Bir vaqtning o'zida bir nechta nefronga xos hujayralardagi aktin sitoskeletini barqarorlashtirish buyrakni turli xil shikastlanishlardan himoya qiladi Ⅱ

Dinamin orqali kortikal aktinning farmakologik barqarorlashuvi AKIni yaxshilaydi.

Aktomiyozin korteksining demontaj qilinishi natijasida buyrak kanalchalari cho'tkasi chegarasining yo'qolishi OKI ning asosiy xususiyati hisoblanadi.2,29. Ko'pincha OKIga olib keladigan saratonga qarshi keng qo'llaniladigan dori sisplatindir30. Buyrak hujayralarida sisplatin shikastlanishining asosiy natijasi reaktiv kislorod turlari (ROS) darajasining oshishi hisoblanadi.31. Bundan tashqari, ROS darajasining oshishi aktin dinamikasining pasayishiga olib keladi32, bu mitoxondriyal membrananing buzilishiga olib keladi; bu yanaROSni kuchaytiradiishlab chiqarish33,34. Shunday qilib, biz dinaminning farmakologik stimulyatsiyasini tekshirdik'ning o'zaro bog'lanish qobiliyati sufFisisplatin tomonidan qo'zg'atilgan shikastlanishga qarshi turish uchun.

35 dan oldin ko'rinib turganidek, sisplatin MDCK hujayra balandligini, mikrovillilar sonini va uzunligini kamaytirdi va endotsitozga ta'sir qilmasdan hujayra qutblanishiga ta'sir qildi (1-jadval, qo'shimcha rasm 7a-d). TEM tahlili shuni ko'rsatdiki, bu fenotiplar F-aktinning sisplatin tufayli yo'qolishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin (4a-rasm). Sisplatindan oldin Bis-T- 23 qo'shilishi sisplatin ta'siridan kelib chiqqan shikastlanishga qarshi aktomiozin korteksini barqarorlashtirish orqali uning ta'sirini bekor qildi (4a-c-rasm). Xuddi shunday fenotiplar cho'chqalarda ham kuzatilganbuyrak proksimal tubulasi(LLC-PK1) hujayralari (Qo'shimcha rasm 8). Birgalikda bu ma'lumotlar Bis-T-23 aktomiozin korteksini sisplatin bilan induktsiyalangan demontajdan saqlab qolishini tasdiqlaydi.

Qo'shimcha fiziologik jihatdan mos keladigan yondashuvda36, Bis T-23 transwell madaniyati tizimidan foydalangan holda jonli epiteliya monoqatlami bo'ylab o'lchangan sisplatinning transepitelial elektr qarshiligini (TER) kamaytirish qobiliyatiga qarshi kurashdi (4d-rasm). TER hujayra madaniyatidagi qattiq birikmalarning yaxlitligini o'lchaganligi sababli, bu ma'lumotlar Bis-T-23 ning shikastlanishdan keyin epitelial hujayra yaxlitligiga foydali ta'sirini aniqlaydi.

CKD UCHUN CISTANCHE OLISH UCHUN SHU YERGA BOSING

O'zgartirilgan aktin dinamikasi ROS ishlab chiqarishni yanada kuchaytirishi mumkinligi sababli, biz aktin tarmog'ini Bis-T-23 tomonidan barqarorlashtirish sisplatin bilan shikastlangan hujayralardagi oksidlovchi stressga qarshi turishi mumkinligini ko'rib chiqdik. Biz yaqinda ishlab chiqilgan TFCH37 lyuminestsent sensorimizdan foydalanib, yuqori darajadagi ROS tomonidan ishlab chiqarilgan oksidlovchi shikastlanishning barqaror biomarkeri bo'lgan hujayra biomolekula karbonillarining holatini baholashni tanladik (4e-rasm). Haqiqatan ham, sisplatin oldidan Bis-T-23 qo'shilishi sisplatin tufayli karbonillanishning o'sishini qisman kamaytirdi (4f-rasm). Karbonillanishga oid shunga o'xshash tendentsiyalar Bis-T-23 va aktin depolimerizatori LatA bilan davolashdan keyin kuzatildi (Qo'shimcha rasm. 9a). Birgalikda bu ma'lumotlar aktin tarmoqlarining barqarorlashuvi oksidlovchi stress va shikastlangan hujayralardagi aktin holati o'rtasidagi geribildirim halqasiga qarshi turishi mumkinligini isbotlaydi.

