Ⅰ qism: autosomal dominant polikistik buyrak kasalligi bilan og'rigan bemorlarning eritroid progenitator hujayralaridan hosil bo'lgan buyrak organoidlari

qo'shimcha ma'lumot uchun:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice va boshqalar.

Kirish

Avtosomal dominant polikistikbuyrak kasalligi(ADPKD) butun dunyo bo'ylab surunkali buyrak kasalligining (CKD) eng ko'p uchraydigan genetik sababi bo'lib, u eng keng tarqalgan irsiy monogen kasalliklardan biri bo'lib, taxminan 1:400-1000 [1].ADPKD (Avtosomal dominant) polikistikbuyrak kasalligi) mos ravishda polikistin-1(PC1) va polikistin-2 (PC2) ni kodlovchi PKD1 (1-toifa polikistik buyrak kasalligi) va PKD2 (2-toifa polikistik buyrak kasalligi) genlaridagi mutatsiyalar natijasida yuzaga keladi, natijada siliya o'zgarishi va kist shakllanishi. Ikkala oqsil ham ko'plab molekulyar yo'llarni, shuningdek, to'qimalarning morfogenezi va funktsiyasini modulyatsiya qiladi. Biroq, sistogenezning aniq molekulyar mexanizmlari noaniqligicha qolmoqda. Sistogenez uchun germline mutatsiyasidan keyin normal alleldagi somatik mutatsiya (ikkinchi zarba) zarurligi yaxshi qabul qilingan [2,3]. Bundan tashqari, sichqonchaning ortologik modellari natijalariga ko'ra, etuk buyraklarda kistaning tez va og'ir o'sishi uchun qo'shimcha buyrak insultatsiyasi (uchinchi zarba) zarurligi ko'rsatildi [4,5]. Ko'rinib turibdiki, odamlarda ko'pincha ikkinchi xitlar buyrak rivojlanishida sodir bo'ladi, bu esa hatto bachadonda ham kista shakllanishiga va o'sishiga olib keladi. Shuning uchun PKD1 (1-toifa polikistik buyrak kasalligi) va PKD2 (2-toifa polikistik buyrak kasalligi) mutatsiyalari natijasida kelib chiqqan buyrak kasalligining og'irligi va rivojlanish tezligiga bir qancha omillar ta'sir qilishi mumkin, jumladan genlarning inaktivatsiyasi vaqti, buyrak rivojlanishi. bosqich, atrof-muhit ta'siri, birga keladigan buyrak lezyonlarining mavjudligi va genetik mutatsiyalarning xilma-xilligi.

ODPKD ning patofizyologik mexanizmlari (autosomal dominant polikistik) haqida son-sanoqsiz ma'lumotlar mavjud bo'lsa-da.buyrak kasalligiSichqonchaning ortologik va orfologik bo'lmagan modellarini qo'llagan tadqiqotlar natijasida to'plangan tsistogenezning inson hujayrali modellariga qaratilgan bir nechta tadqiqotlar mavjud [6]. 2007 yilda Takahashi va boshqalar [Z] somatik hujayralarni embrion xossalariga ega pluripotent ildiz hujayralariga muvaffaqiyatli qayta dasturlashtirib, ularni "induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari" (iPSCs) deb nomladilar. O'shandan beri ko'plab somatik hujayra manbalari hayvonlar yoki inson to'qimalaridan (hiPSCs) [Z] iPSC'larga (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) qayta dasturlashtirildi, ularning asosiy manbai kattalar fibroblastlaridir. 2013 yilda Freedman va boshq.[8] ADPKD fibroblastlaridan (autosomal dominant polikistik) induktsiyalangan hiPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari)buyrak kasalligi) bemorlarni o'rganib chiqdi va polikistin-2ning kamaygan siliyer ekspressiyasini aniqladi, bu polikistik kasallikning (PKD) patofiziologiyasini tekshirish uchun bunday hujayralardan foydalanishni qo'llab-quvvatlaydi. Yaqinda Chen va boshqalar 2016 yilda eritroid progenitor hujayralaridan hiPS hujayralarini olganliklari haqida xabar berishdi [9].

