Sikloastragenol yordamida katepsin B ni nishonga olish MHC-I degradatsiyasini inhibe qilish orqali CD8 T hujayralarining o'smaga qarshi immunitetini oshiradi.

ANTRACT

FonPD-1/PD-L1 yo'lidan kelib chiqqan o'simta antijenlarining yo'qolishi va CD8 T hujayralarining kamayishi o'simta immunitetidan qochish uchun muhim omillardir. So'nggi yillarda o'smalarni davolashda an'anaviy xitoy tibbiyoti bo'yicha tadqiqotlar ortib bormoqda. Astragalus membranaceusdagi samarali faol molekula bo'lgan sikloastragenol (CAG) virusga qarshi, qarishga qarshi, yallig'lanishga qarshi va boshqa funktsiyalarga ega ekanligi aniqlandi. Biroq, uning antitumor ta'siri va mexanizmi aniq emas.

Sistanx glikozidi, shuningdek, yurak va jigar to'qimalarida SOD faolligini oshirishi va har bir to'qimalarda lipofusin va MDA tarkibini sezilarli darajada kamaytirishi, turli xil reaktiv kislorod radikallarini (OH-, H₂O₂ va boshqalar) samarali tozalash va DNKning shikastlanishidan himoya qilishi mumkin. OH-radikallar tomonidan. Cistanche feniletanoid glikozidlari erkin radikallarni kuchli tozalash qobiliyatiga ega, S vitaminiga qaraganda yuqori darajada kamaytirish qobiliyatiga ega, sperma suspenziyasida SOD faolligini yaxshilaydi, MDA tarkibini kamaytiradi va sperma membranasi funktsiyasiga ma'lum bir himoya ta'siriga ega. Cistanche polisaxaridlari D-galaktoza sabab bo'lgan eksperimental qarigan sichqonlarning eritrotsitlari va o'pka to'qimalarida SOD va GSH-Px faolligini oshirishi, shuningdek o'pka va plazmadagi MDA va kollagen miqdorini kamaytirishi va elastin miqdorini oshirishi mumkin. DPPHga yaxshi tozalash ta'siri, qarigan sichqonlarda gipoksiya vaqtini uzaytirish, sarumdagi SOD faolligini yaxshilash va eksperimental qarigan sichqonlarda o'pkaning fiziologik degeneratsiyasini kechiktirish Hujayra morfologik degeneratsiyasi bilan tajribalar Cistanche yaxshi antioksidant qobiliyatiga ega ekanligini ko'rsatdi. va terining qarish kasalliklarini oldini olish va davolash uchun dori bo'lish potentsialiga ega. Shu bilan birga, Cistanchedagi echinacoside DPPH erkin radikallarini tozalashning muhim qobiliyatiga ega va reaktiv kislorod turlarini tozalash va erkin radikallar keltirib chiqaradigan kollagen degradatsiyasini oldini olish qobiliyatiga ega, shuningdek, timin erkin radikal anionining shikastlanishiga yaxshi ta'sir ko'rsatadi.

Cistanche ijobiy va salbiy tomonlarini bosing

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

UsullariCAG ning antitumor ta'siri MC38 va CT26 sichqonchani ko'chirib o'tkazilgan o'simta modellarida tekshirildi. CAG ning antitumor ta'siri bir hujayrali multi-omiks sekvensiyasi orqali yanada tahlil qilindi. CAG ning maqsadli oqsilini topish uchun maqsadli foydalanish imkoniyati profilini yaratish texnologiyasidan foydalanilgan. Keyinchalik, mutant plazmidlarning konfokal mikroskopiya, immunoprecipitatsiya va transfeksiyasi yordamida CAG ning antitumor mexanizmi o'rganildi. Nihoyat, sichqonlarda yoki organoidlarda CAG va PD{6}} antikorlarining o'simtaga qarshi birgalikdagi ta'siri o'rganildi.

NatijalarBiz CAG in vivo jonli ravishda o'simta o'sishini samarali ravishda inhibe qilishini aniqladik. Bizning bitta hujayrali ko'p omik atlasimiz CAG o'simta hujayralari sirti antijenlarining namoyishini targ'ib qilishini va CD8 plus T hujayralarini o'ldirish funktsiyasining kuchayishi bilan tavsiflanganligini ko'rsatdi. Mexanik jihatdan, CAG maqsadli protein katepsin B bilan bog'langan, bu esa keyinchalik asosiy gisto-moslashuvchanlik kompleksi I (MHC-I) ning lizosomal degradatsiyasini inhibe qilgan va MHC-I agregati n ni hujayra membranasiga ko'tarib, o'simta antijenining oldingi stansiyasini kuchaytirgan. . Shu bilan birga, CAG ning PD{7}} antikorlari bilan kombinatsiyasi ksenograft sichqonlari va kolorektal saraton organoidlarida o'simtani o'ldiradigan CD8 va T hujayralarini samarali ravishda kuchaytirdi. Xulosa Bizning ma'lumotlarimiz birinchi marta katepsin B ning regulyatsiyasi o'smaga qarshi immunitetni ta'minlashi va tabiiy CAG mahsulotining o'smaga qarshi mexanizmini muddatini uzaytirishi haqida xabar berdi.

