2-qism: DHHC21 etishmovchiligi septik shikastlanish paytida buyrak funktsiyasini susaytiradi

Aloqatina.xiang@wecistanche.com

Munozara

Ushbu ishda biz DHHC21 ni septik shikastlanish paytida buyrak perfuziyasi va funktsiyasining yangi regulyatori sifatida xabar qilamiz. Bizning yangi topilmalarimiz shuni ko'rsatadiki: (1) Zdhhc21devde? WT sichqonlari bilan solishtirganda sichqonlar buyrak funktsiyasini yaxshilaydi va septik shikastlanishdan keyin kamroq buyrak shikastlanishini namoyish etadi; (2) DHHC21 funktsional etishmovchiligi septik shikastlanishda buyrak to'qimalarining perfuziyasini, kislorod bilan to'yinganligini va RBFni saqlaydi; (3) DHHC21-katalizlangan aAR palmitilatsiyasi aAR signalizatsiya yo'lini faollashtirish va buyrak arteriyalarining aAR sabab bo'lgan siqilishi uchun zarur. Ushbu tadqiqot septik shikastlanish paytida buyrak perfuziyasi va funktsiyasini tartibga solish bo'yicha yangi mexanik tushuncha beradi. Biz DHHC21 funktsional etishmovchiligi himoya ta'sir ko'rsatishini taklif qilamizbuyrak funktsiyasiseptik shikastlanishda va DHHC21 inhibisyonu bilan kurashish uchun terapevtik strategiya sifatida xizmat qilishi mumkin.buyrak funktsiyasining buzilishiseptik shikastlanish paytida.

Cistanche tubulosa ekstraktining afzalliklarini bilish uchun shu yerni bosing

Buyrak to‘qimalarining gipoperfuziyasi/gipoksiyasi septik shikastlanish vaqtida buyrak funktsiyasi buzilishining asosiy sabablaridan biridir3-5. Biz CLP dan so'ng sichqonlarda buyrak hipoperfuziyasini aniqladik, bu umumiy gemoglobinning zaiflashgan MSOT signal intensivligi, buyrak to'qimalarida kislorod bilan to'yinganligining pasayishi va septik shikastlanishdan keyin RBFning kamayishi bilan tasdiqlangan. Bizning topilmalarimizga muvofiq, buyrak shikastlanishi bilan og'rigan sepsis bilan og'rigan bemorlarda, shuningdek, septik shikastlanishning yirik hayvonlar modellarida RBFning pasayishi kuzatilgan7,10l1. Shuni ta'kidlash kerakki, bir nechta tadqiqotlarda buyrak disfunktsiyasi o'zgarmagan sepsisli hayvonlarda rivojlanishi mumkin. yoki hatto RBF334 ni oshirdi. Ushbu nomuvofiq topilmalar turli hayvonlar modellari va qon oqimini o'lchash uchun ishlatiladigan usullar bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Misol uchun, CLP sabab bo'lgan polimikrobiyal septik shikastlanish odatda qo'llanilgan bo'lsa-da, ba'zi tadqiqotlar Escherichia coli35 ni tomir ichiga yuborishdan foydalanadi.

Protein palmitilatsiyasi yaqinda ko'plab kasalliklarning patogenezi va rivojlanishida ishtirok etadigan oqsil funktsiyasining yangi regulyatori sifatida e'tirof etilgan. U birinchi bo'lib Shmidt va boshq.3637 tomonidan post-translatsiyadan keyingi modifikatsiyaning yangi turi sifatida aniqlangan. Palmitoilatsiya va PATlarning roli ko'plab fiziologik va patologik sharoitlarda, shu jumladan lipid metabolizmi,saraton, yurak-qon tomir kasalliklari, va nevrologik kasalliklar23,0,4. Polikistik buyrak kasalligi va buyrak saratonida palmitoillanishning ishtiroki ilgari xabar qilingan bo'lsa-da23., PATlarning funktsional rolini o'rganuvchi juda cheklangan tadqiqotlar mavjud.buyrak kasalliklari, ayniqsa, septik shikastlanish paytida buyrak disfunktsiyasida. Bizning bilimimiz bo'yicha, biz birinchi bo'lib DHHC2l ning buyrak disfunktsiyasida septik shikastlanishdagi rolini o'rganamiz. Bizning topilmalarimiz shuni ko'rsatadiki, DHHC21 inhibisyonu buyrak funktsiyasini sezilarli darajada qutqaradi va septik shikastlanishda buyrak tuzilishini saqlaydi.

