1-qism: Buyrak ishemiyasi-reperfuziyasidan keyin noorganik nitratning renovaskulyar ta'siri

Qo'shimcha ma'lumot uchun. aloqatina.xiang@wecistanche.com

ANTRACT

Fon: Buyrak ishemiyasi-reperfuzion (IR) shikastlanishining keng tarqalgan sababi hisoblanadio'tkir buyrak shikastlanishi(AKI), bu oksidlovchi stress va kamaytirilgan azot oksidi (NO) bioaktivligi va rivojlanish xavfining oshishi bilan bog'liq.surunkali buyrak kasalligi(CKD) va yurak-qon tomir kasalliklari (KVH). Oksidlanish-qaytarilish muvozanatini tiklaydigan yangi strategiyalar AKI va u bilan bog'liq asoratlar paytida terapevtik ta'sir ko'rsatishi mumkin.

Maqsad: IR-induktsiyali buyrak va yurak-qon tomir disfunktsiyasi rivojlanishida nitrat-nitrit-NO yo'lini kuchaytirishning terapevtik ahamiyatini o'rganish.

Usullari: Erkak C57BL/6 J sichqonlariga natriy nitrat (10 mg/kg,ip) yoki transport vositasi chap buyrakning iliq ishemiyasidan 2 soat oldin (45 minut), so'ngra ichimlik suviga natriy nitrat qo'shilishi (1 mmol/kg/) berildi. kun) keyingi 2 hafta uchun. Qon bosimi va glomerulyar filtratsiya tezligi o'lchandi, qon va buyraklar to'plandi va biokimyoviy va gistologik tahlillar, shuningdek, buyrak tomirlarining reaktivligini o'rganish uchun foydalanildi. Mexanik tadqiqotlar uchun angiotensin Ⅱ bo'lgan yoki bo'lmagan gipoksiya-reoksigenatsiyaga duchor bo'lgan glomerulyar endotelial hujayralar ishlatilgan.

Natijalar: IR buyrak funktsiyasining pasayishi va qon bosimining biroz ko'tarilishi bilan bog'liq bo'lib, buyrak shikastlanishi, yallig'lanish, endotelial disfunktsiya, Ang Ⅱ darajalari va Ang II vositachiligidagi vazoreaktivlik bilan birgalikda nitrat bilan yaxshilangan. Bundan tashqari, nitrat (in vivo) va nitrit (in vitro) bilan davolash NO bioaktivligini tikladi va mitoxondriyal oksidlovchi stress va shikastlanishlarni kamaytiradi.

Xulosa: Buyrak ishemiyasidan oldin noorganik nitrat bilan o'tkir davolash OKI va CKD va ular bilan bog'liq rivojlanish xavfini oldini olish uchun yangi terapevtik yondashuv bo'lib xizmat qilishi mumkin.yurak-qon tomir disfunktsiyasi.

Cistanche tajribasi uchun yetkazib beruvchiga murojaat qilish uchun bosing

1.Kirish

Transplantatsiya, yurakni aylanib o'tish operatsiyasi va shok bilan bog'liq bo'lgan buyrakning ishemiya-reperfuzion (IR) shikastlanishi o'tkir buyrak shikastlanishi (AKI) va undan keyingi surunkali buyrak kasalligi (CKD) rivojlanishi uchun katta xavf hisoblanadi [1]. Asosiy mexanizmlar murakkab bo'lib, reperfuziya bilan bog'liq oksidlovchi stress, azot oksidi etishmovchiligi va immun hujayra faollashuvini o'z ichiga oladi, bu birgalikda endotelial disfunktsiyaga olib keladi [2, 3]. Davom etilayotgan izlanishlar OKI ning oldini olish va davolash uchun yangi va samarali davolash usullarini topishga qaratilgan, masalan, uzoqdan ishemik dastlabki shartlar, vaqtinchalik mahalliy gipotermiya, shuningdek, yangi farmakologik aralashuvlar [3,4].

