Tau agregatlarining strukturaviy jihatdan aniq polimorflari nano o'lchovli infraqizil spektroskopiya orqali aniqlandi

Abstrakt

Tau oqsilining to'planishi birgalikda tauopatiyalar deb nomlanuvchi bir qancha neyrodegenerativ kasalliklarda, jumladan Altsgeymer va Parkinson kasalliklarida markaziy rol o'ynaydi. Tau neyrofibrillar chigallarida joylashgan juft spiral filamentlarni tashkil etuvchi fibrillyar beta-varaq tuzilmalariga noto'g'ri aylanadi. Ma'lumki, turli kasalliklar bilan bog'liq bo'lgan tau agregatlarida sezilarli strukturaviy heterojenlik bo'lishi mumkin.

Biroq, etuk fibrillalarning tuzilmalari o'rganilgan bo'lsa-da, erta bosqichdagi tau agregatlaridagi strukturaviy taqsimot yaxshi tushunilmagan. Ushbu tadqiqotda biz AFM-IR dan agregatsiyaning turli bosqichlarida individual tau fibrillalarining nano o'lchamli spektrlarini o'rganish va turli xil ikkilamchi tuzilmalarni ko'rsatadigan bir nechta fibrilyar polimorflar mavjudligini ko'rsatish uchun foydalanamiz. Bundan tashqari, biz etuk fibrillalarda sezilarli miqdorda antiparallel beta varaqlarini o'z ichiga olishini ko'rsatamiz. Bizning natijalarimiz nano o'lchovli infraqizil spektroskopiyaning tau agregatlariga birinchi qo'llanilishi bo'lib, oqsil agregatsiyasini o'rganish uchun fazoviy hal qilingan infraqizil spektroskopiya va'dasini ta'kidlaydi.

Altsgeymer kasalligi neyrodegenerativ kasallik bo'lib, tez-tez uchraydigan kasallik bo'lib, uning asosiy patologik xususiyatlari neyronlar va sinapslarning jiddiy yo'qolishi va miyada -amiloid (-amiloid) va Tau oqsili (mikronaychalar bilan bog'liq protein) to'planishi hisoblanadi. Ushbu oqsillar kasallikning rivojlanishi jarayonida etuk fibril tuzilmalarini hosil qiladi va bu strukturaning oqsil tolalari neyronlarning o'limiga va kognitiv pasayishiga olib kelishi mumkin. Yetuk fibrillalar kasallikning shakllanishida -amiloid va Tau oqsillariga qaraganda jiddiyroq rol o'ynaydi. Buning sababi shundaki, etuk fibrillalarning shakllanishi patogen mexanizmning so'nggi nuqtasi bo'lib, kasallikning rivojlanishi paytida neyronlar va sinapslarning yo'qolishini yanada kuchaytiradi va kasallikning rivojlanishini tezlashtiradi. Shu sababli, Altsgeymer kasalligini davolashni tadqiq qilish va rivojlantirish uchun etuk fibrillalarni tadqiq qilish va tadqiq qilish ham tadqiqot nuqtasiga aylandi. Tadqiqotlarimizda Cistanche Altsgeymer kasalligini davolashda samarali ekanligini aniqladik. Cistanche kuchli antioksidant ta'sirga ega bo'lgan ko'p miqdorda antosiyaninlar va flavonoidlarni o'z ichiga oladi. Ushbu ingredientlar erkin radikallar ishlab chiqarishni kamaytirishga yordam beradi va miya hujayralarini oksidlovchi shikastlanishdan himoya qiladi va shu bilan neyrodegeneratsiya ehtimolini kamaytiradi.

Cistanche deserticola qo'shimchasini bosing

Kalit so'zlar

Tau; yig'ish; Altsgeymer kasalligi; AFM-IR; nano-miqyosli IQ spektroskopiyasi; AFM; fibril tuzilishi; antiparallel beta varaqlari.

Tau oqsillarining noto'g'ri qatlamlanishi va to'planishi tauopatiyalar deb ataladigan ko'plab neyrodegenerativ kasalliklarning, jumladan Altsgeymer va Parkinson kasalliklarining patologik belgisidir1-5. Tau mikrotubulalar (MT) bilan bog'langan oqsil bo'lib, neyrofibrilyar chigallar (NFTs) 1-2, 5-6 deb ataladigan erimaydigan hujayra birikmalariga aylanadi.

Dastlabki dalillar NFTlarning potentsial neyrotoksikligini ko'rsatgan bo'lsa-da, hozirda prefibrillar oligomerik birikmalar asosiy neyrotoksik turlar ekanligiga ishoniladi3, 5-6. Tau fibrilizatsiyasining o'ziga xos yo'llarini aniqlash kasallikning mexanizmlari haqida tushuncha beradi va dori-darmonlarni kashf qilish uchun potentsial terapevtik maqsadlarni ochib beradi. Tau agregatsiyasi va agregatsiyani modulyatsiya qiluvchi turli omillarning rolini tushunish uchun katta kuch sarflandi1-2, 7-18. Boshqa amiloid oqsillarining, masalan, amiloid betaning tau konformatsiyasini o'zgartirishdagi roli ham o'rganildi19-21. Ma'lumki, NFTlardagi tau filamentlari amiloid plaklariga o'xshash o'zaro beta tuzilishga ega. Biroq, fibril shakllanishiga olib keladigan tau strukturaviy evolyutsiyasini har tomonlama yoritib berish muammo bo'lib qolmoqda.