Zdhhc21dp/d4 dan foydalangan holda tadqiqotimiz? sichqonlar DHHC21 funktsional etishmovchiligining buyrak funktsiyasiga foydali ta'siri septik shikastlanish paytida buyrak to'qimalarining perfuziyasini yaxshilash qobiliyatiga bog'liqligini ko'rsatadi. Bazal sharoitda Zdhhc21ewaeP sichqonlarida tuz/suv muvozanati yoki buyrakning strukturaviy/funktsional shikastlanishi belgilari yo‘q5. Shunga qaramay, DHHC21 funktsiyasining yo'qolishi septik shikastlanish natijasida kelib chiqqan RBF, buyrak perfuziyasi va buyrak kislorod bilan to'yinganligini bostiradi. Septik shikastlanishda buyrak to'qimalarining perfuziyasining buzilishining asosiy sababi sifatida buyrak tomirlarining haddan tashqari torayishi natijasida kelib chiqqan buyrak tomirlari qarshiligining kuchayishi hisoblanadi6.9. Natijalarimiz septik shikastlanish natijasida kelib chiqqan buyrak to'qimalarining hipoperfuziyasini vositachilik qilishda aAR ishtirokini ko'rsatadi, bu aAR palmitilatsiyasining kuchayishi va septik shikastlanishda aAR signalizatsiya yo'lining faollashishi bilan tasdiqlanadi. Shu bilan birga, DHHC21 funktsional etishmovchiligi alARpalmitoilatsiyasini inhibe qiladi va aARning quyi oqim effektorini faollashtirish va buyrak arteriyalarida fenilefrin tufayli kelib chiqqan vazokonstriksiyani vositachilik qilish qobiliyatini zaiflashtiradi.

"DHHC21 tomonidan aAR funktsiyasini tartibga solish asosida yotgan molekulyar mexanizm hali ham to'liq ochib berilishi kerak. DHHC21 funksiyasining yo'qolishidan kelib chiqqan aAR funktsiyasidagi nuqson aAR ning konformatsion o'zgarishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Ko'pgina GPCRlar o'zlarining mos kelishi uchun palmitillanishga tayanadi. hujayra ichidagi konformatsiya, GPCRlarning C-terminal dumlaridagi biriktirilgan palmitat plazma membranasiga to'rtinchi hujayra ichidagi halqani hosil qilish uchun kiritiladi, bu GPCRlarning sherik oqsillari bilan o'zaro ta'siri va GPCR signallarining tarqalishi uchun zarurdir17,4. Oldingi tadqiqot Albarning palmitoillanishi uning C-terminal hududida ham sodir bo'lishini ko'rsatdi44. Shuning uchun DHHC21-vositador lAR palmitoilatsiyasining yo'qligi alAR ning hujayra ichidagi konformatsiyasini o'zgartirishi va shu bilan lAR signallarining tarqalishini blokirovka qilishi mumkin. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, aAR faollashuvining quyi oqim signalizatsiya hodisasi bo'lgan ERK faollashuvi septsiyaga uchragan Zdhhc21devider sichqonlarida inhibe qilinadi. ic shikastlanishi. Biroq, aAR karboksil-terminalining DHHC{11}}regulyatsiya qilingan topologiyasi rentgen kristallografiyasi yordamida qo'shimcha tasdiqlanishi kerak.

