Tlr8 va uning endogen ligandlari MiR-21 o'rtasidagi o'zaro ta'sir orqali podotsitlar shikastlanishi obstruktsiyalangan va uning garov buyraklari

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

cistanche erektil disfunktsiyasi buyrak bilan bog'liq

Surunkali buyrak kasalligi kattalarda keng tarqalgan bo'lsa-da, yosh va keksa bemorlarda obstruktiv nefropatiya (ON) haqida xabar berilgan. ONda tubulointerstitial lezyonlar (TIL) keng ko'lamda o'rganilgan, ammo glomerulyar lezyonlar (GL) asosan e'tibordan chetda qolgan. Bu erda biz yosh va qari sichqonlarda ONda GL rivojlanishining yangi mexanizmini ko'rsatamiz. TILlar yallig'lanish hujayralarining tubulointerstitiumga infiltratsiyasi tufayli GLga qaraganda ertaroq rivojlanadi, ammo GLlar glomerulusga infiltratsiya qiluvchi yallig'lanish hujayralari yo'qligiga qaramay, Toll-o'xshash retseptor 8 (Tlr8) faollashgandan keyin rivojlanadi. TLR8 va interleykin 1 beta (IL1b) oqsillari podotsit funktsiyasini kamaytiradigan markerlar (PFMs) bilan birlashadi, bu shikastlangan podotsitlarda TLR8 signalizatsiyasining faollashishini ko'rsatadi. Bundan tashqari, Tlr8 uchun endogen ligand bo'lgan miR -21 ning glomerulyar va sarum darajalari ON sichqoncha modelida soxta nazoratga qaraganda yuqori edi. Tlr8 ning glomerulyar ifodasi miR-21 va quyi oqim Il1b va Il6 sitokinlari bilan ijobiy korrelyatsiya qiladi va PFM (Nphs1 va Synpo) bilan salbiy korrelyatsiya qiladi. Shuningdek, biz TLR8 va IL1b oqsillarining kolokalizatsiyasini ko'rsatamiz, ular PFMlarni ham to'siqli, ham kamaytiradi.garovbuyraklaryosh va qari sichqonlar. Bundan tashqari, in vitro tadqiqot natijalari obstruktsiyadan glomeruliyalarda Tlr8 va uning quyi oqimidagi sitokinlarining yuqori ifodasini aniqladi.buyraklarmiR- 21 mimiki bilan keyingi davolash nazoratga qaraganda. Xulosa qilib aytganda, Tlr8 ning haddan tashqari ko'payishi podotsitlar shikastlanishi orqali ONda GL rivojlanishining asosli mexanizmi bo'lib xizmat qilishi mumkin.

Kalit so'zlar: surunkali buyrak kasalligi,obstruktiv nefropatiya, podotsit, TLR8, obstruktiv va kollateral buyrak

KIRISH

Surunkali buyrak kasalligi (CKD), sog'liqni saqlashning asosiy muammosi, umumiy aholining 8-13 foizida keng tarqalgan (1). Jamiyatning qarishi tufayli keksa odamlarda tez-tez uchraydi. Obstruktiv nefropatiya (ON) klinisyenlar uchun katta qiziqish uyg'otadi, chunki u turli yoshdagi bemorlarda qayd etilgan. Boshqa CKDlardan farqli o'laroq, ON davolash mumkin va tiklanadi (2, 3). Bolalarda u 1500 yoshdan birida uchraydi va rivojlangan mamlakatlarda uning tarqalishi 1 foizdan 5 foizgacha yuqori (4, 5). Kattalardagi ONning tarqalishi 1000 kishida 5 dan 10000 kishida 5 gacha. Bundan tashqari, surunkali bir tomonlama ONning tarqalishi taxminan 0,5 foizni tashkil qiladi, o'tkir bir tomonlama va surunkali ikki tomonlama ON taxminan 0,1 foizni tashkil qiladi (4-7).

ON buyrak funktsiyasining asta-sekin pasayishi va 3 oydan ortiq davom etadigan buyrak tuzilmalarining o'zgarishini o'z ichiga olgan o'tkir buyrak shikastlanishiga yoki CKDga olib kelishi mumkin (8, 9). Bir tomonlama ureteral obstruktsiya (UUO) surunkali ONni o'rganish uchun keng qo'llaniladigan strategiyadir. UUO buyragidagi ON gipertrofiya, gidronefroz, interstitsial sohada yallig'lanish hujayralarining to'planishi, gipoksiyadan quvurli hujayralar o'limi va tubulointerstitial fibrozning (TF) rivojlanishi bilan tavsiflanadi (10).