Ex vivo kalamushbuyrak modeliKeyinchalik cho'tka chegarasida aktomiozin korteksining BisT-23-boshqarilgan saqlanishini tasavvur qilish uchun foydalanilgan. Sisplatin proksimal kanalchalar cho'tkasi chegarasida F-aktin bo'yalishini sezilarli darajada yo'qotdi (4g-rasm). Og'ir ishemiya-reperfuziya shikastlanishining boshlanishi bilan cho'tka chegarasida F-aktinning xuddi shunday yo'qolishi yaqinda intraviral tasvir yordamida kuzatilgan38. Bis-T-23 bilan oldindan davolash buyrak kanalchalarining cho'tkasi chegarasida sisplatin bilan qo'zg'atilgan F-aktinning qisman himoyalangan yo'qolishi (4g-rasm), Bis-T-23 ning aktomiozinga ta'sirini yanada ko'rsatadi. buyrak epiteliya hujayralarining apikal membranasidagi korteks. Hujayra madaniyatida ko'rinib turganidek, Bis-T-23 to'qimalar bo'laklaridagi endositozga ta'sir qilmagan (Qo'shimcha rasm 9b), bundan tashqari Bis-T-23 buyraklardagi endositozda dinaminning roliga ta'sir qilmasligini ko'rsatadi. proksimal tubulalar.

Nihoyat, biz sisplatin bilan qo'zg'atilgan AKI39 ning sichqoncha modelida Bis-T -23 ning reno-himoya ta'sirini ko'rib chiqdik. BL6 sichqonlariga sisplatinni kiritishdan 24 soat oldin kuniga bir marta Bis-T-23 yoki DMSO yuborilgan. Oldindan ko'rinib turganidek40, sarum kreatinin (SCr) va qon siydik azot (BUN) darajalari sisplatin kiritilgandan keyin 3 kundan keyin sezilarli darajada oshdi (4h-rasm). DMSO oksidlovchi moddalarni tozalash qobiliyati tufayli41 avval ko'rilganidek engil reno-himoyani namoyon etdi42. Bis-T-23 ning kundalik ma'muriyati reno-himoya bo'yicha DMSO dan oshib ketdi (4h-rasm). Sisplatinning tizimli toksikligi tufayli barcha hayvonlar 5-kuni qurbon qilinganligi sababli (Qo'shimcha rasm 9c), biz Bis-T-23 ning uzoq muddatli foydasini tekshira olmadik.buyrak funktsiyasi. Birgalikda bu tadqiqotlar apikal membranada aktomiozin korteksini barqarorlashtirish orqali buyrak hujayralari yaxlitligini saqlash sisplatin keltirib chiqaradigan nefrotoksiklikka qarshi turishini ishonchli tarzda ko'rsatadi.

Aktin tarmoqlarini barqarorlashtirish ioheksol tomonidan qo'zg'atilgan AKI ga qarshi turadi.

Kontrastli bo'yoqlardan kelib chiqqan AKI ning aniq mexanizmi to'liq tushunilmagan bo'lsa-da, u kasalxonada sotib olingan AKI43 ning asosiy sababi bo'lib qolmoqda. Fiziologik jihatdan kontrastli bo'yoq osmotik yukni oshiradi, buyrak qon oqimini kamaytiradi va buyrak arterial siqilishini keltirib chiqaradi44. Hujayra darajasida ROS bo'yoq bilan qo'zg'atilgan AKI45 dan farqli o'laroq muhim o'yinchidir. ROS ning aktin sitoskeletini tartibga solishdagi rolini va aktomiozin korteksining barqarorlashuvi oksidlovchi shikastlanishga qarshi turishi mumkinligi haqidagi gipotezamizni hisobga olgan holda, biz Bis-T -23 ning kontrast bo'yoq, ioeksol bilan qo'zg'atilgan AKI46 ga ta'sirini ko'rib chiqdik.

