Ikkinchi qism|Jia-Jian-Di-Huang-Yin-Zi qaynatmasi dopaminerjik neyronlarga va ularning mikro muhitiga neyroprotektiv ta'sir ko'rsatadi

Ikkinchi qism|Cistanche kabi Xitoy o'simlik dori-darmonlari qanday qilib neyroprotektiv ta'sir ko'rsatadi va xotirani yaxshilaydi?

BIRINCHI QISM UCHUN SHU YERGA BOSING

Batafsil maʼlumot uchun ali.ma@wecistanche.com bilan bogʻlaning

Cistanche ekstrakti kukuni va xotira uchun qo'shimchani bosing

Munozara

PDni davolashning hozirgi usullari asosan klinik simptomlarni engillashtirishga qaratilgan. Potentsial aralashuv usullaridan biri sifatida neyrotrofik omillar neyronlarni oziqlantiruvchi rol o'ynaydi, akson regeneratsiyasini rag'batlantiradi18. ning kamayishineyrotrofikomillar dopaminerjik neyronlarning degeneratsiyasiga olib kelishi mumkin. Olimlar 72-79 yoshdagi PD va PD bo'lmagan bemorlarning miya to'qimalarini turli xil ifodalarni kuzatish uchun immuno-bo'yoqlashdi.neyrotrofikomillar. Deyarli barcha omillar ma'lum darajada kamaydi va GDNFning yo'qolishi eng katta edi19. Bundan tashqari, GDNF putamen in'ektsiyasi20 bilan bemorlarning motorli alomatlarini engillashtirdi, shuningdek, in vitro21da dopaminerjik neyronlarning omon qolishiga yordam berdi. Ushbu tadqiqotda biz JJDHYZ qaynatmasining neyrotrofik ta'sirini baholash uchun BDNF va GDNF ni tanladik va yuqori dozada JJDHYZ GDNFni tartibga solishda ishtirok etishini kuzatdik. Aslida,neyroprotektiv ta'sirPD sichqonlarida JJDHYZ soni bundan ham ko'proq edi. Markaziy asab tizimi kislorodning yuqori iste'moli, reaktiv kislorodning yuqori ishlab chiqarilishi va neyrotoksik metall dazmollarining ko'payishi22 uchun oksidlovchi stressga ayniqsa sezgir. Jismoniy jihatdan, superoksid dismutaza (SOD), glutation peroksidaza (GPx) va katalaza (CAT) kabi antioksidant fermentlar erkin radikallarni katalizlaydi. Biroq, dopaminning avtomatik oksidlanishi va fermentativ metabolizmi neyrotoksik erkin radikallar va ortiqcha kislorod turlarini ishlab chiqarishga olib keladi. To'plangan erkin radikallar hujayralardagi biologik molekulalarga zarar etkazish uchun oksidlovchi stressni keltirib chiqaradi va hujayra o'limiga olib keladi23. O'limdan keyingi tadqiqotlar SNpcda GSHning kamayishi va GSSG ning ko'payishini aniqladi, bu tabiiy antioksidant himoyani zaiflashtiradi va nigral neyronlarning degeneratsiyasini qo'zg'atadi24. Hayvon modellarida MPTP sifatida neyrotoksin erkin radikallar hosil bo'lishiga olib keladi va antioksidant fermentlar yukini kuchaytiradi25. Bizning hozirgi tadqiqotimizda biz MPTP GSH, CAT ifodalarini inhibe qilganini va MDA kontsentratsiyasini yaxshilaganini kuzatdik. JJDHYZ MDA hosil bo'lishini inhibe qildi, antioksidant GSHni yo'qotishdan qutqardi, ayniqsa yuqori dozada. PD bo'yicha chuqur o'rganish bilan,neyro yallig'lanishshuningdek, dopaminerjik neyronlarning tanlab yo'qolishi bilan bog'liq deb hisoblanadi. Shuning uchun mikrogliya va astrositlarni faollashtirishga terapevtik aralashuv samarali strategiyalardan biri bo'ladi. Mikroglia immunitetning muhim monitorlari bo'lib, ular bosqinchi patogenlarga qarshi birinchi mudofaa chizig'ini tashkil qiladi va CNS jarohatlariga tezda javob beradi. Otopsiya holatlarida qora rang va striatumda ortiqcha mikrogliya va astrositlar kuzatilgan26. Faollashtirilgan mikrogliya va astrositlar ROS27 hosil qiladi va yallig'lanishga qarshi sitokinlar, kimyokinlar va boshqa proteinazlarni chiqaradi28. Oilaviy yoki sporadik PD29 bilan og'rigan bemorlarning miya omurilik suyuqligida IL-1, IL-2, IL-6 va TNF- darajasi oshadi. Shunga o'xshash kuzatuvlar MPTP va 6-OHDA tomonidan qo'zg'atilgan hayvonlar modellarida qayd etilgan. Bu yashirin omillar neyron muhitidagi almashinishlarga yordam beradi va neyronlarning o'limga moyilligini oshiradi30,31. SNda faollashtirilgan astrositlarni aniqlash uchun biz GFAPni TH bilan ikki marta immuno-bo'yadik. Shu bilan birga, biz mikrogliyani belgilash uchun ikkita biomarkerdan foydalandik. Taniqli Iba-1 biomarkeridan tashqari, transmembran oqsili 119 (Tmem119) deb nomlangan boshqa yangi hujayra yuzasi, mikrogliyaga xos marker ham ishlatilgan32. Natijalar TH-musbatning sezilarli darajada yo'qolganini ko'rsatdi.