Inson miyasida aminokislota qoldiqlari soniga qarab farq qiluvchi olti xil tau izoformasi aniqlangan2, 5, 22. Dominant izoform va fibrillyar struktura kasallikka qarab o'zgarishi mumkin2, 22. Barcha tau izoformalari katta polipeptidlardir va shuning uchun strukturaviy xususiyatga ega. moslashuvchanlik. Shuning uchun katta miqdordagi tadqiqot qiziqishlari to'liq uzunlikdagi oqsillar o'rniga tau agregatsiyasi23-25 uchun muhim bo'lgan mikronaychalarni bog'lovchi domenlarni ifodalovchi qisqa peptidlarga qaratilgan. Bundan tashqari, tau va uning izoformalari polimorfizmni namoyon qiladi: mohiyatan bir xil peptidlar turli fibrillyar tuzilmalarga birlashadi, ular nafaqat morfologiyasi, balki molekulyar joylashuvi bo'yicha ham farqlanadi8-9, 26-27. Yuqoridagi barcha omillar yig'ilishning turli bosqichlarida hosil bo'lgan o'ziga xos tau agregatlarini izolyatsiya qilish va tizimli tahlil qilishni qiyin vazifaga aylantiradi. Umuman olganda, amiloid agregatsiyasining tabiati shundaki, u o'tkinchi va bir-biri bilan muvozanatda bo'lgan ko'plab agregatlangan turlarni hosil qiladi. Yaqinda kriyo-EM tau fibrillar tuzilmalarini hal qilish uchun muvaffaqiyatli qo'llanildi; ammo uning qoʻllanilishi oraliq emas9-10, agregatsiyaning soʻnggi nuqtasi boʻlgan asosan etuk fibrillalar bilan chegaralanib qoladi.

Xususan, erta bosqichdagi tau oraliq mahsulotlarning strukturaviy jihatlari yaxshi tushunilmagan. Amiloidga o'xshash agregatlarning ikkilamchi tuzilishini aniqlashning oltin standarti, umuman olganda, qattiq holatdagi yadro magnit rezonansi (ssNMR) va Furye o'zgarishi infraqizil spektroskopiyasi (FTIR)15, 28-31 kabi spektroskopik usullardir. Biroq, bu usullarning hech biri alohida agregatlar miqyosida fazoviy rezolyutsiyani ta'minlay olmaydi va fazoviy rezolyutsiyasiz spektral xususiyatlarni aniq agregatlar yoki morfologiyalarga bog'lash yoki qaysi vaqtinchalik turlarning ma'lum bir morfologiyaga aylanishini aniqlash qiyin. Umuman olganda, kuzatilgan spektral xususiyatlar ma'lum bir agregatsiya holatidan yoki turli xil konformatsiyalarning statistik aralashmasidan kelib chiqadimi yoki yo'qligini aniqlash mumkin emas.

Natijada, oligomerlar va fibrillalarning faqat o'rtacha tuzilmalari ma'lum va har bir davlat ichidagi strukturaviy o'zgarishlarning heterojenliklari, agar mavjud bo'lsa, yaxshi tushunilmagan. Turli sharoitlarda tau va boshqa amiloidogen oqsillarni yig'ish haqidagi bilimlarimizni oshirish uchun agregatsiyaning turli bosqichlarida konformatsion ansamblning har bir a'zosining tuzilishini tushunish zarur. So'nggi o'n yil ichida nanometr miqyosdagi rezolyutsiyaga erishish uchun infraqizil spektroskopiyani AFM bilan birlashtirgan tebranish spektroskopiyasining fazoviy rezolyutsiyasini yaxshilash uchun yangi yondashuvlar ishlab chiqildi.

Yaqinda ishlab chiqilgan AFM-ga asoslangan yondashuvlardan biri fototermal induktsiyali rezonansdan (PTIR) foydalanadi, bu erda namunaning infraqizil yutilishi natijasida mahalliy termal kengayish AFM uchi 32-35 tomonidan seziladi. Shunday qilib, fototermal AFM-IR infraqizil yutilishni o'lchash uchun AFM zondining uchidan foydalangan holda an'anaviy IQ mikroskopidagi ruxsat chegaralarini chetlab o'tadi. Infraqizil rejimning rezonansli qo'zg'alishi orqali nurlanishning yutilishi namunaning termal kengayishiga olib keladi va AFM konsolida impulsiv kuch hosil qiladi. Natijada paydo bo'lgan AFM probining javobi infraqizil absorbsiyaga mutanosibdir va to'lqin uzunligini skanerlash namunaning nano-miqyosli hududiga mos keladigan infraqizil yutilish spektrini beradi (1-rasm).

Shunday qilib, an'anaviy optik usullardan farqli o'laroq, AFM-IR nano o'lchovli tuzilmalarni misli ko'rilmagan kimyoviy tafsilotlarda tekshirishi mumkin va ikkala dunyoning eng yaxshisini birlashtiradi: AFM ning fazoviy o'lchamlari va infraqizilning kimyoviy o'lchamlari. AFM-IR beta-amiloid va alfa sinuklein 35-38 kabi amiloidogen peptidlarning agregatlarini o'rganish uchun ishlatilgan bo'lsa-da, tau agregatsiyasini o'rganish uchun u hech qachon qo'llanilmagan. Ushbu tadqiqotda biz AFM-IR imkoniyatlaridan foydalanamiz va agregatsiyaning turli bosqichlarida tau{5}} izomerining fibrillalarini tekshiramiz, bu agregatsiyaning dastlabki bosqichlarida fibrillar tuzilishida sezilarli heterojenlik mavjudligini ko'rsatamiz. morfologiyada. Bizning natijalarimiz birinchi marta bir xil morfologiyani ko'rsatadigan fibrillalarning ikkilamchi tuzilishida asosiy farqlar bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Bir nechta strukturaviy farqli fibril polimorflari kuzatiladi; boshqalardan ko'ra ko'proq tizimli tartibli, bu ham vaqtinchalik va etuk fibrillalarda topilmaydi. Bundan tashqari, biz tau fibrillalarida odatda fibrillar morfologiyalari bilan bog'liq bo'lmagan antiparallel beta varaqlari bo'lishi mumkinligini ko'rsatamiz.