Ioheksolning hujayrali ta'siri insonda o'rganildibuyrak proksimal naychasi(HK-2) katakchalar. Sisplatin uchun ko'rinib turibdiki, ioeksol F-aktinni yo'qotdi, bu karbonillangan molekulalar darajasining sezilarli darajada oshishi bilan birga bo'ldi, bu ROS darajasining ko'tarilishining qaytarilmas oqibati (5a, b-rasm). Ikkala fenotipga Bis-T-23 bilan oldindan ishlov berish orqali qisman qarshi kurash olib borildi, bu esa aktin sitoskeletonining holati va bu hujayralardagi oksidlovchi stress darajasi o'rtasidagi sinergiyani yanada aniqladi. Hujayra asosidagi tahlillarga qo'shimcha ravishda, Bis T{7}} ning kunlik qo'llanilishi kontrastli bo'yoq bilan sinovdan o'tgan BL6 sichqonlarida Scr va BUN darajalariga asoslangan buyrak funktsiyasini saqlab qoldi (5c-rasm). Bis-T-23 va kontrastli bo'yoqni olgan hayvonlarda yaxshilangan omon qolish darajasi ham kuzatildi (5d-rasm).

Biz yaqinda eruvchan urokinaz tipidagi plazminogen aktivator retseptorlari (suPAR) ning yuqori zardob darajasi buyrakni ioeksol tomonidan qo'zg'atilgan AKI47 ga sezgirligini ko'rsatdik. Keyinchalik, biz quvurli hujayralarni dinamin vositachiligida himoya qilish, shuningdek, yog 'to'qimalaridan (suPAR-Tg) yuqori darajadagi suPAR ni ifodalovchi BL6 sichqonlarida reno-himoyani ham ta'minlay oladimi yoki yo'qligini tekshirdik. Kutilganidek47, suPAR-Tg sichqonlari ioheksol in'ektsiyasidan 24-48 soat o'tgach buyrak funktsiyasining pasayishini ko'rsatdi (5e-rasm). Bundan farqli o'laroq, Bis-T-23 ning kunlik dozasini olgan hayvonlar namoyish etildibuyrak funktsiyasi sezilarli darajada yaxshilanadikontrastli bo'yoq muammosiga qaramasdan (5e-rasm). Ta'kidlash joizki, Bis-T -23 ni olgan sichqonlar guruhida o'lim darajasining sezilarli pasayishi kuzatildi (5f-rasm). Kutilganidek, Bis-T-23 bilan bir vaqtda davolangan HK-2 hujayralarida oksidlovchi shikastlanish darajasi (biomolekulyar karbonillanish) faqat suPAR va Ioheksol kombinatsiyasini olgan hujayralarga qaraganda ancha past edi (Qo'shimcha rasm). 9d).