Tadqiqotimizning yana bir yangi jihati - septik shikastlanish paytida buyrak perfuziyasi va faoliyatini baholash uchun MSOTdan foydalanish. MSOT turli organlarning perfuziyasini o'lchash uchun yorliqsiz usul va buyrak funktsiyasini aniqlash uchun ishonchli tasvirlash usuli sifatida xabar qilingan2832,45. Mikrotomirlarni vizualizatsiya qilishga imkon bermaydigan Doppler oqim o'lchagich bilan solishtirganda45, MSOT 150 um yuqori fazoviy o'lchamlari bilan tasvirlarni yaratadi va buyrak mikrovaskulaturasidagi perfuziya holatini miqdoriy baholashni ta'minlaydi. Suvda eruvchan IRDye800CW buyrak klirensini o'lchash uchun xavfsiz izlovchi hisoblanadi va u 20 mg/kg dan yuqori dozada zaharlanishni keltirib chiqarmaydi. Biz kuzatgan IRDye800CW ning ikki fazali harakati ilgari chop etilgan tadqiqotlar bilan mos keladi. Bizning MSOT yozuvlarimiz sepsis buyraklarida Tmax-kechikishning ko'proq ekanligini ko'rsatadi, bu buyrak klirensining buzilganligini ko'rsatadi. Nefropatiyani o'rganish shuni ko'rsatadiki, MSOTis tomonidan aniqlangan buyrak funktsiyasi buzilganligi glomerulyar gistologik shikastlanish bilan sezilarli darajada bog'liqdir30. Oldingi nashrlarga mos keladigan ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, MSOT buyrak perfuziyasi va funktsiyasini kuzatish uchun minimal invaziv va ishonchli usuldir.

Hozirda DHHC{0}}maxsus ingibitorlari mavjud emas. Eng ko'p qo'llaniladigan PAT inhibitori 2-BP bo'lib, u bir nechta DHHClarga keng ta'sir qiladi va shuningdek, yog 'kislotalari almashinuviga xalaqit beradi47. Shunday qilib, DHHC21 ni maxsus maqsad qilgan kichik molekula ingibitorlarini ishlab chiqish istiqbolli yo'nalish bo'ladi. Shuni ham ta'kidlash kerakki, aAR DHHC21 ning yagona substrati emas. Yaqinda bir qancha boshqa DHHC21 substratlari aniqlandi, ular orasida trombotsitlar endotelial hujayra yopishish molekulasi (PFCA M-1), estrogen retseptorlari kaveolin-1, endotelial azot oksidi sintaza (eNOS), Fyn, superoksid dismutaza (SOD{{) 8}}) va PLCB122,41,4s,49, Ushbu tadqiqot doirasidan tashqarida bo'lsa-da, biz bu substratlar septik shikastlanish paytida buyrak funktsiyasiga ham ta'sir qilishi mumkinligini istisno qila olmaymiz.

Xulosa qilib aytganda, ushbu tadqiqot birinchi marta DHHC21 aAR palmitilatsiyasi va aAR vositachiligidagi vazokonstriksiyani o'z ichiga olgan mexanizmlar orqali septik shikastlanish paytida buyrak perfuziyasini tartibga solishda muhim rol o'ynashini ko'rsatadi. Bundan tashqari, DHHC21 inhibisyonu septik shikastlanish paytida buyrak funktsiyasiga himoya ta'sir ko'rsatadi.

Materiallar va uslublar

Reaktivlar. Barcha reagentlar S1 qo'shimcha jadvalida keltirilgan.

Hayvonlar. Zdhhc21depher sichqonlari va ularning yovvoyi turdagi nazorat sichqonlari (B6C3Fe) Jekson laboratoriyasidan sotib olingan. Zdhhc21dephe genotipi? sichqonlar ketma-ketlik bilan tasdiqlangan (Genewiz, Inc., NJ, AQSh). Sekvensiya uchun ishlatiladigan primerlar: AGCTGACTGAAGGGCACC (oldinga) va AAAACCTGTAACGCATTTCCA (teskari)23. Hayvonlar 12/12-soat yorug'lik/qorong'u tsikl ostida oziq-ovqat va suvdan bepul foydalanish imkoniyatiga ega bo'lgan. Ushbu tadqiqot uchun ikkala jinsdagi sichqonlar (16-20 hafta) ishlatilgan. Hayvonlar ustida o'tkazilgan barcha tajribalar Janubiy Florida universiteti hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan va laboratoriyani parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha NIH qo'llanmasiga mos keladi.

