RNK-Seq asosidagi De Novo Transkriptom Assambleyasi va Cistanche Desertikola go'shtli poyasining genini kashf qilish -Ⅱ

Gen ontologiyasi va KEGG ma'lumotlar bazalariga asoslangan barcha ifodalangan transkriptlarning funktsional tasnifi

Gen Ontologiyasi (GO) izohi UniProt annotatsiyasi va identifikatorlar assotsiatsiyasi faylidan olingan. Jami ifodalangan ketma-ketlikning 32,69% ni tashkil etuvchi 20907 ta transkript 1745 ta funksional atamaga biriktirilgan. Umumiy funktsional GO atamalarining ko'p qismini biologik jarayonga (1116, 63,95%), so'ngra hujayra komponentiga (329, 18,85%) va molekulyar funktsiyaga (300, 17,20%) tegishli. Ko'rsatilgan transkriptlarning tayinlangan funktsiyalari GO toifalarining keng doirasini qamrab oldi va eng ko'p izohlangan transkriptlarga ega bo'lgan eng yaxshi 10 ta GO atamalari 3-jadvalda keltirilgan. Biz barcha ifodalangan transkriptlarni uchta gen ontologiyasi toifasida (molekulyar funktsiya, hujayra komponenti va) taqsimlaymiz. biologik jarayon) qo'shimcha faylda (S3 Dataset). Bog'lanish funktsiyalari va transferaza faolligi bilan bog'liq GO atamalari asosan molekulyar funktsiyalar toifasida ifodalangan. Bog'lanish funktsiyalariga kelsak, kation bilan bog'lanish (4394 transkript) eng ko'p bo'lgan, undan keyin nukleotid/nukleozid bilan bog'lanish (o'rtacha 3,404 transkript) va oqsil bilan bog'lanish (2,422 transkript) mavjud. Transferaza faolligi guruhida ko'pchilik fosfor o'z ichiga olgan guruhlarga ega (2256 transkript, 65,77%). Hujayra komponentlari toifasida transkriptlar ko'proq hujayra ichida joylashgan (o'rtacha 10,581 transkript), biologik jarayon toifasi orasida esa transkriptlar biopolimer almashinuv jarayonida ko'proq ishtirok etgan (o'rtacha 6,683 transkript), so'ngra hujayra jarayonini tartibga solish (4,841 transkript) ), gen ifodasi (4678 transkript) va transport (3512 transkript).

ALZGEYMER KASALLIKI OLDINI OLISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Lignin va PhG biosintezida ishtirok etadigan genlarni qazib olish uchun KEGG ma'lumotlar bazasida 13 ta o'simlik organizmining gen ketma-ketligiga qarshi 21 358 ortiqcha bo'lmagan potentsial oqsil ketma-ketligi tekshirildi va ular kamida 5 ta zarba bilan 275 KEGG yo'liga tayinlandi. Eng ko'p mos keladigan ketma-ketlikka ega 10 ta yo'l 4-jadvalda keltirilgan. Aksariyat yo'llar aminokislotalar yoki oqsillar almashinuvi (ko01230, ko04141 va ko04120), uglevod almashinuvi (ko01200 va ko00500) va nukleotidlar kabi birlamchi metabolik jarayonlarda ishtirok etgan. nukleozidlar almashinuvi (ko03018, ko00230 va ko00240). Bundan tashqari, terpenoid magistral biosintezi, fenilpropanoid biosintezi, karotenoid biosintezi, izokinolin alkaloid biosintezi va tropan, piperidin va piridin alkaloid biosintezi kabi 27 ta ikkilamchi metabolizm bilan bog'liq yo'llar mavjud (2-rasm). Bu natijalar faol metabolik jarayonlar sodir bo'lganligidan dalolat beradiC. deserticolaildiz to'qimasi. KEGG yo'llari bilan bog'liq barcha ifodalangan transkriptlar qo'shimcha faylda (S4 Dataset) keltirilgan. C. deserticola va guruch (S5 ma'lumotlar to'plami) kabi boshqa o'simliklar o'rtasida sezilarli darajada o'zgargan yo'llar mavjud bo'lsa-da, bizning asosiy maqsadimiz C. deserticola poyasining butun transkriptom profilini ochib berish va PhG biosintezining tegishli yo'llarini tasvirlashdir. yetishtirishga rahbarlik qilish uchun foydali bo'lishi mumkin.

