Tug'ma yurak kasalliklarida neyroproteksiyaning hozirgi holati 1-qism

Annotatsiya:

Sitoplazmada ektopik DNKning mavjudligi yallig'lanish va hujayra o'limiga olib keladi. Yadro DNKsining sitoplazmaga oqib chiqishi asosan siklik GMP-AMP sintaza (cGAS) tomonidan sezilishi mumkinligi keng tarqalgan.

DNK har bir insonning genetik ma'lumotlarini belgilaydigan va har bir hujayramizda joylashgan molekuladir. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, DNK ma'lum yo'llar orqali sitoplazmaga oqib chiqishi va xotiramizga ta'sir qilishi mumkin.

Bu hodisa keksa odamlarda va kognitiv buzilishlari bo'lgan odamlarda keng tarqalgan. DNK sitoplazmaga oqib chiqsa, u hujayra ichidagi normal funktsiyalarga xalaqit beradi va xotirani yo'qotish va kognitiv buzilish xavfini oshiradi.

Biroq, biz bu haqda tushkunlikka tushishimiz va umidsizlikka tushishimiz shart emas. Sog'lom miyani saqlashga yordam beradigan xotira va kognitiv qobiliyatlarni yaxshilashning ko'plab usullari mavjud.

Avvalo, siz sog'lom turmush tarziga rioya qilishingiz kerak. Bunga muvozanatli ovqatlanish, etarlicha uxlash, o'rtacha jismoniy mashqlar qilish va stressni kamaytirish kiradi. Ushbu amaliyotlar miya sog'lig'ini yaxshilaydi, shu bilan DNKning oqishi oldini oladi va xotirani yaxshilaydi.

Ikkinchidan, kognitiv trening talab qilinadi. Bu matematik o'yinlarni o'ynash, o'qish, yangi ko'nikmalarni o'rganish va hokazolarni o'z ichiga olishi mumkin. Bu mashg'ulotlar miyani rag'batlantirishga yordam beradi va DNK sizib ketishining oldini olish uchun neyrogenezni rag'batlantiradi.

Nihoyat, ijobiy munosabatni saqlang. Hissiy beqarorlik va haddan tashqari stress miya kimyosida DNK oqishiga yordam beradigan o'zgarishlarga olib kelishi mumkin. Shuning uchun biz hayotdagi qiyinchiliklarga ijobiy munosabatda bo'lishni va optimistik munosabatni saqlashni o'rganishimiz kerak.

Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, DNKning sitoplazmaga oqib chiqishi xotiraga ta'sir qilishi mumkin bo'lsa-da, biz miya sog'lig'ini yaxshilashimiz, DNK sizib ketishining oldini olishimiz va oxir-oqibatda to'g'ri turmush tarzini qabul qilish, kognitiv mashg'ulotlar bilan shug'ullanish va ijobiy fikrlashni saqlash orqali xotiramizni yaxshilashimiz mumkin. Xotira va kognitiv qobiliyatlar. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak va Cistanche deserticola xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki Cistanche deserticola an'anaviy xitoylik dorivor material bo'lib, u juda ko'p noyob ta'sirga ega, ulardan biri xotirani yaxshilashdir. Cistanche deserticola samaradorligi uning tarkibidagi ko'plab faol moddalar, jumladan, tanin kislotasi, polisakkaridlar, flavonoid glikozidlar va boshqalardan kelib chiqadi. Ushbu ingredientlar turli yo'llar orqali miya salomatligini mustahkamlashi mumkin.

Xotirani yaxshilashning 10 ta usulini bilish tugmasini bosing

Biz yaqinda lizosomal degradatsiyadan qochib qutulgan mitoxondriyadan olingan sitoplazmatik ikki zanjirli DNK (dsDNK) o'stirilgan hujayralar va in vivo muhim sitotoksiklikni keltirib chiqarishi haqida xabar berdik. Sitoplazmatik mitoxondriyal DNK turli kasalliklar va kasalliklarda ishtirok etadi deb taxmin qilinadi va buni tasdiqlovchi ko'plab maqolalar nashr etilmoqda. Boshqa tomondan, sitoplazmadagi mitoxondriyal DNKni baholashning hozirgi usuli miqdoriy bo'lmasligi mumkin.

Bu erda biz ektopik mitoxondrial DNK hujayralarini baholash usulini batafsil ko'rib chiqamiz. Ushbu usul asosiy tadqiqotlarda, shuningdek, qarish, Parkinson kasalligi, Altsgeymer kasalligi, yurak etishmovchiligi, otoimmün kasalliklar, saraton va boshqa sharoitlarni o'rganishda foydalidir.

Kalit so'zlar: ektopik DNK; mitoxondriyal DNK; mitoxondrial transkripsiya omili A (TFAM); Parkinson kasalligi.

1.Kirish

DNK omon qolish va meros uchun muhim ma'lumotlarni o'z ichiga oladi va uni turli xil stress omillaridan, jumladan oksidlovchilar va mutagenlardan himoya qilish kerak. Eukaryotik hujayralar aerob nafas olish orqali ko'plab faol kislorod turlari bilan birga energiya ishlab chiqaradigan mitoxondriyalarni o'z ichiga oladi.