So‘nggi bir necha yil ichida iPSC (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) [Z,10-12] dan 3-o‘lchamli organoidlarni yaratishda sezilarli yutuqlarga erishildi. AsosiybuyrakNaychali epiteliya organoidlari buyrak to'qimalaridan, shuningdek siydikdan olinishi mumkin va bu organoidlar Schutgens va boshqalar tomonidan ko'rsatilganidek, shaxsiylashtirilgan kasalliklarni modellashtirish uchun muhim vositadir. [13].Keyingi tadqiqotlarda Freedman va boshq.[14] hosil qila oldilarbuyrakNefronning barcha tuzilmalarini keltirib chiqaradigan meta-nefrik massada mavjud bo'lgan hujayra turlarini yaratish uchun protokolni o'rnatib, tijoratda mavjud bo'lgan hiPS hujayra liniyasidan olingan organoidlar. Keyin, PKD1 ni (1-toifa polikistikbuyrakkasallik) yoki PKD2 (2-toifa polikistik buyrak kasalligi) genlari, bu tadqiqotchilar kist shakllanishini kuzatdilar.buyraktubulalar. Ushbu ilg'or va innovatsion texnologiyalarni hisobga olgan holda, biz ADPKD (Autosomal dominant polikistik) ning aylanib yuruvchi eritroid progenitor hujayralaridan iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) olishni maqsad qildik.buyrak kasalligi)bemorlar va erta sistogenez bilan bog'liq ba'zi patofiziologik hodisalarni uyg'otishga harakat qilib, organogenezda ishtirok etgan bosqichlarni takrorlash uchun in vitroda buyrak organoidlarining rivojlanishini sinab ko'ring.

Buyrak uchun nojo'ya ta'sirlar va foydani aniqlash uchun bosing

Bemorni tanlash usullari

ADPKD (Autosomal dominant polikistik buyrak kasalligi) (PT1:66 yosh, 1,73 m2 uchun eGFR 43,8 ml/min va PT2:56 yosh/daqiqa, eGF) klinik tashxisi qo'yilgan ikki aloqasi bo'lmagan (PT1 va PT2) ayol bemorlardan qon namunalari olindi. min 1,73 m2), polikistik buyrak kasalligida kuzatilgan. San-Paulu Federal Universiteti (UNIFESP) Nefrologiya bo'limining ambulatoriya klinikasi va bitta sog'lom ayoldan boshqa namuna olindi, bu texnikani barqarorlashtirish va normallashtirish uchun nazorat bo'lib xizmat qildi. ADPKD (Avtosomal dominant polikistik buyrak kasalligi) tashxisi Pei va boshq.[15] ultratovush diagnostika mezonlariga ko'ra, ijobiy oilaviy tarixga va buyrak kistalarining mavjudligiga asoslanadi. (Oilaviy nasl-nasab S1A-rasmda keltirilgan). Ikkala bemorda ham buyrak va jigarning kistasi bor edi (magnit rezonans tasvirlari S1B-rasmda keltirilgan). Tadqiqot universitetning Etika boʻyicha maslahat qoʻmitasi (CEP UNIFESP, "Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo", Nr.1199.-0079-10/2018) tomonidan koʻrib chiqildi va tasdiqlandi. Tadqiqot maqsadini tushuntirish uchun suhbatdan so'ng, bemorlar ham, sog'lom nazorat ham xabardor qilingan rozilik shaklini imzoladilar.

To'liq qondan ajratilgan eritroid progenitor hujayralarining kengayishi Qon namunalari xona haroratida EDTA (antikoagulyant sifatida) o'z ichiga olgan vakutayner naychada yig'ildi. Keyin eritroid progenitor (EP) hujayralari RosetteSep usuli (15216; Ildiz hujayra texnologiyalari) orqali ajratildi, bu esa kerakli EP populyatsiyasini saqlab qolgan holda etuk qizil qon hujayralari va trombotsitlar kabi kiruvchi hujayralarni olib tashladi. To'liq qonda RaIning past konsentratsiyasi tufayli hujayralar kengaytirildi va sitokinlar va qo'shimchalar (X-Vivo muhiti, Lonza) bo'lgan ma'lum bir madaniyat muhitida o'stirildi. EP hujayralari transferrin retseptorlari (CD71) va oqim sitometriyasi yordamida aniqlandi. glikoforin A (Gly A) GFP bilan belgilangan belgilar sifatida (S2-rasm).

