Oldindan qo'rquvni o'rganish yangi qo'rquv xotiralarini to'g'ridan-to'g'ri kortikal tarmoqlarga tez o'zlashtirishga imkon beradi 3-qism

Eksperimental dizayn

Ma'lumotlarning takrorlanishi turli xil replikatsiyalar bilan baholandi (S1 jadvali). Te2 da (1A-1C-rasm) birinchi CNQX inaktivatsiyasi tajribalari ko'proq takroriy sonlarda amalga oshirildi, chunki ular biz o'tkazgan birinchi tajribalar edi va tadqiqotimizning asosiy gipotezasini sinab ko'rishga xizmat qildi. Hayvonlar apriori turli xulq-atvor guruhlariga vazni mutanosib ravishda tayinlangan. Har bir eksperimental guruhga bir xil nasldan bo'lgan erkak hayvonlar tasodifiy ravishda tayinlangan. Biz birinchi navbatda tadqiqotimizning asosiy gipotezasini ko'rib chiqdik, ya'ni kortikal inaktivatsiya eksperimental ravishda sodda kalamushlarda va oldingi qo'rquv hodisasini o'rgangan hayvonlarda yangi qo'rquv xotirasining mustahkamlanishiga boshqacha ta'sir qilishi mumkin.

Erkak hayvonlar juda kuchli xotiraga ega, chunki ular kuchli omon qolish instinkti va ko'payish istagiga ega. Yovvoyi tabiatda omon qolgan hayvonlar atrof-muhitga yaxshiroq moslashish va hayotni himoya qilish uchun ko'plab geografik ma'lumotlarni, oziq-ovqat turlarini, yirtqichlarning izlarini va guruh a'zolarining joylashuvini eslab qolishlari kerak.

Misol uchun, erkak sherlar hududni va ularning maqomini himoya qilish uchun butun hududning holatini, a'zolik munosabatlarini va raqobatchilarning joylashuvini eslab qolishlari kerak. Erkak zebralar omon qolish va ko'payish uchun o'tloqda suv manbalari va oziq-ovqatning joylashishini eslab qolishlari kerak. Bir marta gazlangan ichimliklar ishlab chiqaruvchi kompaniya erkak qutb ayig'i g'avvosni va uning o'ziga xos hidini eslab qolishini ko'rsatuvchi e'lonni chop etdi, shunda u keyingi safar uni ko'rganida uni tanib olishi mumkin edi.

Shuning uchun erkak hayvonlar o'z hududini himoya qilish, etarli miqdorda oziq-ovqat bilan ta'minlash va naslni ko'paytirish nuqtai nazaridan kuchli xotiraga ega bo'lishi kerak. Bu, shuningdek, ularni inson tadqiqotlarida, masalan, xotira buzilishi va Altsgeymer kasalligi kabi kasalliklarni o'rganishda muhim mavzularga aylantiradi.

Inson dunyosida biz erkak hayvonlarning xotirasidan ham ilhom olishimiz mumkin. Doimiy ravishda yangi narsalarga ta'sir qilish, uzluksiz o'rganish va fikrlash bizning xotiramiz va moslashuvchanlikni oshiradi, turmush darajasi va ish samaradorligini oshiradi. Shuning uchun keling, erkaklar hayvonlardan o'rganaylik, bilim va tajriba to'plashda davom etaylik, kuchli omon qolish instinktlari va reproduktiv istaklarga ega bo'lib, yaxshi kelajakni yarataylik. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak. Cistanche deserticola xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki Cistanche deserticola ko'plab noyob effektlarga ega bo'lgan an'anaviy xitoylik dorivor material bo'lib, ulardan biri xotirani yaxshilashdir. Qiymaning samaradorligi uning tarkibidagi turli faol moddalar, jumladan kislota, polisakkaridlar, flavonoidlar va boshqalardan kelib chiqadi. Bu ingredientlar turli yo'llar bilan miya salomatligini mustahkamlashi mumkin.

Miya faoliyatini yaxshilash yo'llarini bilish tugmasini bosing

Ushbu guruhlar o'rtasidagi statistik farqlar bo'lsa, biz oxir-oqibat sho'r suv quyish orqali qo'shimcha nazorat guruhlarini amalga oshirdik. Xuddi shunday yondashuv optogenetik tajribalarda qo'llanildi, bu erda AAV-nazorat guruhi faqat sodda va ilgari o'qitilgan kalamushlar o'rtasidagi statistik farqlar aniqlangandan keyin amalga oshirildi. Ushbu eksperimental jadvallar bizga keraksiz nazorat guruhlari va keraksiz hayvonlardan foydalanishdan qochishga imkon berdi, bu Evropa va Italiya qonunchiligining hayvonlarda tajriba o'tkazish bo'yicha asosiy muammosi (3 Rs printsipi).

Xulq-atvor protseduralari

Barcha tajribalar kunning yorug' fazasida (8 dan 16 gacha) o'tkazildi. Hayvonlar eksperimental talablarga qarab turli xil kichik shaffof chelaklar ichida ob'ektdan eksperimental xonalarga yakka tartibda tashildi.