Ko'richakni bog'lash va ponksiyon qilish, Sichqoncha izofluran bilan behushlik qilindi (3 foiz indüksiyon va 1 foiz parvarishlash). Qorin bo'shlig'ining soqollangan qismida o'rta chiziqli kesma amalga oshirildi va ko'richak tashqi ko'rinishga keltirildi, ileotsekal qopqoqdan 5 mm pastda mahkam bog'landi va bog'lash joyidan distalda 20- o'lchovli igna bilan ikki marta teshildi. Har bir teshikdan bir mm najas siqib chiqarildi. Keyin ko'richak joyini o'zgartirib, qorinni ikki qatlam bilan yopib qo'ydi. 37 C Laktatlangan Ringer eritmasi ko'richak qurib ketishining oldini olish uchun topikal ravishda qo'llanildi. Keyin sichqonlarga suyuqlik reanimatsiyasi uchun teri ostiga 37 daraja 0,9 foiz sho'r suv berildi. Operatsiyadan oldingi 0.5-1.5 mg/kg dozasi og'riqsizlantirish uchun buprenorfinning doimiy chiqarilishi berildi. Sham sichqonlari xuddi shunday jarrohlik amaliyotiga duchor bo'lishdi, ammo ko'richakni bog'lash va ponksiyonsiz 50,51.

Multispektral optoakustik tomografiya. IRDye800CW ning buyrak orqali chiqarilishini baholash. Sichqonlar izofluran orqali behushlik qilindi va torso mintaqasi atrofida depilatsiya qilindi. Sichqonlar Altera Medical MSOT Imaging System (Myunxen, Germaniya) yordamida bir nechta to‘lqin uzunliklarida: 700,730,760,775,785, 800,850 nm 10 kadr/s tezlikda suratga olingan. Sichqonlar ushlagichga supin holatiga joylashtirildi va buyraklarni mahkamlangan konkav transduser ustiga joylashtirish uchun gorizontal chiziqli bosqich bo'ylab harakatlandi. Dastlabki ro'yxatga olishdan so'ng, 100 ul 0,9% fiziologik eritmada eritilgan 60 nmol RDve800CW l0 soniya davomida vena ichiga yuborildi. Tasvirlar orqa proyeksiya formulasi yordamida qayta tiklandi va multispektral tahlil bilan qayta ishlandi. Qiziqarli hududlar (ROI) buyrak korteksi va medulla / tos mintaqasi atrofida chizilgan va ROIlarda MSOT signalining vaqtinchalik o'zgarishlari tasvirlangan.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Buyrak gistopatologiyasi. Buyraklar o'rnatildi, sagittal tekislik bo'ylab kesildi va kerosin kiritish uchun qayta ishlandi. Bo'limlar (5 mkm) parafinsizlantirildi, regidratlandi va davriy kislota bilan 8 daqiqa davomida xona haroratida (RT) oksidlandi, so'ngra Shiff eritmasi bilan 25 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin bo'limlar gematoksilin bilan bo'yalgan. Rasmlar Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, AQSh) yordamida olingan. Buyrak tuzilmasining shikastlanishi quyidagi xususiyatlar asosida baholandi: glomerulyar anomaliya, proksimal tubulaning cho'tkasi chegarasining yo'qolishi, vakuolatsiya, tubula epiteliysining kengayishi, quvurli hujayralar ajralishi/nekroz va neytrofil infiltratsiyasi. Har bir xususiyat jiddiylik darajasiga qarab 0-5 shkalasida baholandi.

Kreatinin va qon karbamid azotini o'lchash. Sichqoncha qoni septik shikastlanishdan 24 soat o'tgach, yurak ponksiyoni orqali to'plangan. Plazma qonni RT da 15 daqiqa davomida 2500 g da santrifüj qilish orqali hosil qilingan. Kreatininni o'lchash: plazma 10-kDa Spin Column yordamida deproteinizatsiya qilindi; filtratdagi kreatinin darajasi so'ngra Kreatinin tahlil to'plami yordamida o'lchandi. Qonda karbamid azoti (BUN) darajasi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq karbamid azotining kolorimetrik aniqlash to'plami yordamida aniqlandi.

