Siklooksigenaza (COX-2) va gipoksiya sabab bo'lgan kasallik o'rtasidagi aloqa

qo'shimcha ma'lumot uchun:ali.ma@wecistanche.com

Hujayra ichidagi prostaglandin E2 gipoksiyadan kelib chiqqan proksimal naycha hujayralarining o'limiga yordam beradi.

Coral Garsia-Pastorl, Selma Benito-Martines, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandes-Martinez, Fransisko J. Lucio-Cazana

Proksimal quvurli hujayralar (PTC) gipoksiya sabab bo'lgan apoptozga ayniqsa zaifdir.buyrak kasalligi. Biz bu erda gipoksiya ostida PTC o'limiga siklooksigenaza (COX-2) ga bog'liq bo'lgan prostaglandin E (PGE,) ishlab chiqarilishi vositachilik qiladi, deb faraz qildik, bu inson proksimal quvurli HK-2hujayralarida tasdiqlangan, chunki gipoksiya. (1 foiz O,) tufayli kelib chiqqan apoptoz (i) COX-2(siklo) bilan oldini oldi.-oksigenaza) inhibitori va prostaglandin (EP) retseptorlari antagonistlari va (ii) gipoksiya qo'zg'atuvchi omil-1 -COX ning transkripsiyaviy ko'tarilishi{{3} tufayli hujayra ichidagi PGE (iPGE,)ning oshishi bilan bog'liq edi. }}(siklo-oksigenaza). Apoptoz prostaglandinlarni qabul qilish tashuvchisi PGT ingibitorlari tomonidan ham oldini oldi, bu iPGE gipoksiyadan kelib chiqqan apoptozga hissa qo'shishini ko'rsatdi (aksincha, gipoksiya/reoksigenatsiya natijasida PTC o'limi faqat hujayradan tashqari PGE tufayli sodir bo'lgan). Shunday qilib, iPGE gipoksiya sabab bo'lgan naycha shikastlanishi patogenezida yangi aktyor bo'lib, PGT buyrak kasalliklarida gipoksiyaga bog'liq lezyonlarning oldini olish uchun yangi terapevtik maqsad bo'lishi mumkin.

Naychali gipoksiya ham o'tkir, ham surunkali holat uchun tegishli omil ekanligi yaxshi ma'lumbuyrak kasalligi'2 Proksimal quvurli hujayralar (PTC) kislorod iste'moli nuqtai nazaridan juda faoldir, chunki ularning energiya talab qiluvchi reabsorbtsiya faoliyati va shuning uchun ular gipoksiyaga zaifdir. Apoptoz gipoksiyaga duchor bo'lgan madaniyatli PTCda tegishli rol o'ynashi ko'rsatilgan, ammo apoptotik mexanizmni faollashtirish uchun mas'ul bo'lgan signalizatsiya yo'llari o'rganilmagan. Biz va boshqalar ko'plab fiziologik va patologik jarayonlarning muhim lipid vositachisi prostaglandin E (PGE,) ekanligini aniqladik.buyrak, sisplatin7, albumin8 yoki leptin va gentamitsin bilan davolashda PTC apoptoziga olib keladigan signalizatsiyada tegishli rol o'ynaydi. Barcha holatlarda PGE ning o'sishi siklooksigenaza -2(COX-2) ning kuchaygan ifodasiga bog'liq ekanligi aniqlandi.(siklooksigenaza), COX{0}}l ​​bilan birgalikda prostaglandinlar sintezida tezlikni cheklovchi bosqich bo'lgan induksiyalanuvchi ferment. Insondabuyrak, bazal COX-2(siklooksigenaza)ifoda COX-1ga qaraganda kamroq intensivdir. COX-2(siklooksigenaza)fiziologik sharoitda podotsitlar va Henle halqasining qismlarida va buyrak tomirlarida aniqlangan10. Ammo patologik holatlarda COX{1}} immunoreaktivligi ko'plab hujayralardagi hujayralarda bo'lishi mumkin.buyrakPTC, shu jumladan, va, ehtimol, buyrak shikastlanishiga hissa qo'shadi. Qizig'i shundaki, gipoksiya COX-2 ifodasini oshiradi.(siklooksigenaza)va/yoki ko'p hujayra turlarida PGE,12-i7 ishlab chiqarish. Aslida, biz ilgari gipoksiya PGEdagi hujayra ichidagi tarkibni, shuningdek, hujayradan tashqari muhitga chiqarilishini kuchaytirganini aniqladik8. Shuning uchun PGE hipoksiyaning PTCga apoptotik ta'siriga vositachilik qilishi nazariy jihatdan mumkin.