Eshitish treningi: Birinchi xulq-atvor seansi. Eshitish qo'rquviga ega hayvonlar (CS1-CS2). Ushbu guruhda kalamushlar uy qafasidan muloyimlik bilan olib ketilgan va turar joy xonasidan ovoz o'tkazmaydigan xonaga olib ketilgan. U erda hayvonlar zarbani etkazib berish moslamasiga ulangan zanglamaydigan po'latdan yasalgan panjaralar (diametri 1 sm, bir-biridan 1,5 sm masofada joylashgan) bilan jihozlangan to'rtburchaklar qora qafasdan (35 × 40 sm) tashkil topgan konditsioner apparati ichiga joylashtirildi.

Kalamushlar 1 daqiqa davomida bezovtalanmagan. Bu vaqtdan so'ng, 15 kHz chastotali (har biri 15 soniya davomiylik, 8 0 dB, 36 s sinov oralig'i) sof ohangdan iborat 7 ta shartli stimul (CS) qo'llanildi. Har bir tonning oxirgi 1 soniyasi og'riqli US (0,5 mA, 1 s) bilan bog'langan. Konditsionerlik sessiyasi oxirida kalamushlar uy qafasiga qaytarildi.

Faqat zarba beruvchi hayvonlar (shok-CS2). Ushbu guruhda kalamushlar xuddi shunday konditsioner apparati ichiga joylashtirilgan. Darhol, har bir kalamush birin-ketin 7-oyoq zarbalariga (1 s, 0,5 mA) duchor bo'ldi. Rag'batlantirish oxirida hayvonlar uy qafasiga qaytarildi. Konditsioner qafasdagi vaqt doimiyligi 9 soniyadan kam edi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, bu protsedura og'riqli stimullar va hissiy stimullar o'rtasidagi assotsiativ jarayonlardan qochish imkonini beradi [29,30].

Xushbo'y hidli qo'rquvga ega hayvonlar (hid-CS2). Ushbu guruhda kalamushlar yuqoridagi eksperimental guruhlarda ishlatiladigan bir xil to'rtburchaklar qora qafas ichiga joylashtirildi va zarba berish moslamasiga ulandi. Sichqonchalar 2 daqiqa davomida buzilmagan holda qoldirildi. Bu vaqtdan so'ng, vanil hidlaridan iborat 7 ta CS qo'llanildi (har biri 10 s davomiylik, 24 s sinov oralig'i). Har bir hidning oxirgi 1 soniyasi og'riqli US (0,5 mA, 1 s) bilan bog'langan. Konditsioner moduli etkazilgan stimullarning ofsetdan keyin ham saqlanib qolmasligi uchun shamollatish manbai yaqiniga joylashtirildi. Qafas yuqori panjara bilan ta'minlangan. Oqim suyultiruvchi olfaktometr yordamida hidlar taqdim etildi. Toza havo (1,5 L / min) solenoid klapanga yo'naltirildi, u ishlaganda havoni 10 ml vanil hidi bo'lgan 15 ml shishaga o'tkazdi.

Faqat ohangli hayvonlar (Tone-CS2). Ushbu guruhdagi kalamushlar bir xil qora qafas ichiga joylashtirildi va AQSh yo'qligida etkazilgan 15-kHz ohang (7 stimul, 15 s davomiylik, 36 s ITI) bilan taqdim etildi.

Oldindan ta'sirlangan hayvonlar (Tone-CS1-CS2). Kalamushlar konditsioner qafas ichiga joylashtirildi va 1 daqiqadan so'ng ular faqat 15-kHz ohang bilan 20 marta taqdim etildi va 24 soatdan keyin xuddi shu ohang AQSH CS1ga aylandi.

Oq shovqindan qo'rqqan hayvonlar (WN-CS2). Ushbu guruhda kalamushlar to'rtburchaklar qora qafas ichiga joylashtirildi va 1 daqiqa davomida buzilmagan holda qoldirildi. Bu vaqtdan so'ng WN (har biri 15 soniya davomiylik, 75 dB, 36 s sinovlar oralig'i) dan iborat 7 ta CS qo'llanildi. Har bir ohangning oxirgi 1 soniyasi og'riqli US (0,5 mA, 1 s) bilan bog'langan. Konditsionerlik sessiyasi oxirida kalamushlar uy qafasiga qaytarildi.

Eshitish qo'rquvini o'rganish: ikkinchi xulq-atvor treningi. Yuqoridagi paragrafda tasvirlangan protseduralardan ikki hafta o'tgach, hayvonlar boshqa turli xil eshitish qo'rquvini tartibga solish vazifasini o'rgatishdi. Kalamushlar avvalgi ishimizda bo'lgani kabi [10] standart teri qutisiga solingan va 2 daqiqa davomida bezovtalanmagan holda qoldirilgan. Bu vaqtdan so'ng, 3 kHz chastotali sof ohanglardan (har biri 8 s davomiylik, 80 dB, 22 s sinov oralig'ida) iborat 7 ta CS yetkazib berildi. Har bir tonning oxirgi 1 soniyasi og'riqli US (0,5 mA, 1 s) bilan bog'langan. Konditsionerlik sessiyasi oxirida kalamushlar uy qafasiga qaytarildi.