RBF va MAPni o'lchash. Sichqonlar izofluran yordamida behushlik qilishdi. Qon bosimi o'tkazgich karotid arteriyaga o'rnatilgan. Qorin bo'shlig'ida o'rta chiziqli kesma, so'ngra buyrak arteriyasini ochish uchun chap ko'ndalang kesma qilingan. RBF ultratovushli tranzit vaqt oqimi o'lchagich yordamida o'lchandi (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, AQSH). Oqim probini ochiq buyrak arteriyasi atrofiga qo'ygandan so'ng, sichqonlarni kamida 30 daqiqa davomida barqarorlashtirishga ruxsat berildi. RBF va MAP bir vaqtning o'zida PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, AQSH) yordamida yozib olingan. Ma'lumotlar LabChart Pro 7-versiya dasturi yordamida tahlil qilindi4,55

Qatronlar yordamida suratga olish. Buyrak arteriyalari to'plangan va lizis buferida lizislangan (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mkM palmostatin B, proteaz inhibitörleri, pH 7,4）22, 56. To'qimalarning lizatlari blokirovka qiluvchi bufer (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5 foiz SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) bilan 50 daraja C da 30 daqiqa davomida doimiy vorteks bilan inkubatsiya qilindi.Sovuq aseton bilan cho'ktirilgandan so'ng oqsillar olindi. 5000 g da 30 daqiqa davomida santrifüjlash yo'li bilan pelletlanadi va besh marta 70 foizli sovuq aseton bilan yuviladi.Protein pelletlari bog'lovchi buferda qayta suspenziya qilindi (100 mM HEPES, 1,0 foiz SDS, 1 mM EDTA, pH 7,4). Protein kontsentratsiyasi aniqlandi va guruhlar o'rtasida normallashtirildi. Har bir protein namunasi ikkita teng qismga bo'lindi, har bir qismiga bir xil miqdorda izopropil separoza 6B boncuklari, mos ravishda gidroksvlamin (0,2 M, pH 7,4) va NaCl (0,2 M) qo'shildi.RTda 4 soat inkubatsiyadan so'ng doimiy aylanish bilan palmitoylangan oqsillar 1 × Namuna Buferida 50 mM DTT bilan elutsiya qilindi va SDS-PAGE uchun to'plandi.

Western bloting. Palmitoylangan lARni o'lchash. RACdan olingan namunalar 4-20 foiz Tris-Glitsin jeliga yuklangan va elektroforezdan so'ng nitroselüloz membranasiga o'tkazilgan. RT da 1 soat davomida blokirovka qilingandan so'ng, aAR quyonlarga qarshi asosiy antikor (1:500) bilan kechasi 4 daraja haroratda tekshirildi. TBST bilan uch marta yuvilgandan so'ng, membrana RTda 45 daqiqa davomida IRDye800CW eshakka qarshi quyonga qarshi ikkilamchi antikor (1:20,000) bilan inkubatsiya qilindi.

ERK fosforlanishini o'lchash. Buyrak arteriyalari proteaza va fosfataza inhibitörlerini o'z ichiga olgan 1 × RIPAda lizing qilindi. Membrana quyonga qarshi ERK(1:1000) va sichqonchaga qarshi fosforlangan ERK (1:1000) antikorlari bilan tekshirildi. Ikkilamchi inkubatsiya uchun IRDye800CW eshak sichqonchaga qarshi va IRDye680RD eshak quyonga qarshi antikorlari ishlatilgan (1:20 000). Membranalar Li-COR Odyssey CLx yordamida tasvirlangan va tahlil qilingan.

Simli miyograf orqali vazoreaktivlikni baholash. Sichqoncha buyrak arteriyalari. Buyrak arteriyalari ({{0}} mkm diametrli) WTand Zdhhc21dp/de sichqonlaridan ajratildi va muzdek sovuq kislorodli (95 foiz O,/5 foiz CO.) fiziologik tuz eritmasiga (PSS,13{) botirildi. {47}} mM NaCl,4,7 mM KCl,1,18 mM KH,PO,1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glyukoza, 0,026 mM EDTA va 1,6 mM CaCl sel. 2 mm uzunlikdagi) simli miograf kamerasiga (Living Systems Instrumentation, VT, AQSh) ikkita volfram simlari (diametri 30 um) orasiga o'rnatildi. Izometrik kuchlanish LabScribe v4 iWorks dasturi bilan birlashtirilgan Living Systems signal konditsioneri (MYO-SC-1) yordamida qayd etilgan. 30 daqiqa davomida 37 daraja Cin PSS da muvozanatlashgandan so'ng, optimal ichki aylana L,=0.9×L(Lo=100 mmHg transmural bosimga to'g'ri keladigan ichki aylana) aniqlash uchun normalizatsiya jarayoni amalga oshirildi. . Keyinchalik, tomirning hayotiyligi 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, PO.1.17 mM MgSO.7H, O, 14.9 mM NaHCO, 5.5 mM glyukoza, 0.06M, 0.02 mM, Ca 1.Cl) bilan sinovdan o'tkazildi. 7.4).KPSSga javob bermagan arteriyalar chiqarib tashlandi. Arteriyalar fenilefrinning ortib borayotgan kontsentratsiyasi (10 nM-30 mM) bilan davolandi. Keyin endoteliy yaxlitligi atsetilxolin (10 mkM) yordamida baholandi. Konsentratsiya-javob egri chiziqlari tuzilgan.

