1-qism: Osteoporoz va Altsgeymer kasalligini davolash uchun Cistanche Tubulosa ning ikki tomonlama ta'sirli komponentlarini o'rganish uchun integratsiyalangan tarmoq farmakologiyasi va zebrafish modeli
Mar 30, 2022
Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * va Fey Li 1, 2, *
ANTRACT
Etnofarmakologik ahamiyatga ega:Osteoporoz (OP) va Altsgeymer kasalligi (AD) keng tarqalgan keksa yoshdagi kasalliklardir va ko'plab tadqiqotlar ularning patogenezi bilan bog'liqligini ko'rsatadi. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) keng qo'llaniladigan an'anaviy xitoy tibbiyoti bo'lib, mos ravishda OP va ADni davolashda keng qo'llaniladi. Shu bilan birga, bir vaqtning o'zida ikkala kasalliklar uchun ham faol moddalar va asosiy mexanizmlar cheklangan.
Tadqiqot maqsadi:Ushbu ish KTda AD va OPni bir vaqtda himoya qila oladigan ikki tomonlama ta'sirli birikmalarni topish uchun samarali va ishonchli tarmoq skrining usulini yaratishga qaratilgan. Va u molekulyar mexanizmlar bo'yicha OP va AD o'rtasidagi bog'liqlikning yangi istiqbollarini beradi.
Materiallar va usullar:KTning ikki tomonlama ta'siri bir nechta ma'lumotlar bazalarini birlashtirish va tarmoq farmakologiyasi darajasida keng qamrovli tahlil qilish orqali tizimli ravishda tahlil qilindi. Har xil turdagi birikmalar orasidagi ta'sirlardagi farqlarni aniqlash uchun tasniflangan dori-maqsadli o'zaro ta'sir tarmog'i qurilgan. Ushbu tarmoqning samaradorligini isbotlash uchun topologik parametrlarga muvofiq zebrafishning Pre-induced OP modeli va AlCl{2}}induktsiyalangan AD modelida tekshirish uchun ba'zi birikmalar tanlangan.
Kalit so‘zlar:Tarmoq farmakologiyasi; Osteoporoz;Altsgeymer kasalligi; tubulosa kistasi; zebrafish.
Cistanche Altsgeymerga qarshi funktsiyaga ega.
1.Kirish
Aholining keksalikka moyilligi yillar davomida osteoporoz (OP) va Altsgeymer kasalligi (AD) tarqalishining oshishiga olib keladi (Parnetti va boshq., 2019; Rizzoli, 2018). Hozirgi vaqtda OP ham, AD ham jamoat salomatligi uchun asosiy tahdidlar sifatida tan olingan, chunki ular simptomlarsiz rivojlanishi va katta ijtimoiy yuklarni keltirib chiqarishi mumkin (Erkkinen va boshq., 2018; Jonsson va boshq., 2018). Yoshga bog'liq kasalliklar sifatida ular ko'pincha nogironlik va o'lim darajasi yuqori bo'lgan klinik amaliyotda birgalikda uchraydi (Dengler-Crish va Elefteriou, 2019). OP - kam suyak massasi va suyak to'qimalarining mikro-arxitekturasining buzilganligi, suyakning mo'rtligi va sinish xavfi ortishi bilan tavsiflangan tizimli skelet kasalligi (Rizzoli, 2018). AD - bu xotira va boshqa kognitiv funktsiyalarning progressiv yo'qolishi bilan tavsiflangan eng keng tarqalgan miya degeneratsiyasi (Bondi va boshq., 2017). Hozirgacha ularning murakkab etiologiyasi va patogenezi bo'yicha ikkita kasallikning oldini olish yoki davolash uchun etarlicha kuchli imkoniyatlar mavjud emas. Va bundan ham yomoni shundaki, bemorda nojo'ya ta'sirlar ko'proq uchraydi (Braun, 2017; Huang va Mucke, 2012).