Lignin biosintezida ishtirok etuvchi fermentlarni kodlovchi nomzod genlari

Lignin o'simliklar shohligida ikkinchi eng keng tarqalgan tabiiy er usti polimeri bo'lib, o'simlik hujayra devorlarida joylashgan materialning uchdan bir qismini tashkil qiladi. Hujayra devorlarining muhim tarkibiy qismi sifatida ligninlar suvni tashishda yordam beradi, mexanik yordam va tizimli yaxlitlikni ta'minlaydi, patogenlar va o'txo'rlardan himoya qiladi. Ligninning bu rollari cho'lda C. desertikolaning er osti erektiv o'sishini qo'llab-quvvatlashda juda qimmatlidir. Ushbu tadqiqotda biz C. deserticolada lignin biosintezi yo‘llarining to‘liq rasmini taqdim etdik (3-rasm), unda lignin monomerlari gidroksillanish, metillanish, qaytarilish va oksidlovchi polimerizatsiya jarayonini o‘z ichiga olgan bir qator fermentativ reaksiyalar orqali fenilalanindan biosintezlanadi. Lignin biosintezi bilan bog'liq fermentlar qon tomir to'qimalarda asosan sintez qilingan uchta shaklda (p-gidroksil-fenil (H), guaitsil (G) va siringil (S) lignin) va 5-gidroksil-guaitsil lignin uchun aniqlandi, ular faqat aniqlangan. COMTda (kofein kislotasi 3-O-metiltransferaza, EC 2.1.1.68) etishmayotgan (masalan, yiqilib tushadigan) o'simliklar.

Fenilalanin ammiak-liyaza (PAL, EC 4.3.1.24) lignin biosintezi yo'lidagi birinchi asosiy ferment bo'lib (3-rasm) fenilalaninni oksidlovchi bo'lmagan dezaminlanish orqali sinnamik kislotaga aylantiradi. Jami 6297 PAL o'qish ketma-ketligi va 7 PAL transkripti C. deserticolada yig'ildi (5-jadval). Ketma-ketlik oʻxshashliklarini taqqoslash natijasida biz ulardan 4 tasi (comp28550_c1_seq1/2/3/5) C. deserticolaning maʼlum mRNK ketma-ketligi (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), comp28550_c{23}}seq4 va comp25940_c0_seq1 mos ravishda 77% va 82% oʻxshashlikka ega edi. ORF prognozi shuni ko'rsatdiki, 5 ta transkript oqsillarni kodlash potentsialiga ega va aromatik aminokislotalar liyaza domeni (PF00221.14) bilan olib borilgan. Ular orasida faqat comp{33}}c1_seq4 transkripti 718 ta aminokislota qoldig‘idan iborat to‘liq oqsil ketma-ketligini kodlashi mumkin edi. PAL ko'pchilik o'simlik turlarida kichik multigen oila tomonidan kodlanganligi ma'lum bo'ldi, masalan Arabidopsis thalianada 4, Populus trichocarpada 5, Scutellaria baicalensisda 3 va Cucumis sativus va boshqalar. Bizning filogenetik tahlilimiz shuni ko'rsatdiki, 4 ta mavjud. C da PAL-kodlovchi genlar.

deserticola va biz ularni mos ravishda CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 va CdPAL4 deb nomladik (S2-rasm). 4-kumarat-KoA ligaza (4CL, EC 6.2.1.12) va trans-sinnamat 4-monoksigenaza (CYP73A, EC 1.14.13.11) ikkita teskari holatda sinnamik kislotani dikumarol-CoA ga aylantirish uchun mas'ul bo'lgan ikkita fermentdir. buyurtmalar. Ular, shuningdek, magistrallarda va ularning ifoda FPKM qiymatlari mos ravishda 39,57 va 51,93 ni tashkil qiladi.