Inson buyraklaridan kichik arteriyalar. Kichkina arteriyalar (diametri ~ 1000 um) transplantatsiya operatsiyasi uchun rad etilgan buzilmagan hayotga yaroqli buyraklaridan ajratildi. Tomir segmentlari (~ 2 mm uzunlikdagi) simli miyograf kamerasining I-barlariga (diametri 250 um) o'rnatildi. Shunga o'xshash muvozanat va normalizatsiya protseduralari inson arteriyalarida amalga oshirildi. Keyinchalik, arteriyalar 1 soat davomida avtomobil nazorati (PSSda 0,02 foiz DMSO) bilan inkubatsiya qilindi. Keyin tomirlar 60 mM KPSS bilan hayotiylik uchun sinovdan o'tkazildi va fenilefrin (10 nM-30 uM) ning ortib borayotgan konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Yuvib bo'lgandan so'ng, tomirlar 2-BP(100 uM) bilan 1 soat davomida inkubatsiya qilindi; keyin tomirning hayotiyligi 100 uM 2-BP bilan 60 mM KPSS bilan yana sinovdan o'tkazildi. KPSSga javob bermagan yoki kamaygan kichik arteriyalar tashlandi. Keyin arteriyalar bir xil konsentratsiyali fenilefrin va atsetilxolin (10 uM) bilan sinovdan o'tkazildi. Avtotransport nazorati yoki 2-BP bilan davolash qilingan arteriyalarning konsentratsiya-javob egri chiziqlari tuzildi va solishtirildi.

Immunofluoresans. Odamning buyrak arteriyalari 1{3}}% formalinda 48 soat davomida fiksatsiya qilindi, kerosin bilan singdirildi va kesildi. Keyin slaydlar deparafinizatsiya qilindi, regidratlanadi va 0,05% Triton X-1002 ni o'z ichiga olgan PBS bilan o'tkazuvchanlikka ega bo'ldi. Bloklangandan so'ng, slaydlar quyonlarga qarshi DHHC21 va echkilarga qarshi antikorlar (1:100) bilan yorliqlandi, bir kechada 4 daraja C da. Yuvilgandan so'ng, ikkilamchi antikor inkubatsiyasi eshaklarga qarshi quyonlarga qarshi Alexa Fluor 488 va eshakka qarshi echki Alexa bilan amalga oshirildi. Fluor 568 (1:500). DAPI bilan ProLong Diamond o'rnatish muhiti bilan o'rnatilgandan so'ng, slaydlar Leica SP8 spektral teskari lazerli skanerlash konfokal mikroskop bilan tasvirlangan.

Statistik tahlil. Har bir statistik test uchun batafsil ma'lumot (masalan, test nomi, post-hoc test, n qiymati, alfa darajasi, p-qiymati) S2 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. Barcha ma'lumotlar normal taqsimot taxminiga javob beradi. Oddiylik testi Shapiro-Wilk testi yordamida 0.05 da o'rnatilgan alfa darajasi bilan amalga oshirildi. Ikki guruh o'rtasidagi taqqoslashlar Student's t-test (ikki dumli) yordamida tahlil qilindi va uchta yoki undan ko'p guruhlar Tukey post-hoc tahlili bilan bir tomonlama ANOVA orqali taqqoslandi. Simli miyograf egri chiziqlarini taqqoslash Ikki tomonlama ANOVA.p. yordamida amalga oshirildi<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">