model guruhidagi glial hujayralar sonining ko'payishi bilan birga keladigan hujayralar (3-rasm). JJDHYZ-H davolash DA yo'qolishini inhibe qildineyronlarva halokatlineyro yallig'lanish.

Yuqorida aytib o'tilgan natijalar orqali biz birinchi navbatda JJDHYZ PD sichqonlariga neyroprotektiv ta'sir ko'rsatdi degan xulosaga keldik. Ammo mexanizmlar hali ham noaniq edi. Dopaminerjik neyronlarning omon qolishi mikro muhitga bog'liq bo'lganligi sababli, ular orasidagi potentsial aloqalarneyronlarva NVU bizni eng ko'p jalb qildi, shuning uchun biz JJDHYZ ning NVU ga tartibga solinadigan ta'sirini batafsil o'rganib chiqdik.

NVU asosan neyronlar va neyron bo'lmagan hujayralardan, jumladan, endotelial hujayralar, peritsitlar, astrositlar, mikrogliyalar va tomirlarning silliq mushak hujayralaridan iborat. BBB asosiy komponent hisoblanadi. Birinchidan, biz TEM tomonidan BBBdagi ultrastruktura o'zgarishlarini kuzatdik. Oddiy mikrotomirlar uzluksiz bazal lamina, astrositik so'nggi oyoqlar va normal endotelial hujayralardan iborat bo'lib, ular transmissiya elektron mikroskop ostida aniq kuzatilishi mumkin. Biroq, MPTP-induktsiyalangan modelda normal tuzilmalar o'rniga shishgan endotelial hujayralar va astrositik end-oyoqlar, mag'lubiyatga uchragan kapillyar lümenler va shish paydo bo'ldi (4B-rasm). JJDHYZ-H astrositik so'nggi oyoqlarning shishishini engillashtirdi. Uzluksiz bazal membrana va endoteliyning yaxlitligi bo'lgan mikrotomirlar ham kuzatildi (4C-rasm). Angiogenez PD33 patofiziologiyasida ishtirok etadigan muhim mexanizmdir. PD va parkinson primatlari bo'lgan bemorlarda SNpcda o'limdan keyin endotelial hujayra yadrolari va qon tomirlari sonining ko'payishi haqida xabar berilgan. CD31 ning ortishi qon-miya to'sig'ining buzilishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin vaneyroinfamatsiya11,34,35. Masalan, TNF nokautiga ega bo'lgan MPTP-induktsiyali sichqonlar BBB36 buzilishining oldini olish uchun ko'proq mumkin edi. Bu erda biz ushbu davolashni chuqur o'rganish uchun BBB, neyronlar va glial hujayralarni birgalikda tekshirdik. Mikrotomirlar anti-CD31 antikori bilan etiketlangan va modellar guruhida ko'proq CD{8}}musbat mikrotomirlar topilgan (6-rasm, P).<0.05), which="" is="" in="" accordance="" with="" the="" reports="" of="" angiogenesis="" in="">

