2-qism: Hipokampal ansamblda xotirani shakllantirish va eslab qolish jarayonida epigenomik va transkriptomik o'zaro ta'sirni xaritalash

qo'shimcha ma'lumot uchun:ali.ma@wecistanche.com

Iltimos, 1-qism uchun bu yerni bosing

Xotirani shakllantirish va eslab qolish jarayonida engram ansambllarining alohida transkripsiya dasturlari

Xromatinning mavjudligi va promotor-enhancer o'zaro ta'siridagi o'zgarishlar gen ekspressiyasiga qanday ta'sir qilishini tushuntirish uchun biz barcha neyronal subpopulyatsiyalardan yadroviy RNK-seq (nRNK-seq) o'tkazdik. Differensial ifodalangan gen (DEG) tahlilimiz bazal holatdagi neyronlar bilan solishtirganda erta bosqichda kam miqdordagi o'zgarishlarni aniqladi (Bazal va erta, 88 DEGs, 5a-rasm, 8-jadval). Bu, ayniqsa, hozirgi vaqtda kuzatilgan xromatin tashkilotining keng darajasini hisobga olgan holda kutilmagan edi (2a-rasm). Aksincha, kech fazadagi neyronlar ushbu vaqt nuqtalarida xromatinga kirishda ko'proq o'xshashlik bo'lishiga qaramay, ko'proq DEG sonini taqdim etdi (5a-rasm). Transkripsiyaviy topilmalarimizni tasdiqlash uchun biz natijalarimizni yangi ta'sir qilishdan 1 soat o'tgach32, FS20 dan 24 soat keyin va KCl33 bilan sichqoncha madaniyati kortikal neyronlarining uzoq muddatli stimulyatsiyasidan so'ng (6 soat) faollashtirilgan DG granulalari hujayralarining ilgari nashr etilgan ma'lumotlari bilan solishtirdik (Kengaytirilgan ma'lumotlar 4a-rasm). ). Qizig'i shundaki, bu taqqoslash bizning ma'lumotlar to'plamimizdagi yuqori tartibga solinadigan genlar va yangi ta'sirdan 1 soat keyin32 (P=0.006) yoki FS20 dan 24 soat keyin (P=0.0005) o'rtasida sezilarli o'xshashlikni aniqlagan bo'lsa-da, biz qayta faollashtirilgan engram hujayralarida va boshqa ma'lumotlar to'plamlarida yuqori tartibga solingan genlar bilan hech qanday muhim o'xshashlikni kuzatmadi, bu esa qayta chaqirish paytida qayta faollashtirilgan engram hujayralarining noyob transkripsiyaviy landshaftini tasdiqlaydi.

ga bosingCistanche foydalari va xotira uchun yon ta'siri

Keyinchalik, etuk RNK (eksonlar) va pre-mRNK (intronlar) o'qishlaridagi o'zgarishlarni o'lchaydigan ilgari chop etilgan hisoblash yondashuvidan34 foydalandik. Kutilganidek, ekzonik o'zgarishlar DEseq2 (ekson va intron o'qishlari) tomonidan o'lchanadigan global transkripsiya o'zgarishlari bilan bog'liq.xotirafazalar (Kengaytirilgan ma'lumotlar 4b-rasm). Biroq, ekson/intron nisbatlarini o'lchash shuni ko'rsatadiki, transkriptlar o'zgargan (yuqoriga va pastga tartibga solingan).xotirakonsolidatsiya (Erta va kech) asosan intronik o'qishlar tomonidan boshqariladi, bu transkripsiya profili asosan RNKni qayta ishlashning qo'shimcha bosqichlarini talab qiladigan etuk bo'lmagan transkriptlarni aks ettiradi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 4c-rasm). Aksincha, eslab qolish vaqtida yuqori tartibga solinadigan genlar (kech va qayta faollashtirilgan) asosan ekzonik transkriptlardan kelib chiqadi va bu RNKning etuk holatini aks ettiradi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 4c-rasm).

