko-aktivatorining yadroviy importini oldini olish orqali miyositlarni kuchaytiruvchi omil 2 (MEF2) transkripsiya faoliyatini repressiya qiladi (Belfield va boshq., 2006). Bundan tashqari, CREBdan farqli o'laroq, MEF2A faoliyati cheklanadixotirashakllanishi (Cole va boshq., 2012). Protein omillaridan tashqari, mikroRNKlar (miRNKlar) neyron funktsiyalarini, shu jumladan o'rganish va xotirani tartibga solishda ham ishtirok etadi (McNeill va Van Vactor, 2012). miRNKlar kichik (22 nt) kodlanmaydigan RNK bo'lib, ular 30 ta tarjima qilinmagan (30 UTR) o'ziga xos mRNK va Han17, mRNKning (Dau17) tanib olish joylari bilan ketma-ketlikka xos bo'lgan tayanch juftligi orqali gen ekspressiyasining birinchi navbatda akttaspost-transkripsiya regulyatorlaridir. miRNKlar post-mitotik neyronlarda signalizatsiya yo'llari qatorida ishtirok etadilar va ular faollikka bog'liq bo'lgan hujayra jarayonlarida vositachilik qiladi, jumladan dendritik o'sish va dallanish, sinaps shakllanishi va kamolotga etish. Gen ekspressiyasini tartibga solish orqali ular sinaptik plastisiyaning uzoq davom etadigan shakllarida ham muhim rol o'ynaydi.xotirashakllantirish, qidirish va mustahkamlash (Chen va Shen, 2013; Vang va boshq., 2012b).

Quyida biz to'qimalarning stoxastik genini ifodalash va hayvonlarning individual xulq-atvori o'zgarishi o'rtasidagi sababchi bog'liqlik uchun dalillarni taqdim etamiz. Xususan, biz hipokampal CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A o'qining stokastik faollashuvi fazoviy o'rganishning individual o'zgarishini modulyatsiya qilishini ko'rsatamiz.xotiraInbred sichqonlarda qobiliyat.

NATIJALAR

Fazoviy o'rganishning individual o'zgarishi vaxotiraqobiliyat ma'lum miRNK klasteridan miR-466f-3p induksiyasi bilan bog'liq

O'rganishni tartibga solishda ishtirok etadigan miRNKlarni aniqlash vaxotirashakllantirishda biz MWM vazifasidan yaxshi yoki yomon o'rganish va xotira qobiliyatiga ega bo'lgan inbred yovvoyi turdagi C57BL/6J sichqonlarini farqlash uchun foydalandik (1A-rasm). Biz oxirgi (6-chi) sessiyada topshiriqni 30 soniya ichida bajargan sichqonlarni "yaxshi o'quvchilar" (GLN) deb belgiladik, oxirgi sessiyada 30 soniya ichida platformani topa olmagan sichqonlar esa "kambag'al o'quvchilar" deb hisoblandi. ' (PLN). 1A-rasmda (chap panelda) ko'rsatilganidek, sichqonlarning 62 foizi GLN guruhiga (289 sichqondan 180 tasi) tegishli bo'lib, qochish kechikishini 98,1 s (1-sessiya) dan 21,8 s (6-sessiya)gacha sezilarli darajada kamaytirdi. Aksincha, sichqonlarning qolgan 38 foizi, ya'ni PLN guruhi (289 sichqonning 109 tasi)ning qochish kechikishi faqat birinchi va oltinchi seanslar orasida o'rtacha darajada kamaydi (1-sessiyadagi 111,8 s dan 6-sessiyada 82,1 s gacha) . Sichqonlarning oltita seans davomida vazifani haqiqatan ham o'rganganligini ko'rsatadigan zond testi, shuningdek, GLN sichqonlari PLN sichqonlariga qaraganda platforma hududida uzoqroq turishini ko'rsatdi (1A-rasm, o'ng paneldagi chap juft bar).

Keyinchalik, biz GLN va PLN sichqonlarining gipokampusidagi RNKlarni miRNK mikroarray gibridizatsiyasi orqali tahlil qildik (har bir guruhda n=4). Umuman olganda, biz GLN va PLN sichqonlaridan hipokampal miRNKlarning ifoda profillarida nisbatan kichik farqlarni kuzatdik. Biroq, biz GLN sichqonlarida ifoda darajasi PLN sichqonlariga qaraganda yuqori bo'lgan eng yaxshi 10 ta miRNK (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) hammasi bir xil kemiruvchilarga xos miRNK klasteridan, miR-466-669, 10-intronda joylashganligini ta'kidladik. mSfmbt2 geni (pastga qarang). Teskari transkripsiya-miqdoriy polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-qPCR) klasterdagi tanlangan miRNKlarning ifoda darajalarini tahlil qilish asosida biz keyingi tekshirish uchun miR-466f-3p ni tanladik (1B-rasm). Bu miRNKning oʻrtacha ifodasi GLN sichqonlarining gippokampusida PLN sichqonlariga nisbatan 1.5-baravar yuqori boʻlgan. Shunisi e'tiborga loyiqki, hipokampal miR-466f-3p ning o'rtacha darajasi PLN guruhi, uy qafasi (HC) nazorat guruhi va suzishni nazorat qilish guruhi (1C-rasm) o'rtasida o'xshash edi, shuning uchun mashqlar paytida mashqlar bilan bog'liq ta'sirlarni istisno qildi. suzish va miR-466f-3p fazoviy oʻrganish jarayonida yuzaga kelganligi haqidagi fikrni qoʻllab-quvvatlash vaxotirashakllanishi.