KIRISH

Kolorektal saraton dunyodagi eng keng tarqalgan saraton turlaridan biridir. Uning kasallanish darajasi va o'lim darajasi inson hayoti va sog'lig'iga jiddiy tahdid soladigan birinchi uchlikka kiradi.1 Umumiy davolash usullari jarrohlik kimyoterapiya va radioterapiya, maqsadli dorilar va immunoterapiyani o'z ichiga oladi.2-4 Biroq, saraton hujayralari odatda sirt antijenlarini yo'qotadi va ekspressiya qiladi. immun hujayralarining kuzatuvidan qochish uchun molekulalarni inhibe qilishning yuqori darajasi. Shu sababli, o'simtaning immunitetidan qochish muammosini hal qilish uchun tadqiqotchilar saraton hujayralarining immun hujayralarga niqoblanishini blokirovka qilish uchun immun nazorat nuqtasi inhibitörlerini va neoantigen terapiyasini ishlab chiqdilar.5-8 Immunitetni nazorat qilish punkti ingibitorlari zaiflashgan immunitet hujayralarini tiklashi mumkin bo'lsa-da, saratonning sirt antijeni. hujayralar sezilarli darajada im-ved qilinmagan. Shuning uchun, ayniqsa, o'simta yuzasi antijenlarining paydo bo'lishiga yordam beradigan dori-darmonlarni topish juda muhim, saraton hujayralarining sitotoksik CD8 plus T hujayralari tomonidan tan olinishi TCR/CD3/asosiy gisto-moslashuv kompleksi (MHC-I) yo'liga bog'liq. TCR dendritik hujayra/saraton hujayralari membranasi oqsili CI tomonidan mavjud bo'lgan antigenni oladi va CD3 ni mahkam bog'lash uchun signalni uzatadi, so'ngra u sitoplazmaga chuqurroq kiradi.9 10 Shu bilan birga, CD28/B7 signalining faollashishi bilan , CD8 plyus T hujayralari saraton hujayralarini tanib olish va o'ldirish uchun birgalikda faollashtirilishi mumkin.11 Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, o'simta rivojlanishi jarayonida lizosomalar saraton hujayralari yuzasida MHC-I agregatsiyasining kamayishiga olib keladi, bu esa samarali emas. mavjud antigenlar.12 13 Liu va boshqalar PCSK9 ning inhibisyonu lizosomalarda MHC-I ning degradatsiyasini oldini olishi va MHC-I ning mavjud antijenler uchun hujayra membranasiga qaytishiga imkon berishini maʼlum qildi.12 Shuning uchun antigen taqdim etish funksiyasini tiklash MHC-I ning o'simta immunitetini blokirovka qilish uchun ayniqsa muhimdir.

Ko'payib borayotgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, an'anaviy xitoy tibbiyotining faol molekulalarini o'smaga qarshi aralashuvda qo'llash katta istiqbolga ega.14 15 Sikloastragenol (CAG) Astragalus membranaceusning samarali faol molekulasi bo'lib, antiviral, antibakterial, antibakterial xususiyatlarga ega. yallig'lanishga qarshi va boshqa farmakologik ta'sirlar, lekin uning o'smaga qarshi ta'siri kamdan-kam qayd etilgan.16–19 Ushbu tadqiqotda biz CAG yo'g'on ichak saratoni o'smalarining trans anteni o'smalarining o'sishini inhibe qilganligini aniqladik. Mexanizm asosan MHC-I ning degradatsiyasini inhibe qilishga olib kelgan. katepsin B (CTSB), saraton hujayralarining antigen taqdimotini rag'batlantiradi va keyin CD8 plus T hujayralarini o'ldirish qobiliyatini oshiradi.

MATERIALLAR VA USULLAR

Antikorlar va reagentlar

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 foiz). CTSB antikorlari (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426), Actin (Cat#{{) 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Mushuk#10094-1-AP, PRID: AB_2210695) ​​va sichqoncha/quyonga qarshi immunohistokimyoni aniqlash to‘plami (Cat#PK10006) Proteintech kompaniyasidan sotib olingan. H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853) antikorlari va CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) Santa Cruz Biotechnology kompaniyasidan xarid qilingan. Ki-67 antikori (Cat#12202, PRID: AB_2620142) Cell Signaling Technology kompaniyasidan xarid qilingan. Na/K ATPaz antikori (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) Abcamdan xarid qilingan. CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) va CD{ ning oqim sitometriya antikorlari{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) BD Bioscience'dan xarid qilingan. Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575) ning oqim sitometriya antikori BioLegend'dan xarid qilingan. NK1 ning oqim sitometriyasi antikorlari.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) va IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) Thermo Fisher Scientific'dan sotib olingan. DMEM muhiti (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomitsin (Cat#15140122) va homila sigir zardobi (Cat#C04001-500) Biological Industries kompaniyasidan xarid qilingan. Echki zardobi (Cat#88RNG001) va Pirs BCA protein tahlili to'plami (Cat#23225) Thermo Fisher Scientific kompaniyasidan sotib olingan. Odamga qarshi PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) va anti-sichqoncha PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) antikorlari Bio X hujayrasidan sotib olingan. MACS o'sma to'qimalarining dissotsiatsiyasi to'plami (Mushuk#130-095-929) Miltenyi Biotec kompaniyasidan sotib olingan.

Hujayra madaniyati

Sichqoncha yo'g'on ichak saratoni hujayralari MC38 va CT26 laboratoriyamizda saqlanadi.20 Inson yo'g'on ichak saratoni HCT-116 liniyalari Xitoy Fanlar Akademiyasining (Shanxay, Xitoy) Madaniyat turlari to'plamidan olingan. MC38, CT26 va HCT{6}} hujayralari 5 foizli CO2 inkubatorida 10 foiz homila sigir zardobi va 1 foiz penitsillin/streptomitsinni o'z ichiga olgan DMEM muhitida 37 daraja haroratda yetishtirildi.