Shunday qilib, eukaryotik hujayrada DNK yadro yoki mitoxondriyada, mos ravishda yadro membranasi yoki mitoxondriyal membranada joylashgan bo'ladi. Biroq, DNK ma'lum sharoitlarda, masalan, virusli yoki virusli bo'lmagan infektsiyalar paytida sitoplazmada bo'lishi mumkin. 4].

Hatto ba'zi yuqumli bo'lmagan sharoitlarda ham (masalan, qarish yoki turli yoshdagi kasalliklar yoki saraton) DNK yadro yoki mitoxondriyadan sitoplazmaga oqib chiqishi mumkin [5-7].

Sitoplazmadagi DNK yallig'lanish va hujayralar uchun toksik bo'lishi mumkin. Yadro DNKsining sitoplazmaga oqib chiqishi asosan interferon genlari (STING) siklik GMP-AMP sintaza (cGAS)-stimulyatori orqali yallig'lanish, sitotoksiklik va qarish bilan bog'liq sekretor fenotipni (SASP) keltirib chiqarishi keng tarqalgan. 5,6].

Biz yaqinda lizosomal degradatsiyadan qochgan mitoxondriyal kelib chiqishi sitozolik ikki zanjirli DNK (dsDNK) Parkinson kasalligining uyali modellarida sitotoksiklik va neyrodegeneratsiyani keltirib chiqarishi ko'rsatilganligi haqida xabar bergan edik [8]. Bunday ektopik DNKning mavjudligi yoki ko'payishi ko'pincha DNK qochqinning o'sishi bilan emas, balki mikroskopik tasvirlar va aniq dalillar bilan ko'rsatilgan.

Ushbu ektopik DNKni baholash nafaqat asosiy tadqiqotlar uchun, balki qarish va Parkinson kasalligi, Altsgeymer kasalligi, amyotrofik lateral skleroz, yurak etishmovchiligi, otoimmün kasalliklar, diabet kabi boshqa kasalliklar bo'yicha tadqiqotlar uchun ham muhimroq bo'lishi kutilmoqda. alkogolsiz steatohepatit (NASH) va saraton. cGAS-STING yo'li nafaqat qarishda, balki ushbu kasalliklarning patogenezida ham hal qiluvchi ahamiyatga ega ekanligi xabar qilingan [8-17].

Ehtimol, mitoxondriya atrofidagi oksidlanish holatlari va mitoxondriyal DNK uchun samarali DNK-ta'mirlash tizimining yo'qligi sababli, mitoxondriyal DNK yadro DNKsiga qaraganda mutatsiyaga yoki shikastlanishga ko'proq moyil bo'ladi [18,19].

Yadro DNKsidan farqli o'laroq, mitoxondriyal DNK bitta hujayrada bir nechta nusxada mavjud bo'lib, kerak bo'lganda sintezlanadi.Shuning uchun mitoxondriyal DNK qarish paytida yoki yoshga bog'liq kasalliklar, mitoxondriyal disfunktsiya kabi xavfli sharoitlarda sitoplazmaga oqib ketish ehtimoli ancha yuqori bo'lishi mumkin. , yoki saraton.

Bunday sitoplazmikmitoxondrial DNKni aniqlash va o'lchash turli kasalliklar va qarish patogenezini tushunishda muhim bo'lishi mumkin va biomarker va terapevtik maqsad bo'lishi mumkin.

Biz sitoplazmaga oqayotgan ektopik mitoxondriyal DNKni baholashning yarim miqdoriy usulini ishlab chiqdik va bu erda biz usulni batafsil tavsiflaymiz. Ushbu maqola mitoxondriyal DNK oqishini ob'ektiv baholash imkonini beradi va turli kasalliklar patologiyalarini o'rganishda foydalidir.

2. Materiallar va usullar

2.1. Hujayra chiziqlari, siRNK bilan davolash va Kantitativ PCR (qPCR) tahlili

HeLa hujayralari ayol bemorning bachadon bo'yni saratoni hujayralaridan olingan (ATCC,CCL-2). HeLa hujayralari Dulbecco's Modified EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Yaponiya) da 37 ◦C da 5% CO2 ostida 10% xomilalik qoramol (FBS) (Biowest, Nuaillé, Frantsiya) va penitsillin eritmasi (-strep) bilan to'ldirilgan. 100 birlik/mlpenitsillin G va 100 mkg/ml streptomitsin sulfat, Vako, Osaka, Yaponiya).

Transfeksiyadan bir kun oldin HeLa hujayralari 600 hujayra/mkl zichlikda qoplangan. Lipofektemine regent (termofisher) regentatsiyasida (Ibs14425140, GBA: HSS178140, GBA: TFAM, MA, AQSh) dan foydalanib o'ldirilgan ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalari (yakuniy RNK kontsentratsiyasi 10 nM).