Gazsimon signalizatsiya molekulasi azot oksidi (NO) yurak-qon tomir va buyrak gomeostazini tartibga solishga muhim hissa qo'shadi va IQ jarohatlari paytida himoya rolini o'ynashi ko'rsatilgan [5,6]. Biroq, ishemik hodisa paytida kislorod etishmasligi endotelial NO sintaza (eNOS) funktsiyasini buzadi, bu reperfuziya bosqichida ishemik to'qimalarda "qayta oqimsiz hodisa" ga yordam berishi mumkin. Bu, o'z navbatida, buyrak funktsiyasining pasayishiga hissa qo'shadigan endotelial va quvurli epiteliya hujayralarining shikastlanishini targ'ib qiladi [7]. Ishemik davrda gipoksiyaga qo'shimcha ravishda, reperfuzion fazada nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidaza va mitoxondriya tomonidan ortiqcha hosil bo'lgan reaktiv kislorod turlarining (ROS) ortiqcha ishlab chiqarilishi NO ni yo'q qiladi [8]. Oksidlanish stressini kamaytiradigan va NO bioaktivligini saqlaydigan yangi yondashuvlar IR-induktsiyali buyrak etishmovchiligiga qarshi kurashda terapevtik ahamiyatga ega bo'lishi mumkin.

Noorganik nitrat (NO3) va nitrit (NOZ) ilgari NO metabolizmidan olingan nisbatan inert mahsulotlar sifatida qaralgan. Biroq, yigirma yildan ko'proq vaqt davomida olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, bu anionlar ketma-ket qisqarish orqali biokonversiyadan o'tishi va yana NO va boshqa biologik faol azot oksidi turlarini hosil qilishi mumkin [9]. Ushbu alternativ nitrat-nitrit-NO yo'lining faolligi klassik NOS tizimi ishlamay qolishi mumkin bo'lgan gipoksiya va past pH sharoitida kuchayadi [10].

Ratsion, NOS tizimiga qo'shimcha ravishda, nitratning yuqori miqdori tufayli, masalan, yashil bargli sabzavotlarda aylanma nitrat va nitritning muhim manbai hisoblanadi. Noorganik nitrat va nitrit qo'shilishi ham eksperimental, ham klinik tadqiqotlarda yurak-qon tomir tizimiga ijobiy ta'sirlar, shu jumladan qon bosimini pasaytirish bilan bog'liq [11]. Organlarning himoya ta'siri, shuningdek, jigar [12], miya [13], o'pka [14] va yurakning [12,15] eksperimental IR shikastlanish modellarida ko'rsatilgan. Shu bilan birga, buyrak IR shikastlanishida noorganik nitrat va nitritning potentsial terapevtik qiymati munozarali bo'lib qolmoqda. Yaqinda ko'rib chiqilganidek [5], nitrit terapiyasidan foydalangan holda IR modellarida o'zgaruvchan natijalar, ehtimol, qo'llaniladigan dozalar, qabul qilish yo'li, davolash davomiyligi, shuningdek, eksperimental modelning o'zi [16,17]. Bir qator eksperimental tadqiqotlar oksidlovchi stressni yumshatish va NO bioaktivligini yaxshilash, shuningdek modulyatsiyani o'z ichiga olgan mexanizmlar orqali yurak-qon tomir kasalliklari modellarida parhez nitrat qo'shimchasining himoya ta'sirini ko'rsatdi.yallig'lanish reaktsiyalari[5]. Bugungi kunga kelib, noorganik nitrat terapiyasining buyrak IR shikastlanishiga ta'siri haqida cheklangan ma'lumotlar mavjud. Biz ilgari nitrat bilan surunkali parhezdan oldingi davolash keyingi IR-induktsiyali buyrak shikastlanishlarini susaytirishini ko'rsatdik [18]. Shu bilan birga, OKI va CKD rivojlanish xavfini kamaytirish uchun IR boshlanishida nitrat-nitrit-NO yo'lini kuchaytirishning potentsial qiymati haqida kam ma'lumot mavjud. Agar himoya bo'lsa, bu OKI rivojlanishi xavfi bo'lgan bemorlarda, masalan, katta jarrohlik amaliyotidan o'tgan bemorlarda keng klinik qo'llanilishi mumkin.