Transplantatsiya o'simtasi tajribasi

Olti sakkiz haftalik ayol C57BL / 6JGpt sichqonlari, BALB / c sichqonlari va BALB /, c yalang'och sichqonlari GemPharmatech (Nanjing, Xitoy) dan sotib olingan. MC38 yoki CT26 saraton hujayralari (1 × 106) har bir sichqonchaga teri ostiga sepildi. O'simta 100 mm3 gacha o'sganda, mikrofon tasodifiy ravishda fosfat tamponli tuz (PBS) guruhiga (masalan, kuniga bir marta) va CAG guruhiga (masalan, kuniga bir marta 50 mg / kg) bo'lingan. Shish hajmi V=uzunlik×kenglik2 /2 formulasi yordamida kalibr o‘lchovi bilan aniqlandi. PBS guruhi sichqonlarining o'simta hajmi 1000 mm3 ga yetganda, sichqonlarning o'simtasi olib tashlandi, suratga olindi va tortildi.

Yagona hujayrali RNK/ATACseq uchun sichqonchadan bitta hujayrali dissotsiatsiya

Sichqonlarning qattiq o'smalari bitta hujayrali bitta hujayralarni olish uchun Tumor Dissociation Kit yordamida hazm qilindi. 10×genomika ishlab chiqaruvchisi protokoliga binoan 10×genomik krom boshqaruvchi bir hujayrali bir hujayraga yuklangan 1000 hujayra/1000 hujayra konsentratsiyasiga ega boʻlgan bitta hujayrali bitta hujayra. Teskari transkripsiya reagentlari, shtrixli jel boncuklar va bo'linish moylari teskari transkripsiya uchun emulsiyalarda (GEM) jel boncuklarini yaratish uchun gen uchun hujayralar bilan aralashtirildi. scRNA-seq ma'lumotlarini qayta ishlash va kv y nazorat qilish.

Sichqoncha GRCm38 (mm10) genomiga asoslanib, bitta hujayrali RNKni qayta ishlash uchun CellRanger V.4.0.0 quvur liniyasi (10×Genomika) har bir tajriba uchun ketma-ketlik ma'lumotlari (GSE197229). Raqamli gen ekspresyon matritsalari R (V.4.0.4) da Seurat (V.4.0.0) paketi yordamida ajratilgan.21 dBeforem tahlilidan oldin hujayralar UMI raqami bo'yicha filtrlangan (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq ma'lumotlarini oldindan qayta ishlash va sifat nazorati

Yagona uyali ATAC-seq ma'lumotlari (GSE197229) hujayra ranger-at (V.2.0.0) tomonidan hisoblash buyruq qatori bilan oldindan qayta ishlandi. Keyingi scATAC-seq ma'lumotlarini qayta ishlash va tahlil qilish uchun biz ArchR (V.1.0.1) paketidan foydalandik.24 Keyin, genom izohi uchun addArchRGethe nom ('mm10') funksiyasidan foydalandik va standart parametrlarga ega cre ArrowFiles funksiyasi bilan oʻq fayli. Keyinchalik, biz potentsial dubllarni o'chirish uchun filterDoublets funksiyasidan foydalandik va standart parametrlarga ega ArchRProject funksiyasidan foydalangan holda ArchR loyihasini yaratdik. Keyin biz AddHarmony funksiyasi orqali partiya effektini olib tashlash uchun Harmony paketidan foydalandik.25 O'lchamlarni kamaytirish uchun ArchR da def t parametrlari bilan ishlash uchun addIterativeLSI funksiyasidan foydalanamiz. Yagona hujayrali oʻrnatish uchun biz uygʻunlik bilan reducedDims obyektini tanladik va vizualizatsiya uchun “chalkashlik=30” parametri bilan addTSNE funksiyasidan foydalandik.

siRNA-seq va scATAC-seq ma'lumotlarini integratsiyalashgan tahlil qilish

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Ikki ma'lumotlar to'plamini yaxshiroq integratsiya qilish uchun bashoratlarning aniqligini oshirish uchun biz "cheklangan integratsiya" rejimidan foydalangan holda yana bir bor scATAC-seq va scRNA-seq ma'lumotlarini birlashtirdik. Qisqacha, biz scATAC-seq ma'lumotlarini scATAC-seq gen ballari asosida hujayra turlari bilan izohladik. Keyin biz cheklangan ro'yxat yaratdik, shunday qilib gen ifodasi o'xshashligi scATAC-seq va scRNA-seq uchun faqat bir xil hujayra turida hisoblangan. T-SNE bilan nazoratsiz klasterlash 13 ta kichik hujayra klasterlarini aniqladi, ular onlayn qo'shimcha 1-jadvalda ma'lum yoki taxminiy belgilar bilan izohlanadi.

Pseudotime nasl traektoriyasi

Saraton hujayralarining hujayra naslining traektoriyasi Monocle2 (V.2.18.0) R paketi yordamida aniqlandi.26 Monotsitlar hujayralarni saralash uchun Reversed Graph Embedding orqali bir hujayrali genomik ma'lumotlardan aniq asosiy grafikni o'rganadilar va shu bilan kompleksni hal qiladilar. biologik jarayonlarni qat'iy va aniqlik bilan amalga oshirdik.27 Biz har bir klasterdan DEGni olish uchun "differensialGeneTest" funksiyasidan foydalandik va hujayra traektoriyasini tuzganimizdan so'ng psevdovaqtda differentsial ifodalangan genlarni aniqladik. Barcha psevdovaqtga bog'liq genlar CellDataSet ob'ektini olgan holda grafik{9}}pseudotime_issiqlik xaritasi funksiyasi yordamida tasvirlangan. CellDataSet asosidagi chiziqli traektoriya chizmalari va silliq ifoda egri chiziqlari mos ravishda psevdotime_hujayra{11}}traektoriyasi va chizmasi_genlar_ tomonidan yaratilgan.28

Bir hujayrali nusxa raqamini o'zgartirish qo'ng'irog'i

Klonal keng miqyosli xromosoma nusxalari soni o'zgarishi (CNV) bo'lgan malign hujayralarni aniqlash uchun biz inferCNV R to'plamidan foydalanib, o'simta genomining har bir xromosoma hududida katta gen to'plamlarining o'rtacha ifodasi asosida har bir hujayraning genetik profilini xulosa qildik. normal hujayralar.29 Namuna bo'yicha immun hujayralari saraton bilan bog'liq hujayralardagi CNVlarni baholash uchun havola sifatida ishlatilgan.