Xotirani saqlab qolishdan qo'rqish. CS2 (3 kHz) ga yaqinda olingan eshitish qo'rquv xotirasini saqlash 4 kundan keyin sinovdan o'tkazildi. Optogenetik tajribalar uchun so'nggi xotira sinovi CS2-AQSh o'rganishdan 24 soat o'tgach, biz CNQX administratsiyasi orqali kortikal inaktivatsiyani amalga oshirgan vaqt oralig'iga o'xshab lazer bilan etkazib berildi (ya'ni, 24 soatdan keyin). trening). Sichqonchalar konditsionerlik uchun ishlatiladigandan farqli apparatga odatlangan va kontekstli signallarga shartli qo'rquv xatti-harakatlaridan qochish uchun boshqa xonaga joylashtirilgan [10,62].

Yangi qurilma shaffof plastik qafasdan iborat bo'lib, tomoni qora rangga bo'yalgan, egzoz ventilyatori bilan jihozlangan ovozni o'chiruvchi quti ichiga o'ralgan bo'lib, u korpusdan hidlangan havoni yo'q qiladi va 60 dB fon shovqinini ta'minladi. Hayvonlarga odatiy mashg'ulot paytida kuniga 5 daqiqa qafasni o'rganishga ruxsat berildi. Qo'rquv xotirasini saqlash sinovi kuni, 2 daqiqalik bepul tadqiqotdan so'ng, biz 3 kHz (8 s - 22 ITI) chastotali 4 CS2 ni yetkazib berdik, undan keyin hech qanday AQSh kuzatilmaydi.

Agar eksperimental talab talab qilinsa, kalamushlar ikkinchi eshitish qo'rquvi sinovidan 2 hafta oldin olingan masofaviy qo'rquv xotirasini saqlab qolish uchun sinovdan o'tkazildi. Shu maqsadda, qo'rquv xotirasini saqlash testidan 7 kun o'tgach, 3-kHz ohangda hayvonlar yangi muhitga (oq va qora chiziqli qafas) joylashtirildi va keyin 15-kHz ohangi taqdim etildi. To'rt tonna 36 soniya oralig'ida taqdim etildi.

Kontekstli trening: Birinchi xulq-atvor sessiyasi. Kontekstli qo'rquvni tartibga soluvchi guruh (CtxA-CtxB). Bu guruhda kalamushlar uy qafasidan muloyimlik bilan olib ketilgan, chelakka solingan va turar joy xonasidan ovoz o'tkazmaydigan xonaga olib ketilgan. U erda hayvonlar yuqorida aytib o'tilgan to'rtburchaklar qora qafasdan iborat bo'lgan konditsioner apparati ichiga joylashtirildi, ular zarba berish moslamasiga ulangan zanglamaydigan po'latdan yasalgan panjaralar bilan jihozlangan. Kalamushlar 1 daqiqa davomida bezovtalanmagan. Bu vaqtdan keyin 5 AQSH (0,5 mA, 1 s) 51 s vaqt oralig'ida qo'llanildi. Seans oxirida hayvonlar uy qafasiga qaytarildi.

Faqat zarba guruhi (shok-CtxB). Konditsioner apparati ichiga joylashtirilgan kalamushlar darhol birin-ketin 5-oyoq zarbalarini (1 s, 0,5 mA) oldilar. Konditsioner qafasdagi vaqt doimiyligi 7 soniyadan kam edi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, bu protsedura og'riqli stimullar va hissiy stimullar o'rtasidagi assotsiativ jarayonlardan qochish imkonini beradi [29,30].

Faqat zarba guruhi (shok-CtxB). Konditsioner apparati ichiga joylashtirilgan kalamushlar darhol birin-ketin 5-oyoq zarbalarini (1 s, 0,5 mA) oldilar. Konditsioner qafasdagi vaqt doimiyligi 7 soniyadan kam edi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, bu protsedura og'riqli stimullar va hissiy stimullar o'rtasidagi assotsiativ jarayonlardan qochish imkonini beradi [29,30].

Yangi kontekstli qo'rquv sharoitlari va yaqinda qo'rquv xotirasini saqlab qolish. Yuqoridagi paragrafda tasvirlangan protseduralardan ikki hafta o'tgach, barcha guruhlar yangi kontekstual muhitni (boshqa xonaga joylashtirilgan skinner qutisi moduli) og'riqli US (0,5 mA, 1 s) bilan bog'lashga o'rgatilgan. . Har bir hayvon yangi kameraga joylashtirildi va 2 daqiqa davomida bezovta qilmadi. Keyin u 30 s oraliqlar bilan ajratilgan 5 AQSHga ta'sir qildi.

