Genni klonlash, funktsional identifikatsiya qilish, Cistanche Tubulosa dan saxaroza sintazasining strukturaviy va ekspressiv tahlili Ⅱ

Natijalar va tahlillar

1 Cistanche tubulosada saxaroza sintaza genlarini qazib olish va CtSus genini klonlash

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>havo qismi.

Erkaklar salomatligi uchun yuqori sifatli Cistanche Tubulosa

Shuning uchun, Cistanche tubulosa ning turli qismlarining transkriptom ma'lumotlarida dastlabki skriningda olingan ikkita nomzod sukroz sintaza genlarining ifoda darajasining FPKM qiymatlari Z-Score bilan normallashtirildi va differentsial tahlil o'tkazildi (1A-rasm). Natijalar shuni ko'rsatdiki, CtSus geni gaustoriumda eng yuqori ifoda darajasiga ega va er osti qismidagi ifoda darajasi havo qismidagiga qaraganda yuqori bo'lgan, bu Cistanche tubulosa turli qismlarida glikozid birikmalarining to'planish tartibiga mos keladi, gaustoriumda CtSus1 genining ifoda darajasi past edi. Shuning uchun, yuqoridagi natijalarga asoslanib, CtSus geni keyingi ketma-ketlikni kuchaytirish, ekzogen ekspressiya va funktsional identifikatsiya qilish uchun tanlangan. Shablon sifatida Cistanche tubulosa cDNA dan foydalanib, PCR kuchaytirilgandan so'ng ~ 2500 bp da bitta tarmoqli mahsulot olindi (1B-rasm). PCR mahsuloti jeldan olingan va klonlash vektoriga bog'langan va maqsadli genning to'liq uzunlikdagi kodlash hududi ketma-ketlik bilan olingan. CtSus ketma-ketligining uzunligi 2418 bp edi.

1-rasm C. tubulosa dan CtSus genini o'rganish va klonlash va uning kodlangan oqsilini bioinformatik tahlil qilish. Javob: C. tubulosanormalizatsiya qilingan turli qismlarida CtSus va CtSus1 genlarining ifoda darajalari, ularning FPKM qiymatlari asosida Z-Scores sifatida normallashtirilgan; B: CtSus genini kuchaytirish; M: DNK markeri;C: SMART tomonidan bashorat qilingan CtSus oqsilining konservativ domeni; D: Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum va Albuca bracteata kabi boshqa o'simliklardan aniqlangan CtSus va saxaroza sintazalarining bir nechta ketma-ketligi. Sukroz sintezi domeni va shakarni uzatish domeni mos ravishda qizil va ko'k qutilar bilan ifodalanadi; E: CtSus va boshqa o'simliklardan saxarozasintazalarning filogenetik tahlili; F: E. coli da pCold™ I vektoridan foydalangan holda CtSus ning geterologik ifodasini SDS-PAGE tahlili. 1-qator: Protein belgisi; 2-qator: Supernatant fraktsiyasi; 3-qator: yog'ingarchilik. Qizil o'q CtSus oqsilini ko'rsatadi. G: Ikkala rekombinant plazmidni o'z ichiga olgan bitta klonning koloniyasi PCR. M: DNK belgisi; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

2-jadval CtSus va boshqa o'simlikdan aniqlangan saxaroza sintazalari o'rtasidagi aminokislotalar ketma-ketligi o'xshashligi

2.3 Filogenetik tahlil

MEGA dasturiy ta'minoti tomonidan yaratilgan filogenetik daraxt Cistanche tubulosa dan CtSus saxaroza sintazasi va boshqa o'simlikdan olingan saxaroza sintazalari o'rtasidagi filogenetik munosabatlarni tahlil qilish uchun ishlatilgan. Natijalar 1E-rasmda ko'rsatilgan. O'simlikdan olingan saxaroza sintazalari dikotlarda (I va II mintaqalarda) va monokotlarda (III mintaqa) aniq evolyutsiya shoxlarini ko'rsatadi. CtSus ikki bargli novdada joylashgan bo'lib, CtSus bilan eng yaqin bog'liq bo'lgan ketma-ketliklar hammasi Lamiaceae o'simliklaridan (Cistanche tubulosa - Lamiaceae Orobanchaceae o'simligi), boshqa novda esa asosan Solanales o'simliklaridan iborat bo'lib, bu yuqori saqlanish va undan dalolat beradi. o'simliklar evolyutsiyasida bir xil tartibda o'simlikdan olingan saxaroza sintaza genlarining homologiyasi. Ular orasida Orobanchaceae o'simlikining Phelipanche ramosasidan olingan saxaroza sintaza PrSus (AEN79500.1) CtSus bilan eng yaqin bog'liqdir.