Boyitish tahlili

KEGG yo‘li va GO izoh tahlillari PValueCutoff=0 parametrlari bilan R paketi clusterProfiler (V.3.11.1) yordamida amalga oshirildi.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 va MaxGSSize=500.20Gen to'plamini boyitish tahlili (GSEA) sezilarli darajada boyitilganlarni aniqlash uchun 50 ta belgi gen to'plami (h.all.V.7.4.symbols. gmt) yordamida qo'llanildi. nominal P-qiymati skrining mezonlari bilan GSEA dasturiy ta'minoti (V.4.1.0) orqali funktsional yo'llar<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Haqiqiy vaqtda PCR tahlili

MC38 va HCT-116 hujayralari oltita quduqli plastinkalarga 6 soat davomida ekilgan va keyin yana 24 soat davomida CAG bilan ishlov berilgan. Hujayralar uch marta sovuq PBS bilan yuvildi va 18{18}}g 5 daqiqa davomida 4 daraja santrifüj qilindi. Shu bilan birga, o'simta to'qimasini maydalashdan keyin. Ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq, TRIzol reaktivi yordamida MC38, HCT-116 hujayralari va o'simta to'qimalaridan jami RNK ajratildi. Reaksiya hajmi 20 µL bo‘lib, quyidagilarni o‘z ichiga olgan: 1µg RNK, 5µL 5xHiscript III qRT SuperMix va RNase Free dH2 O. cDNK 1µL cDNA, 5µL qPCR aralashmasi, 0,75µL primerlar bilan 10µL reaksiya hajmi bilan miqdoriy PCRdan o‘tkazildi. (To'g'ri va teskari) va 3,25 µL RNazsiz dH2 O. Primerlar GenScript Biotech Corporation (Nankin, Xitoy) tomonidan quyidagi ketma-ketliklar bo'yicha sintez qilingan (onlayn qo'shimcha jadval 2).

Maqsadga javob beradigan qulaylik profilini yaratish yondashuvi orqali maqsadni aniqlash

CAG-bog'lovchi oqsillarni skriningi yuqorida aytib o'tilganidek amalga oshirildi.31 32 Qisqacha aytganda, ligand bilan bog'langan lizinni kuzatish orqali hujayra muhitida CAG uchun bog'lovchi oqsillarni topish uchun maqsadli javob beruvchi kirish profili (TRAP) usuli qo'llanildi. foydalanish imkoniyati proteom darajasida o'zgaradi. Qisqacha aytganda, hujayralarning ikkita idishi mos ravishda 10µM CAG va dimetil sulfoksid (DMSO) bilan ishlov berildi. 1-soatlik inkubatsiyadan so‘ng hujayralar M-PER buferi (Thermo Scientific) orqali o‘tkazuvchanlikka ega bo‘ldi va natijada olingan lizatlar formaldegid va bor piridin kompleksi qo‘shilishi bilan kovalent tarzda etiketlandi, ular birgalikda xona haroratida mavjudlik profilini aniqlash uchun oqsilli lizin qoldiqlarini maxsus belgilab qo‘ydilar. . Keyin, lizatlar organik erituvchi bilan cho'ktirildi va to'plangan granulalar 8mol / L karbamidda qayta eritildi, ditiotreitol (DTT) bilan 56 daraja 30 daqiqaga kamaytirildi, so'ngra 30 daqiqa davomida qorong'ida yodoasetamid (IAA) yordamida alkilatsiya qilindi. Ortiqcha IAA bilan reaksiyaga kirishish uchun tegishli miqdorda DTT eritmasi yana qo'shildi. Keyinchalik, karbamidning yakuniy kontsentratsiyasi 1mol / L ga yetguncha proteom ammoniy bikarbonat eritmasi bilan suyultirildi. Yig'ilgan protein hazm qilish C18 HLB ustunlarida (Waters, Milford, Massachusets, AQSh) tuzsizlandi va boyitilgan peptidlar quritildi va 0,1 foizli chumoli kislotasi (FA) suvli eritmasida qayta tiklandi. AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF tizimi (Suvlar) maqsadni aniqlash uchun CAG ulanishiga javoban lizinga kirish imkoniyati o'zgarishlarini miqdoriy profillash uchun namunalarni tahlil qilish uchun ishlatilgan. Ma'lumotlarni yig'ish uchun ijobiy rejimda ma'lumotlarga bog'liqlikni olish qo'llanildi. Ma'lumotlar tahlili PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Kanada) yordamida amalga oshirildi. Xususan, cys alkilatsiyasi sobit modifikatsiya sifatida tanlandi va TRAP markalash orqali erishilgan metionin oksidlanishi va lizin dimetilatsiyasi o'zgaruvchan modifikatsiya sifatida o'rnatildi. Qisqacha aytganda, TRAP tomonidan induktsiyalangan dimetilatsiyani o'z ichiga olgan va CAG inkubatsiyasi bilan va bo'lmagan holda sezilarli darajada o'zgarishlarni ko'rsatadigan peptidlar maqsadga javob beradigan peptidlar sifatida tayinlangan. Har bir TRAP etiketli peptidning ko'pligi nisbati foydalanish imkoniyatining o'zgarishi darajasini ko'rsatadi va ligand bilan bog'lanish yaqinligi bilan chambarchas bog'liq. Belgilangan peptidlarning aniqlangan kirish o'zgarishlari statistik ahamiyatga ega yoki yo'qligini baholash uchun talabalarning t-testi o'tkazildi. Guruhlararo p-qiymati (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Organoid madaniyati