4-rasm Dinamin agonisti apikal membranada aktomiozin korteksini barqarorlashtirish orqali buyrak kanalchalarini sisplatin ta'siridan kelib chiqqan shikastlanishdan himoya qiladi. 1 soat oldin DMSO (0.1%) yoki Bis-T-23 (5 mkM, 0.1% DMSO) bilan ishlov berilgan MDCK hujayralarida lamellipodiyning PR-EM tasviri 23 soat davomida sisplatin (35 mkM) qo'shilishi uchun. Aktomiyozin korteksi sariq rangga ega edi. b (a) dagi qutilarga o'rnatilgan hududlarning kattalashtirilgan tasvirlari. Qalinlikning alohida darajalari rang bilan belgilanadi. Yuqori va pastki panellar navbati bilan qisqaroq filamentlar va uzunroq filamentlardan tashkil topgan tarmoqlarni ko'rsatadi. c Old chetidagi aktin filamentlarining zichligi tasvirlangan grafik ((a); 18–20 maydon hisoblangan sariq quti). d (a) bandida ko'rsatilganidek muomala qilingan jonli MDCK hujayralarida nisbiy transepitelial elektr qarshilik (%) tasvirlangan chiziqli grafik, sisplatin (50 mkM) va Bis-T-23 (30 mkM) konsentrasiyalari (12) bundan mustasno har bir namunadagi o'qishlar). Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida chizilgan (***P <0,001, ****P <0,0001, juftlashtirilmagan ikki dumli t-test). ns, muhim emas. e TFCH tahlili yordamida oksidlovchi stress bilan bog'liq karbonillanishni aniqlashning sxematik ko'rinishi. f TFCH tomonidan aniqlangan biomolekula karbonillarining darajasini ko'rsatadigan rasmlar. Hujayralar sisplatin konsentratsiyasidan (5 mkM) tashqari (a) da ko'rsatilganidek muomala qilindi. Masshtab paneli, 20 mkm. Har bir hujayradagi biomolekula karbonillari bilan bog'liq TFCH floresansining nisbiy darajalari tasvirlangan grafik (ma'lumotlar nuqtalari (n)=83–116; har bir nuqta 4-9 hujayraning o'rtacha intensivligini bildiradi). g Kalamushbuyrak bo'laklarianti-aktin antikorlari bilan bo'yalgan.Buyrak bo'laklarisisplatin (200 µM) yoki buferni 8 soat davomida qo‘shishdan oldin bufer, DMSO (0,1%) yoki Bis-T-23 (30 mkM)da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Oq kvadratli hududlar kengaytirildi. O'lchov chiziqlari, 40 mkm. Har bir tubuladagi cho‘tka chegarasida F-aktin intensivligini ko‘rsatadigan grafik (100-236). c, f, g uchun ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida chiziladi (P qiymatlari Tukeyning bir nechta taqqoslash testi bilan bir tomonlama ANOVA rasmda keltirilgan). h Qon karbamid azoti (BUN) yoki sarum kreatinin (SCr) darajasi bilan belgilanadigan sisplatin tomonidan qo'zg'atilgan AKIni ko'rsatadigan tarqoq nuqtali chizmalar. Hayvonlarga DMSO (1%) yoki Bis-T-23 (20 mg/kg) yuborilgan (n=12, SCr uchun shartga; n=17, BUN uchun shartga) sisplatinni (15 mg/kg) yuborishdan 24 soat oldin kuniga bir marta. O'lchovlar belgilangan vaqtlarda amalga oshirildi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida chizilgan (P qiymatlari rasmda keltirilgan, juftlashtirilmagan ikki dumli t-testi). ns, muhim emas.

Sisplatin va ioeksol tufayli kelib chiqqan ROS vositachiligidagi hujayra shikastlanishidan farqli o'laroq, suPAR qisman kislorod iste'mol qilish tezligini (OCR) oshirish orqali quvurli hujayralar shikastlanishiga yordam beradi47. SuPAR transgen sichqonlarida Bis-T -23 ning fiziologik ta'sirini hujayra metabolizmiga ta'siri bilan bog'lash uchun biz aktin tarmog'ining dinamin orqali barqarorlashishi suPAR tomonidan boshqariladigan OCRni pasaytiradimi yoki yo'qligini tekshirdik. OCR real vaqtda HK{6}} hujayralarida bazal sharoitda va Seahorse XFe24 hujayradan tashqari oqim analizatori yordamida mitoxondrial ingibitorlarning ketma-ket kiritilishiga javoban o'lchandi (5g-rasm). Anti-suPAR antikori yoki Bis-T-23 qo'shilishi suPAR tomonidan yaxshilangan mitoxondrial bazal nafas olish, ATP ishlab chiqarish, maksimal nafas olish tezligi va zaxira nafas olish qobiliyatini oshiradi (5f-rasm). Ushbu ma'lumotlar Bis-T-23 ning shikastlanishdan keyin hujayra metabolizmiga ijobiy ta'sirini ko'rsatadi. Birgalikda, ushbu tadqiqotlar bir nechta AKI turlaridan himoya qilish va shu bilan proksi sifatida dinamin orqali kemiruvchilar modellarida omon qolish darajasini oshirishning maqsadga muvofiqligini tasdiqlaydi.