Vaqt o'tishi bilan fibrillalarning strukturaviy evolyutsiyasini tushunish uchun biz fibrillalarni agregatsiyaning turli nuqtalarida, xususan 3, 5, 10 va 15 kunlik yig'ilishdan keyin tekshirdik. Har bir o'lchov uchun alikvotlar oltin substratlarga yotqizilgan va azot ostida quritilgan. 37 daraja inkubatsiyadan keyin 3 kunlik tau fibrillalarining AFM topografik tasvirlari 2-rasmda ko'rsatilgan. 2A-rasmda vakillik fibrillalari klasteri ko'rsatilgan. Turli agregatsiya bosqichlarida individual fibrillalarning koʻproq AFM tasvirlari S1-S5-rasmda koʻrsatilgan. Namunadagi fibrillalarning umumiy balandligi taqsimotini olish uchun individual fibrillalarning balandlik qiymatlari o'lchandi va gistogramma sifatida chizildi (2B-rasm). 6,3 ± 0 .7 nm o'rtacha balandlik qiymatini aniqlash uchun ma'lumotlar Gauss bilan jihozlangan. 5-Kunlik fibrillalarning AFM tasvirlari va mos keladigan balandlik tahlili 2C-D-rasmda ko'rsatilgan. Fibril klasterlari bilan birga individual fibrillalar kuzatiladi. Fibrillalarning balandligi 6,5±0,9 nm ni tashkil qiladi, bu 3- kunlik fibrilla namunasiga yaqin qoladi.

Keyinchalik, {0}} kunlik inkubatsiyaga ega tau fibrillalari tekshirildi (2E-F-rasm). Oltin yuzasida alohida fibrillalar kuzatilgan (2E-rasm). 10-kun fibrillalarining oʻrtacha balandligi 7,2±1,0 nm. 15 kunlik agregatsiyadan keyin hosil bo'lgan etuk tau fibrillalari 2G-rasmda ko'rsatilgan. 15-kun fibrillalari uzun va bir-biri bilan chigallashgan boʻlib, tarmoqqa oʻxshash morfologiya hosil qiladi. Agregatsiyaning ushbu bosqichida alohida fibrillalar endi ko'rinmaydi. Fibrillaning o'rtacha balandligi 42,5 ± 40,5 nm (2H-rasm) oldingi vaqt nuqtalarida hosil bo'lgan boshqa fibrillalarga nisbatan sezilarli darajada yuqori. Fibrillalar balandligining keng taqsimlanishi, etuk fibrillalar oldingi fibrillalarning tor taqsimlanishidan farqli o'laroq, turli balandlik qiymatlariga ega ekanligini ko'rsatadi. Bu yerda kuzatilgan fibrillyar tuzilmalar tau agregatsiyasi haqidagi oldingi AFM hisobotlariga mos keladi11, 39-40. AFM o'lchovlaridan yana bir muhim kuzatuv shundan iboratki, eritmada hosil bo'lgan tau fibrillalari morfologiyasida bir hildir.

Ular to'g'ri bo'lib, hech qanday shoxlangan yoki burmalangan konformatsiyalarga ega emas, bir fibrilla ichida minimal balandlik o'zgaradi. Fibrillarning pishib etishi bilan biz fibril balandligining oshishini ko'ramiz, ammo yangi morfologiyalar rivojlanmaydi. Buni S5-rasmda ko'rsatish mumkin, bu erda 3-kun va 10- kunlik fibrilla morfologiyalari kamalak rangli xaritada ko'rsatilgan bo'lib, ular bir fibrilla ichida minimal balandlik o'zgarishlariga ega ekanligini ko'rsatadi. Fibrillalar sezilarli morfologik farqlarni ko'rsatmasa-da, fibrillalarning nano o'lchovli IQ spektrlari sezilarli farqlarni o'z ichiga oladi.

Xususan, 3-kun fibrillalari uchun biz turli spektrlarga ega uchta turli fibrilla polimorfini kuzatamiz. 5-kun, 10-kun va 15-kunlik pishgan fibrillalar uchun biz faqat bitta konformatsiyani kuzatamiz. Biz shuni ta'kidlaymizki, odatda polimorfizm molekulyar tuzilishga nisbatan ham har xil bo'lishi mumkin bo'lgan morfologik jihatdan ajralib turadigan fibrillalarni bildirish uchun ishlatiladi2, 26; bizning holatlarimizda morfologiya o'zgarmasdir, ammo tolalar spektrlari bo'yicha uchta alohida kichik turga bo'linishi mumkin. Aniqlik uchun biz ushbu tuzilmalarni/polimorflarni ushbu maqolaning qolgan qismida mos ravishda 1-toifa, 2-toifa va 3-toifa sifatida ko'rib chiqamiz. Amid-I diapazonidagi vakillik infraqizil spektrlari 3-rasmda ko'rsatilgan. Spektrlar fibrillalar uzunligi bo'ylab olingan bir nechta o'lchovlarning o'rtacha qiymatidir. Qo'shimcha spektrlar Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumotlarda keltirilgan (S6-rasm). 3-Kunlik fibrilla turi-1 spektri ~1628sm−1 da sezilarli choʻqqi va ~1670sm−1 da kichikroq yelkadan iborat.