Eritroit progenitor hujayralarini qayta dasturlash

Kengaytirilgan EP xujayralari to'plangan va besh qayta dasturlash omilining optimallashtirilgan aralashmasini o'z ichiga olgan Epi5 Episomal iPSC (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) qayta dasturlash to'plami (Termo Fisher) yordamida nukleofeksiya qilingan (oktabr -4, Sox2, Lin28, L-Myc, va Klf4). Transfeksiya (elektroporatsiya) Lonza Nucleo omil to'plamidan epizomal vektorlar (virussiz, integratsiya bo'lmagan) bilan amalga oshirildi. Transfeksiyadan so'ng, hujayralar standart hujayra madaniyati sharoitida (37C, 95 foiz CO va 5 foiz O,) qayta dasturlash (Ildiz hujayra texnologiyalari) uchun ReproTeSRga xos madaniyat muhitiga qo'yildi.

Karyotiplash

Qayta dasturlash jarayoni xromosoma yaxlitligini saqlab qolganligini tekshirish uchun UNIFESP genetik bo'limida karyotip tahlili o'tkazildi. Hujayralar 5 ml iPda 100 ul kolxisin (0,08ug/ml) bilan ishlov berildi. hujayra siklini to'xtatib qo'yish uchun hujayra madaniyati muhiti, undan so'ng yadro shishini keltirib chiqarish uchun 0,075 M gipotonik KCl eritmasi qo'shildi; Keyin hujayralar metanol va sirka kislotasi (3: 1) aralashmasi bilan mahkamlangan. Metafaz xromosomalari yig'ib olindi va G-bandlarining sitogenik tahlili uchun Raytning bo'yalishi ishlatilgan (S3-rasm).

iPSC (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) koloniyalarining tavsifi

EP hujayralari tipik iPSC (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) koloniyalarini hosil qilgan epizomal vektorlar tomonidan qayta dasturlashtirildi va normal karyotipni taqdim etdi (S3-rasm). iPSC (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) koloniya xususiyatlari H9 chiziqli hujayradan (hESC, Human Embryonic Stem Cells, WA09, Wicell Research Institute, AQSHda mavjud) olingan belgilangan nazorat bilan solishtirildi. 1B-rasm). iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) tipik morfologiyani taqdim etganligi sababli, pluripotentlik belgilari immunofluoresans orqali aniqlandi. Hujayralar xona haroratida 30 daqiqa davomida 4 foizli paraformaldegid bilan mahkamlangan. Fikslashdan keyin namunalar PBS bilan uch marta yuvildi, 5% PSA va 0,3% Triton-X-100/DPBS bilan bloklandi va bir kechada asosiy antikorlar (Cell Signaling, Ma, EUA), ya'ni OCT4(1) bilan inkubatsiya qilindi. :400 suyultirish) pluripotentlik sinovi sifatida. Ertasi kuni yangi slayd tayyorlandi, PBS da yuvildi va Alexa Fluor ikkilamchi antikori (1:200 suyultirish, Cell Signaling) bilan inkubatsiya qilindi va yadro uchun DAPI (1:1000, Invitrogen, MA, AQSh) qo'shildi. identifikatsiya.

1-rasm. iPSC ni yaratish va tavsiflash(induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari). iPSC'lar sog'lom nazorat (HC) va ikki xil ADPKD bemorlarining (PT1 va PT2) kengaytirilgan eritroid progenitori (EP) hujayralaridan qayta dasturlashtirildi.

A. Buyrak organoidlarining sxematik bosqichma-bosqich avlodi B. iPSC ning o'xshashligi (a. H9 tijorat embrion hujayralaridan iPSC ning tipik tasviri. b. Sog'lom nazoratdan olingan progenitor eritroid hujayralaridan iPSC)

C. iPSC koloniyalarining morfologiyasi D. EVOS fl teskari raqamli floresan mikroskop ostida kuzatilgan iPSC pluripotentligining xarakteristikasi.

HC, PT1 va PT2 koloniyalarining pluripotentlik xususiyatini tavsiflash uchun OCT4 antikorlarini belgilash pluripotentlik belgisi sifatida ishlatilgan.

