1-QISM Cistanche Deserticola polisaxarid sichqonlarda OVX sabab bo'lgan suyak yo'qotilishini va RANKL sabab bo'lgan osteoklastogenezni inhibe qiladi
Mar 02, 2022
Kirish
Osteoporoz - suyak massasining kamayishi, suyak to'qimalarining mikro tuzilishining anormalligi, suyaklarning mo'rtligi va sinishi bilan tavsiflangan kasallik (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli va Ginaldi, 2006) - hozirda dunyo bo'ylab 200 milliondan ortiq odamga ta'sir qiladi va jiddiy tibbiy va tibbiy yordam ko'rsatadi. zamonaviy jamiyatdagi ijtimoiy-iqtisodiy yuk (Strom va boshq., 2011). Osteoporozni klinik davolash asosan gormonlarni almashtirish, bifosfonat yoki denosumab terapiyasiga qaratilgan. Ushbu usullar samarali, ammo ko'krak saratoni va atipik femur sinishi xavfi kabi uzoq muddatli yon ta'sirga olib keladi (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof-Bauer, 2011). Shu sababli, nafaqat inhibe qila oladigan dori-darmonlarni o'rganishga shoshilinch ehtiyoj borosteoporozlekin kamroq istalmagan yon ta'sirga ega.
Cistanche deserticola(CD), Xitoyda keng qo'llaniladigan tonik va shifobaxsh oziq-ovqat bo'lib, "cho'l jenshen" nomi bilan mashhur bo'lib, bu quritilgan shirali poyadir.C. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) va xilma-xil va samaralifarmakologiktadbirlarimmunitetni tartibga solish, oksidlanishga qarshi va anti-oksidlanish kabiosteoporozxususiyatlar (Hu va boshq., 2020; Li va boshq., 2012; Zhang va boshq., 2014). Osteoporozni davolash bo'yicha CD ning faol moddalari bo'yicha oldingi tadqiqotlar asosan qaratilganfeniletanoidglikozidlar(Li, Jiang va Gu, 2018; Xu, Chjan, Vang, Yao va Ma, 2017). Shu bilan birga, kompakt diskda iridoidlar, lignanlar kabi boshqa samarali komponentlar ham mavjud.polisakkaridlar(Vang, Zhang va Xie, 2012). An'anaviy xitoy tibbiyotining (TCM) klinik qo'llanilishi asosan suvni qaynatishdir.Polisaxaridlarsuvda eriydigan komponentlar bo'lib, TCM ning asosiy farmakodinamik komponentlari bo'lishi mumkin. TCM dan olingan polisaxaridlar anti-g'ayritabiiy ta'sirga ega ekanligi haqida xabar berilgan.osteoporozta'siri va odatda klinikalarda qo'llaniladigan bir nechta kiruvchi nojo'ya ta'sirlar (masalan, Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020) dan olingan polisaxaridlar), Achyranthes bidentata (Chjan, Zhang, Zhang, Vang, & Yan, 2018) va Morinda officinalis (Yan va boshq., 2019)). Shuning uchun biz buni taxmin qildikCistanche deserticolapolisakkaridCD dan olingan (CDP) osteoporozni davolash uchun potentsial xavfsiz dori bo'lishi mumkin.