Kuzatilgan xromatin o'zgarishlari va har bir subpopulyatsiyadagi transkripsiya holati o'rtasidagi tafovutni yarashtirish uchun biz turli vaqt nuqtalarida aniqlangan DAR va DEGlarning korrelyatsiya tahlilini o'tkazdik.xotirashakllantirish va esga olish. Ushbu tahlil uchun kodlanmagan hududlardagi DARlar (intergenik va intronik) bizning PC-HiC ma'lumotlarimizdan foydalangan holda o'zlarining tegishli promouterlari bilan taqqoslandi. Umuman olganda, biz differensial kromatinga kirish imkoniyati va erta bosqichda yuzaga keladigan gen ifodasi o'zgarishlari o'rtasida past korrelyatsiya (P=2.81 × 10−2) topdik (Bazal va boshqalar. Erta, kengaytirilgan ma'lumotlar 4d-rasm). Bu natijalar giston modifikatsiyalari transkripsiya paytidagi o'zgarishlar bilan unchalik bog'liq emasligi haqida xabar berib, avvalgi ish bilan mos edi21.xotirasotib olish. Kutilmaganda biz xromatin o'zgarishlari o'rtasida kuchliroq o'xshashlik va o'xshashlikni kuzatdikxotiraxotira konsolidatsiyasi (kech) va qayta faollashtirilgan engram neyronlari (P {0}}.13 × 10−8, 2,42 × 10 paytida o'zgartirilgan transkripsiyaviy landshaft bilan kodlash (Erta) −7, mos ravishda, kengaytirilgan ma'lumotlar 4d-rasm). Ushbu tahlilni qo'shimcha tasdiqlash uchun biz DARlardan olingan log2FC qiymatlari va DEGlarning log2FC qiymatlari o'rtasidagi Pearson korrelyatsiyasini o'tkazdik, bu mintaqaga izoh berilgan (intergenik mintaqalar PC-HiC ma'lumotlar to'plami orqali xaritalangan, kengaytirilgan ma'lumotlar 4e-rasm, 9-jadval). . Bizning tahlilimiz shuni ko'rsatdiki, erta xromatin o'zgarishlari (Bazal va erta, DAR) kech fazadagi genlarning pastga regulyatsiyasi bilan sezilarli darajada bog'liq edi (Erta va kech, kengaytirilgan ma'lumotlar 4e-rasm, kulrang chiziq, r=- 0.14, p < 0.0001).="" bundan="" tashqari,="" deglarni="" intronik="" va="" ekzonik="" o'qishlarga="" tahlil="" qilgandan="" so'ng,="" korrelyatsiya="" asosan="" intronik="" o'qishlar="" bilan="" bog'liqligini="" kuzatdik="" (introns="" r="-0,21," p=""><0,0001, exons="" r="-0,09," p="" {{="" 29}}.02).="" aksincha,="" erta="" xromatin="" o'zgarishlari="" (bazal="" va="" erta,="" dar)="" qayta="" faollashtirilgan="" hujayralardagi="" degs="" bilan="" ijobiy="" korrelyatsiyani="" ko'rsatdi,="" bu="" asosan="" ekzonik="" o'qishlar="" bilan="" boshqariladi="" (introns="" r="-0,007," p="0.73" ,="" exons="" r="0.11," p="0.04)." ushbu="" ma'lumotlar="" boshlang'ich="" hodisa="" va="" transkripsiya="" kechikishi="" uchun="" qo'shimcha="" dalillarni="" taqdim="" etadi,="" bunda="" erta="" fazada="" sodir="" bo'lgan="" xromatin="" o'zgarishlari="" keyingi="" vaqt="" nuqtasida,="" birinchi="" navbatda="" qayta="" faollashtirilgan="" engram="" hujayralarida="" kuzatilgan="" transkripsiyaviy="" o'zgarishlarga="" imkon="">

Xotirakodlash, konsolidatsiya va eslab qolish kechikkan gen transkripsiyasining bir necha to'lqinlarini talab qiladigan dinamik jarayondir12,32,33. Shunday qilib, hamma uchun turli xil transkripsiya dasturlarini aniqlashxotiraFazalarda biz har bir genning faollashtirilmagan neyronlardan (Bazal) erta (erta faollashtirilgan), kech (faollashtirilgan-kech) va qayta chaqirish paytida qayta faollashtirilgan neyronlar (Qayta faollashtirilgan) dan ifodalanishini baholadik. Chiqib ketish mezonlariga javob beradigan barcha differentsial ifodalangan genlar (DEGs, n=1095) (p-qiymati < 0.01,="" log2="" (katlama="" o'zgarishi)=""> 1) xolis ravishda klasterlangan (k-o'rtacha) (1-rasm). 5b, c). To'rtta asosiy klaster aniqlandi; i) 260 gen

kech fazada pastga regulyatsiya qilingan (Dw-kech klaster), ii) kech fazada yuqori regulyatsiya qilingan 207 gen (Up-late klaster), iii) erta bosqichda yuqori regulyatsiya qilingan 186 gen, va hamma joyda barqaror edixotirafazalar (Barqaror klaster) va iv) 438 gen

davomida qayta faollashtirilgan neyronlarda noyob yuqoriga tartibga solindixotiraesga olish (qayta faollashtirish klasteri). Bizning juftlik taqqoslashimizga o'xshab, faollashtirilgan-kech neyronlardagi transkripsiyaviy o'zgarishlar intronik o'qishlar bilan yuqori darajada bog'liq edi va qayta faollashtirilgan neyronlarning transkripsiyaviy landshafti yanada etukroq ko'rinadi va ekzonik o'qishlar bilan yuqori korrelyatsiyani taqdim etdi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 5a, b).