Mikrotomirlar tomirlar ichida va tashqarisida moddalar almashinuvini tartibga soladi va markaziy asab tizimini himoya qilish uchun tabiiy to'siq hosil qiladi. Qattiq bog'langan oqsillar hujayra bo'shlig'i orqali ekzogen moddalarning kirishini cheklash uchun yuqori selektivlikka ega. Biz SNpcda immuno-bo'yash orqali okludin va klaudin{0}} ifodasini aniqladik (5-rasm). MPTP bu ikkita qattiq birikma oqsilini yo'q qildi, JJDHYZ-H bilan davolash qilingan sichqonlardagi oqsillar oddiy guruhdagilardan sezilarli darajada farq qilmadi. Qattiq ulanishlardan tashqari, MMPlarning almashinishi ham BBB38 funktsiyasiga ta'sir qiladi. Sinkga bog'liq bo'lgan fermentlar qattiq birikma oqsillari o'zgarishining asosiy vositachilari bo'lib, hujayradan tashqari matritsada, shu jumladan NVU39 da bazal qatlamda proteolitik faollikni namoyish etadi. Neyroinflamatuar sharoitlarda MMP3 va MMP9 birinchi navbatda yallig'lanish shikastlanishiga javoban chiqariladi va MMP2 zimogen shaklda chiqariladi, bu esa CNS40 da xost jarohati bilan faollashadi. Ushbu MMPlarning uchtasi ham qattiq birikma oqsillarini parchalaydi. Okcludin MMP, MMP-2 va MMP-9 ishemik insult41dan so'ng klaudinni pasaytirish-5 tomonidan hujumga moyil. MMPlar, shuningdek, fibronektin, laminin va geparan sulfat kabi bazal lamina oqsillarini ishemik insultdan keyin parchalaydi, bu esa BBB parchalanishiga yordam beradi42,43. Bir nechta hisobotlarda MMPlarning apoptozda ishtirok etishi ta'kidlangan. O'lik DA neyronlari MMP3 ni in vitro chiqaradi, bu esa mikroglial faollashuvni yanada kuchaytiradi44. Biz MMP2, MMP3 va MMP9 ni lyuminestsent usulda bo'yab, modellar guruhida ushbu uchta MMP ning ifodalari ko'payganligini aniqladik (7-rasm). JJDHYZ-H, ehtimol, MMPlarning faollashuvini inhibe qilish orqali, klaudin-5 va okklyuziv ifodasini saqlab qoldi.

Immunitet omillarining mikroekologik o'zgarishlarini o'rganish uchun biz nashr etilgan maqolalardan 29 ta omilni tanladik, ularning har biri mikrogliya va astrositlar bilan chambarchas bog'liq edi. Nazorat guruhi bilan solishtirganda, CCL2, CCL4 va IL -23 modellar guruhida pastga qarab tartibga solingan. JJDHYZ yuqori dozada MPTP ning CCL2, CCL4 va ILga inhibitiv ta'sirini o'zgartirdi -23 (8-rasm). MPTP tomonidan qo'zg'atilgan o'tkir PD modelida CCL2-mRNK ifodasining ortishi haqida xabar berilgan va CCL2 CCL4 ifodasini yanada qo'zg'atishi mumkin; biroq, CCL{12}}nokautli sichqonlarda SNpc neyronal yo'qolishi sezilarli darajada kamaymaydi45. PDda CCL2 ning roli hali ham noaniq. IL-23 miyeloid hujayralar tomonidan ishlab chiqariladi va immunitet bilan bog'liq kasalliklarda maqsadli terapiya uchun asosiy sitokinlardan biri sifatida qabul qilingan46,47. Oldingi hisobotlarga ko'ra, CCL2 va CCL4 modellarida yallig'lanishni kuchaytiradi deb o'ylangan.Altsgeymer kasalligi, IL23 esa yallig'lanishni inhibe qiladi. Bu bilan paradoksal emasmineyroprotektiv ta'sirJJDHYZ haqida? PDda ushbu sitokinlarning roli noaniq bo'lganligi sababli, asosiy mexanizmlarni o'rganish kerak. JJDHYZ CCL2, CCL4 va IL23 ning yuqori tartibga solinishi sabablari hali ham o'rganilmoqda va biz natijalarni kelajakda baham ko'ramiz.