1C-rasmda ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, GLN sichqonlarining 42 foizdan ko'prog'ining hipokampal miR-466f-3p ifoda darajasi kamida 1.5-o'rtacha ifoda darajasidan yuqori bo'lgan. HC sichqonchani nazorat qiladi, holbuki PLN sichqonlarining 15 foizidagi darajalar HC sichqonlarining yarmini tashkil etdi. GLN sichqonlarining taxminan 25 foizi va PLN sichqonlarining 55 foizi miR-466f{{10}p (0.8- dan 1.2- gacha boʻlgan darajada oʻxshash boʻlgan. HC ga nisbatan katlama). Prob sinovi paytida miR{15}}f-3p darajalari va platformadagi foiz davomiyligi o‘rtasidagi ijobiy korrelyatsiyani ko‘rsatuvchi Pearson korrelyatsiya scatterploti 1D-rasmda keltirilgan. Shuningdek, biz GLN va PLN sichqonlarida miR{18}}f-3p va U6 kichik yadroli RNK (snRNK) in situ gibridizatsiyasini (ISH) bajardik (1E-rasm). ISH orqali miR- 466f-3p signallarining statistik tahlili shuni tasdiqladiki, miR{24}}f- 3p ning induksiyasi GLN sichqonlarining DG darajasida sichqonlarga nisbatan ko‘proq ekanligini tasdiqladi.

PLN sichqonlari, U6 snRNK signallari solishtirilganda hech qanday farq topilmadi (o'ng gistogramma, 1E-rasm). Garchi miR{2}}p signallari DG ning alohida granula hujayralari orasida teng bo'lmasa-da, ular hali ham GLN sichqonlarining hipokampusida PLN sichqonlariga nisbatan sezilarli darajada va hamma joyda oshgan. Shuning uchun miR-466f-3p induksiyasi hujayralarning faqat kichik bir qismida, masalan, engram neyronlarida sodir bo'lmagan. Ushbu ma'lumotlar MWM topshirig'i davomida miR-466f-3p ning ko'tarilishi fazoviy o'rganishni yaxshilash bilan chambarchas bog'liqligini ko'rsatadi.xotiraGLN sichqonlarining muhim qismi orasida qobiliyat.

Shuningdek, biz RT-qPCR yordamida bir nechta miyaga xos miRNKlarning o'rtacha ifoda darajalarini tahlil qildik. Ularning orasida MWM topshirig'idan keyin miR{2}}p sichqonchaning hipokampusida ko'tarildi, ammo biz GLN va PLN guruhlari o'rtasida sezilarli farqlarni kuzatmadik (bar juftligi VII, 1B-rasm). miR-335-5p va miR-22 ifoda darajalari GLN, PLN va HC guruhlari orasida oʻxshash edi (S1A-rasm). Shunday qilib, miR-466f-3p dan farqli o'laroq, MWM mashg'ulotlarida ushbu miRNKlarning gippokampal ifodasi fazoviy o'rganish bilan bog'liq emas vaxotirasichqonlarning qobiliyati.

miR-466f-3p ko'tarilishi neyrit o'sishi va dendritik umurtqa pog'onasi shakllanishiga yordam beradi