Keyinchalik biz har bir klaster uchun gen ontologiyasi (GO) tahlilini o'tkazdik (5d-rasm), turli xil ichidagi boyitilgan yo'llarni aniqlash.xotirabosqichlari. Kechiktirilgan klasterning transkripsiya imzosi neyronlarning qo'zg'aluvchanligida rol o'ynashi ko'rsatilgan "inhibitor sinaps funktsiyasi" ni tartibga solishda ishtirok etuvchi genlar uchun boyitilgan (35,36-rasm). Up-late klasterida biz transkripsiyaning ijobiy yoki salbiy regulyatsiyasida ishtirok etadigan genlar to'plamini kuzatdik, masalan, v-maf muskuloaponevrotik fibrosarkoma onkogen oilasi, protein B (Mafb), salyangoz oilasi sink barmoq 2 (Snai2) va RE{{ 8}}trankripsiya koeffitsientini o'chirish (dam olish) (5e-rasm). Qizig'i shundaki, biz Dw-kech klasterdagi gen promotorining 15 foizi (32/207) Snai2 (p-qiymati - 1 × 10−9) yoki Rest (p-qiymati - 1 ×) ga ega ekanligini aniqladik. 10−3) bog‘lash joylari. Transkripsiya regulyatorlarining ushbu dinamikasi Dw va Up-late klasterlari o'rtasidagi mumkin bo'lgan o'zaro ta'sirga ishora qiladi. Shunisi e'tiborga loyiqki, bitta neyronal ansambllar funktsional jihatdan farqlanadixotiraengram, bunda FBJ osteosarkomasi onkogen (Fos)- va neyronal PAS domen oqsili 4 (Npas4) ga bog'liq ansambllar CFC dan keyin aniq sinaptik o'zgarishlardan o'tadi va xotiraga yo'naltirilgan xatti-harakatlarni qarama-qarshi yo'nalishda boshqaradi37. Qo'zg'atuvchi sinaptik kirishlar rag'batlantirilishi ko'rsatildixotiraumumlashtirish va tormozlovchilar xotirani kamsitishni rag'batlantiradi. Ushbu aniq ansambllarni joriy tadqiqotda ajratib bo'lmasa-da, bu kuzatishlar ijobiy yoki salbiy transkripsiya regulyatorlarining ikki tomonlama ifodasini, shuningdek, neyronlarning qo'zg'aluvchanligi bilan bog'liq yuqori va pastga regulyatsiya qilingan genlarni tushuntirishi mumkin.

Cistanche xotirani yaxshilashi mumkin

Stabil-klaster asosan sitoskeletal, aksonni qayta qurish va hipokampalga bog'liq bo'lgan transkriptlar uchun boyitilgan.xotira38, shu jumladan engil va og'ir polipeptid neyrofilamentlari (Neal, Neath) va miyozin, og'ir polipeptid 10, mushak bo'lmagan (Myh10) (5d, e-rasm). Dendritlar va umurtqa pog'onalaridagi sitoskeletal bilan bog'liq o'zgarishlarni ko'rish va kuzatish uchun loop-eYFP reportyori (TAMga bog'liq) adeno-associated virus (AAV) tomonidan Arc-CreERT2 sichqonlarining DG ga etkazilgan (Kengaytirilgan ma'lumotlar 6a-rasm). Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, faollashtirilgan kech va qayta faollashtirilgan neyronlarda qo'ziqorin va ingichka umurtqa pog'onalari sezilarli darajada ko'p (P)< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 6b),="" with="" no="" significant="" changes="" in="" dendritic="" shaft="" diameter="" (p="0.6)," when="" compared="" to="" the="" activated="" -early="">