Materiallar va uslublar

Etik bayonot.

Ushbu tadqiqot Milliy sog'liqni saqlash institutlarining Laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi. Fudan universitetining hayvonlarni o'rganish qo'mitasi barcha tartiblarni tasdiqladi.

Hayvonlar. Og'irligi 22–25 g bo'lgan (8–10 haftalik qarigan) erkak c57BL/6 sichqonlari harorat nazorat qilinadigan muhitda (doimiy harorat 22±3 daraja) 60 foiz namlik va 12-soat yorug'lik/qorong'u aylanish davriga ega bo'lgan. . Oziq-ovqat va suv ad libitum mavjud edi.

JJDHYZ ni tayyorlash.

Te JJDHYZ qaynatmasi ettita xom o'tlardan iborat: Radix Rehmanniae, Fructus Corni, Radix Morinda Officinalis, Herba Cistanches, Radix Angelicae Sinensis, Radix Asparagi va Radix Paeoniae Alba nisbati 1:0. 1:1:1:1 (o'tlar haqida batafsil ma'lumotni 2-jadvalda ko'rish mumkin). Barcha o'simlik tarkibiy qismlari Fudan universitetining Zhongshan kasalxonasidan sotib olingan. Barcha xom o'tlar avval distillangan suvga 30 daqiqaga botiriladi va 1 soat qaynatiladi va suspenziya yig'iladi. Keyin o'simlik qoldiqlariga distillangan suv qo'shildi va jarayon ikki marta takrorlandi. Yig'ilgan suspenziyaga suvsizlangan spirt qo'shildi, yakuniy konsentratsiya 75 foiz spirt (v/v). Suspenziyani yig'ish uchun qoldiqlar 24 soat davomida 75 foizli etil spirtida namlangan. Qoldiqlardan olingan suspenziya va suyuqlik aralashtirildi va 2,{15}} g haroratda 20 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Spirtli ichimliklar aylanuvchi bug'lantiruvchi tomonidan to'liq uchuvchan bo'lgan. JJDHYZ qaynatmasining yakuniy konsentratsiyasi 1 g/ml (w/v) edi.

JJDHYZ ning kimyoviy birikmalari.

JJDHYZ tarkibida rubiadin (PubChem CID: 124062), paeoniforin (PubChem CID: 442534), albiforin (Pubchem CID: 24868421), ferul kislotasi (Pubchem CID: 445858), catalpol (CID0499), catalpol (CID0149) mavjud. ), sistanozid D (PubChem CID: 5315930), echinako tomoni (PubChem CID: 5281771), rehmanniosid A (PubChem CID: 6325881), rehmanniosid D (PubChem CID: 92044472), (ID6498) va (ID64Chem).

O'quv dizayni.

C57BL/6 sichqonlariga 14 kun davomida fiziologik eritma, JJDHYZ yoki selegilin og'iz orqali yuborilgan, so'ngra qorin bo'shlig'iga fiziologik eritma yoki MPTP (5 kun davomida kuniga 30mg/kg) yuborilgan. Sichqonlar tasodifiy ravishda quyidagi oltita guruhga bo'lingan: (1) nazorat guruhi: tuzli in'ektsiya va tuzli gastrointestinal administratsiya; (2) MPTP guruhi: MPTP in'ektsiyasi va sho'r suv; (3) JJDHYZ-past dozalash guruhi (JJDHYZ-L): MPTP in'ektsiyasi va JJDHYZ 8,5 g / kg / kun; (4) JJDHYZ-o'rta dozalash guruhi (JJDHYZ-M): MPTP in'ektsiyasi va JJDHYZ 17 g / kg / kun; (5) JJDHYZ-yuqori dozalash guruhi (JJDHYZ-H): MPTP in'ektsiyasi plus JJDHYZ 34 g/kg/kun; va (6) selegilin guruhi: MPTP in'ektsiyasi va selegilin 1,0 mg / kg / kun48. MPTP kukuni va selegilin sho'r suvda eriydi.