TF buyrak kasalligining so'nggi bosqichining muhim xususiyati va progressiv buyrak shikastlanishining asosiy omilidir (11). TF ON modellarida keng ko'lamda o'rganilgan, ammo glomerulyar shikastlanishlar, ayniqsa qon-siydik to'sig'i (BUB) anormalliklari haqida ma'lumotlar kam (8, 9, 12). Bundan tashqari, tadqiqotlar bir tomonlama ONda kollateral buyrakdagi tubulointerstitial lezyonlar (TILs)ni o'rgandi, ammo glomerulyar lezyonlar (GL) asosan e'tibordan chetda qoldi (12). Bir nechta hisobotlar eksperimental ONda TILlarning rivojlanishida peritubulyar kapillyarlarning ishtirokini aniqladi (13, 14). Shu bilan birga, glomerulus va glomerulyar kapillyar mos ravishda nefron va peritubulyar kapillyarlarning quvurli segmentlariga oqib tushadi. Shuning uchun biz glomerulonefrit tubulointerstitiumga ham ta'sir qilishi mumkinligini taklif qilamiz. Bizning oldingi tadqiqotlarimiz glomerulyar ichki hujayralarga, asosan podotsitlarga shikastlanishning GLga qo'shgan hissasini va turli xil Tollga o'xshash retseptorlarning (TLR) haddan tashqari ko'payishi tufayli otoimmün kasallik sichqoncha modelida TIL rivojlanishini ta'kidladi (15-18).

Glomerulyar kapillyar endoteliy va podotsitlar BUBlarni o'z ichiga olgan muhim darvozabonlardir. Ushbu ikkita epiteliya o'rtasida podotsitlar doimiy ravishda xavfli signallarga, shu jumladan xavf bilan bog'liq molekulyar naqshlar (DAMPs) yoki patogen bilan bog'liq molekulyar naqshlar (PAMPs) kabi TLR ligandlari glomerullarda noyob lokalizatsiyasi tufayli doimiy ravishda ta'sir qiladi (15). Shuning uchun podotsitlardagi TLRlar va ularning endogen ligandlari o'rtasidagi o'zaro ta'sir yuqumli bo'lmagan sharoitlarda podotsitlarning shikastlanishiga yordam beradi deb hisoblanadi. Ushbu tadqiqotda biz yosh va qari sichqonlarning ham obstruksiyalangan, ham garov buyraklarida GL rivojlanishiga e'tibor qaratdik, chunki ON ko'pincha yosh va keksa odamlarda uchraydi. Biz yosh va qari sichqonlarning obstruktsiyali va kollateral buyraklaridan podotsitlarda Tlr8 ning haddan tashqari ko'payishi orqali podotsitlar shikastlanishi tufayli GL ONda ishlab chiqilganligini aniqladik.

MATERIALLAR VA USLUBLAR

Axloqiy bayonot va eksperimental hayvonlarni saqlash Laboratoriya hayvonlaridan foydalangan holda barcha tajribalar Xokkaydo universiteti veterinariya fakultetining hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan (tasdiqlash raqami: 16- 0124). Mualliflar Xokkaydo universiteti veterinariya fakultetining laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha tasdiqlangan qo'llanmasiga amal qilishgan (Laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish xalqaro tashkilotini baholash va akkreditatsiya qilish assotsiatsiyasi tomonidan tasdiqlangan). Olti haftalik C57BL / 6N sichqonlari Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Yaponiya) dan sotib olindi va 1: 1 yorug'lik-qorong'i muhitda maxsus patogensiz sharoitlarda saqlangan. Eksperimental hayvonlarga ad libitum oziq-ovqat va ichimlik suvi berildi.

Eksperimental dizayn Biz yosh (9 hafta) va qari (12 oy) sichqonlardan foydalandik. Har bir yosh guruhidagi sichqonlar (n=4) oldingi tadqiqotimizda tasvirlanganidek, ON-modelli buyrakni yaratish uchun soxta operatsiya (nazorat guruhi) yoki UUO (2, 7, 11 va 21 kun) o'tkazildi. (13).

Namuna tayyorlash Sichqonchalar yuqorida ta'riflanganidek (16) anestetik moddalar aralashmasi bilan chuqur anesteziya qilingan va bachadon bo'yni dislokatsiyasi bilan evtanizatsiya qilingan. Qon zardobidagi markerni tahlil qilish uchun femoral arteriya orqali qon namunalari olingan. UUO va kollateral buyraklar to'plangan va ingichka bo'laklarga bo'lingan. Buyrak bo'laklari gistopatologik, immunohistokimyoviy va elektron mikroskopiya tadqiqotlari uchun mos ravishda 10 foiz neytral bufer formalin (NBF), 4 foiz paraformaldegid (PFA) va 2,5 foiz glutaraldegid (GTA) bilan o'rnatildi.

Immunohistokimyo va Immunoffloresan NBF-fiksatsiyalangan kerosin bloklari 2 mm qalinlikda kesilgan va buyrak gistopatologiyasini tekshirish uchun davriy kislota Schiff-gematoksilin (PAS-H) bilan bo'yalgan. Uyali markerlarning immunodeteksiyasi avval xabar qilinganidek (16) B hujayralari (B220), T hujayralari (CD3), kapillyar endoteliy (CD31), IL1b, makrofaglar (Iba1), podotsitlar (podotsin va sinaptopodin) va TLR8 uchun amalga oshirildi. Bo'yash shartlari 1-jadvalda keltirilgan.