Hujayra yadrolari DAPI bilan etiketlangan (1B-rasm uchun masshtab satri: 200 mkm; 1C-rasm uchun masshtab satri: 1000 mkm; 1D-rasm uchun HC/PT2 shkalasi: 1000 mkm; 1D-shakl uchun PT1 shkalasi: 200 mkm).

iPSClarning (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) barcha uchta germ qatlamiga farqlash qobiliyati

iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) mTeSR1 madaniyat muhitida (Stem Cell Technologies, BC, Kanada) Matrigel (1:10, BD Biosciences, NY, EUA) bilan qoplangan 6-quduq plastinkalarida yetishtirildi. iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) farqlanishining oldini olish uchun koloniyalar mikroskop ostida pipet uchi bilan mexanik parchalanish yo'li bilan qo'lda o'tkazildi yoki ular Gentle Cell (Life Technologies) yordamida fermentativ hazm qilish orqali ajratildi (S4-rasm). Ushbu usullardan foydalangan holda, hujayralar qayta dasturlash omillarini to'g'ri kiritishini ta'minlash uchun iPSC'lar (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) 22 ketma-ket o'tish uchun saqlangan. Keyin iPSC'lar (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) STEMdiff Trilineage Differentiatsiya to'plami (Stem Cell Technologies) yordamida uchta germ qatlamiga differentsiatsiya qilish uchun rag'batlantirildi. Besh kundan so'ng, hujayralar mezoderma va endodermaning yoshga xos belgilarini tahlil qilish uchun yig'ib olindi va etti kundan keyin STEMdiff Trilineage Differentiatsiya protokoliga muvofiq ektoderma uchun tahlil qilindi (S5-rasm).

qRT-PCR yordamida barcha uchta mikrob chizig'ining molekulyar tavsifi

Uchta germ qatlami kulturalaridan jami RNK GE RNK Spin Mini to'plami (GE Healthcare, AQSh) yordamida ekstraksiya qilindi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq yuqori sig'imli teskari transkripsiya to'plami (Applied Biosystems, AQSH) yordamida cDNKga aylantirildi. Miqdoriy real vaqtda PCR (gRT-PCR) ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq SYBR Green PCR to'plami (Applied Biosystems, AQSH) yordamida amalga oshirildi. mRNK ifoda darajalari 2^Ct usuli yordamida hisoblab chiqilgan. Ichki nazorat sifatida gidroksimetilbilan sintaza (HMBS) va glitseraldegid 3-fosfatdehidrogenaza (GAPDH) ishlatilgan va miqdoriy nazorat sifatida OCT4 ifodasi ishlatilgan. SOX17 ifodasi endodermaga differentsiatsiyani aniqlash uchun ishlatilgan, CXCR4 mezodermaga differentsiatsiyani aniqlash uchun ishlatilgan va PAX6 ektodermaga differentsiatsiyani aniqlash uchun ishlatilgan (S6-rasm). Barcha primer ketma-ketliklari S1 jadvalida ko'rsatilgan va samaradorlik egri chizig'i har bir primer juftligi uchun baholangan.

Turli mikrob qatlamlari uchun immunofluoresans

iPSC'lar (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) oltita quduqli plitalardagi qoplamalarda farqlash uchun qo'zg'atildi. Differensiatsiyadan so'ng, qoplamalar asl quduqlardan olib tashlandi va yangi plastinkaga o'tkazildi, u erda hujayralar 4 foizli paraformaldegid bilan mahkamlangan va keyin yuqorida aytib o'tilganidek, PBS bilan yuvilgan. OCT4(1:400; Hujayra signali), CXCR4(1;100; Hujayra signali), PAX6(1:100;Termo Fisher) va SOX17 (1:100;R&D tizimlari) ga qarshi birlamchi antikorlar ishlatilgan. Flüoresans yordamida baholangan. Alexa Fluor ikkilamchi antikori (1:200; Hujayra signali).