Odamning yo'g'on ichak saratoni organoidlari Chongqing Kingbiotech kompaniyasi tomonidan yaratilgan va o'stirilgan.33 Jarrohlik operatsiyasi natijasida olingan bemor to'qimalari namunalari steril qaychi bilan imkon qadar mayda bo'laklarga bo'lingan. To'qima bo'laklari muz ustida taxminan 1: 4 nisbatda Matrigel (Corning, Cat # 356231) bilan yaxshilab aralashtirildi. Keyingi qayta ishlash nashr etilgan protokollarga tegishli. Qisqacha aytganda, bo'laklar - Matrigel suspenziyalari yarim sharsimon tomchilarni hosil qilish uchun ko'p teshikli plastinkaga tezda ekilgan va 15-20 daqiqa davomida 37 darajaga o'tkazilgan va bu tomchilarning qotib qolishini ta'minlagan. Har bir quduqqa tegishli miqdordagi madaniy muhit (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​qo'shildi va har 2-4 kunda muhit o'zgartirildi.

Inson CD8 T hujayralarining izolyatsiyasi va madaniyati

Butun qonni suyultirish uchun antikoagulyantlarni o'z ichiga olgan sog'lom odamlarning periferik qoniga bir xil hajmdagi oddiy sho'r suv qo'shing. 15 ml lik santrifüj trubasiga ma'lum hajmdagi ajratuvchi eritma qo'shing, asta-sekin naycha devori bo'ylab suyultirilgan butun qonni ajratish eritmasining yuqori qismiga qo'shing va 20 daqiqa davomida 750 g santrifüj qiling. Santrifüjdan so'ng, o'rta oq qatlamdagi monositlarni 15 ml santrifüj trubkasiga ehtiyotkorlik bilan so'rish uchun pipetkadan foydalaning, qayta suspenziya qilish uchun ma'lum hajmdagi PBS qo'shing, 5 daqiqa davomida 250 g santrifüj qiling va supernatantni tashlang. Hujayra cho'kmalariga inson CD8 magnit boncuklarini qo'shgandan so'ng, CD8 T hujayralari LS saralash ustuni bo'yicha saralangan. CD8 T hujayralari 5 mkg/ml CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) antikori va keyin 10ng/ml IL{{15} bilan oldindan qoplangan teshilgan plastinkaga qo'shildi. } (Peprotech Cat# 212-12) va 5µg/ml CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) funktsional antikorlar 24 soat davomida yetishtirilgan holda qo‘shildi.

Madaniyat

Organoidlar 24 soat davomida CAG bilan inkubatsiya qilingandan so'ng, yangi madaniyat muhiti almashtirildi, so'ngra organoidlar va faollashtirilgan CD8 T hujayralari matritsali jelda to'xtatildi, so'ngra suspenziya olti quduqli plastinkaga qo'shildi va 37 ga joylashtirildi. 15 daqiqa davomida inkubator, so'ngra 2 ml sarumsiz to'liq madaniyat muhiti 24 soat davomida qo'shildi.

Gʻarbiy blot

MC38 va HCT-116 hujayralari oltita quduqli plastinkalarga 6 soat davomida ekilgan va keyin yana 24 soat davomida CAG bilan ishlov berilgan. Hujayralar uch marta sovuq PBS bilan yuvildi va 4 daraja haroratda 180 g 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Umumiy protein 30 daqiqa davomida muz ustida 1 foiz proteaz inhibitori bo'lgan WB-IP lizis bilan lizing qilindi. Umumiy protein BCA protein miqdorini aniqlash to'plami yordamida baholandi. Protein namunalari 10% -12% SDS poliakrilamid gel elektroforezi bilan ajratildi va 90 daqiqa davomida 350 mA da PVDF (poliviniliden ftorid) membranalariga o'tkazildi. PVDF membranalari 5 foiz BSA bilan 1 soat davomida bloklandi, chiziqlar bir kechada ko'rsatilgan asosiy antikor bilan va ikkilamchi antikor bilan xona haroratida 90 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Nihoyat, chiziqlar LumiGLO xemiluminesans substrat tizimi (KPL, Gaithersburg, Merilend, AQSh) yordamida aniqlandi.

Oqim sitometriyasi

O'simta to'qimalarining hazm bo'lishidan so'ng va bitta hujayrali suspenziya tayyorlandi. Yuzaki bo'yash FCM (oqim sitometriyasi) tamponida (1 foiz FBS o'z ichiga olgan PBS) sirt antijeni antikorlari bilan amalga oshirildi va 30 daqiqa davomida tegishli antikorlar bilan muzda bo'yaldi. O'lik hujayralarni yo'q qilish uchun reaktiv bo'yoqlar (eBioscience) ishlatilgan. Hujayra ichidagi sitokinni bo'yash BD hujayra fiksator eritmasi/hujayradan tashqari membrana eritmasi bilan amalga oshirildi va hujayralar mahkamlandi va o'tkazdi, so'ngra Perm/Wash buferida (BD Biosciences) sitokinlarga qarshi antikorlar bilan bo'yaldi.

Transfektsion CTSB mutant plazmidlari

HCT-116 xujayralari 6-quduq plastinkalariga 12 soat davomida ekilgan va keyin 36 soat davomida CTSB-WT-EGFP yoki CTSB mutant plazmidlari (Y75A, A77V va G198A) bilan transfektsiya qilingan.