MiR-466f-3p haqiqatan ham neyronlarda ifodalanganligini tasdiqlash uchun birlamchi hipokampal neyronlarda NeuN va MAP2 ning immunofluoresans (IF) bo‘yalishi bilan birgalikda miRNA ISHni o‘tkazdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, boshqa miRNKlarga o'xshash (Cohen va boshq., 2011; Thomas va boshq., 2017), miR-466f-3p asosan neyronal soma hududida, ba'zi qo'shimcha signallar bilan ifodalangan. dendritlarda (S2A-rasm). Yuqori tartibga solinadigan miR-466f-3p ning o'rganish bilan bog'lanishining molekulyar va hujayrali asoslarini tushunish uchunxotirahosil bo'lganda, biz birinchi navbatda miR-466f-3p ni pFUGW- miR-466f-3p- dan ubiquitin promotori nazorati ostida dsRed termoyadroviy polipeptid bilan birgalikda haddan tashqari oshirib yubordik. dsRed plazmid DIV10 asosiy hipokampal neyronlarga (rasm S2B). miRNA ISH orqali miR{8}}f-3p signali miR{10}}f{11}}p haddan tashqari ifodalash guruhida vektor nazorati yoki mutant miR{{ga nisbatan kuchliroq ekanligini tasdiqladik. 12}}f{13}}p guruhi (strelkalar, S2B-rasm). Bunga parallel ravishda, miR{15}}f-3p funksiyasining yo‘qolishining miR-466f-3p inhibisyoni natijasida miR-gubka yordamida tekshiriladigan platforma ham yaratdik. pFUGW-miR-sponge-EGFP plazmididan ifodalangan 30 UTR EGFP mRNK (S2C-rasm). Shimgich plazmididagi EGFP muxbiri transfeksiya samaradorligi ko'rsatkichi va hujayra miRNK faolligi sensori bo'lib xizmat qildi (Kluiver va boshq., 2012). Transfektsiyalangan HEK293T hujayralarining sezilarli qismida EGFP signali yovvoyi turdagi miR-466f-3p bilan birgalikda ifodalanganda kamaydi, lekin mutant miR-466f{{32 bilan emas. }}p, 30 UTRda miR-466f-3p ni miR- shimgichga bog'lash orqali EGFP mRNK tarjimasini inhibe qilish tufayli (chap to'rtta rasm va ikkita uning dasturini solishtiring, S2C-rasm) . Bundan farqli o'laroq, biz pFUGW-SCR-sponge-EGFP plazmididan miR-466f-3p yoki miR{43}}f-3 bilan shifrlangan ketma-ketlikning sakkiz nusxasini kodlovchi nazorat shimgichining birgalikda ifodalanishida EGFP signalining pasayishini kuzatmadik. uning mutantini (o'ngdagi to'rtta rasm va ikkita histogrammani solishtiring).

2A-rasmda ko'rsatilganidek, miR{1}}f-3p ning ektopik ifodasi neyronlarning morfologik o'zgarishiga olib keldi, eng muhimi, dsRed ifodalovchi pFUGW- vektori bilan transfektsiyalangan nazorat neyronlariga nisbatan neyrit o'sishini kuchaytirdi. dsRed yoki mutant miR-466f-3p-ekspressiv plazmid pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Miqdoriy ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, neyron boshiga o'rtacha dendritik shoxchalar soni miR{14}}f-3p-ortiqcha ifodalovchi guruh (II satr) va vektor yoki mutant nazorati (I va III qatorlar) o'rtasida sezilarli darajada farq qilmagan (o'ngda). yuqori gistogramma, 2A-rasm). Biroq, o'rtacha umumiy dendrit uzunligi va birlamchi dendritlarning o'rtacha uzunligi miR{18}}f-3p haddan tashqari ifodalanganda ortdi (II satrni I va III chiziqlar bilan solishtiring, 2A-rasmning o'ng pastki gistogrammasi). Bunga parallel ravishda miR-sponge yordamida endogen miR-466f-3p ni inhibe qildik. Ko'rinib turibdiki, miR{24}}f{25}}p-inhibisyonu va nazorat guruhlari o'rtasida dendritik shoxchalar sonida sezilarli farq yo'q (IV satrni I va V chiziqlar bilan solishtiring, o'ng yuqori gistogramma, 2A-rasm) , ammo miR{29}}f-3p-inhibisyon guruhi boshqa guruhlarga nisbatan dendritlarning oʻrtacha umumiy uzunligi hamda birlamchi va ikkilamchi dendritlarning oʻrtacha uzunligi sezilarli darajada qisqarganini koʻrsatdi (IV satrni I va barlar bilan solishtiring). V, 2A-rasmning o'ng pastki gistogrammasi). Bundan tashqari, IF binoni shuni ko'rsatdiki, miR{33}}f-3p haddan tashqari ekspressiya, lekin inhibisyon emas, shuningdek, dendritik tikanlar zichligini oshirdi (2B-rasm, yuqori panellar va pastki chap gistogramma). Shuningdek, biz postsinaptik zichlikdagi protein 95 (PSD-95) uchun birgalikda bo'yashni amalga oshirdik va qo'zg'atuvchi sinapslarning aniq sonini aniqlash uchun kolokalizatsiyalangan dendritik tikanlar zichligini hisobladik (2B-rasm, pastki o'ng gistogramma), bu miR{{40} }}f-3p haddan tashqari ifodalanishi boshqa nazorat guruhlariga nisbatan PSD-95-musbat tikanlar zichligini oshirdi. Biroq, miR-466f-3p inhibisyonu PSD musbat tikanlarining zichligini nazorat guruhlariga nisbatan sezilarli darajada o'zgartirmadi (2B-rasm, pastki o'ng gistogramma). Birgalikda, bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, neyron stimulyatsiyasi bo'lmasa, miR{48}}f-3p inhibisyonining o'zi qo'zg'atuvchi sinapslar yoki umumiy dendritik tikanlar zichligiga ta'sir qilmaydi.