PGE ga bog'liq apoptoz bo'yicha ko'pgina tadqiqotlar asosan hujayradan tashqari PGE bilan bog'liq mexanizmlarga qaratilgan, chunki PGE o'zining biologik ta'sirini plazma membranasini o'z ichiga olgan G-oqsil bilan bog'langan PGE, retseptorlari (E seriyali prostaglandin retseptorlari) faollashtirish orqali amalga oshirishi keng e'tirof etilgan. EP1-4) 1. Shunga qaramay, ba'zi modellarda hujayra ichidagi PGE (iPGE,) apoptotik hujayralar o'limiga ta'sir qiladi720-22. Bu apoptozni qo'zg'atish uchun PGE yana hujayra ichidagi muhitga etib borishi va hujayra ichida joylashgan EP retseptorlarining bir qismini faollashtirishi kerakligini anglatadi (iEP retseptorlari). PGE ni ushlash vazifasi asosan prostaglandinlarni qabul qilish tashuvchisi (PGT)23-26 tomonidan bajarilganligi sababli, PGT inhibisyonu iPGE vositachiligida apoptotik hujayralar o'limining oldini oladi7.

Ushbu fonni hisobga olgan holda, biz ushbu ishda COX-2 mavjudligini o'rgandik.(siklooksigenaza)iPGE ning -bog'liq o'sishi, darajalar PTCda gipoksiyadan kelib chiqqan apoptozga vositachilik qiladi.

Buyrak kasalligi uchun organik Cistanche uchun bosing

Usullari

Reaktivlar.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, kristalli binafsha, tripan koʻk eritmalari, Bromosulfoftalein (BRS), 3-(5'-Hidroksimetil2'-furil)-1-benzil indazo), va aktinomitsin D Sigma kompaniyasidan (Sent-Luis, MO, AQSh) sotib olingan. Z-VAD-FMK va selekoksib mos ravishda Calbiochem (Darmshtadt, Germaniya) va Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, AQSh) dan edi. TriReagent Vitro (Madrid, Ispaniya) dan, PVDF membranalari va Western blotting luminol reagenti Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. USA) dan sotib olindi. }}fenil indol (DAPI), anneksin-V-FITC (fluoressen izotiyosiyanat)/propidiy yodid (PI) apoptozni aniqlash to'plami va 2',7'-diklorofloressein diasetat (DCFH-DA) zondi Invitrogen(Carls) dan sotib olindi. AQSH) va Molekulyar problar (Oregon, AQSh) mos ravishda. Antikorlar quyidagi manbalardan olingan: anti-PGE va anti-COX-2(siklooksigenaza)antikorlar Abcamdan (Kembrij, Buyuk Britaniya); anti-Bax va anti-Bcl-2 Santa Cruz Technologies kompaniyasidan (Santa Cruz, CA.USA); anti-HIF-la antikori va -rabbit-Alexa-Fluor 488 mos ravishda BD Biosciences (Palo Alto, CA, AQSh) va Invitrogen (Karlsbad, CA, AQSh) kompaniyalaridan edi; anti- -aktin va quyon sichqonchaga qarshi IgG peroksidaza konjugati Sigma kompaniyasidan (Sent-Luis, MO, AQSH) xarid qilingan.

Hujayra madaniyati va eksperimental sharoit.

Insonning proksimal quvur shaklidagi HK-2 hujayralari American Type Culture Collection(ATCC) (Rockville, MD, AQSH) dan sotib olindi. Hujayralar 5 foiz CO, 37 daraja Cin DMEM/F12 da, 10 foiz homila sigir bilan to'ldirildi. sarum (FBS), 1 foiz penitsillin/streptomitsin/amfoteritsin B va 1 foiz glutamin (Invitrogen. Carlsbad, CA, AQSH) va 1 foiz insulin-transferrin-selen (ThermoFisher. Grand Island, NY, AQSH). Barcha tajribalarda hujayralar. 70-90 foiz qoʻshilish joyida qoplangan va toʻliq biriktirilgach, ular gipoksik (1 foiz kislorod) yoki normoksik sharoitda (21 foiz kislorod) ekilgan.Gipoksiyatajribalar In vivo200 da o'tkazildigipoksiyaish stantsiyasi (Ruskin Technology, West Yorkshire, Buyuk Britaniya). Uchungipoksiya/reoksigenatsiya tajribalari, hujayralar o'tkazildigipoksiya24 soat davomida, keyin esa hujayralar normoksik sharoitda 3 soatgacha inkubatsiya qilindi (reoksigenatsiya davri).

iPGE ning immunofluoresans tahlili va COX ning Western blot tahlili-2(siklooksigenaza)va HIF-1 .