Kontekstli qo'rquv xotirasining saqlanishi qo'rquvni tartibga solish protsedurasidan 4 kun o'tgach, kalamushlarni Skinner qutisi kamerasiga 3 minutga qo'yish orqali sinovdan o'tkazildi. Optogenetik tajribalar uchun so'nggi xotira sinovi CtxB-AQSh o'rganishdan 24 soat o'tgach, biz CNQX ma'muriyati orqali kortikal inaktivatsiyani amalga oshirgan vaqt oralig'iga o'xshash (ya'ni, mashg'ulotdan 24 soat keyin) lazer etkazib berish bilan amalga oshirildi. Agar eksperimental talab talab qilsa, kalamushlar yangi assotsiatsiyadan 2 hafta oldin hayvonlarni AQShga juftlashgan kontekstga qo'yib, uzoqdan qo'rquv xotirasini saqlab qolish uchun sinovdan o'tkazildi.

Hayvonlar 2 xil chelakda turli kontekstual protseduralarga muvofiq konditsioner kameralarga olib borildi.

Muzlatish o'lchovi. Barcha eksperimental protseduralarda qo'rquv xotirasining saqlanishini baholash muzlatish javobi sifatida aniqlandi [10], nafas olish harakatlaridan tashqari somatik harakatchanlikning to'liq yo'qligi sifatida tahlil qilindi. Har bir hayvon uchun muzlashda o'tkazgan vaqt miqdori (soniyalarda) hayvonlar guruhlariga ko'r bo'lmagan 2 mustaqil kuzatuvchi tomonidan oflayn rejimda o'lchandi.

Jarrohlik muolajalari

Tanlangan moddalarni maqsadli joylarga yuborish uchun kalamushlar izofluran bilan behushlik qilindi: induksiya 2 L/min tibbiy havoda 4% [hajm/hajm] da amalga oshirildi va 2% [hajm/vol] doimiy taʼsir qilishgacha uzaytirildi. kalamushlar stereotaksik apparatga o'rnatilganda.

Bosh suyagi kesilib, 28-oʻlchovli infuziya ignasi kirib borishi uchun kichik burma teshiklari burgʻulandi. Infuzion nasosga oʻrnatilgan 10-ul Hamilton shpritsidan moddalarni yetkazib berish uchun foydalanilgan. Infuziyalardan so'ng, igna qo'shimcha 3 daqiqa davomida joyida qoldiriladi. Keyin kesma zanglamaydigan po'latdan yara qisqichlari bilan yopildi va hayvonga teri ostiga og'riq qoldiruvchi/yallig'lanishga qarshi ketoprofen (tana vazniga 2 mg/kg) yuborildi va hayvon behushlikdan tuzalib ketgunga qadar issiq va kuzatuv ostida saqlangan.

Oldingi tadqiqotlarda bo'lgani kabi [10,32-34], hayvonlarni kanulyatsiya qilish kerak emas edi, faol birikmalar to'g'ridan-to'g'ri stereotaksik tarzda boshqariladi. Ushbu protsedura foydalidir, chunki doimiy kanulatsiya jarayoniga xos bo'lgan jarrohlik jarohati oldini oladi, shu bilan jarohatni bitta igna kirishi bilan cheklaydi [10,32-34]. Darhaqiqat, umumiy behushlik xotira konsolidatsiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatmaydi [10,32-34]. Ta'lim sinovi bilan bog'liq bo'lgan aralashmalarni kiritish vaqti aniq bo'lishi uchun kalamushlar tanlangan birikmalarni mashg'ulotdan taxminan 1 soat va taxminan 1 kun o'tgach qabul qilishini ta'minlash uchun izofluran anesteziyasi rejalashtirilgan in'ektsiya vaqtidan 5 minut oldin, masalan, 55 daqiqada kiritildi. kalamushlarda min. mashg'ulotdan keyin 60 daqiqa va mashg'ulotdan keyin 24 soatdan keyin in'ektsiya qilingan hayvonlarda 23 soat va 55 minut davolanadi. Har bir kalamush shartlangan va keyin alohida operatsiya qilingan. Turli xulq-atvor guruhlariga mansub hayvonlar interleaved tarzda manipulyatsiya qilindi.

AMPA/kainat glutamat retseptorlarining selektiv inhibitori CNQX ({0}}Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dion) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] steril tuz eritmasida (NaCl, 0,9%) eritildi va HCl bilan pH 7,4 ga moslashtirildi. Protein sintezi ingibitori anizomisin (Merck, 125 ug/ul) ekvimolyar HCl da eritildi, steril fiziologik eritma bilan suyultirildi va NaOH bilan pH 7,4 ga sozlandi. Avtomobil nazorati sifatida steril sho'r suv (0,9% NaCl) ishlatilgan. Ushbu moddalar Paxinos va Watson atlasidan [26] olingan quyidagi stereotaksik koordinatalar bo'yicha 0,1 ul/min tezlikda va 0,5 ul hajmda ikki tomonlama AOK qilingan, Zilles atlasiga [25] tegishli Te2 kortikal maydoni:

Ikkilamchi eshitish korteksi (Te2): 1) AP: -5,8 L: ±7,2 DV: -6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Anterior singulat korteks (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

In'ektsiya hajmi (har bir sayt uchun 0.5 ul) kattalar kalamushlarida Te2 [10,34] va ACC [55,63] ga faol birikmalar kiritilgan oldingi tadqiqotlar asosida tanlangan.