Buyrak organoidlarini iPSC dan farqlash (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari)

Renalorganoidlar Cruz va boshqalar tomonidan tasvirlangan protokolga muvofiq yaratilgan. [6] ba'zi moslashuvlar bilan. Qisqacha aytganda, HC va ikkita ADPKD (autosomal dominant polikistik buyrak kasalligi) bemorlaridan olingan 50,{2}} iPSC (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) Accutase detachment eritmasi (Stem Cell Technologies) bilan bitta hujayra suspenziyalarini ishlab chiqarish uchun ishlatilgan. Yagona hujayralar 10uM Rho-kinase inhibitori (Y27632, Stem Cell Technologies yoki Stemgent) bilan to'ldirildi. 16 soatdan keyin madaniyat muhiti 1 ml mTeSR1 plyus 2,5 foiz Matrigel plyus 10 mkm Y27632 bilan almashtirildi. 20 soatdan keyin muhit faqat 1 ml mTeSRI bilan almashtirildi; 14 soatdan keyin madaniyat muhiti almashtirildi va hujayralar induktsiya qilindi. 6 uM CHIR99021 (AT104; Ildiz hujayra yoki Stemgent GSK-3b inhibitori/Wnt yoʻl agonisti) va Advanced RPMI (Thermo Fisher) va Glutamax (Life Technologies) va 10 ug/ml antibiotik (Ampitsillin; 1:10) ). Nihoyat, 36 soatdan keyin madaniyat muhiti Advanced RPMI (Thermo Fischer) va Glutamax (Thermo Fischer) va B27 Supplement (17504-044; Life Technologies) va antibiotikni o'z ichiga olgan DRB muhiti bilan almashtirildi. DRB muhiti har uch kunda 28 kun davomida o'zgartirildi. Organoidlarni mikroskopda ko'rish uchun bu muddat (28 kun) etarli edi.

RT-PCR yordamida organoidlarning molekulyar tavsifi

Yarim miqdoriy gen ifodasi embrionogen jarayon davomida RT-PCR tomonidan baholandi, umumiy RNK 0 (iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari)) va 14,21, 28 va kunlarda hosil bo'lgan hujayra tuzilmalaridan tozalandi. Differensial induksiyadan keyin 35 kun. WT1 (rivojlanayotgan buyrak), AQP1 (proksimal naycha) va ECAD (kist epiteliya belgisi) ifodasi baholandi. GAPDH ichki nazorat sifatida ishlatilgan. OCT4 ifodasi miqdoriy standart sifatida ishlatilgan.

Natijalar

Eritroit progenitatorlaridan (EP) iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) olish

Eritroit progenitatorlaridan buyrak organoidlarini olish uchun qo'llaniladigan protokol umumlashtiriladi. RaIning kengayishi natijasida taxminan 20 kundan so'ng 1x10 darajali hujayralar paydo bo'ldi (S2A-rasm) va taxminan ikki oy o'tgach, RaIlar CD71 va Gly A belgilarini ifodalash orqali aniqlandi. Ajratish usulining samaradorligi ifodani aniqladi; hujayralarning 88 foizi CD71 musbat, 57,4 foizi esa Gly A musbat edi (S2BFig).

Hujayralarning RaI ekanligini tekshirgandan so'ng, ular qayta dasturlash omillari (Okt-4, Sox2, Lin28, L-Myc va klf4) bilan transfektsiya qilindi va keyin qayta dasturlash uchun maxsus muhitda saqlangan (ReproTeSR, Stem Cell Technologies) taxminan besh kun. iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) bir xil hujayra madaniyatida mavjud bo'lgan qayta dasturlashtirilmagan hujayralardan farqli morfologiyaga ega bo'lgan koloniyalarni hosil qilish orqali tipik hujayra xususiyatlarini ishlab chiqdi. Tijoriy H9 hujayra liniyasi koloniyalariga (Eig 1B) o'xshash tipik iPSC (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) koloniyalari kuzatilgunimizcha hujayralar kuzatildi. qattiq hujayrali qadoqlash, aniq belgilangan bir hil shakli va muntazam qirralari. Identifikatsiyaga oziqlantiruvchisiz qayta dasturlash muhitida differentsiatsiyalangan hujayralardan koloniyalarning past darajada o'sishi yordam berdi (Mas. 1C). 1D-rasmda ko'rsatilganidek, koloniya morfologiyasi va pluripotentlik belgilari bo'yicha HC va ADPKD (Autosomal dominant polikistik buyrak kasalligi) bemorlaridan (PTl va PT2) iPSC koloniyalari o'rtasida aniqlangan farqlar topilmadi.