Gistoplanimetriya PAS-H va immuno-bo'yalgan buyrak bo'limlari Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Yaponiya) yordamida virtual slaydlarga aylantirildi. Ijobiy hujayralar NDP.view2 dasturi (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) yordamida 400x kattalashtirishda tubulointerstitiumdan tasodifiy tanlangan 20 ta glomeruli yoki 20 fokusdan hisoblangan. PAS-H bilan bo'yalgan bo'limlardan 20 ta glomeruliya tasvirlari, shuningdek, BZ-X710 (Keyence, Osaka, Yaponiya) All-in-One floresan mikroskop yordamida har bir sichqonchadan 400x da olingan. BZ-X analizatori (Keyence) yordamida olingan tasvirlardan glomerulyar mezangial maydon va hajmi o'lchandi.

RNK ekstraktsiyasi va kulturasi uchun glomerulusning izolyatsiyasi Soxta operatsiya qilingan va UUO buyraklaridan glomerullar ilgari tasvirlanganidek ajratilgan (16). Qisqacha aytganda, sichqonlar chuqur anesteziya qilingan va chap qorincha orqali Dynabeads (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, AQSh) o'z ichiga olgan 40 ml Hankning muvozanatli tuz eritmasi (HBSS) bilan perfuziya qilingan. Buyrak kesilgan

va mayda bo'laklarga bo'linadi. Keyin hujayralar kollagenaz A (1 mg / ml; Roche, Bazel, Shveytsariya) va deoksiribonukleaza I (100 U / ml; Life Technologies) bilan HBSS da 37 daraja 30 daqiqa davomida hazm qilindi. Tarkibida hazm boʻlgan toʻqima boʻlgan suspenziya 100- mm hujayrali filtrdan (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, AQSH) yassilangan toʻqmoq yordamida muloyimlik bilan bosildi. Olingan hujayra suspenziyasi 200 × g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi va hujayra pelleti 2 ml HBSSda qayta suspenziya qilindi. Dynabeadlarni o'z ichiga olgan glomeruli magnit zarrachalar kontsentratori (Life Technologies) yordamida to'plangan va RNK izolyatsiyasi uchun ishlatilgan.

Teskari transkripsiya va real vaqtda PCRUmumiy RNK RNeasy to'plami (Qiagen, Hilden, Germaniya) yordamida glomeruliyadan ajratilgan. cDNK umumiy RNK dan ReverTra Ace teskari transkriptaza fermenti (Toyobo, Osaka, Yaponiya) va tasodifiy dT primerlari (Promega) yordamida teskari transkripsiya orqali sintez qilindi. cDNK Brilliant III SYBR Green QPCR master mix va Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, AQSh) bilan real vaqtda PCRda ishlatilgan. Glomerulyar gen ifodasi Actb ifodasiga normallashtirildi. Amaldagi primer juftlari 2-jadvalda ko'rsatilgan.

Teskari transkripsiya va TaqMan-ga asoslangan real vaqtda PCRJami RNK, jumladan, ajratilgan glomeruliyadagi mikroRNK (miRNK) miRNeasy to'plami (Qiagen) yordamida ajratilgan. Ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq (Applied Biosystems, Foster City, CA, AQSH) jami RNKni teskari transkripsiya qilish uchun miRNKga xos bo'lgan ildiz-pastali RT primerlari, teskari transkriptaza, teskari transkripsiya buferi, dNTPlar va RNase inhibitori ishlatilgan. Olingan cDNK bilan real vaqtda PCR miR-21--ga xos TaqMan primerlari va maxsus zondlar (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) va Mx3000P (Agilent Technologies) yordamida amalga oshirildi.

Izolyatsiya qilingan glomeruliyalarni mimiklar bilan in vitro davolashGlomeruli sham-operatsiya qilingan va UUO dan ajratilganbuyraklar11 kunlik obstruktsiyadan keyin. Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) muhiti (Fujifilm Wako, Yaponiya) 300 glomerulini o'z ichiga olgan 96-quduq madaniyat plitasining (TPP, Trasadingen, Shveytsariya) har bir qudug'iga tarqatildi va PBS, salbiy nazorat va miR{5}} mimik (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Janubiy Koreya) bilan 1 pmol/mkL da 4 soat davomida 37 daraja, 5 foiz CO2 bilan ishlov berilgan. Tlr8 va uning quyi oqimidagi sitokinlarining ifodasi avvalgi bobda ta'riflanganidek o'lchandi.

Skanerli elektron mikroskopMuntazam skanerlash elektron mikroskopi (SEM) uchun, kichikbuyrak tilim2,5% GTA bilan 4 soat davomida va 1 soat davomida 1% osmiy tetroksid bilan fiksatsiya qilingan, keyin 1 soat davomida 1% tanin kislotasi bilan ishlov berilgan. Keyin namunalar 1 foizli osmiy tetroksid bilan 1 soat davomida mahkamlangan va mos ravishda 10 daqiqa va 1 soat davomida 0,5 foiz va 1 foiz tanin kislotasi bilan ishlov berilgan.Buyraktilimko'tarilgan spirt bilan suvsizlandi, 3-metilbutil asetatga o'tkazildi va nihoyat HCP-2 kritik nuqtali quritgichda quritildi (Hitachi, Tokio, Yaponiya). Namunalar ionli purkashga duchor qilindi va keyin S-4100 skanerlovchi elektron mikroskop ostida 12 kV tezlashtirilgan kuchlanishda tekshirildi.