Bundan tashqari, zaif chiziq ~1740 sm-1 da ko'rish mumkin. Fibrilla turi-2 spektri sezilarli darajada farq qiladi va markazi ~1650 sm-1 da joylashgan kengaygan assimetrik amid-I bandini o'z ichiga oladi. 1700 sm−1 dan yuqori sezilarli intensivlik kuzatilmaydi. Fibrilla turi-3 uchun biz -2 turiga juda o'xshash amid-I spektrini kuzatamiz, bitta asosiy istisno: ~1738 sm-1 da sezilarli chiziq mavjudligi. Shunisi qiziqki, fibril spektrlari, polimorf turidan tashqari, ~1630cm−1 boʻlgan beta-varaq chastotalarida keskin choʻqqisini oʻz ichiga olmaydi, garchi fibrillar agregatlari roʻyxatga olingan parallel beta ekanligi maʼlum boʻlsa ham. varaqlar. 2 va 3 turdagi fibrillalar uchun kuzatilgan kengroq chiziq kengligi, beta varaq chastotalarida keskin cho'qqining yo'qligidan tashqari, tizimli buzilish mavjudligini ko'rsatadi.

Qizig'i shundaki, biz bitta fibrilla bo'ylab spektrlarda hech qanday katta farqni topmadik (S5-rasm), bu fibrillalar aniq belgilangan tuzilmalar ekanligini va ichki strukturaviy buzilishlarga ega ekanligini ko'rsatadi. Shu nuqtai nazardan shuni ta'kidlash kerakki, tolalar bo'ylab spektrlarda o'zgarishlar mavjud, xususan, -3 tipdagi fibrillalar uchun bu kattaroq spektral standart og'ish bilan tasdiqlanadi (3-rasm). Biroq, fibrilning uchta kichik turi o'rtasidagi asosiy farq 1628sm-1 va 1738sm-1 da bantlarning intensivligi jihatidandir. Yuqorida qayd etilgan o'zgarishlar fibrillalarni bir yoki boshqa kichik tipga tasniflashga ta'sir qilmaydi.

5-kun, 10-kun va 15-kunlik etuk fibrillalar spektral heterojenlikni ko'rsatmaydi va har bir holat uchun bitta polimorf kuzatiladi (3-rasm). 5-Kunlik fibrilla spektri 2-toifa va 3-turdagi fibrillalar bilan solishtirganda yuqoriroq toʻlqin raqamlariga biroz siljiydi (~6sm−1) hamda chiziq kengligining ortib borishini koʻrsatadi. 10-Kunlik va 15- kunlik pishgan fibrillalar 2-turdagi fibrillalarnikiga oʻxshash spektrlarga ega boʻlib, ikkinchisi ~4cm−1 ga yuqori toʻlqin raqamlariga oʻtadi. Barcha 5-kun, 10-va 15-kun fibrillalari 1700 sm dan yuqori aniq choʻqqiga ega emas-1.

Fibrilla spektrlaridan asosiy tushuncha shundan iboratki, etilishning dastlabki bosqichlarida fibrillalar tuzilishida sezilarli heterojenlik bo'lishi mumkin va pishib bo'lgach, fibrillalar yagona tuzilishga aylanadi. Biroq, faqat spektrlarni tekshirishdan kelib chiqqan holda, asosiy tarkibiy o'zgarishlarni aniq tushunish qiyin. Shu sababli, kuzatilgan polimorflar orasidagi spektral va strukturaviy o'zgarishlar haqida qo'shimcha ma'lumotga ega bo'lish uchun spektrlar spektral moslama orqali dekonvolyutsiya qilindi. Proteinlarning amid I spektrlari odatda turli ikkilamchi tuzilmalarning hissalarini o'z ichiga oladi41-42.

Kuzatilgan spektrlarning har biriga hissa qo'shadigan ikkilamchi struktura apriori aniq ma'lum emasligi sababli, biz tepaliklar sonini aniqlash uchun ikkinchi hosila spektriga murojaat qildik (S8-rasm). Asosiy cho'qqilarni aniqlash uchun spektral ma'lumotlarning ikkinchi hosilasidan foydalanish spektroskopiyaning mashhur amaliyotidir43-44. Biz ikkinchi hosilaviy spektrdagi tepaliklar sonini va ularning mos keladigan chastotalarini spektral moslashtirish uchun boshlang'ich nuqta sifatida ishlatdik. 3-kun, 5-kun, 10-kun va 15-kunlik etuk fibrillalarning oʻrtacha spektrlari uchun mos natijalar 4A-F-rasmda koʻrsatilgan. O'rnatilgan cho'qqilarning umumiy spektrlarga foiz hissasi 4G-L-rasmda ko'rsatilgan. Spektrlar maksimal intensivlikka normallashtiriladi, ammo bu ma'lum bir spektr uchun har bir kichik diapazonni teng ravishda o'lchaydi. Shunday qilib, 4G-L rasmlarida ko'rsatilganidek, bantlarning nisbiy populyatsiyalari normalizatsiyaga ta'sir qilmaydi. Moslash parametrlari 1-jadvalda keltirilgan.

Kunlik fibrillalar-1 3- uchun uchta Gauss diapazoni ikkala spektrga ham yuqori aniqlik bilan mos keladi, markaz chastotalari 1628sm−1, 1659sm−1 va 1670sm−1. Kunlik fibril spektri turi{7}} beshta asosiy diapazonga mos keladi, chastotalari 1626sm−1, 1642sm−1, 1662sm−1, 1680sm−1 va 1694sm−1. Spektral o'xshashlikdan kutilganidek, -3 fibrilla turi bir xil beshta bandga to'g'ri keladi, lekin 1736 sm-1 da qo'shimcha cho'qqilikni talab qiladi. Spektral dekonvolyutsiya tahlilini yanada etuk fibrillalargacha kengaytirsak, biz 5-kun, 10- va 15- kunlik fibrillalarning barchasi ikkilamchi tuzilmalarning bir xil taqsimlanishini ko‘ramiz. 5-kun, 10- va 15- kunlik fibril spektrlari optimal moslashish uchun oltita diapazonni talab qiladi, bunda yuqori to‘lqinlar sonining cho‘qqisi ~1725 sm−1 ga o‘tadi, qolgan beshta cho‘qqi esa: turiga o'xshash-2 fibrillalar.