Aktinning bir vaqtning o'zida barqarorlashishialohida buyrak hujayralarinefron shikastlanishini susaytiradi. Biz ilgari dinaminga asoslangan aktin polimerizatsiyasining farmakologik faollashuvi CKD12 ning turli xil sichqon modellarida podotsitlarning tuzilishi va funktsiyasini tiklaganini ko'rsatdik. Ushbu tadqiqotda biz aktin sitoskeletini o'zaro bog'lash orqali o'tkir jarohatlarda dinaminning quvurli hujayralar yaxlitligini saqlab qolish qobiliyatini namoyish etdik. Birgalikda, bu tushunchalar bizni bir vaqtning o'zida glomerulyar va quvurli shikastlanishga, farmakologik jihatdan dinaminni yo'naltirish orqali qarshi turish imkoniyatini tasavvur qilishga olib keldi.

Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun biz Bis-T-23 ning yo'qolishini kechiktira oladimi yoki yo'qligini tekshirdikbuyrak funktsiyasiAlport sindromining (AS) sichqoncha modelida. AS ning irsiy shaklidirprogressiv buyrak etishmovchiligiCOL4A3, COL4A4 yoki COL4A5 genlaridagi mutatsiyalar tufayli glomerulyar bazal membrananing (GBM) asosiy komponenti bo'lgan IV turdagi kollagenni birgalikda kodlaydi49,50. ASning asosiy nuqsoni oyoq jarayonining o'chishi va proteinuriya bo'lsa-da.

Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun biz Bis-T-23 ning yo'qolishini kechiktira oladimi yoki yo'qligini tekshirdikbuyrak funktsiyasiAlport sindromining (AS) sichqoncha modelida. AS ning irsiy shaklidirprogressiv buyrak etishmovchiligiCOL4A3, COL4A4 yoki COL4A5 genlaridagi mutatsiyalar tufayli glomerulyar bazal membrananing (GBM) asosiy komponenti bo'lgan IV turdagi kollagenni birgalikda kodlaydi49,50. ASning asosiy nuqsoni oyoq jarayonining o'chishi va proteinuriya bo'lsa-da.

Munozara Dinamin-aktinning to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'siri10 aniqlangandan beri, bu GTPazni hujayradagi aktin sitoskeletonining asosiy regulyatorlaridan biri sifatida tasdiqlovchi dalillar to'plami ortib bormoqda. Kanonik ABPlardan farqli o'laroq, dinaminning aktinga ta'sir qilish mexanizmlari juda ko'p qirrali va hujayra tipiga xosdir. Bu dinaminning ko'p oligomerizatsiya holatlarining kombinatsiyasi va F-aktinni ikki xil bog'lanish joylari bilan bog'lash qobiliyati bilan bog'liq. F-aktinning C-terminal PRD orqali dinamin halqalari va spirallari bilan o'zaro ta'siri aktin to'plamlari va giper-to'plamlarga olib keladi, bu miyoblastning sintezi paytida filopodiya56 va membrana o'simtalarining shakllanishida ishtirok etgan. Dinaminning o'rta domeni va F-aktin o'rtasidagi o'zaro ta'sirlar lamellipodiyadagi aktin tarmoqlarini tartibga solishda26, postsinaptik sitoskeleton tashkil etishda va nerv-mushak birikmalarining rivojlanishida27, mioblast sintezi paytida endosomalarda aktin to'plamining qattiqligi25 va podotsitlar oyoq jarayonlarining shakllanishida ishtirok etgan. Oyoq jarayonlarining shakllanishi dinamin bilan stimulyatsiya qilingan aktin polimerizatsiyasi bilan bog'liq bo'lsa-da, ushbu tadqiqot dinaminning boshqa aktin bilan boshqariladigan jarayonlarga ta'sir qilishining molekulyar mexanizmi qisman F-aktinni tarmoqlangan tarmoqlarga o'zaro bog'lash qobiliyatiga bog'liq bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. . Bizning hozirgi tadqiqotimiz qutblangan epiteliya hujayralarining apikal membranasida aktomiozin korteksining shakllanishi va hujayra qattiqligini o'rnatish uchun dinaminga bog'liq tarmoq shakllanishi rolini kengaytiradi.