Statistik tahlilQiymatlar o'rtacha ± standart xato (se) sifatida ifodalanadi. Natijalar parametrik bo'lmagan Mann-Whitney U-testi (P ​​< 0.05)="" yordamida="" statistik="" tahlil="" qilindi.="" uch="" yoki="" undan="" ortiq="" populyatsiyani="" solishtirish="" uchun="" kruskal-uollis="" testidan="" foydalanildi="" va="" sezilarli="" farqlar="" kuzatilgandan="" keyin="" sheffe="" usuli="" yordamida="" bir="" nechta="" taqqoslashlar="" amalga="" oshirildi="" (p="">< 0.05).="" ikkala="" parametr="" o'rtasidagi="" korrelyatsiya="" spearmanning="" darajali="" korrelyatsiya="" koeffitsienti="" testi="" (p=""><0,05) yordamida="" tahlil="">

NATIJALAR

Yosh sichqonlarning tiqilib qolgan buyraklarida TIL va GLBiz birinchi navbatda turli vaqt oralig'ida obstruktsiyaga uchragan yosh sichqonlarning soxta va UUO buyraklarida TIL va GLlarni tekshirdik. Soxta operatsiya qilingan buyraklar normal tubulointerstitiyni ko'rsatgan bo'lsa (1A-rasm), 2 kunlik UUOdan keyin tiqilib qolgan buyraklar TILlarni ko'rsatdi va tubulalarning kengayishi bilan tavsiflanadi; ba'zi tubulalarda siydik yo'llari ham bo'lgan. Bunday lezyonlar obstruktsiyaning kuchayishi bilan ortdi (1A-rasm). GLs, asosan, glomeruloskleroz, UUO dan keyingi 21 kun ichida kechki bosqichda kuzatilgan va davriy kislota-Schiff (PAS)-musbat materiallarning cho'kishi bilan tavsiflangan. Glomerulyar struktura sham va erta UUO buyraklarida ham normal edi (2, 7 va 11 kun) (1B-rasm). Glomerulyar hujayralar soni obstruktsiyadan keyingi kungacha-11 ko'paydi va UUO buyraklarida-21 kamayish tendentsiyasi kuzatildi (1C-rasm). Glomerulyar mezangial to'planish obstruktsiyadan keyingi 7 kundan boshlab o'sish tendentsiyasiga ega (1D-rasm).

obstruktsiyadan keyin 21 kun ichida UUO buyrak glomerulining markazida yo'q edi (1F-rasm). Polimeraza zanjiri reaktsiyasi obstruktsiyadan 21 kundan keyin UUO buyraklarida PFMlarning (Nphs1 va Synpo) sezilarli darajada pasayishini aniqladi (1G-rasm). Bundan tashqari, SEM tahlili soxta operatsiya qilingan buyraklarda normal podotsit oyoq jarayonlarini (PFP) aniqladi; ammo, obstruktsiyadan 21 kun o'tgach, UUO buyraklarida PFP o'chirilishi va mikrovillusga o'xshash tuzilmalar haqida xabar berilgan (1H-rasm). Birgalikda bu natijalar obstruktsiyadan 21 kun o'tgach, tiqilib qolgan buyrakda podotsitlar shikastlanishining paydo bo'lishini ko'rsatadi.

Infifiltratsiya qiluvchi immun hujayralar tiqilib qolgan buyrakda yo'q Biz podotsitlar shikastlanishi glomerulusdagi infifiltrlovchi immun hujayralari bilan bog'liqligini ilgari ko'rsatgan edik (13, 16, 18). Shuning uchun biz soxta va UUO buyraklarining TIL va GLlarida B- va T-hujayralari, shuningdek makrofaglarning infifiltratsiyasini tekshirdik (2-rasm). Obstruktsiyadan keyingi kunlarda UUO buyraklarining TILlarida ko'plab infifiltratsiya qiluvchi B-, T-hujayralari va makrofaglar kuzatilgan, ammo ular sham va UUO buyraklarining glomeruliyalarida deyarli yo'q yoki kam edi (2A-E-rasmlar). B-, T-hujayralari va makrofaglar soni glomerulusda juda oz edi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan), ammo ularda sezilarli darajada yuqori.

2-, 7-, 11- va 21- kunlik buyraklardagi tubulointerstitiy soxta buyraknikiga nisbatan (2F-rasm). Shuning uchun infiltratsiya qiluvchi immun hujayralar tiqilib qolgan buyrakda TILlarning rivojlanishiga hissa qo'shishi mumkin. Biroq, boshqa omillar GL rivojlanishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin.