Barcha mosliklardagi 1626-1628sm−1 choʻqqisi beta-varaqlar bilan bogʻliq boʻlishi mumkin, bu barcha fibrillar polimorflar beta-varaq strukturasini oʻz ichiga olishini koʻrsatadi28, 30, 41-42. 1642sm-1 choʻqqisi odatda tasodifiy oʻramlardan hosil boʻladi, ~1660cm−1 va 1682cm−1 choʻqqilari esa odatda beta-burilishlarga tayinlanadi 41-42. Birgalikda olingan spektral dekonvolyutsiya, kamolotga erishgandan so'ng, fibrillalar tuzilishida ko'proq tartibsizliklar mavjudligini ko'rsatadi, bu beta-varaq cho'qqisiga nisbatan tasodifiy lasan cho'qqisining oshishi bilan tasdiqlanadi. Beta-burilishlarning mavjudligi va ularning nisbiy o'sishi, 1660cm-1 o'rnatilgan cho'qqining intensivligi bilan tasdiqlanadi, fibrillalarning kutilgan o'zaro faoliyat beta tuzilishiga mos keladi. ~1694cm−1 va ~1725cm−1 da bantlarning mavjudligi biroz kutilmagan. Birinchisi, odatda, antiparallel beta varaqlar41-42, 45 bilan bog'liq va beta amiloid45-46 va alfa-sinuklein oligomerlarida kuzatilgan38. Antiparallel beta-varaq tuzilmalari oligomerik amiloid birikmalari uchun ma'lum bo'lsa-da, ularning fibrillalarda mavjudligi kamdan-kam hollarda kuzatilgan. 2D IR tadqiqotlari sinuklein fibrillalarida antiparallel beta-varaq imzolarini aniqladi47; beta-amiloidning o'ziga xos mutantlari ham antiparallel beta-varaq tuzilishini namoyish etadi47. Bizning natijalarimiz, bizning ma'lumotlarimiz bo'yicha, tau agregatlari uchun antiparallel beta varaqlarining birinchi kuzatuvidir. Antiparallel beta-varaqning cho'qqisi-1 polimorf turida sezilarli darajada yo'q. Bu shuni ko'rsatadiki, fibrillalar qat'iy yaxshi tartiblangan tuzilmani (polimorf turi-1) qabul qilishi mumkin, bu asosan parallel beta-varaqlardir, lekin strukturaviy moslashuvchanlikning kuchayishi va/yoki buzilish antiparallel beta varaqlarining shakllanishiga olib kelishi mumkin.

Ammo shuni ta'kidlash kerakki, ~1626cm−1 cho'qqisi odatda parallel va antiparallel beta-varaqlar o'rtasida sezilarli darajada siljimaydi. Shunday qilib, bizning natijalarimiz ~ 1694 sm-1 cho'qqisi kuzatilgan har qanday fibrillada parallel beta-varaqlar paydo bo'lishini istisno qilmaydi. ~1725cm−1 dagi choʻqqi amidning orqa miya tebranishi bilan bogʻliq boʻlishi mumkin emas va, ehtimol, yon zanjirli karboksilik kislotalarning COOH choʻzilishidan kelib chiqadi41-42. Pinto va uning hamkasblari tomonidan olib borilgan so'nggi ishlar gibrid kvant/klassik hisoblash usullari48 yordamida aspartik kislotaning COOH guruhining karbonil diapazoni IR spektrini hisoblash strategiyalarini namoyish etdi. Ularning topilmalari shuni ko'rsatdiki, protonlangan yon zanjir 1700-1780 sm-1 mintaqasida paydo bo'ladi va 5-10 sm-1 chastotali siljish yon zanjir va zanjir o'rtasidagi o'zaro ta'sir uchun zond sifatida ishlatilishi mumkin. orqa miya. Tau 441 peptidlar ketma-ketligida bir nechta karboksilik kislotalar, jumladan, mikrotubulalar bilan bog'lovchi takroriy domenlar mavjud bo'lib, ular beta-varaqlarni shakllantirishga yuqori moyilligi ko'rsatilgan5-6.

Boshqa amiloid agregatlarining AFM-IR o'lchovlari karboksilik kislotalar bilan bog'liq bo'lgan o'xshash cho'qqilarni36 aniqladi. Biroq, bu karboksilik kislota tasmasi ba'zi fibrillalarda boshqalarga qaraganda ko'proq namoyon bo'ladi: uning umumiy cho'qqiga qo'shgan hissasi faqat -3 3-kun fibrillasi va 5- kunlik fibrilla uchun muhimroqdir. Shakl 4. Infraqizil spektroskopiyada tartiblangan tuzilmalarda dipolyar moslashish ko'pincha yutilish zonalarining intensivligini oshirishga olib keladi; Tegishli misol - tartibsiz peptidlardan tartiblangan beta-varaqlarning hosil bo'lishi, bu ~ 1625 sm-1 da o'tkir intensiv chiziqlarga olib keladi. Shunday qilib, kuchli karboksilik kislota bantlarining mavjudligi, ehtimol, glutamik va aspartik kislota yon zanjirlarining tizimli tartibidan kelib chiqadi. Biroq, tau-446 tarkibida bir nechta karboksilat yon zanjirlari mavjud va ularning o'ziga xos molekulyar o'zaro ta'siri va yo'nalishi bu erda kuzatilgan tuzilmalar uchun aniq ma'lum emas.