Immunogistokimyo.

Har bir sichqonchadan SNpc bo'limlari (-3,64 mm ~ - 2,92 mm Bregma) olingan. Bo'limlar dewakslangan, gidratlangan va fosfat tamponlangan sho'r suv (PBS) bilan yuvilgan (5 min × 3) va limon kislotasi tamponida (pH 6.0) ​​antigen olish amalga oshirildi. Endogen peroksidaza faolligi 3 foizli vodorod peroksid-metanol buferi bilan bloklandi. Xona haroratida 1 0 foizli echki zardobi bilan 1 soat davomida inkubatsiya qilingandan so‘ng, bo‘limlar okklyuzinga qarshi antikor (ab168986, Abcam) bilan kechasi 4 darajada inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, immunobelinglash otquloq peroksid (HRP) ikkilamchi antikori (echkiga qarshi quyon, A0208, Beyotime) yordamida davom ettirildi. Immunopozitiv hujayralar har bir sichqon uchun SN mintaqasining 5 ta slaydlaridan hisoblab chiqildi va o'rtacha olindi. Har bir guruhga 3 ta hayvonlardan foydalanilgan. Barcha ijobiy hujayra raqamlari Image-Pro Plus 6.0 dasturi (Media Cybernetics, AQSH) yordamida SNpc da 40 kattalashtirish ostida hisoblangan.

Immunofluoresans.

SNpc ning muzlatilgan qismlari asetonda 20 daqiqa davomida mahkamlangan, metanoldagi 3% vodorod periks bilan ishlov berilgan va keyin 10% echki zardobini blokirovka qiluvchi eritma bilan inkubatsiya qilingan. Keyinchalik, bo'limlar quyidagi maqsadli oqsillarga qarshi antikorlar bilan 4 daraja kechada inkubatsiya qilindi: BDNF (ab108319, Abcam), GDNF (ab18956, Abcam), Iba{6}} (#019–19741, uyg'ondi, Yaponiya), Tmem119 (ab209064, Abcam), claudin-5 (ab15106, Abcam), MMP2 (ab92536, Abcam), MMP3 (ab53015, Abcam) va MMP9 (ab76003, Abcam). Ikkilamchi antikor sifatida Cy{19}}konjugatsiyalangan echkining quyonga qarshi antikori (A0516, Beyotime) ishlatilgan. Yadrolar DAPI (C1005, Beyotime) bilan bo'yalgan. Ijobiy bo'yalgan hujayralar tasvirlari floresan mikroskop (Olympus BX51, Yaponiya) yordamida olingan. Miqdorni aniqlash usuli immunohistokimyo bilan bir xil edi.

Miqdoriy RT-PCR tahlili.

SNpc to'qimalaridan jami RNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq TRIzol reagenti (T9424, Sigma) yordamida chiqarildi. mRNKning kontsentratsiyasi va sifati spektrofotometrik tarzda aniqlandi. Teskari transkripsiya reaktsiyalari SYBR Premix Ex Taq II to'plami (RR820, Takara) yordamida Applied Biosystems 7500 real vaqtda PCR aniqlash tizimida PrimeScript RT reaktiv to'plami (RR047, Takara) yordamida amalga oshirildi. GAPDH, GDNF va BDNF uchun quyidagi primerlar ishlatilgan: GAPDH: 5′-GGT TGT CTC CTG CGA CTT CA-3′ va 3′-CCT CAT TCT TTG GGA CCT GGT-5′; BDNF: 5′-GAG GTC TGA CGA CGA CAT CA-3′ va 3′-GTC AGT TCA CGG AA A CCT CG-5′; va GDNF:5′-CAA TGG ATT CAT ACC CTG-3′ va 3′-TCC AGA TAA TGT AGG TCG T-5′. Barcha namunalar uch nusxada baholandi va o'rtacha qiymatlar 2−DCT nisbiy miqdoriy aniqlash uchun ishlatilgan.