Immunofluoressensiya tahlili va Western blot tahlili uchun hujayralar mos ravishda shisha qoplamlarga (4 × 104 hujayra/shisha qoplamasi) yoki olti quduqli plitalarga (15 × 104 hujayra/quduq) bo'lindi va "Natijalar" da tavsiflanganidek inkubatsiya qilindi. Keyin immunofluoresans va immunoblotting tahlillari asosan yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi.Tanaga qarshi ishlaydigan suyultirishlar: PGE uchun 1/50, COX uchun 1/1000-2(siklooksigenaza)/HIF-1a/a-quyon-Alexa-Fluor 568 va -aktin uchun 1/5000. Immunofloressensiyani aniqlash Leica SP5 konfokal mikroskopi (Leica Microsystems, Wetzlar, Germaniya) yordamida Biomedikal tadqiqot tarmoq markazining Bioinjeneriya, biomateriallar va nanomedicine (CIBER-BBN) konfokal mikroskopiya xizmati (ICTS 'NANBIOSIS'U17) orqali amalga oshirildi. Alkal universiteti, Madrid, Ispaniya)

Vaqtinchalik transfeksiya.

siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), yovvoyi turdagi inson 15-gidroksi-prostaglandin dehidrogenazasi (p15-PGDH) cDNKsini o'z ichiga olgan pcDNA3 sutemizuvchilar ifoda vektori bilan vaqtinchalik transfeksiya. Inson COX uchun lusiferaza reportyor plazmid konstruksiyalari-2(siklooksigenaza)phPES2-Luc, insongipoksiyajavob elementi (HRE)p9HIF1-Luc va R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) va lusiferaza faolligini aniqlash boshqa joyda tasvirlanganidek amalga oshirildi27,28.

Hujayralar soni va hujayra/yadro morfologiyasi.

Yopishqoq hujayralar soni o'zgartirilgan kristalli binafsha rangga bo'yash usuli bilan spektrofotometrik tarzda aniqlandi. Apoptozning dalillarini aniqlash uchun fazali kontrastli mikroskop yordamida hujayra morfologiyasi kuzatildi. Hujayra yadrolari DAPI bilan DNK bo'yalganidan so'ng, avvalroq ta'riflangan 0, tekshirilgan tipik apoptotik morfologiyaga hujayra qisqarishi, yadro kondensatsiyasi va parchalanishi va apoptotik jismlarning shakllanishi kiradi. Miqdorni aniqlash uchun apoptozga o'xshash ko'rinishga ega yadrolarning foizini baholash uchun har bir eksperimental holatda oltita maydon ko'r-ko'rona tekshirildi.

Oqim sitometriyasi apoptozi tahlili va tripan ko'k bo'yoqni istisno qilish testi orqali hujayra hayotiyligini tahlil qilish.

Plastinaga yopishgan hujayralar tripsinizatsiya yo'li bilan ajratildi va avval madaniyat muhitidan olingan ajratilgan hujayralar bilan birgalikda tahlil uchun foydalanildi.

Annexin-V-FITC/PI apoptozni aniqlash to'plami yuqorida tavsiflanganidek, apoptotik va nekrotik HK-2 hujayralarining oqim sitometriyasini aniqlash imkonini berdi7. Erta va kech apoptoz hujayralar mos ravishda anneksin V bo'yalishi va ikkalasi ham, V aneksin ham ijobiy bo'ldi. bo'yash. Nekrotik hujayralar faqat PI uchun ijobiy bo'lgan va jonli HK-2 hujayralarida bo'yash yo'q edi.

Hujayra hayotiyligini baholash uchun tripan ko'k bo'yoqni istisno qilish testi ishlatilgan. Hayotiy hujayralar (oq) va o'lik hujayralar (ko'k) yorug'lik mikroskopi va gemositometr yordamida hisoblangan.