Qayta faollashtirilgan engram neyronlarining noyob transkripsiya imzosi (Reaktivatsiya klasteri) asosan "RNKni tashish/bog'lash" va "oqsillarni tarjima qilish mexanizmlari" toifalari bilan tavsiflangan (5d-rasm). Ushbu transkripsiya dasturi kinesinlar oilasi a'zolari 5a va c (Kif5a, Kif5c), eukaryotik tarjima boshlanishi (Eif) omil 3 subbirligi A, D (3a, 3d), omil 4 sub birlik H (Eif4h), omil 5 sub birlik A () ning yuqori ifodasini o'z ichiga oladi. Eif5a) va ribosoma oqsili (Rpl27a, Rpl35, Rpl36, Rps19, Rps24, Rosa) (5d,e-rasm), ular ilgari mRNKni sinaptik bo'limga tashishda va mahalliy tarjimani avtonom nazorat qilishda hal qiluvchi rol o'ynashi haqida xabar berilgan39 . Ushbu topilmalarni tarjima darajasida qo'shimcha tasdiqlash uchun biz immunohistokimyo (IHC) orqali Eif oilasining uchta a'zosining protein ifodasini va lokalizatsiyasini o'lchadik. Ilgari Serval Eif a'zolari sinaptik bo'limlarda tarjima qilishda maxsus ishtirok etgani haqida xabar berilgan edi39, shuning uchun biz faollashtirilgan neyronlarning soma va dendrit vallaridagi protein ifodasini alohida tahlil qildik (5f-rasm). Qayta faollashtirilgan neyronlar faollashtirilgan-erta va kech neyronlarga qaraganda somada Eif3e oqsillarining yuqori ifodasiga ega edi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 6c-rasm). Bundan farqli o'laroq, Eif4e faollashtirilgan erta va kech neyronlarga (Ps) nisbatan qayta faollashtirilgan neyronlarning shaftalarida sezilarli darajada ko'proq bo'lgan.<0.05, fig.="" 5f),="" providing="" further="" evidence="" for="" increased="" protein="" synthesis="" in="" those="" neurons.="" cistanche="" can="" improve="">xotira.

Tarjima mexanizmlarining ko'payishi umurtqa pog'onasi shakli, hajmi va sonidagi o'zgarishlarni osonlashtiradi, bu esa sinaptik plastisiyani kuchaytiradi39-41. Bundan tashqari, bosh diametri kattaroq bo'lgan tikanlar mahalliy oqsil sintezi uchun ribosomalarni, katta postsinaptik zichlikni o'z ichiga oladi, ular ko'proq AMPA glutamat retseptorlarini bog'laydi va bu sinapslarni funktsional jihatdan kuchliroq qiladi41,42. Ushbu hisobotlarga muvofiq, Qayta faollashtirilgan neyronlar faollashtirilgan - kech (18 foiz) guruhiga nisbatan (kengaytirilgan ma'lumotlar 6d-rasm) bilan solishtirganda kattalashgan bosh diametrini (barcha qo'ziqorin tikanlarining 51 foizini) taqdim etdi. Bundan tashqari, faollashtirilgan - erta va - bilan solishtirganda, biz glutamat retseptorlari 1, ionotrop, AMPA1 (Gria1) mRNK (Kengaytirilgan ma'lumotlar 6e-rasm) va Gria1 oqsillari darajasining faqat qayta faollashtirilgan neyronlarning dendritik vallaridagi sezilarli o'sishini aniqladik. kech neyronlar (5g-rasm). Birgalikda, bu ma'lumotlar engram ansamblining ishlash muddati davomida neyronlarning qo'zg'aluvchanligini, strukturaviy o'zgarishlarni, oqsillarni tarjimasini va sinaptik plastisiyani saqlab qolish uchun turli xil vaqtinchalik ajratilgan transkripsiya dasturlari sinxronlashtiriladi degan gipotezani qo'llab-quvvatlaydi.

Qarama-qarshi transkripsiyaviy ta'sirga ega tartibga soluvchi elementlar xotira kodlashdan eslab qolishgacha o'tishi bilan promotorlar bilan o'zaro ta'sir qiladi.

Keyinchalik biz uzoq masofali promouter-enhancer o'zaro ta'siri va xromatin holati transkripsiya klasterlarining har birida kuzatilgan muvofiqlashtirilgan gen ekspressiyasining o'zgarishiga olib kelishi mumkinligini so'radik. Bunga erishish uchun biz har bir transkripsiya klasteridan promotorlar bilan o'zaro ta'sir qiluvchi kuchaytirgichlarga nisbatan xromatin mavjudligini o'lchadik (6a-c-rasm). Bundan tashqari, ushbu kuchaytirgichlarning o'zaro ta'siri xromatinning mavjudligi va ularning tegishli gen ifodasiga qarshi birgalikda tuzilgan (qo'shimcha jadval 10).