SiRNA ishdan chiqqanidan uch kun o'tgach, ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq (Thermo Fisher Scientific) TRIzolreagent yordamida umumiy hujayrali RNK ajratildi. cDNA shablonlari tozalangan RNK dan ProtoScript II Birinchi StrandcDNA sintez to'plami (New England Biolabs, Ipswich, MA, AQSh) yordamida oligo (dT)20 primerlari bilan sintez qilindi.qPCR TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu) yordamida amalga oshirildi. , Yaponiya) va Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio) da tahlil qilingan. Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan PCR primerlari GBA oldinga (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA teskari (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM oldinga (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM teskari (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTTA), Glitseraldegidgidogenaz (dehidrogenez (dehidrogen) dehidrogenaz{{1}CCGATCAPG CAGCA) va GAPDH teskari (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Statistik tahlillar GraphPad Prism dasturiy ta'minotining 9.3.1 versiyasi (GraphPad Software, San-Diego, CA, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Ikki guruh o'rtasidagi arifmetik o'rtachalarni solishtirish uchun ikki tomonlama Student t-testlaridan foydalanilgan. Ma'lumotlar vosita va ± standart xatolar sifatida taqdim etiladi.

2.2. Ektopik mitoxondriyal DNKning immunofluoressensiyani aniqlash va tasvir tahlili

Transfeksiyadan bir kun oldin HeLa hujayralari 600 hujayra/mkL zichlikda qoplandi. Lipofektamin RNAiMAX transfektsiya reagentida (ThermoFisher Scientific) Stealth RNKi siRNA (Thermo Fisher Scientific) yordamida qiziqish genlari ifodasi HeLa hujayralarida o'chirildi. ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalari (yakuniy RNK kontsentratsiyasi 10 nM).

siRNK ishdan chiqqanidan uch kun o'tgach, hujayralar immunofluoresans bo'yalgan. Mitoxondriyal DNK, anti-dsDNA antikorini aniqlash uchun (Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya, klon 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 yoki EMD Millipore, Billerica, MA, AQSh, AC klon-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) Hoechst 33258, DAPI yoki Picogreenga qaraganda yaxshiroq signal-shovqin nisbatini ko'rsatdi. Bu erda biz uchta asosiy antikorlarni birlashtirdik: anti-dsDNA antikori (35I9 DNK) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), anti-giston-H2B antikor (Abcam, Cat# ab134211) va anti-issiqlik- shok oqsili-60 (Hsp60)antikor (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Boshqa antikorlar tanlanishi yoki giston bilan lyuminestsent bilan belgilanishi mumkin yoki Hsp60 muqobil ravishda ishlatilishi mumkin, ammo har bir kombinatsiya uchun uch marta bo'yash shartlarini optimallashtirish kerak.

Hujayralar ikki marta fosfat tamponlangan sho'r suv (PBS) bilan yuvildi va 10 daqiqa davomida 4 ◦C da muzdek sovuq metanol bilan mahkamlandi. Shu bilan bir qatorda, fiksatsiya uchun 4% paraformaldegid (PFA) ishlatilishi mumkin, ammo fon signallari ko'rinadi. PFA-fiksatsiyalangan namunalarda ancha katta. Fiksatsiyadan so'ng hujayralar har biri 5 daqiqa davomida Tween 20 (PBST) bilan fosfat tamponlangan sho'r suv bilan uch marta yuvildi. Hujayralar 10 daqiqa davomida 0,2% (w/v) Triton X-100 ni o'z ichiga olgan PBS bilan o'tkazuvchanlikka ega bo'ldi.

Har safar 5 daqiqa davomida PBST bilan uch marta yuvilgandan so'ng, hujayralar PBSTda 2% (w/v) sigir sarum albumini (BSA) bilan 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Hujayralar PBST O/N da 4 ◦C da 2% (w/v) BSAda suyultirilgan birlamchi antikor, anti-giston-H2B antikor (1/400, Abcam, Cat # ab134211) bilan inkubatsiya qilindi. Har safar 5 daqiqa davomida PBST bilan uch marta yuvilgandan so'ng, hujayralar Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17) bilan inkubatsiya qilindi. }}) xona haroratida (RT) 1 soat davomida PBSTda 2% (v/v) BSAda suyultiriladi.

PBST bilan har safar 5 daqiqa davomida uch marta yuvilgandan so'ng, hujayralar birlamchi antikorlar va anti-dsDNA antikorlari (35I9 DNK) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) va antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. -Hsp60 antikori (1/400, Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB{13}}) PBSTda 2% (v/v) BSAda suyultirilgan RT da 1 soat yoki kechasi (O/N) da 4◦C.

Har safar 5 daqiqa davomida PBST bilan uch marta yuvilgandan so'ng, hujayralar yuqori darajada o'zaro adsorbsiyalangan Alexa Fluor 680-konjugatsiyalangan Eshak anti-Rabbit IgG(H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043) bilan inkubatsiya qilindi. , RRID: AB_2534018) ​​va Donkeyanti-Sichqoncha IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073)2% (s/h) suyultirilgan RT da 1 soat davomida PBST da BSA.

Hujayralar har safar 5 daqiqa davomida PBST bilan uch marta yuvildi va namuna A1R+ konfokal mikroskop (Nikon, Tokio, Yaponiya) yordamida tahlil qilindi.

For more information:1950477648nn@gmail.com