Odatda, suyak rezorbsiyasi va suyak shakllanishi bir necha turdagi hujayralar, jumladan, osteoklastlar, osteoblastlar, suyak qoplami hujayralari va osteotsitlar bilan muvofiqlashtirilgan holda suyakni qayta qurish jarayonida dinamik muvozanatni saqlaydi (Kular, Tickner, Chim va Xu, 2012). Ushbu muvozanatning buzilishi suyaklarning turli metabolik kasalliklariga olib kelishi mumkin, masalanosteoporoz(Zhu va boshq., 2018) va osteoskleroz (Ihde va boshq., 2011). Osteoklastlar mononuklear/makrofag nasl-nasabidan kelib chiqqan so'nggi differentsiatsiyalangan hujayralar sifatida suyak rezorbsiyasi funktsiyasiga ega bo'lgan yagona hujayralardir (Teitelbaum, 2000). Osteoklastlarning differentsiatsiyasi va kamolotida ishtirok etadigan ikkita asosiy sitokin mavjud (Koga va boshq., 2004): makrofag koloniyasini stimulyatsiya qiluvchi omil (M-CSF) va yadro omili KB (NF-kB) ligandining retseptorlari faollashtiruvchisi (RANKL). M-CSF gematopoetik ildiz hujayralarining osteoklast progenitorlariga differensiallanishiga vositachilik qiladi va RANK retseptorlari ifodasini ko'tarish orqali osteoklastlarning differentsiatsiyasiga yordam beradi (Takayanagi, 2007). RANKL va RANK ning osteoklast hujayra yuzasida bog'lanishi quyidagilarga olib keladi: (1) TNF retseptorlari bilan bog'langan omil 6 (TRAF6) kabi signalizatsiya adapter molekulalarini jalb qilish; (2) NF-kB va mitogen bilan faollashtirilgan protein kinazlarni (MAPK) o'z ichiga olgan bir nechta quyi oqim maqsadlarini faollashtirish; va (3) faollashtirilgan T-hujayralarining yadro omili, sitoplazmatik 1 (NFATc1) ifoda darajasini oshirish (Liu va boshq., 2019; Yamashita va boshq., 2007). Ushbu signalizatsiya yo'llarining faollashishi osteoklast genlarining, jumladan kislota fosfataza 5 (Acp5) [tartrata chidamli kislota fosfatazasini (TRAcP) kodlash], matritsa metalloproteinaza 9 (MMP9) va katepsin K (CTSK) ekspressiyasini bevosita tartibga soladi (Boyle, Simonet). , & Leysi, 2003). Shuning uchun, RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklast differentsiatsiyasi bilan bog'liq signalizatsiya yo'llarini inhibe qilish osteoporoz uchun potentsial terapevtik usuldir.
Ushbu tadqiqotda biz CDP bilan davolashning tuxumdonlarga (OVX) ta'sirini aniqlashni maqsad qildik.osteoporozsichqoncha modeli in vivo va in vitro RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklast faolligi bo'yicha, osteoklastga xos genlarning ifodalanishiga va NFATc1 va NF-kB va MAPK signalizatsiya yo'llarining faollashuviga e'tibor qaratilgan. Bizning topilmalarimiz CDP ning osteoporozni davolash uchun xavfsiz va samarali dori sifatidagi salohiyati haqida yangi tushunchalar berishi mumkin.
Qo'shimcha ma'lumot olish uchun quyidagi manzilga murojaat qiling:Joanna.jia@wecistanche.com
2. Materiallar va usullar
2.1. Kimyoviy moddalar va namunalar yig'ish
CD (no. 180801) Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Xitoy) dan sotib olingan va Guanchjou Xitoy tibbiyoti universiteti, Farmatsevtika fanlari maktabi professori Xaybo Xuang tomonidan aniqlangan, Guanchjou, Xitoy. Estradiol valerat tabletkalari Bayerdan (Leverkusen, Shimoliy Reyn-Vestfaliya, Germaniya) sotib olingan. Alfa o'zgartirilgan minimal muhim vosita
(-MEM) va homila sigir zardobi (FBS) Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) dan olingan. Penitsillin/streptomitsin va TRAcP bo'yash to'plami Solarbio (Pekin, Xitoy) dan sotib olingan. Rekombinant sichqoncha M-CSF va rekombinant sichqoncha RANKL R&D Systems (Minneapolis, MN, AQSh) tomonidan sotib olingan. Gidroksiapatit bilan qoplangan plitalar Corning Life Sciences kompaniyasidan (Sent-Louell, MA, AQSh) sotib olingan. NFATc1 va CTSK uchun asosiy antikorlar (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, AQSH); IKB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK va P-JNK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, AQSH); va -aktin (CWBIO, Pekin, Xitoy) ham olingan. Ushbu tadqiqotda foydalanilgan boshqa reagentlar analitik darajada edi va suv Milli-Q suv tozalash tizimi (Millipore, Bedford, MA, AQSh) tomonidan tozalandi.