Yosh sichqonlarning sham bilan boshqariladigan va tiqilib qolgan buyraklarida TLR oilasining turli a'zolari va quyi oqim sitokinlarining ifodalanishi Oldingi tadqiqotlar kasallangan buyraklar podotsitlarida turli TLRlarning yuqori ifodalanishini aniqlagan (15, 16, 19, 20). Qizig'i shundaki, bizning ma'lumotlarimiz UUO 21- kunlik guruhdan ajratilgan glomeruliyalarda sham guruhidagi glomeruliyalarga qaraganda Tlr8 va Tlr9 ning sezilarli darajada yuqori ifodasini aniqladi (3A-rasm). Bundan tashqari, biz sham va UUO 21- kunlik guruhlardagi glomeruliyalarda TLR oilasi a'zolarining quyi oqim sitokinlarining ekspressiyasini o'rganib chiqdik va interleykin 1 beta (Il1b) va interleykin 6 ni kodlaydigan genlarning ifodalanishida sezilarli darajada ko'tarilganligini aniqladik. (Il6) UUO guruhida soxta guruhdagiga nisbatan (3B-rasm).

TLR8 PFM bilan birgalikda lokalizatsiya qilindi. Tlr8 va Tlr9 ning ifodasi tiqilib qolgan buyrakdan ajratilgan glomeruliyalarda yuqori bo'lganligi sababli, biz ularning lokalizatsiyasini immunofloressensiya bilan bo'yash orqali tekshirdik. TLR8 oqsili soxta operatsiya qilingan buyraklarda aniqlanmadi (4A-rasm), lekin UUO buyragida PFM sinaptopodin bilan birgalikda lokalizatsiya qilindi (4B-rasm). Bundan tashqari, biz soxta yoki UUO sichqonlaridan buyrakda TLR9 oqsili ifodasini aniqlay olmadik (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

Yosh sichqonlarning tiqilib qolgan buyragida podotsitlardan IL1b ishlab chiqarilishi 3B-rasmda ko'rsatilganidek, glomerulyar Il1b (TLR oilasining quyi oqim sitokini) 21 kun ichida UUO buyragida soxta buyrakdagiga qaraganda sezilarli darajada yuqori bo'lgan. Shuning uchun biz UUO buyraklarining glomerulidagi IL1b manbasini immunofloressensiya bilan bo'yash orqali tekshirdik. IL1b oqsili ifodasi soxta buyraklar glomeruliyasida aniqlanmadi, lekin UUO buyraklarining glomeruliyalarida kuzatildi (4C, D-rasmlar). Bundan tashqari, IL1b PFM podotsin bilan kolokalizatsiya qilingan (4D-rasm).

UUOdabuyrakShamdagidan 21 kun ichidabuyrak.Shuning uchun biz UUO buyraklarining glomerulidagi IL1b manbasini immunofloressensiya bilan bo'yash orqali tekshirdik. Sham glomeruliyasida IL1b oqsili ifodasi aniqlanmadibuyraklarlekin UUO ning glomerulalarida kuzatilganbuyraklar(4C, D rasmlari). Bundan tashqari, IL1b PFM podotsin bilan kolokalizatsiya qilingan (4D-rasm).

ON modelidagi sichqonlarda taxminiy endogen Tlr8 ligand darajasining ortishi Oldingi tadqiqot shuni ko'rsatdiki, miR-21 TLR8 uchun ligand bo'lib xizmat qiladi (21). Shuning uchun biz sham va UUO 21-kun guruhlari o'rtasida miR-21ning glomerulyar va sarum darajalarini solishtirdik. Qizig'i shundaki, UUO 21-kun guruhida glomerulyar miR-21 soxta guruhdagiga qaraganda sezilarli darajada yuqori bo'lgan (P < 0.05),="" ammo="" sarum="" mir{="" {10}}="" oldingi="" guruhda="" ikkinchisiga="" qaraganda="" kuzatilgan="" (p="0.06)">

Tlr8 ifodasining uning miR-21 ligandlari va obstruksiyadagi PFMlar bilan korrelyatsiyasiBuyrak3-jadvalda ko'rsatilganidek, biz Tlr8 mRNKning glomerulyar ifodasi va uning endogen ligand (miR-21) hamda quyi oqimdagi Il1b va Il6 sitokinlari o'rtasida sezilarli ijobiy korrelyatsiyani kuzatdik. Boshqa tomondan, Tlr8 mRNK va PFMs Nphs1 va Synpo o'rtasida salbiy korrelyatsiya aniqlandi.

miR{0}} bilan glomeruliyalarni in vitro stimulyatsiyasi Tlr8 va uning quyi oqimidagi sitokinlarning ifodasini faollashtiradi. uning quyi oqimidagi sitokinlari (Ifng va Il1b) soxta sichqonlarning glomeruliyasida sezilarli darajada oshgan (P <0,05 va 0,01).

miR-21 mimiki bilan davolash PBS va salbiy nazorat mimikasi bilan davolash qilingan sichqonlarning glomeruliyalaridagiga nisbatan (5A-rasm). Biroq, mimiklar bilan davolashdan keyin soxta sichqonlarning glomerulida Tlr8 va uning quyi oqim sitokinlari o'rtasida sezilarli korrelyatsiya kuzatilmadi (4-jadval). Tlr8 va uning quyi oqimidagi sitokinlarining ifodasi UUO glomeruliyasida sezilarli darajada yuqori bo'lgan.buyraklar, miR-21 bilan davolashdan keyin UUO glomerulidagiga qaraganda mimikbuyraklarPBS va salbiy nazorat mimikasi bilan ishlov berilgan (5B-rasm). Mimiklar bilan davolashdan so'ng UUO buyrak glomeruliyasida Tlr8 va uning quyi oqim sitokinlari o'rtasida sezilarli bog'liqlik aniqlandi, bu Tlr8- vositachi yadro omili kappa B (NF-kB) yo'lining yuqori faollashuvidan dalolat beradi. tiqilib qolgan buyrakda yallig'lanishga qarshi sitokinlarning sekretsiyasi (4-jadval).