Dorsal gipokampusni faolsizlantirish uchun faol birikmalar quyidagi stereotaksik koordinatlarda har bir saytga 0,6 ul hajmda yuborildi:

Dorsal Hippocampus: 1) AP: -2,8 L: ±1,6 DV: -3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Dorsal gipokampalning qaytarilmas lezyonlari NMDA (Tocris, 18 ug/ul, steril fiziologik eritmada eritilgan, 0, 4 ul) 0,1 ul/ yuqorida qayd etilgan koordinatalardagi nuqtalarda min. Xuddi shu koordinatalar sho'rlangan in'ektsiya nazorati va soxta hayvonlar uchun ishlatilgan.

Qizil retrobeads (Lumafluor, sho'r suvda 1:2 suyultirish, 0.6 ul) quyidagi koordinatalarga muvofiq BLAga AOK qilindi: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8.3.

Tajribalar oxirida CNQX, anizomisin yoki fiziologik in'ektsiya holatlarida igna izlari yoki NMDA in'ektsiyalari holatida lezyonlarning kengayishi gistologik jihatdan tekshirildi. Kalamushlar chuqur anesteziya qilingan va 4% formaldegid bilan intrakardial perfuziya qilingan. Ularning miyalari kriostatda 30 mkm masofada bo'lingan. Nissl bilan bo'yalgan ketma-ket kesmalar an'anaviy protsedura yordamida tayyorlangan va bo'limlar 2,5 × kattalashtirilgan mikroskop ostida gistologik jihatdan tasdiqlangan.

Optogenetik tajribalar

Virusli in'ektsiya. Adeno bilan bog'langan virus AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-gilos va nazorat vektor AAV5:CaMKII -gilos Shimoliy Karolina Vektor yadro universitetidan (Chapel Hill, Shimoliy Karolina, Amerika Qo'shma Shtatlari) olingan. Virus titri 5:8 edi. Virus titri ikkala virus uchun 5,8 × 10^12 vg/ml edi. CaMKII promouteridan foydalanish piramidal neyronlarni qo'llab-quvvatlovchi transgen ifodasini ta'minlaydi. Viruslar −80˚C haroratli muzlatgichda saqlangan. Te2 yoki ACC ga qaratilgan virusli infuziyalar yuqoridagi stereotaksik koordinatalarda har bir teshik uchun 0,5 ul hajmda amalga oshirildi. Virus 0,1 ul/min tezlikda kiritildi va igna qo'shimcha 5 daqiqa davomida joyida qoldirildi. Virusli in'ektsiya optogenetik tajribalardan 4 hafta oldin amalga oshirildi.

Yoritish.

Optik tolalar (Plexon, 200/230 mkm yadro; 10 mm uzunlik) BLAga ikki tomonlama implantatsiya qilingan (AP=-2,8, L=± 5,4, V=-8,2 mm bregmadan). Te2 proektsiyalarining BLA ga yoki ACC proektsiyalarining BLA ga optogenetik inhibisyoni lazer diodiga (Laserglow Technologies) ulangan PlexBright Optogenetik stimulyatsiya tizimi yordamida erishildi. Sariq yorug'lik (589 nm) hosil bo'ladi va optik toladan o'tadi. Optik tolaning uchida hisoblangan quvvat zichligi proyeksiya joylarini yoritish uchun 10 dan 15 mVtgacha bo'lgan. Qo'rquv xotirasini saqlash vaqtida yorug'lik emissiyasi ohang boshlanishidan 4 soniya oldin boshlangan, butun ohang davomida saqlanib qolgan va ohang o'zgarishidan 4 soniyadan keyin to'xtatilgan. Kontekstli qo'rquvni tartibga soluvchi guruhlarga mansub hayvonlar butun kontekstni o'rganish davomida (3 daqiqa) yorug'lik stimulyatsiyasini oldilar. Kalamushlar xotirani saqlash sinovidan 2 kun oldin patch shnur bilan tanishdilar.

Immunogistokimyo. Optogenetik tajribalar tugagandan so'ng, kalamushlar chuqur anesteziya qilindi va virusning tarqalishini tekshirish uchun 4% PAF bilan intrakardial perfuziya qilindi. Miya parchalanib, bir kechada 4˚C da saqlanadi va nihoyat 30% saxarozaga o'tkazildi. Koronal bo'laklar (30 mkm) kriostatda kesilgan va PBSda to'plangan. Erkin suzuvchi qismlar blokirovka qiluvchi eritmada RT da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyin ular bir kechada RT da blokirovka qiluvchi eritmada mCherry (1:500 suyultirish, Abcam) birlamchi monoklonal sichqoncha antikorida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, bo'laklar PBS bilan yuvildi va PBSda suyultirilgan ikkilamchi lyuminestsent AlexaFluor{9}} sichqonchaga qarshi antikor (1:600, Invitrogen) bilan RTda 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Bo'limlar PBS da yuvilgan, DAPI (Vektor) o'z ichiga olgan o'rnatish vositalari bilan o'rnatilgan va qopqoq bilan qoplangan.