Sindrom differentsiatsiyasining nazariy asoslarida (Sucher, 2013) bir nechta patofiziologik mexanizmlarga qaratilgan bir nechta komponentlarga ega an'anaviy xitoy dori-darmonlari (TCM) ba'zi tanish murakkab kasalliklarni davolashda o'ziga xos ustunlikka ega. Buyrakni kuchaytiruvchi o'simlik sifatida Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) an'anaviy xitoylik shifokorlar tomonidan xotira yo'qolishi va suyaklarning atrofik zaifligiga qarshi keng qo'llaniladi (Fu va boshq., 2018). An'anaviy samaradorligidan tashqari, katta tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, u kognitiv va xulq-atvor kamchiliklarini yaxshilash (Wu va boshq., 2014), yallig'lanishga qarshi (Fu va boshq., 2018), suyak shakllanishini rag'batlantirish va suyakni bostirish kabi turli xil farmakologik faoliyatga ega. rezorbsiya (Li va boshq., 2013; Li va boshq., 2012), shuningdek, antioksidant faollik (Zhang va boshq., 2016). Ammo uning faol moddalari va metabolik jarayonlarning murakkabligi inson to'qimalarida nishonlarni o'rganish va ta'sir mexanizmini tushuntirishda qiyinchiliklarni keltirib chiqardi.
Avvalo, OP/AD ning terapevtik maqsadlarini ishonchli muhokama qilish zarur. Ayniqsa, TKMlarda "turli kasalliklarni bir xil davolash" fikriga va tarmoq ichidagi farmakologiyaning "ko'p komponentli terapevtika, biologik tarmoq" metodologiyasiga asoslanib, ikkala kasallik o'rtasida muhim umumiy maqsadlarni izlashga urinishlar ayniqsa amaliy bo'lishi mumkin. OP va AD ning oldini olish va nazorat qilish bo'yicha ko'rsatmalar berishda ma'no. Zebrafishlar skelet fiziologiyasida sutemizuvchilarga va odamlarga juda homolog genlarga kuchli o'xshashliklarga ega. Bu OP va AD tadqiqotlari uchun in vivo mavjud va jozibali hayvon modelidir (Bergen va boshq., 2019; Newman va boshq., 2014). Shunday qilib, ushbu tarmoq farmakologiyasi tadqiqoti KTning ikki tomonlama ta'sirli faol tarkibiy qismlarini skriningga, OP va ADning umumiy potentsial maqsadlarini o'rganishga, shuningdek, ikkita kasallikni bir vaqtning o'zida davolash uchun KTdan foydalanish imkoniyatini aniqlashga qaratilgan. Ushbu tadqiqotda maqsadli KT faol moddalari, genomlari va OP va AD proteomik ma'lumotlari interaktiv tarmoqni yaratish uchun mos ravishda turli ma'lumotlar bazalaridan to'plangan va OP va ADni davolash uchun KTning sinergik mexanizmlarini aniqlash uchun boyitish tahlili tuzilgan. . Bundan tashqari, biz mos ravishda OP va AD zebrafish modellarini qo'zg'atdik va ikkita kasallik uchun ularning samaradorligi va maqsadlarini tekshirish uchun tarmoqdagi asosiy birikmalarni qo'lga kiritdik.
Cistanche sklerotinning o'sishini kuchaytiradi.
2. Materiallar va usullar
2.1 Reaktivlar
Genistein (GE), quercetin (QU), abietik kislota (AA), -sitosterol (BSS) (sofligi 98 foizdan katta yoki unga teng) kimyoviy standartlari Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Xitoy) dan sotib olingan. Madaniyat plitalari Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Xitoy) dan olingan. Prednisolon (Pre), Etidronate Disodium (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3 · 6H2O Aladdin Reagent Inc. dan sotib olingan. Asetiltransferaza (ChAT) fermenti bilan bog'liq immunosorbent tahlili (ELISA) to'plami Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanxay, Xitoy) tomonidan taqdim etilgan. Trizol Nanjing KeyGen Biotech kompaniyasidan olingan. Co., Ltd. (Nankin, Xitoy). Transtar Top Green qPCR SuperMix TransGen Biotech kompaniyasidan sotib olingan. Co., Ltd. (Pekin, Xitoy).
cistanche ekstrakti
2.2 Hayvonlar
Voyaga etgan zebrafish (AB shtammi, 4 oylik) chuchuk suv almashinuvi bilan ta'minlangan akvariumda 14/10 soat yorug'lik / qorong'u tsiklda 28 daraja haroratda saqlangan. Ular kuniga ikki marta yangi tug'ilgan sho'r qisqichbaqalar dietasi bilan saqlangan (Chen va boshq., 2018). Odatda urug'lantirilgan embrionlar tanlangan va urug'lantirilgandan keyingi 3 kungacha (dpf) engil o'sish inkubatorida ekilgan. Hayvonlar ustida o'tkazilgan barcha tajribalar muassasa va hukumatning hayvonlar tajribalari bo'yicha ko'rsatmalariga muvofiq edi.