Statistik tahlil.

Har bir tajriba kamida uch marta takrorlandi. Natijalar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi. Ular bir tomonlama dispersiya tahlilidan (ANOVA) so'ng Bonferronining bir nechta taqqoslash testidan o'tkazildi. Muhimlik darajasi P 0 dan kam yoki unga teng boʻlgan.05.

Natijalar

Gipoksiya proksimal naychali HK-2 hujayralarining o'limiga olib keladi.

Gipoksiyakristalli binafsha rang tahlili bilan baholangan HK-2 hujayralari sonini kamaytirdi (la-rasm), shuningdek, hujayraning yaxlitlanishi va plastinkadan ajralishini keltirib chiqardi (lb-rasm, yuqori panel). Kutilganidek,gipoksiyaapoptozning aniq morfologik xususiyatlariga ega bo'lgan hujayra o'limi modelini ishga tushirdi (Shakl lb, pastki panelda, chapda DAPI bilan yadroviy bo'yash), masalan, muhim yadro kondensatsiyasi, parchalanish va apoptotik o'xshash jismlarning shakllanishi bilan hujayra qisqarishi.Gipoksiya-induktsiyalangan apoptoz, oqim sitometriyasi bilan baholanganidek, anneksin V-FITC bo'yashining ko'payishi va uni pan-kaspaza inhibitori Z-VAD-FMK bilan oldini olish bilan tasdiqlandi (lc-rasm).Gipoksiyashuningdek, yashovchan hujayralar sonining kamayishini aniqladi, lekin nekrotik hujayralar sonida statistik jihatdan muhim o'zgarishlarni keltirib chiqarmadi (lc-rasm, ichki qism).

1-rasm. Gipoksiya proksimal naychali HK-2 hujayra o'limiga olib keladi.(a) Hujayralar sonining kamayishi (kristal binafsha rang tahlili). (b) apoptozning morfologik xususiyatlari. Fazali kontrastli fotomikrograflar (yuqori panel, asl kattalashtirish, 10 ×) DAPI bo'yash fotomikrograflari (pastki panel, original kattalashtirish, 40 ×). (c) apoptozning ko'payishi (oqim sitometriyasini o'rganish). Anneksin V plyus hujayralari Anneksin V plyus/propidiy yodid-hujayralari (ya'ni, plazma membranasi yaxlitligi saqlanib qolgan erta apoptotik hujayralar) va anneksin V plyus/propidiy yodid plyus hujayralari (ya'ni, kech apoptotik hujayralar) dan iborat. Inset: Hujayra populyatsiyalarining turlari (Annexin V-/ propidium yodid plyus hujayralar nekrotik hujayralar va anneksin V-/ propidium yodid - tirik hujayralar). Natijalar hodisalarning umumiy soniga nisbatan foizlarda ifodalanadi. Umumiy ma'lumot: (1) Hujayralar "Usullar?" da ko'rsatilganidek, normoksik (21 foiz O2) yoki gipoksik (1 foiz O,) sharoitlarda 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Pan-kaspaza inhibitori Z-VAD-FMK （25 mM） ta'sir qilishni boshlashdan 1 soat oldin qo'shiladigipoksiya. (2) Mikrofotosuratlar uchta mustaqil tajribaning namunaviy namunasidir. Grafiklardagi chiziqlar va xato chiziqlari: Har bir satr 3 xil tajribaning o'rtacha ± SEM ni ifodalaydi *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">gipoksiya;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">gipoksiyaplus ZVAD.

COX-2(siklooksigenaza)/iPGE,/EP retseptorlari yo'li gipoksiya sabab bo'lgan proksimal quvurli HK-2 hujayralari o'limiga vositachilik qiladi.

COX rolini baholash uchun-2(siklooksigenaza)/iPGE2/EP retseptorlari yo'ligipoksiya-HK-2 hujayra o'limiga olib keldi, biz avval hujayralarni selekoksib, COX-2 bilan oldindan inkubatsiya qildik.(siklooksigenaza)inhibitor1; AH6809, EP1, EP2 va EP3 retseptorlari antagonisti yoki GW627368X, EP4 retseptorlari33 antagonisti; yoki bromokrezol yashil yoki bromosul-foftali bilan ularning ikkalasida PGT435.PGT inhibitörleri ham siRNK bilan transfeksiya orqali urib tushirildi.