Ushbu tadqiqotda biz ishemik hodisadan oldin o'tkir nitrat bilan davolashning potentsial afzalliklarini o'rganish uchun buyrak IR shikastlanishining sichqoncha modelidan foydalandik. Bu mexanik eks vivo tomir tadqiqotlari va nitrit bilan ishlov berish bilan in vitro hujayra madaniyati tajribalari bilan birlashtirildi. Biz nitrat-nitrit-NO yo'lini kuchaytirish oksidlovchi stress va NO bioaktivligini, shuningdek mitoxondriyal funktsiyani modulyatsiya qilish orqali buyrakni IQ shikastlanishidan himoya qiladi, deb faraz qildik.

2. Usullar

2.1.Reaktivlar

Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, barcha reagentlar Sigma-Aldrich, Shvetsiyadan olingan.

2.2. Hayvonlar va buyrak ishemiyasi-reperfuziya modeli

C57BL/6 J sichqonlari (Erkak, 10 hafta) Janvier Lab-oratories (Fransiya) dan olingan va bizning Karolinska Institutida iqlim nazorati ostidagi sharoitda 12-soat yorug'lik/qorong'u tsikl bilan jihozlangan va ta'minlangan. standart kemiruvchi chow va musluk suvi bilan. Hayvonlar bo'yicha barcha protseduralar Hayvonlar bo'yicha eksperimentlar bo'yicha mintaqaviy axloq qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan (Protokol ID: N139/15) va Milliy sog'liqni saqlash institutlari (NIH) ko'rsatmalariga muvofiq va Evropa Ittifoqining 2010/63/EU direktivasiga muvofiq amalga oshirilgan. hayvonlarda tajribalar.

1 haftalik iqlimlashtirishdan so'ng, chap buyrakning bir tomonlama ishemiyasidan 2 soat oldin sichqonlarga platsebo (NaCl) yoki natriy nitrat (NaNO3) intraperitoneal (1 0 mg / kg) kiritildi. O'ng buyrak tekshirildi, ammo boshqa hollarda buzilmagan. Sham operatsiyalari xuddi shu tarzda, lekin chap buyrakni qistirmasdan amalga oshirildi. Sichqonlar izofluran bilan behushlik qilishdi va butun operatsiya davomida isitish lampasi va o'z-o'zini nazorat qiluvchi isitish pedi yordamida tana harorati 37 ± 0,5 darajada ushlab turildi. Operatsiyadan so'ng, sichqonlar natriy nitrat (1 mmol / kg / kun) yoki platsebo bilan 2 hafta davomida tugatilgunga qadar davolandi.

2.3. Qon bosimini o'lchash

Tugatishdan oldin sichqonlarda qon bosimi invaziv bo'lmagan dum-manjet usuli yordamida o'lchandi. Sichqonlar 10 daqiqa davomida 35 daraja C haroratda iliq plastinkada konditsioner qilindi va keyin plastik to'siqlarga joylashtirildi. Quyruq qismiga pnevmatik impuls sensori o'rnatilgan manjet biriktirilgan va qon bosimi qiymatlari CODA tizimi (Kent Scientific, Torrington, CT, AQSh) bilan qayd etilgan. Hayvonlar qon bosimini qayd etishdan kamida uch kun oldin isitish plastinasidagi cheklovchilar bilan o'rgatilgan. Sistolik, diastolik va o'rtacha arterial bosim ketma-ket 3 kun davomida to'plangan va baholash uchun barcha qabul qilingan qiymatlarning individual medianasi tuzilgan.

2.4.To'qimalarni yig'ib olish

Tugatishdan oldin sichqonlar glomerulyar filtratsiya tezligini (GFR) hisoblash uchun siydik to'plash uchun metabolik kataklarga joylashtirildi. Keyin hayvonlar izofluran bilan behushlik qilindi va qon namunalari pastki vena kava orqali yig'ildi. Barcha namunalar EDTA (Sigma-Aldrich, Stokgolm, Shvetsiya) ishtirokida darhol 6000 × g, 4 daraja C da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi, yakuniy konsentratsiyasi 2 mM. Plazma namunalari yangi naychalarga o'tkazildi va darhol quruq muzda muzlatib qo'yildi va nihoyat -80 darajada saqlangan. Buyraklar ekstraksiya qilingan va eks vivo qon tomir funktsiyasi tajribalari (interlobar arteriyalar va afferent arteriolalar), gistologiya () uchun bir necha qismlarga bo'lingan. HE va PAS bilan bo'yash), apoptoz va yallig'lanish miqdorini aniqlash (Tissue-Tek optimal kesish harorati (OCT) birikmasini kiritish va TUNEL va F4/80 bo'yash uchun muzlatilgan).