MC38 hujayralari yoki HCT{2}} hujayralariga CTSB ning transfeksiya aralashuvi yoki haddan tashqari ifodalangan plazmidi

MC38 xujayralari (1×106/quduq) 6 soat davomida 6-quduq plastinkalarida inokulyatsiya qilindi, so‘ngra 48 soat davomida CTSB interferentsiya qiluvchi RNK (ketma-ketlik: Oldinga-GGACAUAGAUCUACCUGAATT va Teskari-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) bilan transfektsiya qilindi va mRNA yoki protein ifoda darajalari ning Ctsb va H2-k1 aniqlandi. HCT-116 xujayralari (1×106/quduq) 6-quduq plastinkalarida 6 soat davomida inokulyatsiya qilindi, so‘ngra CTSB interferensiyasi (ketma-ketligi: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) yoki haddan tashqari ifodalangan plazmid bilan 48 soat davomida va mRNK bilan transfektsiya qilindi. yoki CTSB va HLA-A ning protein ifoda darajalari aniqlandi.

Docking texnologiyasi

CTSB ning 3D tuzilishi Protein ma'lumotlar bazasidan (PDB ID: 2iPP) yuklab olindi va CAG tuzilmalari PubChem'dan yuklab olindi. O'rnatish jarayoni Autodock 2 da simulyatsiya qilingan tavlanish algoritmi yordamida qo'pol o'rnatish va genetik algoritm yordamida keyingi takomillashtirish bilan amalga oshirildi.

Uyali termal almashinuv tahlili

MC38 xujayralari bir kechada 1{2}}sm plitalarga ekilgan va keyin yana 2 soat davomida CAG yoki 0,1% DMSO bilan ishlov berilgan. Hujayralar yig'ildi, sovuq PBS bilan yuvildi va 180 g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Keyin hujayralar teng ravishda santrifüj naychalariga bo'lindi (har bir naycha uchun 70 µL) va 3 daqiqa davomida quyidagi haroratda isitiladi: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 va 67 daraja, namunalar 3 daqiqa davomida haroratda sovutilgan va keyin muz ustida saqlanadi. Keyin, namunalar bir kechada -80 daraja sovutgichga joylashtirildi. Namunalar xona haroratida 30 daqiqa davomida eritildi va keyin 4 soat davomida -80 daraja sovutgichga yuborildi. Nihoyat, namunalar 12, 000 g 25 daqiqa davomida santrifüj qilindi, yuklash tamponiga supernatant qo'shildi va Western blot usulida tahlil qilindi.

Immunogistokimyoviy bo'yash

O'simta to'qimalarining kerosin bo'laklari mum olish uchun 20 daqiqa davomida ksilenga, so'ngra 100%, 75% va 50% etanolga 10 daqiqa davomida botirildi. Dilimlar natriy sitrat antijeni tuzatuvchi eritmasi bilan antijen ta'miriga duchor bo'lgandan so'ng, endogen vodorod periks 3 foizli vodorod periks bilan faolsizlantirildi. 5 foizli echki zardobi bilan 1 soat davomida blokirovka qilingandan so'ng, Ki67ga qarshi antikor (1:200) qo'shildi va kechasi 4 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. Sichqoncha/quyonga qarshi HRP etiketli polimer (100 µL) qo‘shildi va namunalar 37 daraja haroratda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi, so‘ngra 100 µL DAB ishchi eritmasi va xona haroratida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Gematoksilin bilan 1 daqiqa bo'yalgandan so'ng, namunalar 50%, 75% va 100% etanol va ksilenda 5 daqiqa davomida yuvilgan va plyonkani yopish uchun neytral saqich ishlatilgan. Film mikroskop ostida kuzatilgan va suratga olingan.

Statistiktahlil

Statistik tahlil GraphPad Prism dasturi (V.8.0) yordamida amalga oshirildi. Barcha natijalar uchta mustaqil tajribaning o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi. Ikkidan ortiq guruhlar mavjud bo'lganda farqlarni baholash uchun Dunnettning post hoc testidan so'ng bir tomonlama dispersiya tahlili ishlatilgan. Ikki guruh o'rtasidagi sezilarli farqni baholash uchun Student's t-testi ishlatilgan. Statistik ahamiyatga ega bo'lgan p<0.05.

NATIJALAR

Sichqonlarda ko'chirilgan yo'g'on ichak saratoni o'sishini inhibe qiluvchi CAGning bir hujayrali multi-omiks tahlili

CAG ning antitumor ta'siri bor-yo'qligini tekshirish uchun biz birinchi navbatda MC38 saraton hujayralarini C57BL / 6 sichqonlariga ko'chirdik. Biz CAG o'smalarning o'sishini sezilarli darajada inhibe qilganini ta'kidladik (onlayn qo'shimcha raqam S1A, B). Keyinchalik, biz CT26 hujayralarini BALB / c sichqonlariga ko'chirib o'tkazdik va CAG ham o'smalarning o'sishini inhibe qilishini aniqladik (onlayn qo'shimcha rasm S1C, D).

CAG o'simta o'sishini inhibe qiladigan o'ziga xos mexanizmni yanada ochib berish uchun biz uni scRNA-seq va scATAC-seq texnikasi yordamida tahlil qildik (1A-rasm). Biz hujayra populyatsiyasini to'rt guruhga ajratdik: saraton hujayralari, fibroblastlar, miyeloid hujayralar va limfotsitlar (1B-rasm, onlayn qo'shimcha rasm S2A, B). Biz saraton hujayralari (52 foiz) va fibroblastlar (41 foiz) asosan o'simta to'qimalariga infiltrlanganligini aniqladik, immun hujayralari esa atigi 7 foizni tashkil qiladi. Keyin saraton hujayralarini sakkiz kichik to'plamga va fibroblastlarni uchta kichik to'plamga ajratdik (1C-E-rasm). Keyinchalik, har bir hujayra populyatsiyasida yuqori darajada ifodalangan genlarni boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, saraton hujayralarida MHC-I molekulyar yo'llari, T hujayralari va NK hujayralarining antitumor signallari boyitilgan (onlayn qo'shimcha raqam S2C). Keyin, shuningdek, scATAC-seq va scRNA-seq integratsiya tahlili yordamida to'rtta hujayralar guruhi topildi (2D-G-rasm). Taqqoslashdan so'ng, biz saraton hujayralari (C01, C03 hujayralari), CD8 plyus T hujayralari, Spp1 va TAM hujayralari va fibroblastlar (F01 va F02 hujayralari) ATAC ketma-ketligida paydo bo'lganligini aniqladik (1F, G-rasm) va keyinchalik yuqori darajada ifodalangan. transkripsiya omillari bu hujayralarda boyitilgan (1H-rasm). Ushbu tahlillar orqali biz CAG tomonidan o'simta o'sishini inhibe qilish ushbu hujayralardagi o'zgarishlar bilan chambarchas bog'liq deb taxmin qilamiz.