Yosh sichqonlarning kollateral buyraklarida TLR8 lokalizatsiyasi va podotsitlar shikastlanishiSoxta operatsiya qilingan buyraklarda glomerulus normal bo'lsa, kollateral buyraklarda glomerulyar gipertrofiya, glomerulyar hujayralar sonining ko'payishi va glomerulyar kapillyarlarning kengayishi (6A-rasm). Soxta operatsiya qilingan buyraklardagi glomerullar sinaptopodin ifodasi uchun ijobiy edi va TLR8 ifodasi yo'q edi (6B-rasm). Boshqa tomondan, kollateral buyraklar glomeruliya markazida sinaptopodin ifodasini yo'qotdi, ammo glomerulyar tezlik bo'yicha TLR8 ifodasini ko'rsatdi (6C-rasm). Bundan tashqari, TLR8 oqsili sinaptopodin bilan birgalikda lokalizatsiya qilingan (6C-rasm). Sham bilan operatsiya qilingan buyraklar podotsinning normal ifodasini ko'rsatdi, ammo glomerullarda IL1b ifodasi yo'q (6D-rasm). Shu bilan birga, kollateral buyrak ichidagi glomeruli markazda podosin ifodasini yo'qotdi, ammo glomerulyar tezlik bo'ylab IL1b ifodasiga ega edi (6E-rasm). Bundan tashqari, IL1b oqsili podotsin bilan kolokalizatsiya qilingan (6E-rasm). SEM tahlili sichqonchaning soxta buyraklarida normal PFPlarni aniqladi, ammo kollateral buyraklarda PFP o'chirilishi va mikrovillusga o'xshash tuzilmalar ko'rindi (6F-rasm).

Keksa sichqonlarning tiqilib qolgan va kollateral buyraklarida TLR8 lokalizatsiyasi va podotsitlar shikastlanishiSham bilan operatsiya qilingan buyraklar sinaptopodinning normal ifodasini ko'rsatdi, ammo ularning glomerullarida TLR8 oqsili uchun bo'yash aniqlanmadi (7A-rasm). Qizig'i shundaki, kollateral va UUO buyraklari ham glomeruliya markazida sinaptopodin ifodasini yo'qotgan, ammo glomerulyar rete bo'ylab TLR8 ifodasini saqlab qolgan (7B, C-rasmlar). TLR8 oqsili sinaptopodin bilan kollateral va UUO buyraklarida kolokalizatsiya qilingan (7B, C-rasmlar). Sham bilan operatsiya qilingan buyraklar xuddi shunday normal podotsin ifodasini ko'rsatdi, ammo ularning glomerulida IL1b ifodasi yo'q edi (7D-rasm). Boshqa tomondan, ikkala kollateral va UUO buyraklari glomeruliya markazida podotsin ifodasini yo'qotdi, ammo glomerulyar rete bo'ylab IL1b ifodasini ko'rsatdi (7E, F-rasm). Ijobiy binoni kollateral va UUO buyraklarining glomeruliyalarida podotsin bilan kolokalizatsiyalanganligi aniqlandi (7E, F-rasm). SEM tekshiruvi soxta sichqonchaning buyraklarida oddiy PFPlarni, PFPni yo'q qilishni va eski sichqonlarning kollateral va UUO buyraklarida mikrovillusga o'xshash tuzilmalarni aniqladi (7G-rasm).