2.3 Tarmoq farmakologik jarayon
2.3.1 Kimyoviy fazoni hisoblash va nomzod birikmalarni tekshirish
KT ning barcha kimyoviy ingredientlari ma'lumotlari an'anaviy xitoy tibbiyoti tizimlari farmakologiya ma'lumotlar bazasi va tahlil platformasidan to'plangan. TCMSP - bu dorilar, maqsadlar va kasalliklar o'rtasidagi munosabatlarni aks ettiruvchi Xitoy o'simlik dori vositalarining tizimli farmakologiya platformasi (Ru va boshq., 2014). Shu bilan birga, TCMSPda farmakologiya bilan bog'liq to'rtta muhim parametr, jumladan molekulyar og'irlik (MW), oktanol va suv o'rtasidagi bo'linish koeffitsienti (AlogP), vodorod donorlari soni (Hdon) va vodorod qabul qiluvchilar soni (PCA) uchun asosiy komponentlar tahlili (PCA) uchun olingan. Hacc). KT ning kimyoviy taqsimoti SIMCA dasturidan foydalangan holda yuqoridagi parametrlar bilan qurilgan (Version 14.1, Umetrics). Va DrugBank tomonidan AD/OP uchun tasdiqlangan kichik molekulali preparatlar xuddi shu kursda qayta ishlandi. KTdan olingan ingredientlar dori o'xshashligi (DL) bo'yicha filtrlangan. DL - bu dori-darmonlarni loyihalashda istiqbolli birikma qanchalik "giyohvandlik" ekanligini baholash uchun ishlatiladigan sifatli tushuncha. Ushbu muhim xususiyat an'anaviy xitoy o'tlarida "dorilarga o'xshash" birikmalarni tanlash mezoni sifatida ishlatiladi va farmakokinetik va farmatsevtik xususiyatlarni optimallashtirishga yordam beradi (Tao va boshq., 2013). Adabiyot va TCMSPdagi takliflar asosida biz filtrlash shartlari sifatida 0.18 dan katta yoki unga teng DL ni tanladik. Shartga mos keladigan ingredientlar keyingi tahlil uchun eksport qilindi. Ularning 2-oʻlchamli (2D) va 3D tuzilmalari ChemDraw Professional 16.0 dasturi yordamida boʻyalgan. 3D tuzilmalar esa Chem3D 16.0 da energiyani minimallashtirish funksiyasi bilan optimallashtirilgan.
2.3.2 OP va AD bilan bog'liq maqsadlar to'plami
OP va AD uchun barcha gen assotsiatsiyalari mustaqil ravishda DisGeNET va GeneCards dan to'plangan. DisGeNET ma'lumotlar bazasi inson kasalliklari bilan bog'liq bo'lgan genlar va variantlarni ommaga ochiq bo'lgan eng yirik kashfiyot platformalaridan biridir (Pinero va boshq., 2017). GeneCards - bu genomik, transkriptomik, proteomik, genetik, klinik va funktsional ma'lumotlarni o'z ichiga olgan inson genlarining integratsiyalangan ma'lumotlar bazasi (Safran va boshq., 2010).
2.3.3 Murakkab maqsadlarni yig'ish va teskari o'rnatishni bashorat qilish
KTdagi faol moddalarning tegishli maqsadlarini bashorat qilish uchun GeneCards ma'lumotlar bazasi va Shveytsariya TargetPrediction ma'lumotlar bazasi birlashtirildi. GeneCards birikmalarning ma'lum faol maqsadlarini ko'rsatadi, Shveytsariyaning TargetPrediction ma'lumotlar bazasi esa kichik molekulalarning eng mumkin bo'lgan makromolekulyar maqsadlarini taxmin qilishi mumkin (Daina va boshq., 2019). Bashorat qilishdan oldin, nomzod molekulalarining strukturalari Open Babel (2.4.1-versiya) yordamida mol2 formatidan SMILES formatiga aylantirildi.