NMDA in'ektsiyasidan o'tgan kalamushlarning miyalari ham xuddi shunday yig'ilgan. Erkin suzuvchi qismlar, bir necha marta chayishdan so'ng, blokirovka qiluvchi eritmada bir kechada xona haroratida birlamchi monoklonal sichqoncha anti-Neun (1:1,000 suyultirish, Merck) antikorlari bilan inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, bo'laklar PBS bilan yuvildi va 1 soat davomida xona haroratida biotinlangan ot sichqonchaga qarshi antikor bilan inkubatsiya qilindi (1:200 suyultirish, Vektor). Neunni bo'yash uchun avidin-biotin kompleksi (ABC kompleksi 1:100, Vektor, 2 soat va inkubatsiyaning yarmi) diaminobenzidin (0,03%, Merck) bilan birlashtirildi. Keyin bo'limlar PBSda yuvildi va jelatin bilan qoplangan slaydlarga o'tkazildi, suvsizlandi va qopqoq bilan qoplangan.

Retro boncuklar AOK qilingan kalamushlarning Te2 bo'limlari bir kechada RT da blokirovka qiluvchi eritmada asosiy poliklonal quyonga qarshi Fos antikori (1:2, 000, hujayra signali) bilan inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, bo'laklar PBS bilan yuvildi va quyonlarga qarshi Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, PBSda) bilan RTda 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Nihoyat, immunobeled bo'limlari PBS da yuvilgan, jelatin bilan qoplangan slaydlarga o'rnatilgan va DAPI bilan to'ldirilgan o'rnatish vositasi bilan qoplangan.

Mikroskop

mCherry yorlig‘i Zeiss Airyscan konfokal mikroskopi yordamida tekshirildi: ikkita lazer (405 va 561 nm), har biri DAPI (hujayra yadrolari uchun Nissl bo‘yalishi) va Alexa 568 (mCherry) uchun eng yuqori emissiya spektriga mos keladi. ), mos ravishda. Virusning in'ektsiya joylarida tarqalishini tahlil qilish uchun Te2 va ACC mikrograflari mozaik tasvirlar sifatida olingan (har biri 10 × ob'ektiv yordamida olingan). BLA-ga akson terminallari bir-biridan 1 mkm masofada joylashgan 10 bo'limdan iborat z-stack sifatida 40 × ob'ektiv yordamida tahlil qilindi (159 mkm kvadrat; kattalashtirish fraktsiyasi, 1,0).

cFos immunobelingidan oʻtgan retrobeadlar in’ektsiya qilingan hayvonlar uchun tasvirlar maksimal emissiya spektriga mos keladigan 3 xil lazer yordamida 40× kattalashtirishda (159 mkm kvadrat; masshtabli ulush, 1.{7}}) olingan. mos ravishda DAPI (hujayra yadrolari uchun Nissl dog'i), AlexaFluor 488 (cFos) va Texas Red (Retrobeads) uchun. 0,7 mkm bo'lgan qismlar 10- mkm z-stack bo'ylab olindi. Te2 mintaqasidagi har bir hayvon uchun bregmadan 6,7 dan 7,3 mm gacha bo'lgan anteroposterior koordinatalarda cFos, boncuklar bilan etiketlangan va qo'sh musbat (cFos + boncuklar etiketli) ifodalangan yadrolar soni aniqlandi [10]. Keyin har bir hayvonning o'rtacha qiymatini ishlab chiqarish uchun ma'lumotlar o'rtacha hisoblangan va natijalar statistik taqqoslangan. Neunning DAB bo'yalgan bo'limlari tasvirlari rangli CCD kamera orqali mikroskopga ulangan Neurolucida dasturi yordamida tahlil qilindi [10].

Ma'lumotlarni tahlil qilish va istisno qilish mezonlari

Har bir guruh uchun n oldingi tadqiqotlarimiz [10,16,17] bo'yicha apriori o'rnatilgan, bu sohada ilgari nashr etilgan ishlar (ACC [6,22,55] va Te2 [10,59] uchun havolalar sifatida qarang), va quyidagi jadvalga muvofiq G quvvatini baholash orqali (1-jadval):

Har bir tahlil uchun biz har bir guruh uchun 8 dan 10 gacha hayvonlarning yakuniy o'rtacha sonini taxmin qildik. Guruhlar bir xil eksperimental sessiyada ichki nazorat bilan boshqarildi (S1 jadvali). Jarrohlik va xulq-atvor muolajalarining o'zgaruvchanligini hisobga olgan holda, biz ba'zi hollarda eksperimental mezonlarga javob beradigan va kiritilgan eksperimental sub'ektlarning ko'proq sonini (15% gacha) o'zboshimchalik bilan chiqarib tashlashning oldini oldik. Hipokampal tadqiqotlar holatida, NMDA va CNQX in'ektsiyalarining turli vaqt oralig'ida ta'sirini baholash uchun biz turli guruhlar orasida transport vositalari va soxta kalamushlar o'rtasidagi nazorat hayvonlarining umumiy sonini muvozanatlashtirdik.