To'rt turdagi ligninlar uchta asosiy ferment, sinnamoil-CoA reduktaza (CCR, EC 1.2.1.44), shikimat o-gidroksisinnamoiltransferaza (HCT, EC 2.3.1.133) va ferulat{{1{1} tomonidan boshqariladigan turli yo'llar bilan biosintezlangan. {56}}}}gidroksilaza (F5H, EC 1.14.-.-). CCR ligninlar yo‘lining nazorat nuqtasi sifatida xabar qilingan [50, 51], u X-CoA (X, shu jumladan, dikumarol, kofeol, feruloil, 5-gidroksil-feruloil va sinapoil) Y-aldegidga (Y, shu jumladan, p) katalizlaydi. -puma, kofeol, koniferil, 5-gidroksil-koniferil va snap), HCT esa p-kumaroil-KoA-ni p-kumaroil shikimik kislota/p-kumaroil quinik kislotaga katalizladi. Ikki ferment, xuddi kalit kabi, P-gidroksil-fenil ligninlarning yoki boshqa uch turdagi ligninlarning biosintezini tartibga solgan. F5H siringil lignin va 5-gidroksil-guaitsil ligninni tartibga soluvchi boshqa tarmoq kaliti edi. Boshqa muhim fermentlar, jumladan, kofein kislotasi 3-O-metiltransferaza (COMT, EC 2.1.1.68), kofeol-KoA O-metiltransferaza (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) va sinnamil-spirtli dehidrogenaza (SAPR, EC.11.15). ) ham ifodalanganligi aniqlandi. Batafsil ifoda ma'lumotlari 6-jadvalda keltirilgan. Ushbu tadqiqotda aniqlangan ushbu ferment genlari ushbu muhim dorivor o'simlikda funktsional genomik tadqiqotlar uchun qimmatli manba bo'ladi. 6-jadvaldagi lignin biosintezi yo'liga tegishli 10 ta gen RNAseq natijalarini tasdiqlash uchun RT-qPCR tekshiruvi uchun tanlangan (4-rasm) va ularning yuqori korrelyatsiyasi (Pirson korrelyatsiya koeffitsienti: 0,90343) transkriptom tahlilimizning yuqori aniqligi va takrorlanishini ko'rsatdi. S1 ma'lumotlar to'plami ushbu tahlilda ishlatiladigan primer ketma-ketliklarini sanab o'tadi.

JINSIY FUNKSIYANI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

PhG biosintezida ishtirok etuvchi fermentlarni kodlovchi nomzod genlari

Feniletanoid glikozidlar (PhGs) jinsiy quvvatni yaxshilash, erkin radikallarni tozalash va qarishga qarshi faollik bilan C. desertikolaning asosiy faol moddalari ekanligi ma'lum. PhG ning uchta kimyoviy komponenti organik kislota, saxarid va feniletanol aglikondir (3-rasm). Organik kislotalar, shu jumladan kofein kislotasi, ferul kislotasi va kumalik kislotalar fenilpropanoid biosintez yo'lining mahsulotlaridir. Glyukoza va ramnozni o'z ichiga olgan saxaridning tarkibiy qismlari uglevod almashinuvi yo'llarining mahsulotlari, masalan, kraxmal va saxaroza almashinuvi, aminokislotali shakar va nukleotid shakar almashinuvi, fruktoza va mannoz almashinuvi va boshqalar. Biroq, feniletanol qismining biosintez yo'li hali aniq emas. Bu erda biz ketma-ketlik ma'lumotlarimizga asoslanib, ikkita mumkin bo'lgan feniletanol biosintezi yo'lini taklif qildik. Ulardan biri kofein kislotasi yoki ferul kislotasi yo'li bo'lib, u lignin biosintezining magistral yo'liga o'xshash sinnamik kislota yo'li deb ham ataladi. Boshqasi fenilalanin almashinuvi yo'liga asoslanadi (3-rasm), bunda fenilalanindan feniletanolga ma'lum bo'lgan "Enrlich yo'li" orqali erishiladi, bu birinchi marta xamirturushda bir asr oldin topilgan va petuniya gullari, pomidor va atirgulda tasdiqlangan. C. deserticola poyasida aspartat/tirozin aminotransferaza, histidin-fosfat aminotransferaza va fenilalaninni feniletanolga aylantirish uchun mas'ul bo'lgan birlamchi amin oksidazani kodlovchi to'rtta ferment genlari aniqlandi. Fenil etanol mahsuloti monooksigenaza bilan qo'shimcha oksidlanishi yoki metiltransferaza yordamida PhG biosintezida ishtirok etadigan hosilalariga (fenil etanol aglikon) metillanishi mumkin. Xulosa qilib aytganda, feniletanol aglikonning ikkita taxminiy biosintez yo'llari taklif qilingan.C. deserticolalekin hali ham ko'proq o'rganish kerak.