2.5. Nitrat, nitrit, cGMP, kreatinin, qon karbamid azoti (BUN) va angiotensin II o'lchovlari

Nitrit va nitrat yuqorida tavsiflanganidek HPLC(ENO-20) yordamida tahlil qilindi 【19】. Plazma namunalari (10 ul HPLC tizimiga Gamilton shprits bilan yuborildi. Keyinchalik, nitrit va nitrat teskari fazali / ion almashinadigan xromatografiya bilan ajratildi, so'ngra nitratni kadmiy va misni qisqartirish orqali nitritga qaytarish. Nitrit diazo birikmalarini hosil qilish uchun Griess reagenti yordamida hosil qilingan va 540 nm da aniqlangan. cGMP degradatsiyasini oldini olish uchun plazma PDE inhibitori, BMX(3-Izobutil-1metilksantin; Sigma-Aldrich #I5879) o'z ichiga olgan naychalarga o'tkazib, yakuniy konsentratsiyani (10 mkM) hosil qildi. Namunalar olindi. keyin muzlatiladi va ishlab chiqaruvchilarning ko'rsatmalariga muvofiq, cGMP ni ELISA to'plami (GE Healthcare # RPN226) yordamida tahlil qilishdan oldin-80 darajada saqlanadi.

Plazma va siydikdagi kreatinin darajalari Kreatinin kolorimetrik tahlil to'plamlari (Cayman Chemical, #700460 va #500701) yordamida aniqlandi. GFRni baholash uchun kreatinin klirensi formulasi (CLcr =Urinecrx Siydik oqimi/plazmakr) ishlatilgan. Plazmadagi BUN darajalari BUN Colorimetric Detection Kit (Invitrogen, #EIA-BUN) yordamida aniqlandi. Plazma va buyrak to'qimalarida Ang darajasi ishlab chiqaruvchilarning ko'rsatmalariga muvofiq Ang ⅡI ELISA to'plami (Cloud-Clone Corp., # CEA005Mu) yordamida o'lchandi. Biroq, to'qima ekstraktining tayyorlanishi tavsiya etilganidan bir oz farq qildi. 50 foizli EtOH tarkibidagi 10 vol 50 mM HCl to'qimaga qo'shildi va 10 daqiqa davomida 100 daraja qizdirildi, 10 000×g 10 min sentrifuga qilindi. Shundan so'ng namunalar muzlatilgan va tahlil qilishdan oldin -80 darajada saqlangan. Barcha absorbans o'qishlari Molekulyar qurilmalardan SpextraMax iD3 da amalga oshirildi.

2.6. Interlobar arteriyalarning izolyatsiyasi va perfuziyasi

Qurbonlikdan keyin buyraklar yig'ib olindi va interlobar arteriyalar izolyatsiya qilinmaguncha muzli sovuq fiziologik tuz eritmasida (PSS) saqlanadi. Buyrak interlobar arteriyalari ajratilgan (uzunligi 2 mm) va a.ga o'rnatilgan

miograf kamerasi (Model 620 M, Danish Myo Technology, Daniya) yuqorida tavsiflanganidek PS bilan jihozlangan [20]. Izometrik kuchlanish Powerlab tizimi (Powerlab 4/30, AD Instruments, Avstraliya) yordamida qayd etilgan. O'rnatilgandan so'ng, tomirlar 37 daraja pH7.4 da karbogen (95 foiz O2; 5 foiz CO2) bilan qaynayotgan PSda 20 daqiqa davomida muvozanatlashtirildi. Keyin arteriyalarning dam olish kuchlanishi yuqorida tavsiflanganidek o'rnatildi [21], bu Mulvanining normallashtirish tartibiga muvofiq [22]. Ikkinchi muvozanatdan so'ng arterial halqaning hayotiyligini baholash uchun 0,1 mol / L KCl qo'llanildi.