Xulq-atvorni tahlil qilish, gistologik tekshiruvlar va hujayralarni hisoblash ko'r-ko'rona amalga oshirildi. NMDA-qaytarib bo'lmaydigan lezyonlar holatida igna yo'li yoki lezyon etarli darajada lokalizatsiya qilinmagan hayvonlar ma'lumotlar tahlilidan chiqarildi (S1 jadvali). Farmakologik tadkikotlar davomida biz ignaning noto'g'ri joylashishi (Te2 uchun 22/255, ACC uchun 31/179 va hipokampus uchun 4/31) tufayli jami 465 hayvonlardan 57 tasini chiqarib tashladik. 21 ta hayvon ustida olib borilgan kuzatuv tadqiqotlarida biz retrobead in'ektsiyasi BLA ni o'tkazib yuborgan 3 ta sub'ektni yo'q qildik. Te2 optogenetik tadqiqotlarida, jami 30 hayvonlardan ortiq, biz 1 ta kalamushni chiqarib tashladik, chunki optik tolalarning joylashishi maqsadli hududdan yuqori bo'lmagan, 1 kalamush. Axir, virus Te2 va 2 kalamushda yo'q edi, chunki virus tarqalishi in'ektsiya joylarida Te2 maydonining mos ravishda 4,7% va 5,3% dan kam edi. Statistik tahlilga kiritilgan kalamushlarda virusning minimal tarqalishi oldingi stereotaksik koordinatada 39,6% va orqa stereotaksik koordinatada 50,2% ni tashkil etdi.

Xuddi shunday, ACC optogenetik tajribalarida, jami 32 hayvonlardan, 2 ta kalamush yo'q qilindi, chunki optik tolalarni joylashtirish maqsadli hududdan yuqori bo'lmagan. ACCda virus yo'qligi sababli ikkita kalamush, virus qo'shni ikkilamchi motor korteksiga tushganligi sababli 1 hayvon va 1 ta kalamush in'ektsiya joylarida virus tarqalishi ACC maydonining 2,3% dan kam bo'lganligi sababli chiqarib tashlandi. Qolgan kalamushlarda virusning minimal tarqalishi oldingi stereotaksik koordinatada 33,3% va orqa koordinatada 42,2% ni tashkil etdi.

NMDA lezyonlarini o'rganishda jarohatlar asosan dorsal hipokampusning CA1 mintaqasiga qaratilgan. Dorsal hipokampusning butun maydoni bo'ylab hipokampal lezyonlarning minimal (qizil) va maksimal kengayishi (pushti) oldingi stereotaksik koordinatada mos ravishda 23,2% va 53,5% va orqa koordinatada 28,3% va 62,3% ni tashkil etdi. Jami 73 ta hayvonlardan 4 tasi lezyon yoʻqligi sababli yoʻq qilindi, qoʻshimcha 3 tasi esa jarohatlar kengayishi 5.0% dan kam boʻlgani uchun yoʻq qilindi (yaʼni 4.8%, 4.3%, 3.1). %) 2 koordinatadagi hipokampal sohaga tegishli.

Hudud konturini tahlil qilish ZEN 3.0 dasturining mintaqaviy-kontur vositasi yordamida vizual tekshirish va qo'lda miqdorni aniqlash orqali amalga oshirildi. Keyinchalik hududning umumiy maydoni bo'yicha maydon qiymatlari normallashtirildi. Te2, ACC va hipokampusning stereotaksik koordinatalari Paxinos atlasiga [26] va Te2 holatida kortikal maydon Zilles atlasiga [25] asoslangan.

Statistik tahlil

Barcha ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Barcha ma'lumotlar Levenning dispersiyalarning tengligi uchun testidan o'tdi. Shunday qilib, barcha tajribalar davomida parametrik statistika qo'llanildi. 2 guruh maʼlumotlari 2-quyruqli juftlashtirilmagan Student t-testlari yordamida taqqoslandi. Ko'p guruhli taqqoslashlar Tukeyning post hoc testi bilan 1-usul ANOVA testi yordamida baholandi. Guruhlar orasidagi va guruh ichidagi farqlarni hal qilish uchun biz 3 × 2 aralash dizaynli ANOVA modelini guruhli (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) hisoblab chiqdik. sub'ektlar o'zgaruvchisi va holati (yaqindagi konditsionerdan oldin va keyin) sub'ektlar ichidagi o'zgaruvchi sifatida. Guruh × shartlarning o'zaro ta'siri muhim bo'lgan joyda biz oddiy asosiy effektlar tahlilini o'tkazdik va har bir p-qiymatini Bonferroni tuzatish bilan moslashtirdik. Har bir aralash ANOVA modeli uchun biz Sferiklik taxminini Mauchlining Sferiklik testi orqali baholadik.

Statistik parametrlar (ya'ni, har bir guruh uchun n ning aniq qiymati, SEM, statistik test, ta'sir hajmi va aniq p-qiymati) afsonalarda xabar qilinadi. Teng tanlanma kattaliklari uchun, juftlashtirilmagan t-testlar uchun ta'sir o'lchovlari SDlarning o'xshashligiga ko'ra Cohen's d yoki Glass's d ni, turli xil o'lchamlar uchun esa Hedges'g ni hisoblash orqali aniqlandi. Hujayralar soni va muzlatish o'rtasidagi korrelyatsiya Pearson koeffitsienti yordamida hisoblangan. Ma'lumotlar statistik yondashuvning taxminlariga mos kelishini aniqlash uchun biz P < 0.05 darajasida nol gipotezani rad etdik. Barcha statistik tahlillar SPSS Statistics 22 (IBM) yordamida amalga oshirildi.

Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumotlar

S1 rasm. Misol sifatida tanlangan Te2 (A) va ACC korteksining (B) CNQX bilan AOK qilingan igna izlarini kattalashtirish. (C) Jarayondan 2 hafta o'tgach, xuddi shu kontekstda tasvirlanganda, faqat zarbaga duchor bo'lgan hayvonlar past qo'rquv reaktsiyasini ko'rsatdi va bu protsedura zarba berilgan kontekstda shartli muzlatishga olib kelmasligini ko'rsatdi. (D) 1-rasmdagi kabi natijalar CS (CS1, 3 kHz va CS2, 15 kHz) sifatida qo'llaniladigan 2 tonnani muvozanatlash orqali olingan (Student t test, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) Konditsionerlik holati bo'yicha boshqa muhitda sinovdan o'tgan bo'lsa ham, hidga ega bo'lgan CS konditsioner kalamushlarda hidga muzlash, konditsionerdan 2 hafta o'tgach, yuqori darajada bo'lgan va shu bilan qo'rquv ushbu signalni etkazib berish bilan bog'liqligini ko'rsatadi. O'lchov chiziqlari, 300 mkm. ��P <0,01. Barcha ma'lumotlar o'rtacha va SEM. S1 Fig uchun umumiy ma'lumotlarni S1 qo'llab-quvvatlovchi rasm ma'lumotlari nomli fayldagi qo'llab-quvvatlovchi ma'lumotlardan topish mumkin. (TIF)

S2-rasm. CNQX in'ektsiyasi kalamushlarda so'nggi eshitish qo'rquvi xotiralarini saqlab qolishga putur etkazdi, bunda qo'rquvni umumlashtirish faqat oldingi ta'sir qilish yoki CS1 sifatida oq shovqin ohangini qo'llash orqali kamayadi. 3 × 2 aralash dizaynli ANOVA (guruhning asosiy effekti: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, ē2=0. 236, shartning asosiy ta'siri: F(1,42)=0.161, p=0.691, ķ2=0.004, × guruh shart o'zaro ta'siri F(2,42)=3.942, p=0.027, ē2=0.158) AQSh bilan bog'lanishidan oldin 3 kHz ohanggacha muzlash pastroq ekanligini ko'rsatdi. 15 kHz-AQSh juftligidan oldin 15 kHz ohangni oldindan qabul qilgan hayvonlarda (n=10, p=0.001) yoki oq shovqinga (n=13) shartlangan kalamushlarda , p=0.008) CS1-CS2 hayvonlari (n=22) bilan solishtirganda, o'zgaruvchan qo'rquvni umumlashtirish javobini ko'rsatdi. Biroq, Te2 korteksida CS-US o'rganish va cnqx in'ektsiyalaridan so'ng, barcha guruhlarda yaqinda qo'rquv xotirasi buzilgan (p> 0,05). Guruhlar ichidagi oddiy asosiy effekt (CS-US o'rganishdan oldin va keyin, keyin cnqx in'ektsiyasi): CS1-CS2, p=0.025; Tone-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P <0,05, ��P <0,01. Barcha ma'lumotlar o'rtacha va SEM. S2 Fig uchun umumiy ma'lumotlarni S1 qo'llab-quvvatlovchi rasm ma'lumotlari nomli fayldagi qo'llab-quvvatlovchi ma'lumotlardan topish mumkin. (TIF)

S3-rasm. (A) BLAga mo'ljallangan retrobeads in'ektsiyasining tasodifiy misoli. (B va C) Te2 (B) va ACC korteksida (C) AAV vektorlari bilan AOK qilingan hayvonlarning BLA ustidagi optik tolali joylashtirish misollari. O'lchov chiziqlari, 500 mkm.

Minnatdorchilik

Biz doktor E. Manasseroga doimiy yordam va maslahatlari uchun minnatdorchilik bildiramiz.

Muallif hissalari

Kontseptualizatsiya: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Ma'lumotlar kuratori: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Rasmiy tahlil: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Moliyaviy sotib olish: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Tekshiruv: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologiya: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Nazoratchi: Benedetto Sakchetti.

Tasdiqlash: Benedetto Sacchetti.

Yozuvchi - asl qoralama: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Yozish - ko'rib chiqish va tahrirlash: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Ma'lumotnomalar
1. Frankland PW, Bontempi B. Yaqinda va uzoq xotiralarni tashkil qilish. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Konsolidatsiyalarning neyrobiologiyasi, yoki, engram qanchalik barqaror? Annu Rev Psixol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Xotirani mustahkamlash. Sovuq bahor Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Skvayr LR. Xotira konsolidatsiyasi va medial temporal lob: oddiy tarmoq modeli. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Nima uchun hipokampus va neokorteksda qo'shimcha ta'lim tizimlari mavjud: o'rganish va xotiraning ulanish modellarining muvaffaqiyatlari va muvaffaqiyatsizliklaridan tushunchalar. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com