iPSC'lar (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) uchta germ qatlamiga differensiallanish qobiliyati bilan ajralib turardi. HC hujayralarida mikrob qatlami rivojlanishining odatiy tasvirlari S5-rasmda ko'rsatilgan. Uchta mikrob qatlamining rivojlanishi tipik morfologiya (Mas. 2A) va differentsiatsiya belgilari uchun immunofluoressensiya belgilari bilan, ya'ni endo-derma uchun FOXA2 bilan tasdiqlangan. , mezoderma uchun silliq mushak aktin (SMA) va ektoderma uchun SOX2 (Eig2B-2D). Antikorlar uchun salbiy nazorat S7 da ko'rsatilgan. 2E-rasmda RT-PCR tomonidan aniqlangan endoderma (SOX17), mezoderma (CXCR4) va ektoderma (PAX6) ning o'ziga xos belgilarining gen ekspresyon darajalari ko'rsatilgan.

2-rasm. Uchta germ qatlamining xarakteristikasi. Sog'lom nazorat (HC) va ADPKD1 bemorlari (PT1 va PT2).

A. Uchta germ qatlamining tipik morfologiyasi. Germ qatlamlari o'ziga xos antikorlar yordamida immunofluoresans bo'yash bilan tavsiflangan. B. Endoderma (FOXA2),

C. Mezoderma (SMA) va D. Ektoderma (SOX2). Hujayra yadrolari DAPI bilan bo'yalgan. Oxirgi ustunlar birlashtirilgan rasmlarni ko'rsatadi.

E. OCT4 gen ifodasi iPSClarning pluripotentligini ko'rsatadi, SOX17 endoderma uchun marker, CXCR4 mezoderma uchun marker va PAX6 ektoderma uchun marker edi (n=2).

iPSCs tomonidan OCT4 ifodasi ichki miqdoriy nazorat sifatida ishlatilgan. OCT4 ifodasi uchta germ qatlamining hujayralarida aniqlanmadi (shkala: 200 mkm).

iPSC dan buyrak organoidlarini yaratish (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari)

Uch o'lchovli buyrak tuzilmalari HC va ikkala ADPKD (autosomal dominant polikistik buyrak kasalligi) dan olingan iPSC'lardan (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) embrion rivojlanishini takrorlaydigan bosqichlardan so'ng yaratilgan. 3-rasmda tegishli embrion tuzilmalarni olish uchun zarur bo'lgan bosqichlar ko'rsatilgan. iPSC (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) koloniyalari (masalan, 3A) bitta iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) olish uchun Accutase (3B-rasm) bilan ajralib chiqdi (3C-rasm). Oddiy embriogenik jarayonni hisobga olsak, koloniyalar blastulaga, so'ngra gastrulaga differensiallanishi kutiladi, ammo madaniyatda iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) ning o'z-o'zidan farqlanishi hali ham qiyin, chunki hujayralar o'z-o'zidan apoptozdan o'tadi [16]. Ushbu istalmagan natijani chetlab o'tish uchun ROCK signalizatsiya inhibitori (10 mkM Rho-kinase inhibitori Y27632) bir hujayrali bosqichdan 16 soat o'tgach qo'shildi. ROCK yo'lining inhibisyonu hujayralarni o'lim yo'llarini qo'zg'atishiga to'sqinlik qiladi, bu ularga omon qolish va differentsiatsiya jarayoniga moslashishga imkon beradi. Keyin iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari) sferoid bo'shliqlar mavjudligi bilan tavsiflangan epiblast bosqichiga etgunga qadar o'sdi (3D-rasm). Keyinchalik, kuchli GSK{12}}b inhibitori/Wnt yoʻl agonisti (CHIR99021) qoʻshildi, undan soʻng epiteliya-mezenxima oʻtishini (3E va 3E-rasm) va nihoyat mezenxima-epitelial oʻtishni (3E va 3E-rasm) qoʻshish uchun DRB muhiti qoʻshildi. 3G-rasm); bu bosqichlar epitelizatsiya va tubuladan oldingi agregatlar va buyrak pufakchalarining ketma-ket shakllanishiga imkon berdi (Masalan 3H), natijada buyrak tubulali organoidlarning shakllanishiga imkon berdi (3D-rasm). Bularning barchasi in vitro embriogenez bosqichlari ikkala HC va ADPKD (autosomal dominant polikistik buyrak kasalligi) bemorlaridan olingan hujayralar uchun o'xshash edi.