Cag o'simta hujayralari antijeni taqdimotini rag'batlantiradi

CAG ning antitumor mexanizmini tahlil qilish uchun biz birinchi navbatda o'simta hujayralari populyatsiyasini tahlil qildik va saraton hujayralarini sakkizta kichik guruhga bo'ldik (rasm 2A, B, onlayn qo'shimcha rasm S3A). Natijalar shuni ko'rsatdiki, PBS guruhi bilan solishtirganda, C05 guruh hujayralari sezilarli darajada kamaydi, C07 guruh hujayralari esa ko'paydi (2C-rasm). Shu bilan birga, o'simta hujayralari to'plamining to'g'riligini tekshirish uchun biz limfotsitlar va miyeloid hujayralarning CNV ni mos yozuvlar hujayralari sifatida taqqosladik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, saraton hujayralarining CNV darajasi immunitet hujayralarinikiga qaraganda ancha yuqori (onlayn qo'shimcha raqam S3B). Saraton hujayralarining quyi to'plamlarini tahlil qilganda, biz interferon javob genlari Isg15, Irf7, Ifit3 va Ifi47 PBS guruhi bilan solishtirganda CAG guruhining C07 va C08 hujayra populyatsiyalarida yuqori darajada ifodalanganligini aniqladik (onlayn qo'shimcha raqam S3C). O'simta hujayralari populyatsiyasining tahlili shuni ko'rsatdiki, antigen taqdimoti bilan bog'liq yo'llar bir nechta hujayra populyatsiyalarida sezilarli darajada boyitilgan. Shuning uchun, biz CAG saraton hujayralarining antigen taqdimotini antitumor rolini o'ynashga yordam berishi mumkin deb taxmin qilamiz (2D-rasm). Keyin biz antigen taqdimoti bilan bog'liq genlarni tanladik va CAG guruhidagi ifoda darajasi PBS guruhidagiga qaraganda sezilarli darajada yuqori ekanligini aniqladik (2E-rasm, onlayn qo'shimcha rasm S3D). Shuningdek, biz CAG o'simta to'qimalarida antigen namoyishini targ'ib qilganligini aniqladik (2F, G-rasm).

Keyinchalik, biz scATAC-seq-dan CAG-ni rag'batlantiruvchi o'simta hujayralari antijeni taqdimotining o'ziga xos sabablarini tahlil qilish uchun foydalandik. Biz o'simta hujayralari populyatsiyasi Fos, Junb, Jund, Fosb va Fosl1 transkripsiya omillarini yuqori darajada ifodalaganligini aniqladik (2H, I-rasm). Keyinchalik, biz transkripsiya omillari va mos keladigan genlar o'rtasidagi o'zaro ta'sir xaritasini tuzdik, bu CAG o'simta hujayralari antijenini taqdim etish bilan bog'liq genlarning ifodalanishiga yordam berdi (2J-rasm). O'simta to'qimalarida biz shuningdek, Junb, Fos, Jund va Fosb transkripsiya omillari PBS guruhida CAG bilan davolashda sezilarli darajada haddan tashqari ko'tarilganligini aniqladik (2K-N-rasm, onlayn qo'shimcha rasm S3E-I). Hozirgacha biz CAG antigenni taqdim etuvchi genlarning transkripsiya omillarining ifodalanishini rag'batlantirishi mumkinligini aniqladik va shu bilan saraton hujayralarining antigenni taqdim etish funktsiyasini kuchaytiradi. Biroq, bu saraton hujayralari immunitet hujayralarining javoblariga qanday javob berishi noma'lumligicha qolmoqda.

CAG saraton hujayralarining antigen taqdimotini rag'batlantiradigan hodisani ochish uchun biz saraton hujayralari immun hujayra javoblariga javoban bir-birini qanday o'zgartirishini o'rganish uchun traektoriya tahlilini o'tkazdik. Vaqt o'tishi bilan C07 saraton hujayralari C05, C06 va C08 hujayralariga aylanganligini aniqladik va genlarni boyitish ham saraton hujayralari antigen taqdimotiga aylanishini ko'rsatdi (3A-E-rasm).

CAG immunitet hujayralarini o'ldirish funktsiyasini kuchaytiradi

Ushbu natijalar CAG o'simta hujayralari antijenlarini taqdim etishi mumkinligini ko'rsatadi, shuning uchun o'simta hujayralari antijeni taqdimotini kuchaytirish immun hujayra funktsiyasining kuchayishiga olib keladimi? Buni aniqlash uchun biz mos ravishda limfotsitlar va miyeloid hujayralarni tahlil qildik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, CAG o'simta to'qimalarida CD8 plyus T hujayralarining infiltratsiyasini rag'batlantirdi va CD8 plyus T hujayralari va NK hujayralarining infiltratsiyasi ham ko'paydi, oqim sitometriyasi bilan aniqlandi (onlayn qo'shimcha rasm S4A-F). Shuningdek, biz CAG CD8 plus T hujayralarida Ifitm2, Cxcr6 va S100a6 genlarining ifodasini kuchaytirganini kuzatdik.