Bundan tashqari, AFM-IR spektrlaridagi intensivlik FTIR32-33 ga mutanosibdir, ammo karboksilik kislota tebranishlari uchun AFM-IR va FTIR o'rtasidagi raqamli korrelyatsiya faktori haqida xabar berilmagan. Shunday qilib, eng yuqori intensivlikni o'ziga xos karboksilik yon zanjirlar bilan bog'lash uchun AFM-IR reaktsiyasining nazariy hisob-kitoblari/mulohazalari kerak bo'ladi, bu ish doirasidan tashqarida. Shu nuqtai nazardan shuni ham ta'kidlash kerakki, AFM-IR o'lchovlari eritmada olingan izotrop infraqizil spektrlardan farq qiladi va AFM-IRda o'lchangan spektrlar lazer polarizatsiyasi va yorug'lik konfiguratsiyasining konvolyutsiyasidir49-50. Shu sababli, bu cho'qqining strukturaviy asoslarini aniq aniqlash qiyin va ularning aniq kelib chiqishini aniqlash uchun ko'proq tadqiqotlar talab etiladi. Kelgusi ishimizda buni hal qilishni maqsad qilganmiz.

Tau izomerlarining in vitro agregatsiyasi batafsil o'rganildi; ammo, erta va/yoki vaqtinchalik oraliq mahsulotlarning tuzilishi unchalik yaxshi ma'lum emas. Amiloid oqsillari agregatsiyasidagi oligomerik turlar fibril hosil bo'lish yo'lida yoki undan tashqarida ekanligi aniqlangan. Fibrillalar agregatsiyaning so'nggi nuqtasi ekanligiga ishonishganligi sababli, fibrilla tuzilmalari, shu jumladan ularning turli xil polimorflari odatda vaqtinchalik yoki yo'ldan tashqarida deb hisoblanmaydi. Fibrillar strukturasidagi heterojenlik mavjudligi ma'lum, lekin morfologik o'zgarishlar bilan bir vaqtda namoyon bo'lishi ma'lum2, 8, 26, 51. Bizning natijalarimiz noyobdir, chunki ular fibrillalarning ikkilamchi tuzilishidagi o'zgarishlarni ko'rsatadi, hatto morfologik farqlar sezilmaydi. . Biz shuni ta'kidlaymizki, -1 fibrilla turidan tashqari, barcha fibrillar spektrlari bir xil asosiy chiziqlar to'plamini o'z ichiga oladi, bu -1 fibrilla turi pirovardida etuklik bilan tuzilmaviy qayta tashkil etilishini boshdan kechiradigan vaqtinchalik oraliq mahsulot ekanligini ko'rsatadi. Yana bir imkoniyat shundaki, bu tartiblangan parallel beta-varaq polimorflari "yo'ldan tashqari" strukturani ifodalaydi, u "yo'lda" fibrillalarga qayta integratsiya qilish uchun monomerik yoki prefibrilyar agregatlarga parchalanishi kerak. Biz o'rganilgan namunalarda fibrillar bo'lmagan konlarning sezilarli mavjudligini topmadik; ammo, mavjud bo'lganlar tartibsiz fibrillalarga ko'proq o'xshash spektrga ega (S9-rasm). Bu yo'ldan tashqari gipotezaga mos keladi va shuning uchun kuzatilgan boshqa 3-kunlik polimorflarni yo'lda agregatlar sifatida ko'rish mumkinligini ko'rsatadi.

Ammo shuni ta'kidlash kerakki, bu erda keltirilgan fibril spektrlari tau agregatsiyasi paytida ustun bo'lgan butun konformatsiya ansamblini qamrab olmaydi. Erta bosqichdagi agregatlarning etuk fibrillalarga strukturaviy evolyutsiyasini aniq tushuntirish uchun agregatsiya kinetikasini batafsilroq tahlil qilish kerak, biz kelajakda hal qilishni maqsad qilganmiz. AFM-IR tomonidan qo'llanilgan boshqa qiziqarli kuzatuv - bu etuk fibrillalarda antiparallel beta varaqlarini aniqlash. Ko'pgina tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, erta bosqichdagi amiloid agregatlari antiparallel tuzilishga ega bo'lishi mumkin, ular etuk agregatlarda parallel beta-varaq sekbeta-varaqqa aylanadi. Biz qarama-qarshi tendentsiyani kuzatamiz: erta bosqich agregatlari tartiblangan parallel beta-varaqlarni o'z ichiga olishi mumkin, ko'proq etuk fibrillalar esa mos keladigan cho'qqining nisbiy populyatsiyalari bilan tasdiqlanadigan antiparallel beta-varaq beta-varaqlarini o'z ichiga oladi (4G-L-rasm).

Xulosa qilib aytganda, biz nano miqyosli AFM-IR spektroskopiyasi yordamida tau fibrillalari, ayniqsa agregatsiyaning dastlabki bosqichlarida sezilarli strukturaviy o'zgarishlarga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatdik. Heterojenlik o'xshash morfologiyaga ega, ammo ikkinchi darajali tuzilishga ega bo'lgan strukturaviy jihatdan farq qiluvchi polimorflar shaklida namoyon bo'ladi. Xususan, biz erta bosqichdagi fibrillalarda vaqtinchalik tartiblangan parallel beta-sheebeta-varag'ini aniqlaymiz, ular pishib bo'lgach, antiparallel beta varaqlarini o'z ichiga olgan yanada tartibsiz fibrilla tuzilishiga aylanadi. Ushbu natijalar spektroskopiyani AFM kabi fazoviy hal qilingan texnika bilan birlashtirish zarurligini ta'kidlaydi, chunki FTIR kabi fazoviy o'rtacha usullardan bu aniqlikni aniqlab bo'lmaydi. Ushbu tadqiqotda tasvirlangan eksperimental natijalar shuni ko'rsatadiki, tau fibrillyar agregatlari heterojendir va kelajakdagi ishlar ushbu polimorflar turli agregatsiya sharoitlarida va miya lizatlaridan urug'langan agregatsiyada davom etishi yoki turli tauopatiyalar kontekstidagi ahamiyatini tushunish uchun ko'rib chiqiladi.