Naychali tuzilmalarning mavjudligi immunofloressensiya orqali maxsus markerlarni ifodalash orqali tekshirildi: proksimal kanalchalar uchun NHE3 va AQP1 (Eig4A) va glomerullar uchun NPHS2 (Eig 4B). Aksincha, AQP2 yorlig'i aniqlanmadi (Eig 4B), bu buni tasdiqlaydi. metodologiya faqat metanefrik massaning rivojlanishiga imkon berdi, ammo siydik pufagining emas. ECAD belgisi forskolin yo'qligida aniqlanmadi (4B-rasm).

Progenitor buyrak rivojlanishi jarayonida ifodalangan o'ziga xos belgilar mavjudligini tekshirish uchun barcha namunalar (HC, PT1 va PT2) butun differentsiatsiya jarayonining besh nuqtasida to'plangan: kun 0(iPSCs (induktsiyalangan pluripotent ildiz). hujayralar)), 14,21,28 kun, keyin esa 35-kuni (kist induksiyasidan 7 kun o'tgach). Genni ifodalash vaqti 5A-5C-rasmda ko'rsatilganidek, embriogenez jarayonida differentsiatsiyani aniqladi. OCT4 pluripotentlik belgisi iPSCs (O kuni) tomonidan ifodalangan, ammo uning darajalari 14 kun davomida kamaygan va farqlanishdan keyin juda past darajaga etgan. Bundan farqli o'laroq, metanefrik mezenxima (WT1) va proksimal tubula (AQP1)ning o'ziga xos belgilarining ifodasi differentsiatsiya jarayoni 14-kunda boshlanganda bosqichma-bosqich ortib, 21-kunga kelib platoga yetib boradi. 5D-rasmda ECAD, sistogenez ifodasi ko'rsatilgan. marker, 35-kuni, ya'ni forskolin tomonidan kist induksiyasidan 7 kun o'tgach. Forskolin bo'lmaganda, ECAD ifodasi hatto ADPKD (Autosomal dominant polikistik buyrak kasalligi) bo'lgan bemorlarda juda past edi. Biroq, forskolin qo'shilganda (28 kun), ikkala bemorda ECAD ifodasi kuchaygan; ammo forskolin borligida ham ECADexpressionning past darajalari bilan qolgan HC organoidida xuddi shunday naqsh kuzatilmadi.

Forskolin bilan qo'zg'atilgan organoidlardan hosil bo'lgan kistlarning mavjudligi, Eig6da ko'rsatilganidek, ADPKD (Autosomal dominant polikistik buyrak kasalligi) uchun aniq edi. Yuqori panelda organoidlarning 28-kuni, forskolin qo'shilishidan oldin (Eig6Aa) tasvirlari ko'rsatiladi. forskolin ikkala bemorning (PT1 va PT2) namunalarida kistaga o'xshash tuzilmalar mavjudligini ko'rsatadi, ammo HC namunasida emas. Kistlarning mavjudligi immunofluoresans bo'yash orqali ham tekshirildi (6B-rasm). HC organoidida ECAD yorlig'i aniqlanmadi, lekin ikkala bemorning organoidlarida aniq kuzatildi. Qizig'i shundaki, kist lümenining mavjudligi ham kuzatilishi mumkin.

3-rasm. Naychali organoidlarni hosil qilish.

HC, PT1 va PT2 guruhlaridan hosil bo'lgan iPSC'lardan 28 kun ichida epitelial naychali buyrak organoidlarini ishlab chiqarishning fazali kontrastli tasvirlari. Birinchi 36 soat ichida iPSClar 3D madaniyatida saqlangan.

Keyin ular ajralib chiqdi, bitta hujayraga aylantirildi va Y-27632 bilan davolash qilindi, bu hujayralarni qayta tashkil etish va omon qolish imkonini berdi, epiblast sferoidlarini (d) hosil qildi.

Keyin, CHIR99201 va DRB qo'shildi, Wnt / -katenin yo'lini faollashtirdi va quvurli organoidlarga (I) differensiallashishga imkon berdi.

ADPKD bemorlaridan va HC donoridan olingan sferoidlar orasida morfologiya o'xshash. (a va f uchun masshtab satri: 1000 mkm; b, cd, e, g, h va i uchun masshtab paneli: 200 mkm).

QISM UCHUN SHU YERGA BOSINGⅡ