Western blot tahlili.

Western blot tahlili avval xabar qilinganidek amalga oshirildi49. Te SNpc to'qimalari muzli sovuq plastinkaga olib tashlandi, fosfataza ingibitorlari bilan bog'liq bo'lgan RIPA va PMSF o'z ichiga olgan aralashma bilan lizing qilindi va keyin 20 daqiqa davomida 4 gradusda 13,500 aylanish tezligida santrifüj qilindi. SDS-PAGE jellari va PVDF membranalari yordamida ekvivalent miqdordagi oqsillar ajratildi. Membranalar xona haroratida 1 soat davomida 5 foiz yog'siz sut bilan bloklangan va keyin bir kechada GDNF (1:1,000) va BDNF (1:1,000) ga qarshi asosiy antikorlar bilan inkubatsiya qilingan. . Keyinchalik, membranalar quyonlarga qarshi HRP-konjugatsiyalangan antikor bilan inkubatsiya qilindi (suyultma 1:1,000). Immunoreaktiv tasmalar kengaytirilgan xemiluminesans (P0018, Beyotime) yordamida aniqlandi va Image J dasturi yordamida miqdori aniqlandi.

Fermentga bog'liq immunosorbent tahlilini o'lchash.

Lipid peroksidlanish yakuniy mahsuloti MDA (Katalog #K739, BioVision, AQSH) va antioksidant fermentlar SOD (Katalog #K335, BioVison), CAT (Katalog #K773, BioVision) va GSH (Katalog #K261, BioVision) yordamida aniqlandi. Elishay to'plamlari ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq.

BBB ning ultrastruktura o'zgarishi.

Sichqonlar chuqur anesteziya qilindi va keyin sovuq PBS bilan transkardial ravishda perfuziya qilindi. SNpc to'qimalari olib tashlandi va 1-mm3 segmentlarga bo'lingan. Namunalar 2 soat davomida 2,5 foizli glutaraldegid va 1 foiz osmiy bilan mahkamlangan, so‘ngra bosqichli etanol seriyasida suvsizlanish va qatronlar bilan biriktirilgan. Ultra yupqa bo'laklar mikrotom yordamida kesilib, 3 foizli uranil asetat-qo'rg'oshin sitrat bilan bo'yalgan va keyin TEM (PHILIPS CM-120) bilan kuzatilgan.

BBB o'tkazuvchanligini baholash. BBB

o'tkazuvchanlik Evans Blue (E2129, Sigma) yuqorida aytib o'tilganidek, quyruq venasi in'ektsiyasidan keyin miyaga oqishi bilan baholandi50. Qisqacha aytganda, hayvonlarni evtanizatsiya qilishdan 1 soat oldin oddiy sho'r suvdagi 2 foiz Evans Blue AOK qilingan. Sichqonlar chuqur anesteziya qilingan va normal fiziologik eritma bilan transkardial perfuziya qilingan. SNpc to'qimalari ajratildi va formamidda (100 mg/ml) 60 gradusda 24 soat davomida inkubatsiya qilindi, so'ngra 1,{8}} aylanish tezligida 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Te supernatantlar yig'ildi va to'qimalarning yutilishi Evans Blue standart egri asosida 620nm to'lqin uzunligida luminesans spektrometri yordamida aniqlandi.

Statistik tahlil.

Ma'lumotlar SPSS 22.0 dasturiy ta'minoti yordamida bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) va post hocleast muhim farq (LSD) testidan foydalangan holda tahlil qilindi. Natijalar bir nechta guruhlarni taqqoslash uchun o'rtacha ± standart xato sifatida ifodalangan. Farqlar P-qiymati 0.05 (P) dan kichik bo'lgandagina statistik ahamiyatga ega deb hisoblanadi.<>