MUHOKAZAON

tarqalishi chaqaloqlarda, shuningdek, keksa odamlarda (4-7) keng tarqalgan. Shunday qilib, biz yosh va qari sichqonlarni turli yoshdagi shaxslarning ON holatini taqlid qilish uchun UUO ga duchor qildik va TIL va GLlarni tekshirdik. Obstruktsiyali buyrakda TILning rivojlanishi obstruktsiyaning oldingi bosqichida (2 kun) aniq edi; ammo, keyingi bosqichda podotsitlar shikastlanishi bilan birga GLlarning rivojlanishi kuzatildi. Kollateral buyrak bir vaqtning o'zida GL va podotsit shikastlanishini ko'rsatdi. Bu kuzatuv shuni ko'rsatadiki, podotsitlarning shikastlanishi ham obstruksiyalangan, ham kollateral buyraklarda sodir bo'ladi, garchi dastlabki haqorat har xil bo'lishi mumkin. Bizning oldingi tadqiqotlarimiz podotsitlar shikastlanishi va glomerulusdagi immunitet hujayralarining infiltratsiyasi o'rtasidagi bog'liqlikni ta'kidladi (13, 16, 18). Biroq, ushbu tadqiqotda soxta yoki tiqilib qolgan buyraklarning glomeruliyalariga immun hujayralarining infiltratsiyasi kuzatilmadi. Shuning uchun biz tiqilib qolgan buyrakda podotsitlar shikastlanishida boshqa omillarning ishtirokini ko'rib chiqdik. Biz qon aylanishidan kelib chiqadigan yoki shikastlangan quvurli epiteliydan kelib chiqadigan xavfli signallar (DAMP yoki PAMP) glomerulusdagi noyob joylashuvi tufayli ONda podotsitlar shikastlanishiga yordam berishi mumkin deb taxmin qildik. Muhimi, DAMP va TLR o'rtasidagi o'zaro ta'sir yuqumli bo'lmagan kasalliklarning patogenezida muhim rol o'ynashi ko'rsatilgan (15). TLR oilasining turli a'zolari hujayra plazma membranasida yoki hujayra ichidagi vesikulalarda (22) ifodalanadi va DAMP yoki PAMPlarni samarali taniydigan tug'ma immun sensorlar sifatida tavsiflanadi. Tegishli DAMP yoki PAMP tomonidan faollashtirilgandan so'ng, TLRlar NF-kB yo'li orqali quyi oqim sitokinlarining ifodasini kuchaytirdi va xost mudofaa tizimini qo'zg'atdi (22). Bundan tashqari, DAMPlar immunitet hujayralariga yoki mahalliy ichki hujayralarga to'qimalarning shikastlanishi mavjudligini bildiradi va natijada to'qimalarning shikastlanishini kuchaytiradi (23-26). Muhimi shundaki, barcha TLRlar yallig'lanishli sitokin genlari to'plamining ifodasini boshqaradigan NF-kB yo'lini faollashtiradi (27). Bundan tashqari, TLRlarning faollashishi yallig'lanish uchun mas'ul bo'lgan va shikastlangan to'qimalarning patogenezi bilan bog'liq bo'lgan NF-kB ni faollashtirish uchun ularning quyi oqim yo'llariga signal beradi (28). Shichita va boshqalar. endogen ligandlar va TLR2 yoki TLR4 o'rtasidagi patologik o'zaro ta'sirlarni aniqladi, bu esa ishemik miya shikastlanishiga yordam beradi (25). Oldingi tadqiqotlar, shuningdek, TLR oilasi a'zolarining buyrakda (TLR2, 4, 5, 7 va 11) va GL'larda (TLR1-6, 8 va 9) TILlarni qo'zg'atish qobiliyatini ko'rsatdi (17, 29-33). ). Ushbu tadqiqotda biz obstruktsiyali va kollateral buyraklardagi podotsitlar shikastlanishini aniqladik va aniqladik.

podotsitlar shikastlanishiga hissa qo'shishi mumkin bo'lgan TLR oilasining turli a'zolarining rollari (15, 16, 19, 20). Biz taxmin qilganimizdek, Tlr8 va Tlr9 ning glomerulyar ifodasi UUO buyragidan ajratilgan glomeruliyalarda sham bilan ishlaydigan sichqonlarga qaraganda yuqori edi. Bundan tashqari, NF-kB yo'li bilan bog'liq yallig'lanish sitokinlarining glomerulyar ifodasi, shu jumladan Il1b va Il6, obstruktsiyadan keyingi 21 kun ichida UUO buyragida yuqori bo'lgan. Shuning uchun biz TLR vositachiligidagi NF-kB yo'li obstruktiv buyrakda GL patogenezida muhim rol o'ynaydi degan xulosaga keldik. TLR oilasining boshqa a'zolaridan farqli o'laroq, TLR8 va TLR9 hujayralar endosomalarida aniqlanadi. TLR8 mikroorganizmlardan bir zanjirli RNK va qisqa ikki zanjirli RNKlarni taniydi va bir nechta NF-kB vositachiligidagi sitokinlarni ishlab chiqarishni faollashtiradi (22). Boshqa tomondan, TLR9 ikki zanjirli DNKlarni taniydi va quyi oqim sitokinlarini ishlab chiqarish uchun NF-kB yo'lini faollashtiradi (16, 34). Ushbu tadqiqotda biz faqat glomeruliyadagi PFM sinaptopodin bilan birga TLR8 oqsilining kolokalizatsiyasini tan oldik. Bizning oldingi tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, TLR8 va TLR9 ham PFMlar bilan birlashadi va podotsitlar shikastlanishini qo'zg'atish uchun NF-kB vositachiligida yallig'lanishli sitokin ishlab chiqarishni faollashtiradi (15, 16). Bundan tashqari, boshqa tadqiqotlar in vitroda TLR vositachiligidagi yo'llar va podotsitlar shikastlanishi o'rtasidagi patologik korrelyatsiyani ko'rsatdi (34, 35). Banas va boshqalar. GL rivojlanishi davrida podotsitlardagi TLR4 ning immun tizimi bilan o'zaro ta'sirini aniqladi (35). Shunday qilib, podotsitlar TLR vositachiligidagi yo'llar orqali immunitetni kuzatishga hissa qo'shishi mumkin. Ushbu tadqiqotda biz tiqilib qolgan buyrak podotsitlarida TLR8 genining ifodalanishi va oqsil lokalizatsiyasini hamda glomerulusdagi quyi oqim sitokinlarining yuqori ifodalanishini ko'rsatdik. Shunday qilib, biz TLR vositachiligidagi yo‘llar tiqilib qolgan buyrakdagi podotsitlar shikastlanishi orqali GL rivojlanishiga hissa qo‘shadi, degan xulosaga keldik.