Munozara Dinamin-aktinning to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'siri10 aniqlangandan beri, bu GTPazni hujayradagi aktin sitoskeletonining asosiy regulyatorlaridan biri sifatida tasdiqlovchi dalillar to'plami ortib bormoqda. Kanonik ABPlardan farqli o'laroq, dinaminning aktinga ta'sir qilish mexanizmlari juda ko'p qirrali va hujayra tipiga xosdir. Bu dinaminning ko'p oligomerizatsiya holatlarining kombinatsiyasi va F-aktinni ikki xil bog'lanish joylari bilan bog'lash qobiliyati bilan bog'liq. F-aktinning C-terminal PRD orqali dinamin halqalari va spirallari bilan o'zaro ta'siri aktin to'plamlari va giper-to'plamlarga olib keladi, bu miyoblast sintezi paytida filopodiya56 va membrana o'simtalarining shakllanishiga ta'sir qiladi. Dinaminning o'rta domeni va F-aktin o'rtasidagi o'zaro ta'sirlar lamellipodiyadagi aktin tarmoqlarini tartibga solishda26, postsinaptik sitoskeleton tashkil etishda va nerv-mushak birikmalarining rivojlanishida27, mioblast sintezi paytida endosomalarda aktin to'plamining qattiqligi25 va podotsitlar oyoq jarayonlarining shakllanishida ishtirok etgan. Oyoq jarayonlarining shakllanishi dinamin bilan stimulyatsiya qilingan aktin polimerizatsiyasi bilan bog'liq bo'lsa-da, ushbu tadqiqot dinaminning boshqa aktin bilan boshqariladigan jarayonlarga ta'sir qilishining molekulyar mexanizmi qisman F-aktinni tarmoqlangan tarmoqlarga o'zaro bog'lash qobiliyatiga bog'liq bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. . Bizning hozirgi tadqiqotimiz qutblangan epiteliya hujayralarining apikal membranasida aktomiozin korteksining shakllanishi va hujayra qattiqligini o'rnatish uchun dinaminga bog'liq tarmoq shakllanishi rolini kengaytiradi.

Bu yaxshi tasdiqlanganCKD va AKI, garchi mexanik jihatdan bir-biridan farq qilsa ham, bir-biri bilan chambarchas bog'liq bo'lib, AKI CKD rivojlanishi va rivojlanishi uchun xavf omili sifatida e'tirof etiladi 66. Hozirgacha AKI davolab bo'lmaydi67. Bu, ayniqsa, 2019-yilgi koronavirus kasalligi (COVID-19) pandemiyasi fonida ayniqsa dolzarbdir, bunda COVID-19 bilan kasalxonaga yotqizilgan bemorlarda va plazmadagi suPAR darajasi yuqori bo'lganida, AKI qo'rqinchli darajada rivojlanadi. Yuqori suPAR darajalari ikkala AKI47 va CKD69 bilan bog'langan, bu ikkalasi o'rtasidagi molekulyar aloqani yanada kuchaytiradi.alohida buyrak kasalliklari. Shu sababli, bir nechta hujayra turlarini buyrak shikastlanishidan himoya qila oladigan terapevtik vositalarni ishlab chiqish tobora muhim ahamiyat kasb etmoqda70. Bu erda biz podotsitlar va quvurli hujayralarga shikast etkazadigan ASning genetik modelida dinamin agonistining reno-himoya ta'siri haqida xabar beramiz. Bizning tadqiqotimiz nefron ichidagi bir nechta hujayra turlarida aktin tarmog'i bilan bog'langan va ko'p sonli kasalliklarni davolaydigan yangi terapevtiklarni ishlab chiqish uchun keng qamrovli yondashuvni o'rnatadi.buyrak kasalliklarishikastlanish joyidan qat'i nazar.