3 CtSusning ekzogen ifodasi va faolligi tahlili

3.1 CtSus genining ekzogen ekspressiyasi Sekvensiyalash orqali tasdiqlangan pET{2}}a-CtSus, pET-24b-CtSus va pCold™ I-CtSus plazmidlari vakolatli E. coli Transetta (DE3) ifodasiga o‘tkazildi, va musbat klonlar ketma-ketlikni tekshirish uchun koloniya PCR orqali tekshirildi. Olingan rekombinant ekspresyon shtammlari oqsillarni ifodalash uchun IPTG past harorati bilan induktsiya qilindi, bakteriyalar santrifüjlash yo'li bilan yig'ildi va supernatant va cho'kma olish uchun bakteriyalarni sindirish uchun lizis buferi qo'shildi va aniqlash uchun SDS-PAGE bajarildi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, pET{9}}a va pET{10}}b ifoda vektorlari sifatida foydalanilganda, CtSus E. coli da ifodalanmagan, pCold™ I ifoda vektori sifatida ishlatilganda, aniq CtSus ~100 kDa mintaqasida rekombinant oqsil bandi aniqlandi, bu uning nazariy jihatdan bashorat qilingan nisbiy molekulyar massasi 92,2 kDa (1F-rasm) bilan mos edi.

3.2 Butun hujayra transformatsiyasi

CtSus ning katalitik funktsiyasini oldindan tekshirish uchun CtSus va UGT71BD1 glikoziltransferaza genining birgalikda ifodalangan shtammi yaratilgan. UGT71BD1 klonlangan va Cistanche tubulosa dan aniqlangan va feniletanoid glikozidlar, turli turdagi flavonoidlar, stilben va kumarin kabi aromatik birikmalarni retseptorlar sifatida keng qabul qila oladigan UDP-glyukoziltransferaza bo'lib, fenolik gidroksidli substratdan foydalangan holda UDP-glyukozil guruhining glyukozillanish reaktsiyasini katalizlaydi. shakar donori sifatida [18]. CtSus ning kiritilishi nazariy jihatdan UGT71BD1 tomonidan katalizlangan glyukozillanish reaktsiyasi uchun etarli darajada glikosil donor UDP-glyukoza bilan ta'minlashi mumkin va shu bilan reaksiya muvozanatining glikozillanish mahsulotlari hosil bo'lishi tomon harakatlanishiga yordam beradi va shu bilan glikozillanish mahsulotlarining hosildorligini oshiradi. pCold™ I-CtSus plazmidi va pET{12}}a-UGT71BD1 plazmidi bir vaqtning o'zida E. coli Transetta (DE3) ekspressiyasiga aylantirildi. Ikkala rekombinant plazmidni o'z ichiga olgan yagona klonlar koloniya PCR orqali skrining qilindi va ijobiy rekombinant ekspresyon shtammlari ketma-ketlikni tekshirish orqali olindi (1G-rasm). Ikki genning birgalikda ifodalanishi in vitro induktsiya qilindi va nazorat guruhi sifatida pET{19}}aUGT71BD1 yagona gen ekspresyon shtammi ishlatilgan. UDP-glyukoza donorining hosil bo'lishini katalizlashda CtSus faolligi oldindan butun hujayra transformatsiyasi bilan tasdiqlangan. HPLC va yuqori aniqlikdagi mass-spektrometriya natijalari shuni ko'rsatdiki, butun hujayra transformatsiyasi reaktsiyasi substrat sifatida akonitin 1 va resveratrol 2 bilan amalga oshirilganda, 2-rasmda ko'rsatilganidek, 24 soatlik transformatsiyadan keyin aniq glikozillanish mahsulotlarining paydo bo'lishi aniqlangan.

2-rasm UGT71BD1 yoki CtSus bilan bog'langan UGT71BD1 rekombinant shtammi bilan 1 yoki 2-substratning butun hujayrali biotransformatsiyasi. Javob: Substratning butun hujayrali biotransformatsiyasining HPLCxromatogrammalari 1. Aniqlash to'lqin uzunligi 360nm edi; B: 1a mahsulotining HRESI-MS va MS2 spektrlari; C: 2-substratning butun hujayrali biotransformatsiyasining HPLC xromatogrammalari; Aniqlash to'lqin uzunligi 330 nm edi. D: 2a va 2b mahsulotlarining HRESI-MS spektrlari