2.7. Afferent arteriolalarning izolyatsiyasi va mikro-perfuziyasi

C57BL/6 J sichqonlari inhalatsiyalangan izofluran bilan behushlik qilindi va buyraklar olib tashlandi va avvalroq [23-25] tasvirlanganidek, tezda tilimga kesildi. Buyrak bo'laklari muzdek sovuq Dulbekkoning o'zgartirilgan Eagle muhitiga (DMEM) joylashtirildi. Birikkan glomerulu bo'lgan bitta afferent arteriola stereomikroskop ostida mikro-diszektsiya qilindi va arteriolaga o'tkazildi.

teskari mikroskop sahnasida haroratni tartibga soluvchi kamera. Glomerulus ushlab turuvchi mikropipet bilan o'rnatildi va afferent arteriola kanulyatsiya qilindi va mikropipetlar to'plami bilan perfuziya qilindi. Tajribalar davomida perfuziyalangan afferent arteriolaning intraluminal bosimi 60 mmHg darajasida saqlanib qoldi. Diseksiyon va keyingi mikro-perfuziya uchun vaqt sichqonchani qurbon qilinganidan keyin 120 daqiqa bilan cheklangan edi [26]. 30 daqiqalik muvozanat davridan so'ng 37 daraja haroratda Ang II (10-12 dan 10-8 mol/L) ga kümülatif doza-javob egri chiziqlari olindi. Ang II ning har bir konsentratsiyasi 2 daqiqa davomida perfuziya qilingan, konstriktiv reaktsiya qayd etilgan va keyin afferent arteriolaning diametri o'lchangan.

2.8. Gistologik tekshirish

Buyrak namunalari olindi va 4 foizli paraformaldegid eritmasiga biriktirildi. Ruxsat etilgan buyrak to'qimalari kerosinga solingan va keyin dilimlenmiş va gistologik baholash uchun Gematoksilin-Eozin (H&E) yoki Periodic Acid Schiff (PAS) bilan bo'yalgan. Tahlil qilish uchun har bir tajriba guruhidan tasodifiy tanlangan to'rtta hayvon ishlatilgan. Har bir bo'limdan tasodifiy tanlangan o'nta maydon 400 × kattalashtirish ostida olingan. Barcha morfometrik tahlillar ko'r-ko'rona amalga oshirildi.

2.9. TUNEL bo'yash

TUNEL bo'yash uchun OCT ga o'rnatilgan buyrak namunalari ishlatilgan. 6-mkm qalinlikdagi boʻlaklar xona haroratida 15 daqiqa davomida 20ug/ml proteinaz K bilan inkubatsiya qilindi va ishlab chiqaruvchining koʻrsatmalariga muvofiq Click-iTTM Plus TUNEL tahlili (Invitrogen C10618, AQSh) yordamida TUNEL reaktsiyalari amalga oshirildi. Protokol oxirida DAPIstaining amalga oshirildi. Miqdorini aniqlash uchun uchta hayvon va tasvirning uchta maydoni (200 ×) tasodifiy tanlab olindi va Zeiss LSM800-Airy konfokal mikroskopi yordamida suratga olindi, musbat signallar ImageJ/Fiji dasturi yordamida aniqlandi va ijobiy signallarning DAPI ga nisbati.

2.10. To'qimalarni immunofluoresans bo'yash va konfokal mikroskopiya (F4/80)

Buyraklar OKTda muzlatilgan (Tissue-Tek, Torrence, CA, AQSH) va bo'limlar (6 mkm) tayyorlangan va keyinchalik qayta ishlangan. Muzlatilgan bo'laklar 1 × PBS bilan yuviladi va 30 daqiqa davomida PBSda 2 foiz BSA bilan bloklanadi va keyin anti-F4/80 (1:50, BIO-RAD Cl: A3-1) bilan kechasi 4 daraja haroratda inkubatsiya qilinadi. sovuq xonada va keyin ikkilamchi antikor (1:200 Cell signaling Tech №4417) bilan xona haroratida 1 soat davomida, so'ngra 300 nmol/L DAPI (4'6-diamidino-2-fenil bilan qarshi bo'yash. -indol, dihidroklorid, Invitrogen) 3 min. Immunofluoresans signallari Zeiss LSM800-Havoli konfokal mikroskop ostida koʻrildi. uchta hayvon va tasvirning uchta maydoni (200 ×) tasodifiy tanlangan. F4/80 musbat signallari ImageJ/Fiji dasturi yordamida aniqlangan va ijobiy signallarning DAPIga nisbati sifatida hisoblangan.