Qo'shimcha material

Qo'shimcha materiallar uchun PubMed Central veb-versiyasiga qarang.

MAQDOR

Ushbu ish Milliy Sog'liqni saqlash institutlari tomonidan qo'llab-quvvatlandi (AG'ga 1 R35 GM138162 mukofoti).

ADABIYOTLAR

1. Shimić G; Babić Leko M; Wray S; Xarrington C; Delalle I; Yovanov-Milosevich N; Bažadona D; Buée L; de Silva R; Di Giovanni G; Wischik C; Altsgeymer kasalligi va boshqa tauopatiyalarda Hof PR Tau oqsilining giperfosforilatsiyasi va agregatsiyasi va mumkin bo'lgan neyroprotektiv strategiyalar. Biomolekulalar 2016, 6 (1), 6-6. [PubMed: 26751493]

2. Li D; Liu C Neyrodegenerativ kasallikda amiloid polimorflarini ierarxik kimyoviy aniqlash. Tabiatning kimyoviy biologiyasi 2021, 17 (3), 237–245. [PubMed: 33432239]

3. Kametani F; Hasegawa M Altsgeymer kasalligida amiloid gipotezasi va Tau gipotezasini qayta ko'rib chiqish. Neuroscience in Frontiers 2018, 12 (25).

4. Iadanza MG; Jekson deputat; Hewitt EW; Ranson NA; Radford SE Amiloid tuzilmalari va kasalliklarni tushunish uchun yangi davr. Tabiat sharhlari Molekulyar hujayra biologiyasi 2018, 19 (12), 755–773. [PubMed: 30237470]

5. Ballatore C; Li VMY; Trojanowski JQ Tau vositachiligida Altsgeymer kasalligi va shunga o'xshash kasalliklarda neyrodegeneratsiya. Nature Reviews Neuroscience 2007, 8 (9), 663–672. [PubMed: 17684513]

6. Kolarova M; Garc; #00ED; a-Syerra F; Bartos A; Rikni J; Ripova D Altsgeymer kasalligida Tau oqsilining tuzilishi va patologiyasi. Altsgeymer kasalligi xalqaro jurnali 2012, 2012, 13.

7. Tapiola T; Alafuzof I; Herukka SK; Parkkinen L; Hartikainen P; Soininen H; Pirttilä T miya omurilik suyuqligi - Amiloid 42 va Tau oqsillari miyadagi Altsgeymer tipidagi patologik o'zgarishlarning biomarkerlari sifatida. JAMA Nevrologiya 2009, 66 (3), 382-389.

8. Mukrasch MD; Bibow S; Korukottu J; Jeganathan S; Biernat J; Grisinger C; Mandelkow E; Zweckstetter M 441-Bir qoldiq ruxsatida Tau qoldig'ining strukturaviy polimorfizmi. PLOS Biology 2009, 7 (2), e1000034.

9. Sheres SHW; Chjan V; Falcon B; Goedert M Tau filamentlarining Cryo-EM tuzilmalari. Strukturaviy biologiya boʻyicha joriy fikr 2020, 64, 17–25. [PubMed: 32603876]

10. Fitzpatrik AWP; Falcon B; U S; Murzin AG; Murshudov G; Garringer HJ; Crowther RA; Ghetti B; Goedert M; Scheres SHW Altsgeymer kasalligidan tau filamentlarining Cryo-EM tuzilmalari. Tabiat 2017, 547 (7662), 185–190. [PubMed: 28678775]

11. Makki A; Bousset L; Madiona K; Melki R atom kuchi mikroskopiyasini ko'rish va oltita Tau izoform yig'ilishlarining nanomexanik xususiyatlari. Biofizika jurnali 2020, 119 (12), 2497–2507. [PubMed: 33217380]

12. Metrik MA; Ferreira NDC; Saijo E; Kraus A; Nyuell K; Zanusso G; Vendruskolo M; Ghetti B; Altsgeymer va Pik kasalliklarining tau agregatlarini aniqlash va diskriminatsiya qilish uchun Caughey BA yagona ultrasensitiv tahlili. Acta Neuropathologica Communications 2020, 8 (1), 22. [PubMed: 32087764]

13. Haili Z; Meng SR; Fan JB; Chen J; Liang Y Inson Tau fibrilizatsiyasi uning-330 va uning-362 bilan o'zaro ta'siri orqali qo'rg'oshin ta'sirida tezlashadi. PloS one 2011, 6, e25020. [PubMed: 21966400]

14. Fon Bergen M; Barghorn S; Li L; Marks A; Biernat J; Frontotemporal demansdagi Tau oqsilining Mandelkow EM mutatsiyalari mahalliy tuzilmani kuchaytirish orqali juftlashgan spiral filamentlarning agregatsiyasiga yordam beradi. Biologik kimyo jurnali 2002, 276, 48165–74.

15. Ayoz B; Ollesch J; Ville H; Olmos MI Shablonli konformatsiya o'zgarishi bilan ko'rsatilgan yovvoyi tipdagi Tau fibrillalarining konformatsion xilma-xilligi. Biologik kimyo jurnali 2009, 284 (6), 3546–3551.