Usullari Hujayra madaniyati. MDCK (Madin-Darby it buyrak) hujayralari (ATCC CCL-34) va sichqonchaning ichki medullar yig'uvchi kanali (mIMCD-3) hujayralari (ATCC CRL-2123) DMEM/F12 (ThermoFisher) da o'stirildi. Ilmiy) tarkibida 10% xomilalik sigir zardobi (FBS) va 1X Antibiotik-antimikotik (penitsillin, streptomitsin va Amfoterisin B; Gibco). LLC-PK1 (Lilly Laboratories Cell-Porcin Buyrak 1) hujayralari (ATCC CL- 101) DMEMda 4,5 g/L glyukoza, L-glutamin, natriy piruvat (Corning), 10% FBS va 1X Antibiotik bilan o'stirildi. - Antimikotik. MDCK va LLC-PK1 hujayralari tajribalarni boshlashdan oldin mos ravishda ~ 24 va ~ 72 soat davomida o'stirildi. HK-2 (Inson buyragi 2) proksimal quvurli hujayralar (ATCC CRL-2190) bioenergetik tajribalar uchun ishlatilganda 10% FBS, 100 U/ml penitsillin va 100 ug/ml streptomitsinni o'z ichiga olgan DMEM/Ham's F12 muhitida (Corning) yetishtirildi. Aktin sitoskeleti va hujayra karbonillanishi holatini tahlil qilish uchun HK-2 hujayralari 10% FBS, 1X Antibiotik-Antimikotik va 1X ITS (insulin, transferrin va) o'z ichiga olgan DMEM F-12 (ATCC) da o'stirildi. natriy selenit) suyuq muhit qo'shimchasi (Sigma-Aldrich). Dynamin 2 (Dyn2) yiqituvchi hujayra chizig'ini (mIMCD Dyn2KD) o'rnatish uchun hujayralar DNM2 genini kodlaydigan shRNKni (5′CGGCCTAGTGGACATGACAATGAACTCGAGTTCATTGTCATGTC CACTAGGTTTTTG3′) 10-to'liq media (SCRICHNATGTCATGTC) ni o'z ichiga olgan lentiviruslar bilan yuqtirgan. 8 mkg/ml). 24 soatdan so'ng, vosita har kuni barqaror transfektantlarni tanlash uchun puromisin o'z ichiga olgan vosita bilan almashtirildi. Dyn2 nokautining darajasi western blot tomonidan baholandi. Barcha hujayra chiziqlari kollagen bilan qoplangan shisha qoplamalarda o'stirildi.