1 (m/z 179.034 4 [M+H]+ bo‘lganda, molekulyar formula C9H6O4) substrat sifatida ishlatilgan, mahsulot xromatografik cho'qqisi 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, taxmin qilingan molekulyar formula C15H16O9) 5,39 daqiqada aniqlangan, bu UV bilan mos edi. substrat va nazorat mahsulotining so'rilishi. Shu bilan birga, 1a ning MS2 spektrida m/z 179.033 4 [M+H]+ boʻlak choʻqqisi aniqlandi, bu 1a glyukoza molekulasini (162 Da) yoʻqotish natijasida hosil boʻldi, bu shuni koʻrsatadiki, 1a glyukoza molekulasi bilan bog'langan 1-substratning mahsuloti edi. Ayirboshlash darajasi tepalik maydonini birlashtirish orqali hisoblab chiqilgan. Glikozillangan mahsulot 1a hosil qilish uchun 1-substratni katalizlovchi UGT71BD1 butun hujayralarining konversiya tezligi 71,87% ni tashkil qilgani, CtSus qo'shilishi esa reaktsiyaning konversiya tezligini 95,84% ga, nazorat guruhidagidan 1,3 barobarga oshirganligi aniqlandi. Substrat 2- birikma (m/z 227.072 5 [MH]-, molekulyar formula C14H12O3) bo'lganda, mahsulot xromatografik cho'qqilari 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, taxmin qilingan molekulyar C20H22O8 formulasi) va 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, taxmin qilingan molekulyar formula C26H32O13) substrat va nazorat mahsulotining xarakterli UV yutilishiga mos ravishda mos ravishda 10,32 va 6,52 daqiqada aniqlandi. . Bir glyukoza molekulasining (162 Da) yo'qolishi natijasida hosil bo'lgan 3 [MH]-da fragment cho'qqisi aniqlandi, bu 2a bir glyukoza molekulasi bilan bog'langan substrat 2 mahsuloti ekanligini ko'rsatadi. Adabiyotdagi [18] ma'lumotlar va massa spektrometriyasini bashorat qilish ma'lumotlari bilan solishtirganda, 2b mahsuloti ikkita glyukoza molekulasi bilan bog'langan 2-substrat mahsuloti ekanligi aniqlandi. Konvertatsiya darajasi integral tepalik maydoni yordamida hisoblab chiqilgan. Aniqlanishicha, CtSus qo'shilishi 2-substratning glikozillanish reaktsiyasining konversiya tezligini 64,01% dan 78,51% gacha oshirishi mumkin, ular orasida monosaxarid mahsuloti 2a ning 45,09% dan 63,58% gacha ko'tarilishi va disaxarid mahsulotining chiqishi 2b. 18,92% dan 14,93% gacha o'zgardi.

3.3 CtSus rekombinant oqsilini tozalash va in vitro fermentativ faolligini aniqlash

Butun hujayra transformatsiyasi tajribasi natijalari shuni ko'rsatadiki, CtSus faol glyukoza donori UDP-glyukoza ishlab chiqarishni katalizlash faolligiga ega. Ushbu katalitik faollikni in vitro fermentativ katalitik reaktsiya orqali to'g'ridan-to'g'ri tekshirish uchun pCold™ ekspresyon tizimidagi CtSus genining termoyadroviy oqsili ajratildi va yaqinlik xromatografiyasi bilan tozalandi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, pCold™ I ifoda vektori sifatida ishlatilganda, rekombinant oqsil ko'p miqdorda, lekin asosan cho'kmada ifodalangan. Ekspressiya vektori sifatida pCold™ TF ishlatilganda, CtSus geni E. coli da katta miqdorda ifodalangan (3A-rasm). Birlashma oqsili HisTrap FF yaqinlik xromatografiyasi bilan tozalandi va in vitro fermentativ katalitik reaktsiyaga duchor bo'ldi. Natijalar 3B-rasmda ko'rsatilgan. Substrat sifatida sukroz va UDP ishlatilganda, salbiy nazorat guruhi bilan solishtirganda, yangi mahsulot cho'qqisi 10,32 daqiqada aniqlandi. Uning ushlab turish vaqti va UV singishi UDP-glyukoza bilan mos edi. Mahsulot standart bilan solishtirganda UDP-glyukoza ekanligi isbotlangan. Biroq, pCold™ TF ifoda vektori tomonidan ifodalangan termoyadroviy oqsil katta tetik omil eruvchan tegni o'z ichiga olganligi sababli (teg oqsilining hajmi 48 kDa), bu oqsilning katalitik faolligiga katta ta'sir qiladi. Shuning uchun termoyadroviy oqsil yorlig'i Factor Xa fermenti tomonidan qo'shimcha ravishda kesildi va ekzogen teglarsiz CtSus oqsili tozalandi (3A-rasm). Protein in vitro fermentativ katalizga duchor bo'ldi va natijalar UDP-glyukoza hosildorligi 3,53% dan 10,66% gacha ko'tarilganligini ko'rsatdi.

(3B-rasm). Yuqoridagi natijalar in vitro fermentativ kataliz orqali UDP-glyukoza ishlab chiqarishni katalizlashda CtSus faolligini tasdiqladi, shuningdek, katta yaqinlik yorlig'ining mavjudligi CtSus ning eruvchan ifodasi uchun qulay ekanligini ko'rsatdi, lekin u ham sezilarli darajada ta'sir qiladi. fermentning vitro katalitik faolligi.

3-rasm CtSusning heterologik ifodasi va funktsional identifikatsiyasi. Javob: CtSus oqsillarining SDS-PAGE tahlili. 1-qator: Protein belgisi; 2-qator: tetik faktorli rekombinant CtSus; 3-bo'lak: qizil o'q bilan belgilangan CtSus oqsilini berish uchun Faktor Xa proteaz yordamida faktor tegining ajralishini tetiklang. B: standart UDP-glyukoza bilan mos ravishda saxaroza va UDP ishtirokida UDP-glyukoza sintezini katalizlash uchun termoyadroviy oqsil va trigger omilsiz CtSus oqsillari yordamida invitro fermentativ tahlillar. Xuddi shu sharoitda qaynatilgan oqsil nazorat guruhi sifatida ishlatilgan. Aniqlash to'lqin uzunligi 260 nm edi