2.2. CDP ekstraktsiyasi
CD mayda kukunga aylantirildi va uni engish uchun uch marta neft efiri bilan aralashtirildi. Qattiq qoldiq filtrlash orqali to'plangan va keyin xona haroratida quritilgan. ThepolisakkaridlarOldindan ishlov berilgan namunalardan uch marta suv bilan 2 soat davomida ajratib olindi, konsentratsiya qilindi, suvsiz etanol qo'shilishi bilan yakuniy 80 foiz (v/v) konsentratsiyasiga cho'ktirildi va 4 ◦C da 24 soat davomida saqlanadi. Cho'kmalar 20 daqiqa davomida 3000 rpm tezlikda santrifüjlash orqali to'plangan, distillangan suvda eritilgan va Sevag usuli yordamida tozalangan (erkin oqsillarni olib tashlash) (Zhao va boshq., 2019). Qayta tiklanganpolisakkaridlardializ qilingan, quritilgan va keyingi foydalanishgacha saqlanadi. Bundan tashqari, kimyoviy tarkib natijalari shuni ko'rsatdiki, CDP tarkibidagi umumiy shakar, uron kislotasi, sulfat va oqsil miqdori 67.63 0.98 foiz, 21.05 0.49 foiz, 1.{{7 }}.24 foiz va 8.81 0.36 foiz.
CDP ning monosaxarid tarkibi va Furye transform infraqizil tahlili qo'shimcha 1 va 2-rasmda ko'rsatilgan.
2.3. OVX tomonidan qo'zg'atilgan osteoporoz sichqoncha modeli
Hayvonlar ustida o‘tkazilgan barcha tajribalar Guanchjou Xitoy tibbiyot universitetining Hayvonlar etikasi qo‘mitasi tomonidan tasdiqlangan (tasdiqlangan SYXK 2019-0202). O'ttiz 6-haftalik urg'ochi C57BL/6 sichqonlari Guanchjou Xitoy Tibbiyot Universitetining Hayvonlar Tajriba Markazi tomonidan yetkazib berildi. 1 hafta davomida iqlimga moslashgandan so'ng, bir guruh sichqonlarga soxta operatsiya (Sham guruhi), qolgan sichqonlarga ovariektomiya operatsiyasi (OVX guruhi) o'tkazildi. Operatsiyadan keyin sichqonlarga 1-hafta davomida tiklanishiga ruxsat berildi. Keyin, muvaffaqiyatli modellashtirilgan sichqonlar tasodifiy ravishda 5 guruhga bo'lingan, har bir guruhda 6 ta sichqon:
(1) Sham guruhi: distillangan suv bilan ishlov berilgan, (2) OVX guruhi: distillangan suv bilan ishlov berilgan, (3) OVX E2 guruhi (E2): 0.13 mg/kg estradiol valerat tabletkalari bilan ishlov berilgan, (4) ) OVX CDP past dozali guruhi (CDP-L): 300 mg/kg CDP, (5) OVX CDP yuqori dozali guruhi (CDP- H): 600 mg/kg CDP bilan davolash. Distillangan suv, E2 yoki CDP kuniga bir marta gavaj orqali yuboriladi. Barcha sichqonlar 12- haftalik davolash davridan keyin qurbon qilindi (1A-rasm). Bachadonlar yig'ilib, tortildi, chap tibia esa keyingi tekshiruvlar uchun yig'ildi. To'liq qon namunalari yig'ildi va 5000 rpm da santrifüj qilindi
4 ◦C da 15 daqiqa. Sarum supernatantlari aspiratsiya qilindi va saqlanadi
-80 ◦C keyingi tahlilga qadar.
2.4. Mikro-kompyuterli tomografiya (mikro-KT) tahlili va suyak histomorfometriyasi
Chap tibias 4% paraformaldegid bilan 48 soat davomida o'rnatildi va keyinchalik oddiy sho'r suvli santrifüj naychalariga joylashtirildi. Ruxsat etilgan namunalar Skyscan 1172 micro-CT asbobi (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgiya) bilan quyidagi sozlamalar yordamida skanerdan o'tkazildi: kuchlanish, 8{7}} kV; manba oqimi, 100 mkA; Al, 0,5 mm filtr; piksel
hajmi, 9,76 mkm; va aylanish bosqichi, 0.6◦. ning bir nechta parametrlari
trabekulyar suyak, jumladan, suyak mineral zichligi (BMD), suyak hajmi ulushi (BV/TV), umumiy hajmdagi suyak yuzasi (BS/TV), trabekulyar son (Tb. N) va trabekulyar bo'shliq (Tb. Sp) yordamida o'lchandi. CT- Analyser® dasturi (Bruker micro-CT, Skyscan). CTVol dasturi (Bruker micro-CT. Skyscan) yordamida uch o'lchamli tasvirlar yaratilgan.