2.3.4 Protein-oqsil o'zaro ta'sirini tahlil qilish
CT-OP-AD umumiy maqsadlari guruhi oʻrtasidagi oʻzaro aloqalarni aniqlash uchun STRING maʼlumotlar bazasidan foydalanildi. "Homo sapiens" namunasi ostida qidiruvdan so'ng, oqsil-oqsil o'zaro ta'siri (PPI) tarmog'i Cytoscape (Version 3.7.2) dasturi tomonidan ingl. STRING - genomik kontekstni bashorat qilish, yuqori mahsuldorlikdagi laboratoriya tajribalari, (konservatsiyalangan) birgalikda ifodalash, avtomatlashtirilgan matn qazib olish va ma'lumotlar bazalaridagi oldingi bilimlardan olingan ma'lum va bashorat qilingan PPI ma'lumotlar bazasi (Szklarczyk va boshq., 2017).
Cistanche Altsgeymer kasalligi uchun yaxshi.
2.3.5 GO va KEGG yo'lini boyitish tahlili
Gen Ontology (GO) boyitish tahlili Funrich dasturida amalga oshirildi. FunRich (Version 3.1.3) asosan genlar va oqsillarni boyitish tahlili uchun foydalaniladigan funktsional dasturdir (Pathan va boshq., 2015). ConsensusPathDB-inson ma'lumotlar bazasi yo'lni boyitish tahlilini o'tkazish uchun ishlatilgan. Olingan genlar ro'yxati ma'lumotlar bazasiga "p-qiymatini kesish" 0,01 sifatida taqdim etilgan. Natijalarni olgandan so'ng, faqat OP va/yoki AD bilan bog'liq ushbu yo'llar tanlab olindi va KEGG funktsiyalari toifalariga ko'ra guruhlarga bo'lingan. CPDB ikkilik va murakkab oqsil-oqsil, genetik, metabolik, signalizatsiya, genlarni tartibga solish va dori-maqsadli o'zaro ta'sirlarni, shuningdek, Homo sapiensdagi biokimyoviy yo'llarni o'z ichiga olgan uzluksiz o'zaro ta'sir tarmog'idir (Kamburov va boshq., 2013).
2.4 OP Zebrafish modeli uchun eksperimental protseduralar
2.4.1 Modellarni guruhlash
Zebrafish lichinkalari bir nechta guruhlarga bo'lingan: nazorat guruhi, model guruhi, model va Ed guruhi, model va birikmalar guruhlari, ularning har birida 30 lichinka mavjud. Nazorat guruhi 0,2 foiz DMSO bilan muhitda saqlanib qoldi. Model guruhi Pre (25 µM) bilan 3 dpf dan 8 dpf gacha ishlov berildi. Model plus Ed guruhi Pre va Ed (30 µg/ml) bilan birgalikda davolandi.
2.4.2 Alizarin qizil bo'yash
Turli xil birikmalar bilan 5 kunlik madaniyatdan so'ng, lichinkalar navbat bilan behushlik qildi, mahkamlandi va oqartirildi. Alizarin qizil rangi zebra baliqlarining bosh suyaklarini bo'yash uchun ishlatilgan. Ortiqcha moddalarni olib tashlash uchun mos ravishda 1 foiz KOH va glitserin (3: 1, 1: 1 va 1: 3 nisbatlari) qo'llaniladi. Nihoyat, stereomikroskop (Olympus SZX16) zebrafishning moyil holatida bo'yalgan tasvirlarini olish uchun ishlatildi. Bo'yash maydoni va birlashtirilgan optik zichlik (IOD) Image-Pro Plus 6 tomonidan hisoblangan.0.
2.4.3 ALP va TRAP faoliyatini aniqlash
Zebrafish lichinkalari 3 dpf da 6-quduq plastinkalarida subkulturatsiya qilindi va Pre bilan 5 kun davomida aralashmalar bor yoki yoʻq holda inkubatsiya qilindi. Keyin ular ALP faolligini o'lchash uchun yig'ildi. ALP faolligi ishlab chiqaruvchining protokoli asosida zebrafish ALP ELISA to'plamidan foydalangan holda aniqlandi. TRAP faoliyatini baholash usuli ALP bilan bir xil edi.