Oldingi tadqiqot shuni ko'rsatdiki, miR-21, TLR8 ning endogen ligandlari hujayra endosomalarida TLR8 ga yetib, bog'lanishi mumkin, bunda NFkB yo'lining TLR vositachiligida faollashuvi va yallig'lanish proinflamatuar sitokinlarning sekretsiyasini induktsiya qilishi mumkin. (21). Ushbu tadqiqotda biz UUO buyragida glomerulyar miR-21 ning sezilarli darajada yuqori darajalarini, shuningdek, qon zardobidagi miR-21 ning soxta nazoratdagilarga qaraganda yuqoriligini aniqladik va uning Tlr8 glomerulyar ifodasi bilan bog'liqligini ko'rsatdik. . Qizig‘i shundaki, miR-21 mimiki bilan davolash qilingan UUO buyraklaridagi glomerullar miR-21 mimikasi bilan ishlov berilgan soxta sichqonlarning glomeruliyalariga nisbatan Tlr8 va uning quyi oqim sitokinlarining yuqori ifodasini ko‘rsatdi, bu esa endogen miR ning mavjudligini ko‘rsatdi. -21 tiqilib qolgan buyrakdagi shikastlangan toʻqimalardan va UUO buyraklarida Tlr8 ning haddan tashqari koʻpayishi faollashuvi sham bilan solishtiriladi. Birgalikda biz tiqilib qolgan buyrakdagi miR-21 ning yuqori hajmi podotsitlardagi endosomalarga yetib boradi va NF-kB yo‘lining Tlr{14}}vositalangan faollashuviga va yallig‘lanishga qarshi sitokinlar sekretsiyasiga sabab bo‘ladi, degan xulosaga keldik. Bu sitokinlar, o'z navbatida, podotsitlar shikastlanishi orqali GL rivojlanishida ishtirok etadilar.

IL1b NF-kB-yo'lining muhim quyi oqim sitokinlaridan biri bo'lib, asosan kasallik sharoitida glomerulusdagi podotsitlar tomonidan ishlab chiqariladi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, IL1b PFMlarni kamaytirish orqali podotsitlar shikastlanishiga olib keladi (36, 37). Ushbu tadqiqotda biz Il1b ning yuqori glomerulyar ifodasini va uning PFMlar bilan kolokalizatsiyasini ko'rsatdik, bu esa ifodaning kamayganligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, Il1b ning glomerulyar ifodasi Tlr8 bilan korrelyatsiya qilingan va PFM (Nphs1 va Synpo) ifodasi bilan bog'lanishga moyil edi. Shuning uchun, bu natijalar Tlr8 ning quyi oqimidagi omillar, shu jumladan Il1b va Il6, PFM ifodasini kamaytirish orqali obstruktsiyalangan buyrakda podotsitlar shikastlanishiga olib kelishi mumkinligini ko'rsatadi.

Yosh sichqonlarning kollateral buyraklari ham GL va PFM yo'qolishini ko'rsatdi. Bu natija SEM tomonidan tasdiqlandi, bu esa kollateral buyrakda podotsitlar shikastlanishini aniqladi. Shuningdek, biz ON sichqoncha modelida zardobdagi miR-21 ning yuqori darajasini aniqladik. Bundan tashqari, IL1b oqsili PFM bilan birgalikda lokalizatsiya qilinadi. Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, miR{3}} qon zardobining kollateral buyrak podotsitlarida TLR8 bilan o'zaro ta'sir qiladi va quyi oqim sitokinlarini ishlab chiqarishni faollashtiradi, bu esa o'z navbatida podotsitlar funktsiyasini va podotsitlar shikastlanishini kamaytiradi. Yosh sichqonlarda kuzatilganga o'xshash mexanizm orqali eski sichqonlarning obstruktsiyali va kollateral buyraklarida ham podotsitlar shikastlanishi kuzatildi.

Xulosa (8-rasm), glomerulyar miR-21 ifodasi bir tomonlama ureteral obstruktsiyadan keyin ko'tariladi, bunda u podotsitlardagi TLR8 bilan o'zaro ta'sir qiladi va NF-kB yo'lining faollashuvini ko'rsatadigan quyi oqim sitokinlarini (Il1b va Il6) ishlab chiqarishni keltirib chiqaradi. Yuqori darajadagi sitokinlar PFMlarni kamaytiradi, natijada podotsitlar shikastlanishi va keyinchalik GL ning rivojlanishiga olib keladi. Qon zardobidagi miR-21 ning yuqori darajalari kollateral buyrak podotsitlarida TLR8 ni faollashtiradi va podotsitlar shikastlanishi orqali GL ni keltirib chiqaradi. Shu sababli, ushbu tadqiqot Tlr8 haddan tashqari ifodalanishidan keyin podotsitlar shikastlanishi orqali obstruktsiyali va kollateral buyraklardagi GL rivojlanishini aniq ko'rsatadi.