NK hujayralarida Fcer1g, Gzmb, AW112010 va Zfp36i2 genlari va CD4 plus T hujayralarida Nfkbia va Junb genlari (onlayn qo'shimcha rasm S4G). CD8 plus T hujayralarida Ifng va Gzmb ifodasi oqim sitometriyasida aniqlanganidek sezilarli darajada yaxshilandi (onlayn qo'shimcha rasm S4H, I). Bundan tashqari, biz CAG bilan davolashdan so'ng, CD8 plyus T hujayralari yuzasida Lag3, Tigit va Havcr2 inhibitiv retseptorlarining ekspressiyasi pasayganligini va Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 va Pdcd1 genlarining ifodalanishini aniqladik. CD8 plus T hujayralarining faollashuvi sezilarli darajada oshdi (onlayn qo'shimcha raqam S4J). CAG o'simta antijeni taqdimotini kuchaytirish orqali CD8 plyus T hujayralarini o'ldirish funktsiyasini kuchaytirganligini tekshirish uchun biz CT26 hujayralarini yalang'och sichqonlarda transplantatsiya qilingan o'smalarga ko'chirib o'tkazdik va CAG o'smalarning o'sishini samarali ravishda inhibe qila olmasligini kuzatdik (onlayn qo'shimcha rasm S4K-M) ).

Shundan so'ng, biz miyeloid hujayralarni tahlil qildik va CAG bilan davolashdan keyin Spp1 plus TAM hujayralari ko'payganini aniqladik, C1qc plus TAM hujayralari soni kamaygan va Il1b plyus monositlar soni ko'paygan (onlayn qo'shimcha rasm S5A-D). CAG bilan davolashdan so'ng, Spp1 plus TAM va C1qc plus TAM hujayralari yallig'lanishga qarshi TAM transformatsiyasiga ko'proq moyil bo'ldi. Boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, u asosan Tnf-, Ifn-g va yallig'lanishga javob signalizatsiya yo'liga qaratilgan (onlayn qo'shimcha raqam S5E-H). Yuqorida aytib o'tilgan natijalarga asoslanib, biz CAG saraton hujayralarida antigen taqdimotini rag'batlantirish orqali immun hujayralarni tanib olish va o'ldirish funktsiyasini kuchaytiradi degan xulosaga keldik. Biroq, CAG qanday tartibga solinishi aniq emas.

CAG maqsadli oqsili CTSB ni tuzoq bilan topish

Keyinchalik, antitumor rolini o'ynaydigan o'ziga xos CAG maqsadli oqsilini tekshiramiz. Biz tadqiqot ob'ekti sifatida saraton hujayralarini tanladik, chunki biz CAG saraton hujayralarining antigen taqdimotini kuchaytirishi va shu bilan immunitet hujayralarini o'ldirish funktsiyasini kuchaytirishi mumkinligini aniqladik. Biz birinchi navbatda CAG ning biotin hosilasini sintez qildik va faqat 3-OH reaksiyaga kirishishini aniqladik (onlayn qo'shimcha rasm S6A). Keyin biz CAG-biotin sichqonchaning MC38 o'simta hujayralarida antigen taqdimoti bilan bog'liq genlarning ifodalanishiga yordam beradimi yoki yo'qligini tekshirdik. Natijalar shuni ko'rsatadiki, CAG-biotin H2-K1, Cd74 va Anxa1 genlarining ifodalanishiga ta'sir qilmagan (onlayn qo'shimcha rasm S6B-D).

Shuning uchun biz laboratoriyada oldingi TRAP maqsadli qidirish usulidan foydalandik.32 CAG va DMSO ikkalasi ham MC38 hujayra liniyasi bilan inkubatsiya qilingan (4A-rasm). Biz FC kattaroq yoki 2 ga teng va ap 0.05 dan kichik yoki teng boʻlgan proteinni CAG uchun nomzod maqsadli oqsil sifatida tanladik. Kichik molekulalarning oqsillarga ulanishi lizinning past etiketkalash samaradorligiga olib keladi degan tamoyilga amal qilib, tadqiqot uchun CTSB ni tanladik (4B-rasm). Keyinchalik, biz CAG va CTSB o'rtasidagi bog'lanishni tekshirish uchun uyali termal siljish tahlilini (4C-rasm) va mikroshkalali termoforezni (MST) (4D-rasm) ishlatdik va CAG va CTSB o'rtasidagi yaqinlik 26,6 nM (4D-rasm) ekanligini aniqladik. Keyinchalik, biz PDB kutubxonasida CTSB ning protein kristalli tuzilishiga ko'ra CAG va CTSB o'rtasidagi bog'lanish joylarini taxmin qildik. Biz CAG ning ikkala uchidagi gidroksil guruhlari va CTSB ning ALA77 va GLY198 joylari vodorod aloqasi bilan, CAG va CTSB ning TYR75, PRO76 va ALA173 joylari esa van der Waals kuchi bilan bog'langanligini aniqladik (4E-rasm). . CAG va CTSB o'rtasidagi bog'lanish joyini tekshirish uchun biz HCT-116 hujayralarida CTSB mutant plazmidini transfektsiya qildik. Natijalar shuni ko'rsatadiki, A77V va G198A va CAGdagi mutant plazmid o'rtasidagi yaqinlik WT plazmididan yuzlab marta yuqori bo'lgan (4F, G-rasm). Keyingi bo'limda biz CAG CTSB orqali antitumor rolini o'ynaydigan o'ziga xos mexanizmni o'rganamiz.

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】