Mikro-KT tahlilidan so'ng, chap tibias 14 foizli EDTA eritmasida dekalsifikatsiya qilindi va kesish uchun kerosin ichiga kiritildi. Namunalar gematoksilin va eozin (H&E) va TRAcP bo'yash tajribalaridan oldin mikrotom yordamida 5 mkm bo'laklarga bo'lingan. Bo'yalgan bo'laklar Olympus CX 31 mikroskopi (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Yaponiya) yordamida tekshirildi va hujjatlashtirildi.
Cistanchesuyak zichligini oshirish va osteoporozni engillashtirishi mumkin
2.5. Sarum tahlili
Kaltsiy (Ca) va fosfor (P) kontsentratsiyasi Nankin Jiancheng biomuhandislik instituti (Nankin, Xitoy) tomonidan ishlab chiqilgan to'plam ko'rsatmalariga muvofiq aniqlandi. Sarumdagi TRAcP-5b va RANKL darajalari mos ravishda TRAcP-5b ELISA to‘plami (CUSABIO, Vuxan, Xitoy) va RANKL ELISA to‘plami (Cloud-CloneCorp., Vuxan, Xitoy) yordamida tahlil qilindi.
2.6. In vitro osteoklastogenez tahlili
BMMlar 6-haftalik urgʻochi C57BL/6 sichqonlarining tibia va son suyagidan ajratilgan. Izolyatsiya qilingan hujayralar 25 ng/ml M-CSF, 10 foiz FBS va 1 foiz penitsillin/streptomitsinni o'z ichiga olgan -MEM muhitida ekilgan. Qo‘shilish joyiga yetib borgach, BMMlar (1 104 hujayra/quduq) 96-quduq plastinkalariga ekildi va 50 ng/ml RANKL ishtirokida CDP bilan ishlov berildi. O'rta va CDP har 2 kunda almashtirildi. 7 kundan so'ng, hujayralar 4 foizli paraformaldegid bilan mahkamlangan va TRAcP mavjudligi uchun bo'yalgan. Uch yoki undan ortiq yadroli TRAcP-musbat hujayralar sifatida aniqlangan osteoklastlar soni yorug'lik mikroskopi yordamida hisoblangan va hujjatlashtirilgan.
2.7. Hujayra proliferatsiyasi tahlili
BMMlar (1 × 104 hujayra / quduq) 96-quduq plastinkasiga ekilgan va bir kechada inkubatsiya qilingan. Shundan so'ng, hujayralar 48 soat davomida turli xil konsentratsiyali CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 va 40 mkg/ml) bilan ishlov berildi. Hujayralarning birlashishi uzoq muddatli, real vaqtda dinamik jonli hujayra tasvirlash tizimi IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, AQSh) yordamida aniqlandi va tahlil qilindi.
2.8. Gidroksiapatit rezorbsiyasi tahlili
BMMlar ({0}} hujayralar/quduqlar) gidroksiapatit bilan qoplangan plastinkaga ekilgan, ko'rsatilgan konsentratsiyalarda (0, 5 va 10 mkg/ml) CDP bilan ishlov berilgan va to'liq -MEMda ekilgan. tarkibida 25 ng/ml M-CSF va 50 ng/ml RANKL mavjud. 7 kundan keyin hujayra tarkibiy qismlarini olib tashlash uchun hujayralar 10 foizli oqartiruvchi eritma bilan yuvildi. Gidroksiapatit rezorbsiya joylari tasvirlari IncuCyte ZOOM® yordamida olingan va ImageJ dasturi (NIH, Bethesda, MD, AQSh) yordamida tahlil qilingan (Abramoff, Magelhaes va Ram, 2003).