16. Lyu V; Hu X; Chjou L; Tu Y; Shi S; Rutenium (II) kompleksli iskala bilan konjugatsiyalangan kurkumin tomonidan Tau agregatsiyasining molekulyar ingibitoriga Yao T yo'nalishidan ilhomlangan istiqbol. Fizikaviy kimyo jurnali B 2020, 124 (12), 2343–2353. [PubMed: 32130010]

17. Prokopovich DV; Whittaker JW; Muthee MM; Ahmad A; Larini L. Fosforlanish va psevdofosforillanishning mikrotubula bilan bog'liq bo'lgan protein Tau agregatsiyasining dastlabki bosqichlariga ta'siri. Fizikaviy kimyo jurnali B 2017, 121 (9), 2095–2103. [PubMed: 28218850]

18. Arya S; Ganguli P; Arsiccio A; Klod SL; Trapp B; Schonfeld GE; Liu X; Lazar Cantrell K; Shea JE; Bowers MT amiloidogen tau fragmentining terminalini yopish uning fibrilatsiyaga moyilligini modulyatsiya qiladi. Fizikaviy kimyo jurnali B 2020, 124 (40), 8772–8783. [PubMed: 32816481]

19. Rojas AV; Maisuradze GG; Scheraga HA Tau va A peptidli aralash agregatlarning hosil bo'lishining A ning N-terminal mintaqasining ikkilamchi tuzilishiga bog'liqligi. Fizikaviy kimyo jurnali B 2018, 122 (28), 7049–7056. [PubMed: 29940109]

20. Qi R; Luo Y; Vey G; Nusinov R; Ma BA "Uzilishi-va-qadoqlash" o'zaro ekish mexanizmi Tau oqsili agregatsiyasini qo'zg'atishi mumkin. Fizikaviy kimyo maktublari jurnali 2015, 6 (16), 3276–3282.

21. TD qiling; Economou NJ; Chamas A; Buratto SK; Shea JE; Bowers MT Amiloid va Tau fragmentlari o'rtasidagi o'zaro ta'sir aberrant agregatlarni rag'batlantiradi: amiloid toksikligi uchun ta'sir. Fizikaviy kimyo jurnali B 2014, 118 (38), 11220–11230. [PubMed: 25153942]

22. Buée L; Bussière T; Bué-Scherrer V; Delacourte A; Hof PR Tau oqsili izoformlari, fosforillanish va neyrodegenerativ kasalliklardagi roli. Miya tadqiqotlari sharhlari 2000, 33 (1), 95-130. [PubMed: 10967355]

23. Luo Y; Ma B; Nusinov R; Wei G Tau oqsilining ichki buzuq xulq-atvori, o'z-o'zini atsetilatsiya faoliyati va agregatsiya paradoksiga strukturaviy tushuncha. Fizikaviy kimyo maktublari jurnali 2014, 5 (17), 3026–3031. [PubMed: 25206938]

24. Dong X; Bera S; Qiao Q; Tang Y; Lao Z; Luo Y; Gazit E; Wei G suyuqlik-suyuq fazali Tau oqsilining ajratilishi monomerik darajada kodlangan. Fizikaviy kimyo maktublari jurnali 2021, 12 (10), 2576–2586. [PubMed: 33686854]

25. Goux WJ; Kopplin L; Nguyen AD; Oqish K; Rutkofskiy M; Shanmugandam VD; Sharma D; Inouye H; Kirschner DA Qisqa Tau peptidlaridan to'g'ridan-to'g'ri va o'ralgan filamentlarning shakllanishi. Biologik kimyo jurnali 2004, 279 (26), 26868–26875.

26. Fändrich M; Nyström S; Nilsson KPR; Böckmann A; LeVine H 3; Hammarström P Amiloid fibril polimorfizmi: molekulyar ko'rish va terapiya uchun qiyinchilik. J Intern Med 2018, 283 (3), 218-237. [PubMed: 29360284]

27. Härd T amiloid fibrillalari: hosil bo'lish, polimorfizm va inhibisyon. Fizikaviy kimyo maktublari jurnali 2014, 5 (3), 607–614. [PubMed: 26276617]

28. Martial B; Lefèvre T; Auger M Protein fragmentlari yordamida amiloid fibril shakllanishini tushunish: tebranish spektroskopiyasi va qattiq holatdagi NMR orqali tizimli tadqiqotlar. Biophys Rev 2018, 10 (4), 1133–1149. [PubMed: 29855812]

29. Eyzenberg DS; Sawaya MR Molekulyar darajada amiloid oqsillarining strukturaviy tadqiqotlari. Biokimyoning yillik sharhi 2017, 86 (1), 69–95.

30. Moran SD; Zanni MT Infraqizil spektroskopiyadan amiloid tuzilishi va shakllanishi haqida qanday ma'lumot olish mumkin. Fizikaviy kimyo maktublari jurnali 2014, 5 (11), 1984–1993. [PubMed: 24932380]

31. Amiloid fibril tuzilishini Tycko R qattiq holatdagi NMR tadqiqotlari. Fizikaviy kimyoning yillik sharhi 2011, 62 (1), 279–299.

32. Dazzi A; Prater CB AFM-IR: Nano o'lchovli infraqizil spektroskopiya va kimyoviy tasvirlashda texnologiya va ilovalar. Kimyoviy sharhlar 2017, 117 (7), 5146–5173. [PubMed: 27958707]

33. Dazzi A; Prater CB; Hu Q; Chase DB; Rabolt JF; Markott C AFM-IR: Atom kuchlari mikroskopiyasi va infraqizil spektroskopiyani nano o'lchovli kimyoviy tavsiflash uchun birlashtirish. Ilova. Spektr. 2012, 66 (12), 1365. [PubMed: 23231899]

For more information:1950477648nn@gmail.com