Munozaralar

So'nggi yillarda o'simliklar genomikasi keyingi avlod sekvensiyasi texnologiyasini qo'llash bilan jadal rivojlandi, cho'l dorivor o'simliklari genomikasiga bir nechta tadqiqotlar qaratilgan. Uning qurg'oqchilik va sho'rlanish muhitiga moslashishini va asosiy bioaktiv komponentlarning biosintez yo'lini tushunish uchun zudlik bilan genomik yoki transkriptomik tadqiqotlar o'tkazish kerak. Ba'zi tibbiy o'simliklar uchun de novo transkriptom kashfiyoti,

Panax ginseng, Ginkgo biloba va Glycyrrhiza uralensis birinchi marta uzoq o'qish uzunligi uchun Roche 454 platformasidan foydalangan holda ishlatilgan. Qisqa o'qishlar bilan samarali yig'ish qobiliyati, ayniqsa afzal juftlangan o'qishlar tufayli, Illumina asosidagi transkriptomani ketma-ketlashtirish va yig'ish model va model bo'lmagan organizmlar uchun ham keng qo'llanilgan. Ushbu tadqiqotda biz taxminan 8G 101 bp juftlashtirilgan o'qishni yaratdik va o'rtacha uzunligi 725 bp bo'lgan uzunroq unigen ketma-ketliklarini ishlab chiqardik. Katta miqyosli poyaga xos transkriptom ma'lumotlari foydali ma'lumotnoma ma'lumotlarini taqdim etishi va C. deserticola bioaktiv komponentlarining ikkilamchi metabolizmini qazib olish uchun ishlatilishi mumkin. Yig'ilishdan oldin qattiq sifatli filtrlardan o'tgan jami xom o'qishlarning 81,62 foizi (shu jumladan, adapterni kesish va past sifatli o'qishlarni bekor qilish) bizning ketma-ketlik ma'lumotlarimizning yuqori sifatini ko'rsatadi va yuqori sifatli o'qishlarning 82,08 foizi yig'ish uchun foydalidir. Yig'ish uchun ishlatilmagan boshqa o'qishlar ketma-ketlik xatolaridan, montaj parametrlari va boshqalardan kelib chiqishi mumkin. Foydalanilmayotgan yuqori sifatli o'qishlar kelajakda boshqa platformadan (masalan, Roche 454) uzoqroq o'qishlar bilan birgalikda de novo yig'ishni yaxshilashda yordam berdi.