Cistanche xotirani yaxshilashi mumkin

Umuman olganda, barcha klasterlar kuchaytirgichlarda xromatin mavjudligini sezilarli darajada oshirishni ko'rsatdi. Muhimi shundaki, biz xromatinga kirish imkoniyati 3D - xromatinni qayta tashkil etish va gen ekspressiyasini o'zgartirishdan oldin sodir bo'lganligini aniqladik, bu transkripsiyaviy kechikishni qo'shimcha qo'llab-quvvatlaydi (6a-c-rasm, kengaytirilgan ma'lumotlar 7a,b-rasm). Xususan, Reaktivatsiya klasterida bizning tahlilimiz ikki fazali jarayonni aniqladi, unda dastlabki bosqichxotirashakllanishi boshlang'ich hodisaga olib keladi, bunda kuchaytirgichlar yanada qulayroq bo'ladi, lekin gen ifodasida kutilgan o'zgarishlarni ko'rsatmaydi. Engram hujayralarining qayta faollashishi promotor-enhancer o'zaro ta'sirining qayta tashkil etilishi bilan bog'liq edi, bu erda primer kuchaytirgichlar o'zlarining tegishli promouterlari bilan yuqori chastotada aloqa qilishdi va transkripsiyaning ko'tarilishi kuzatildi (6a-c-rasm). Cistanche yaxshilanishi mumkinxotira.

Ilgari promotor va kuchaytiruvchi o'zaro ta'sirlar yuqori darajada dinamik bo'lib, alohida kombinator kuchaytirgichlar bilan o'zaro ta'sir kuchaytirgichda repressor yoki faollashtiruvchi motivlarga ega ekanligiga bog'liq holda gen ekspressiyasining yo'nalishli o'zgarishiga olib keladi14, 18. Cistanche yaxshilashi mumkinligi taklif qilingan edi.xotira.

Buni qo'shimcha tekshirish uchun biz genomni transkripsiya faollashtiruvchilari1 (erta o'sish reaktsiyasi 1 (Egr1), Ap1), transkripsiya repressorlari43,44 (pleiomorfik adenomaga o'xshash gen 1 (Plagl1)) bog'laydigan motiv joylari bilan aniqlangan turli holatlarga xolis ravishda ajratish uchun xromdan foydalandik. ), saraton 2 (Hic2), metil CpG bog'lovchi oqsil 2 (Mecp2), Snai2 va dam olish,) yoki transkripsiyaga ikki tomonlama ta'sir ko'rsatadigan va 3D-genom arxitekturasida ishtirok etadigan TF'larda gipermetillangan25,44,45 (CCTCTC-bog'lovchi omil (CCTC) CTCF), E2F transkripsiya omili 1 (E2f), Yy1). Bu TF-bog'lanish joylarining uch xil kombinatsion holatini aniqladi (kuchli repressor, ikki valentli va kuchli aktivator, 6d, e-rasm). Qizig'i shundaki, gen ekspresyonining qisqarishi (Dw-kech) bo'lgan klaster transkripsiyaviy repressorlar va bivalent motivlarni o'z ichiga olgan kuchaytirgichlar bilan kodlashdan tortib olishgacha borgan sari ortib borayotgan korrelyatsiyani ko'rsatdi (6d-rasm, yuqori issiqlik xaritasi; Kengaytirilgan ma'lumotlar 7c, d-rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, kuzatilgan xromatin mavjudligiga qaramay, genlar ushbu tartibga soluvchi elementlardan kelib chiqadigan repressiya tufayli past tartibga solinadi. Cistanche yaxshilanishi mumkinxotira.

Bundan farqli o'laroq, qayta faollashtirish klasterida biz transkripsiya faollashtiruvchilarini va halqa tuzilmalarini bog'laydigan motivlarni o'z ichiga olgan kuchaytirgichlarning ko'payishini kuzatdik (kengaytirilgan ma'lumotlar-rasm 7c, d). Demak, neyron faolligida bir nechta promotorlar gen ekspressiyasini differentsial muvofiqlashtirishga qodir bo'lgan yangi promotor va kuchaytiruvchi o'zaro ta'sirlarni o'rnatish uchun turli xil kuchaytirgichlardan foydalanishi mumkin. Ushbu modelda pastga regulyatsiya qilingan genlarning promotorlari transkripsiya repressorlarini o'z ichiga olgan kuchaytirgichlar bilan o'zaro ta'sir qiladi, yuqori regulyatsiya qilingan genlar esa transkripsiya faollashtiruvchilarini tegishli promotorlar bilan yaqin aloqada bo'lgan promotor-enhancer o'zaro ta'siri natijasidir. Birgalikda bizning ma'lumotlarimiz xromatinga kirish imkoniyatini, 3D-genom arxitekturasini va engram shakllanishi davomida promotorni kuchaytiruvchi o'zaro ta'sirlarni ketma-ket qayta dasturlashni ochib beradi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 8-rasm).