2.9. RNK izolyatsiyasi va real vaqtda teskari transkripsiya-miqdoriy PCR (RT-qPCR) tahlili
BMMlar ({0}} hujayralar/quduqlar) 6-quduq plastinkasiga ekilgan va turli konsentrasiyalarda (0, 5 va 10) CDP ishtirokida RANKL va M-CSF bilan stimulyatsiya qilingan. mkg/ml) 5 kun davomida. Umumiy RNK TRIzol reagenti (Sigma-Aldrich) yordamida sichqonlarning hujayralari yoki suyak to'qimasidan ajratilgan. Qo'shimcha DNK teskari transkriptaza to'plami (TransGen Biotech, Pekin, Xitoy) yordamida 2 mkg umumiy RNK dan sintez qilindi. RT-qPCR reaktsiyalari PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) yordamida tayyorlangan va ABI 7500 tizimi (Amaliy) tomonidan aniqlangan.
Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, AQSH). PCR uchun aylanish parametrlari quyidagicha o'rnatildi: 5 daqiqa davomida 95 ◦C, keyin 15 s uchun 95 ◦C 40 tsikl va 30 s uchun 60 ◦C. Amaldagi maxsus primerlar 1-jadvalda ko'rsatilgan va har bir maqsadli genning miqdori GAPDH (ichki nazorat) ga normallashtirildi.
2.10. Western blot tahlili
BMMlar ({0}} hujayralar/quduqlar) 6-quduq plastinkasiga ekilgan. Qisqa muddatli tajribalar uchun hujayralar CDP ning turli konsentrasiyalari (0, 5 va 10 mkg/ml) bilan 1 soat davomida oldindan inkubatsiya qilindi va keyin 30 daqiqa davomida 50 ng/ml RANKL bilan ishlov berildi. . Uzoq vaqt davomida hujayralar CDP (0, 5 va 10 mkg/ml) ishtirokida 3, 5 va 7-kunlarda 50 ng/ml RANKL bilan stimulyatsiya qilindi. Umumiy oqsillar RIPA lizis buferi (CWBIO) yordamida ekstraksiya qilingan. Proteinlar 10 foiz SDS-PAGE bilan ajratildi va PVDF membranalariga o'tkazildi. Membranalar xona haroratida 2 soat davomida 5 foizli yog'siz sut bilan to'sib qo'yildi, birlamchi sut bilan inkubatsiya qilindi.
antikorlar kechada 4 ◦C da, keyin esa mos keladigan ikkinchi darajali bilan
1,5 soat davomida antikorlar. Membranalar ECL reagentlari (Millipore Corp., Billerica, MA, AQSh) yordamida ishlab chiqilgan va tasvirlar Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanxay, Xitoy) yordamida olingan.
Cistanchesuyak zichligini oshirishi mumkin
2.11. Immunofluoresans testi yordamida NFATc1 translokatsiyasini aniqlash
BMMlar {0}} quduq qoplamalariga ekilgan, RANKL va M-CSF bilan stimulyatsiya qilingan va 5 kun davomida 10 mkg/ml CDP bilan ishlov berilgan. Hujayralar 15 daqiqa davomida 4 foizli paraformaldegid bilan mahkamlangan, PBS bilan uch marta yuvilgan va 10 daqiqa davomida 0,1 foiz Triton X-100 bilan o'tkazuvchan bo'lgan. Hujayralar 10 foizli echki zardobi (CWBIO) bilan aralashtirildi va 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, hujayralar bir kechada birlamchi antikor bilan 4 ◦C da, so'ngra Alexa Fluor 488 echki sichqonchaga qarshi ikkilamchi antikor bilan (Abcam, Kembrij, MA, AQSh) qorong'ida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Qopqoqlar PBS bilan yuvilib, 4′, 6-diamidino-2-fenil in-dol (DAPI) (Quyosh) bilan Prolong Gold antifade reagentiga o‘rnatilgan va
Airyscan konfokal mikroskop bilan Zeiss LSM 800 yordamida tekshirilgan (Karl Zeiss, Oberkochen, Germaniya).
2.12. Statistik tahlil
Barcha eksperimental ma'lumotlar SPSS 25.0 statistik dasturlari (IBM Corporation, Armonk, NY, AQSH) yordamida tahlil qilindi. Hayvonlar va hujayralarni o'rganish uchun ma'lumotlar mos ravishda ± SEM va ± SD degan ma'noni anglatadi. Natijalar dispersiyaning bir tomonlama tahlili yoki Student t-testidan foydalaniladi. p < 0.05="" qiymatlari="" statistik="" jihatdan="" ahamiyatli="" deb="">
Cistanchekamaytirishi mumkinapoptozva suyakni mustahkamlaydizichligi