JINSIY FUNKSIYANI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ko'pgina yig'ilgan transkriptlar (30 098) ommaviy ma'lumotlar bazalarida ma'lum genlar bilan yuqori ketma-ketlik o'xshashligini ko'rsatdi, bu bizning Illumina-ga asoslangan juftlashtirilgan ma'lumotlarimiz C. deserticola transkriptlarining katta qismini qamrab olganligini ko'rsatadi. BLAST xitlari bo'lmagan transkriptlar 3' yoki 5' tarjima qilinmagan hududlar, kodlanmagan RNK yoki C. deserticola yangi gen ketma-ketligi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Ko'rsatilgan transkriptlar GO toifalari va KEGG yo'llarining keng doirasiga izohlangan (3 va 4-jadvallar), ularda ko'plab transkriptlar ikkilamchi metabolizm bilan bog'liq yo'llarga tayinlangan. Ma'lumki, fenilpropanoid er osti turmush tarzi uchun juda foydali bo'lgan induksiyali mikroblarga qarshi birikma sifatida xizmat qilishi mumkin [1], shuningdek, dorivor foydasidan tashqari o'simlik va mikroblarning o'zaro ta'sirida signal molekulasi sifatida ham ishlaydi [68, 69]. Terpenoid bioaktiv komponentlarning (masalan, 6- deoksikatalpol) biosintezi uchun ishlatiladi [70]. Biz fenilpropanoid va terpenoid magistral biosintez yo'lida ishtirok etadigan genlar C. deserticolada juda ko'p ekanligini aniqladik. Eng muhimi, lignin biosintezining yaxshi ifodalangan yo'llarining kashf etilishi (3-rasm) C. deserticola poyasida ligninning faol metabolik jarayonini ko'rsatdi. Lignin biosintezida ishtirok etadigan barcha ma'lum ferment genlari (3-rasm) aniqlandi va to'rtta asosiy ferment, jumladan PAL, CCR, HCT va F5H bilan solishtirganda ekspressiya ko'pligi (mos ravishda FPKM 26,47, 3,89, 3,4 va 3,83) bor edi. boshqa ferment genlari (6-jadval). Ushbu uchta genning ifoda o'zgarishi C. desertikolada lignin ishlab chiqarishga ta'sir qilishi mumkinmi yoki yo'qmi, keyingi o'rganishga loyiqdir. PAL lignin biosintezidagi asosiy ferment bo'lib, fenilpropanoid, resveratrol, flavonoid va kumarin biosintezida ham ishtirok etadi [71-74]. Biz C. deserticola genomida to'rtta alohida PAL genini aniqladik (S2-rasm), bu PAL kichik multigen oilasi tomonidan kodlanganiga to'g'ri keldi [39, 43, 45-49] va u metabolik uglerod oqimida muhim rol o'ynashi mumkinligini isbotladi. .

PhG C. deserticolaning asosiy faol moddasidir. Feniletanol biosintezida ishtirok etadigan genlar C. deserticola sifati uchun muhimdir. Biz fenil etanolning ikki xil biosintez yo'lini va C. deserticola poyasida PhG biosintezida ishtirok etadigan 17 ferment genini aniqladik. Kofe/ferul kislotasidan keyingi mumkin boʻlgan jarayonlar (3-rasm) ham birinchi marta oraliq mahsulotlarning strukturaviy formulasi va tegishli fermentlarning katalitik xususiyatlari asosida aniqlandi, bunda kofe/ferul kislotasi birinchi boʻlib fenilpiruvat hosilasiga oksidlanadi; keyin karboksil guruhi dekarboksilazalardan mahrum bo'ldi; Nihoyat, aldegid guruhi dehidrogenaza ta'sirida yana alkogol guruhiga aylantirildi. Bu C. deserticolaning butun transkriptomini tekshirish va mos yozuvlar genomisiz RNK-seq o'qishlarini yig'ish uchun Illumina juftlashtirilgan sekvensiya texnologiyasining birinchi qo'llanilishidir. Ushbu tadqiqot kelajakda C. deserticola bo'yicha funktsional genomika va proteomika tadqiqotlari uchun foydali resurslar va gen ketma-ketligini ta'minlaydi.

Xulosa

Ushbu tadqiqotda biz C. deserticola poyasining transkriptomini yuqori o'tkazuvchanlikdagi ketma-ketlik ma'lumotlariga asoslangan holda profilladik, ligninning biosintez yo'llari bilan bog'liq genlarni aniqladik, shuningdek, birinchi marta PhG ning potentsial biosintez yo'lini aniqladik, bu albatta tushunishni tezlashtiradi. noaniq fiziologik jarayonlar va molekulyar darajada katta dorivor ahamiyatga ega. Hozirgacha bu C. deserticola poyasining butun transkriptomini yig'ish va Illumina asosidagi ketma-ketlik ma'lumotlar to'plamidan foydalangan holda dorivor komponentlar biosintezi yo'lini aniqlash bo'yicha birinchi urinishdir. Bizning tadqiqotimiz tabiiy dori vositalarining rivojlanishiga va shifobaxsh xususiyatlarga ega navlarni tanlashga yordam berishi mumkin.

JINSIY FUNKSIYANI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%