2.5 AD Zebrafish modeli uchun eksperimental protseduralar
2.5.1 Modellarni guruhlash
Zebrafish lichinkalari bir nechta guruhlarga bo'lingan: nazorat guruhi, model guruhi, model va DPZ guruhi, model va aralashmalar guruhlari, ularning har birida 30 lichinka mavjud. Nazorat guruhi 0,2 foiz DMSO bilan muhitda saqlanib qoldi. Model guruhi 3 dpf dan 6 dpf gacha AlCl3 (150 mkM, pH 5,8) bilan ishlov berildi. Model va DPZ guruhi AlCl3 va DPZ (8 µM) bilan birgalikda ishlandi.
2.5.2 Xulq-atvor tahlili
Dori yetkazib berishdan 3 kun o‘tgach, lichinkalar harakati ViewPoint xulq-atvor analizatori (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) tomonidan qayd etildi. Barcha tajribalar yorug'lik/qorong'i fazaning 3 tsiklini o'z ichiga olgan 28˚C da 60 daqiqada yakunlandi (har biri yorug'lik va qorong'ilik uchun 10 minut). Oldingi hisobotdagi usullarga ko'ra, ADga qarshi dori samaradorligi sifatida o'rtacha tezlik (AS), tezlik o'zgarishi (∆S), diskineziyani tiklash darajasi (DRR, tenglama a) va javob samaradorligi (RE, tenglama b) tanlangan. ushbu modeldagi baholash indeksi (Pan va boshq., 2019; Wenhai va boshq., 2016).
AS (mm/sek)=D / T, DRR (foiz )=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
Bu erda D - zebrafishning 60 minut davomida harakatlanish masofasi, T - tajriba vaqti.
RE (foiz )=100 × (∆SDrug - ∆SMmodel) / (∆SCControl - ∆SMmodel), b
Bu erda ∆S - yorug'lik / qorong'u davrlarda zebrafish tezligining o'zgarishi.
2.5.3 AChE va CHAT faoliyatini o'lchash
3 dpf da zebrafish lichinkalari 6-quduq plastinkalarida subkulturatsiya qilindi va 3 kun davomida aralashmalar bor yoki yo'qligida AlCl3 bilan inkubatsiya qilindi. Keyin ular AChE faoliyati uchun yig'ildi. AChE faolligi ishlab chiqaruvchining protokoli asosida zebrafish AChE ELISA to'plamidan foydalangan holda aniqlandi. ChAT faoliyatini baholash usuli AChE bilan bir xil edi.
2.6 Miqdoriy real vaqtda PCR tahlili
Zebrafish lichinkalari OP va AD guruhlariga bo'lingan. OP guruhlari 3 dpf dan 8 dpf gacha yetishtirilgan nazorat guruhi, Pre guruhi va Pre plus birikmalar guruhlaridan iborat edi. AD guruhlari nazorat guruhini, AlCl3 guruhini va AlCl3 plyus birikmalar guruhlarini o'z ichiga oldi, ular 3 dpf dan 5 dpf gacha yetishtirildi. Har bir guruhda 30 ta lichinka bor edi. Jami RNK mos ravishda Trizol tomonidan ushbu zebrafish lichinkalari namunalaridan olingan. RNK namunalari ishlab chiqaruvchining cDNA to'plami bo'yicha ko'rsatmalariga muvofiq cDNKga teskari transkripsiya qilindi. mRNK ifoda darajasi real vaqtda lyuminestsent miqdoriy PCR (Roche LightCycler96) yordamida aniqlandi. Natijalar -aktin ifodasiga normallashtirildi va qiyosiy (2−∆∆Ct) usuli bilan miqdori aniqlandi. Amaldagi oldinga va teskari primerlar Sangon Biotech (Shanxay, Xitoy) tomonidan sintez qilingan va S1 qo'shimcha jadvalida keltirilgan.
cistanche va Tongkat ali kukunlariimmunitetni yaxshilashga yordam beradi.
Qo'shimcha ma'lumot olish uchun bu yerni bosing.
2.7 Statistik tahlil
GraphPad Prism versiyasi 8.00 tavsiflovchi statistik tahlillar uchun ishlatilgan. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ifodalangan va har bir sinov o'rtasidagi o'zgaruvchanlikni sinash uchun ANOVA usuli bilan tahlil qilingan, P 0.05 dan kam yoki unga teng, muhim deb hisoblanadi.