6-rasm Dinaminning farmakologik faollashuvi bir vaqtning o'zida nefronning ikkita alohida hujayralaridagi aktin sitoskeletini nishonga oladi. a Col4a3−/− sichqonlari DMSO (1%) yoki Bis-T-23 (20 mg/kg) bilan kuniga bir marta 42 kunlik (0-kun) AOK qilingan. DMSO yoki Bis-T-23 bilan ishlov berilgan sichqonlarning teng soni (ACR uchun n=10; BUN uchun n=8) ishlatilgan. Tarqalgan nuqta grafigi proteinuriya darajasini (albumin va kreatinin nisbati, ACR) vabuyrak shikastlanishiBUN darajasi bilan belgilanadi. Xato satrlari, o'rtacha ± SD (P qiymatlari rasmda keltirilgan, juftlashtirilmagan ikki dumli t-testi). b Log-Rank (Mantel-cox) testi ikkita davolash guruhining omon qolish egri chizig'ini tahlil qilish uchun o'tkazildi. c Buyrakning reprezentativ gistopatologiyasi davriy kislota-Schiff (PAS) va (a) da tasvirlangan Col4a3−/− sichqonlaridan olingan namunalarda H&E bo'yalishi bilan aniqlanadi. Hayvonlar 62 kunlik edi (Bis-T-23 yoki DMSO bilan davolashning 20-kuni). Col4a3−/− DMSO bilan davolash qilingan hayvonlarda glomerulopatiya PAS bo‘yalishida kuzatilgan mezangial kengayish (qora o‘q), hujayralilikning oshishi va Bowman bo‘shlig‘ining ortishi bilan tavsiflangan. Naychalardagi degenerativ o'zgarishlar gipslarning shakllanishi (*) va quvurli sklerozning mavjudligini o'z ichiga oladi. 20 kun davomida Bis-T{15}} bilan davolash glomeruli (mezangial kengayishning kamayishi) va tubulalarning (gips yo'qligi) morfologiyasini qisman saqlab qoldi. d Nefron sxemasi (rasm Milliy diabet va ovqat hazm qilish instituti vaBuyrak kasalliklari, Milliy sog'liqni saqlash institutlari) va dinamin bilan boshqariladigan reno-himoya bilan bog'liq mexanizm. Buyrak kanalchalarining qutblangan epitelial hujayralarida dinamin aktin filamentlarini tarmoqlarga o'zaro bog'lash orqali hujayra polaritesini o'rnatadi (ushbu tadqiqot). Dynaminning filamentlarni o'zaro bog'lash qobiliyati mikrovilluslarning shakllanishiga ta'sir qiladi. O'tkir shikastlanish ROS ishlab chiqarishni ko'paytiradi, hujayra metabolizmini o'zgartiradi va aktin dinamikasini buzadi, bu esa ROS ishlab chiqarishni yanada kuchaytiradi, bu esa aniqroq hujayrali oksidlovchi shikastlanishga olib keladi (biomolekulyar karbonillanish). Aktomiyozin korteksida dinaminning o'zaro bog'lanish qobiliyatining oshishi quvurli hujayralar yaxlitligini saqlaydi, bu ularni qisman oksidlanishdan himoya qiladi. Bundan tashqari, dinamin podotsitlarning tuzilishi va faoliyati uchun zarurdir. Dinaminning farmakologik faollashuvi aktin polimerizatsiyasini qo'zg'atish orqali oyoq jarayonlarini tiklaydi. Bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, dinamin oligomerizatsiyasining farmakologik faollashuvi ikkita aniq molekulyar mexanizmga yo'naltirilgan holda nefronga ikki tomonlama foydali ta'sir ko'rsatadi: podotsitlar yaxlitligini saqlash (aktin polimerizatsiyasi) va buyrak quvur hujayralari (aktin filamentlarining o'zaro bog'lanishi).

Ma'lumotnomalar

1. Basile, DP, Anderson, MD & Sutton, TA O'tkir buyrak shikastlanishining patofiziologiyasi.Compr. Fiziol. 2, 1303–1353 (2012).

2. Bonventre, JV & Yang, L. Ishemik o'tkir buyrak shikastlanishining hujayrali patofiziologiyasi.J. Klin. Invest. 121, 4210–4221 (2011).

3. Campanale, JP, Sun, TY & Montell, DJ Bir qarashda hujayra polaritesining rivojlanishi va dinamikasi.J. Hujayra fanlari. 130, 1201–1207 (2017).

4. Salbreux, G., Charras, G. & Paluch, E. Actin korteks mexanikasi va hujayra morfogenezi.Trends Cell Biol. 22, 536–545 (2012). 

5. Visente-Manzanares, M., Ma, X., Adelshteyn, RS & Horwitz, AR Mushak bo'lmagan miyozin II hujayra yopishqoqligi va migratsiyasida markaziy o'rinni egallaydi.Nat. Ruhoniy Mol. Hujayra Biol. 10, 778–790 (2009). 

6. Chugh, P. va boshqalar. Aktin korteks arxitekturasi hujayra sirt tarangligini tartibga soladi.Nat. Hujayra Biol. 19, 689–697 (2017). 7. Nguyen, LT & Hirst, LS. Yuqori darajada o'zaro bog'langan F-aktin tarmoqlarining polimorfizmi: bir nechta uzunlikdagi o'lchovlarni tekshirish.fizika. Rev. E Stat. Nonlin yumshoq materiya fizikasi. 83, 031910 (2011).

Wecistanche-ning qo'llab-quvvatlovchi xizmati - Xitoydagi eng yirik cistanche eksportchisi:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp% 2fTel:+86 15292862950}

Do'kon:

https://ww.xjcistanche.com/cistanche-shop