2.11. Hujayra madaniyati

Kalamush glomerulyar endotelial hujayralari (GECs) (DSMZ ACC262, Germaniya) RPMI1640 (Gibco 21870-076) muhitida 10 foiz homila sigir zardobi va 2 m ML-Glutamin (Gibco 25030-082), penitsillin va streptomisin bilan yetishtirildi. (50 mg/l, Gibco 15140-122). Hujayralar 5 foiz CO2 namlangan atmosferada 37 daraja haroratda saqlangan. Gipoksiya tajribalarida hujayralar zardobsiz muhit o'rniga HBSS (Gibco 14025-092) da 1 foiz kislorodli kamerada 37 daraja C da 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. Hujayralar nitrit (10 mkM, ksantin oksidoreduktaza (XOR) inhibitori febuksostat (100 nM) bilan / holda, gipoksiyadan oldin 30 daqiqa davomida oldindan inkubatsiya qilingan. Hujayra hayotiyligi PrestoBlue⑧ tahlili (Invitrogen, A13261 va A13262) tomonidan baholandi va hujayra o'limi Trypan Blue istisno tahlili (Sigma, T8154-20 ML) bilan baholandi.

2.12. Mitoxondriyal ROSni aniqlash

Mitoxondriyal superoksid darajalari ftorogenik bo'yoq (MitoSOXTM, Invitrogen M36008) bilan aniqlandi. Davolanishdan so'ng, endotelial hujayralar 2 mkmol / L MitoSox bilan madaniyat muhitida 37 daraja 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin hujayralar ikki marta 1 × HBSS bilan yuvildi va lyuminestsent signal o'lchandi (SpectraMax iD3 o'quvchi, Molecular Devices, AQSh) va hujayra hayotiyligi normallashtirildi.

2.13. Immunoblotting tahlili

Muzlatilgan buyrak namunalari yoki endotelial hujayralar 10 mmol/L Tris-HCl pH 8, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 60 mmol/L N-oktil-glyukozid, 1 foiz Triton X{{9) o'z ichiga olgan buferda lizing qilindi. }}, proteaz inhibitör kokteyli va protein fosfataza inhibitörleri. Hujayra yoki to'qima lizatlari 10,000×g 4 daraja haroratda 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Supernatantlar/oqsillar yangi naychalarga o'tkazildi va Bio-Rad yordamida miqdori aniqlandi

protein tahlili. Ekvivalent miqdordagi oqsillarni o'z ichiga olgan oqsil ekstraktlari {0}}% natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) yordamida tahlil qilindi. Proteinlar 300 mA da 1 soat davomida immobilon poliviniliden diftorid membranasiga o'tkazildi. Membranalar 20 mM Tris-HCl (pH7,4), 150 mM NaCl va 0,1 foiz Tween 20 (TBS-T) tarkibida yog'siz 5 foizda bloklandi. 1 soat davomida sut kukuni va anti-TFAM (1:2000, ab131607), anti-OXPHOS (1:1000, ab110413), anti-vinkulin (1:5000, ab129002) (Abcam Cambridge, Buyuk Britaniya) va antikorlar bilan immunodetlangan. -Cleaved kaspaz-3 (1:1000,#9664)(Cell Signaling Technology, Beverli, MA, AQSH). Immunoblot tahlili uchun barcha ikkilamchi antikorlar Cell Signaling Technologydan olingan. G'arbiy dog'lar uchun kesilmagan, izohlangan, MW markerlari bilan to'liq uzunlikdagi tasvirlar Qo'shimcha faylda ko'rsatilgan.

2.14. Statistik tahlil

Guruhlar o'rtasida bir nechta taqqoslashlar bir yoki ikki tomonlama ANOVA tomonidan tahlil qilindi, keyin tavsiya etilgan post-hoc testi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Barcha statistik hisob-kitoblar Graphpad Prism 8.0 yordamida amalga oshirildi. Statistik ahamiyatlilik p sifatida belgilangan<>