2-rasm. COX-2(siklooksigenaza)/iPGE,/EP retseptorlari yo'li gipoksiyadan kelib chiqqan proksimal quvurli HK-2 hujayralari o'limiga vositachilik qiladi.(a) yo'lning ingibitorlari tomonidan hujayra o'limining oldini olish. Yuqori panel; Chiziqlar umumiy hujayra o'limi foizini (chapda) yoki apoptotik anneksin V plyus hujayralar foizini (o'ngda) ko'rsatadi. Ta'sir qilishdan oldingipoksiya, hujayralar 3 mkM selekoksib (COX-2 bilan 1 soat davomida oldindan inkubatsiya qilindi.(siklooksigenaza)inhibitor）;10 mkm AH6809, （EP{2}} retseptorlari antagonisti）, 10 mkM GW627368X（EP4 retseptorlari antagonisti）; yoki 50 mkM bromokrezol yashil （BG） yoki 25 mkM bromosulfoftalein (BrS), ikkita PGT inhibitori bilan. Pastki panel: Chapda: siRNA bilan transfeksiya orqali PGTni yiqitish orqali hujayra o'limining oldini olish (tripan ko'k sho'ng'inni istisno qilish testi). Inset: PGT ni nokdaun qilish samaradorligi (Western blot analizi) O'ngda: Bromokresol yashil (BG) profilaktik ta'sirining konsentratsiyaga bog'liqligi. (b) Prostaglandinni faollashtiruvchi ferment 15-gidroksi-prostaglandindehidrogenaza (15-PGDH) cDNK (tripan koʻk boʻyoqni chiqarib tashlash testi) ni oʻz ichiga olgan sutemizuvchilar ekspresyon vektori bilan transfeksiya orqali hujayra oʻlimining oldini olish. Inset: {{ ifodasi. 11}} Transfektsion hujayralardagi PGDH (Western blot tahlili). (c)GipoksiyaiPGE ning PGTga sezgir o'sishiga olib keladi, Chapda: PGEga bog'liq bo'lgan immunofluoressensiyaning o'zi yoki DAPI bilan yadroviy bo'yash bilan birlashtirilgani ko'rsatilgan (original kattalashtirish,40×) O'ngda: Image J dasturi yordamida chap panelda taqdim etilgan tasvirlarga miqdoriy yondashuv. (d) EGFR faollashuvining ingibitori AG1478 HK-2 EGFR hujayralari o'limiga to'sqinlik qilmaydi. Hujayralar 1 soat davomida l mM AG1478 bilan inkubatsiya qilingan.gipoksiya. （e） PGT inhibitori BG HK-2 hujayralarida Bax va Bcl-2 ifodasini o'zgartirmaydi.gipoksiya(Western blot tahlili). (f) oldini olishgipoksiya/ yo'lning ingibitorlari tomonidan reoksigenatsiya natijasida hujayra o'limi (tripan ko'k bo'yoqni istisno qilish testi). Hujayralar yo'lning ingibitorlari bilan oldindan inkubatsiya qilingan va ta'sirlangangipoksiya(a) dagi kabi. Keyin hujayralar 3 soat davomida normoksiyaga duchor bo'ldi. Umumiy ma'lumot: (1) Hujayralar "Usullar"da ko'rsatilganidek, normoksik (21 foiz O,) yoki gipoksik (1 foiz O,) sharoitlarda 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. (2) Mikrofotosuratlar uchta mustaqil tajribaning namunaviy namunasidir. (3) Inhibitorlarning erituvchilari (luL/ml muhit) ta'sirini o'zgartirmadigipoksiyahujayra o'limi haqida (natijalar ko'rsatilmaydi). (4) Western blot tahlili: Proteinning tengligi anti- -aktin yoki anti-GAPDH antikori bilan tekshirish orqali tasdiqlandi. (5) Grafiklardagi chiziqlar va xato satri: Har bir satr 3 xil tajribaning oʻrtacha±SEM koʻrsatkichini bildiradi.*P<0.01><0.01>gipoksiyayokigipoksiya/reoksigenatsiya.

2a-rasmda ko'rsatilganidek,gipoksiya- barcha holatlarda proksimal naychali hujayralar o'limining oldi olindi. Selekoksib tomonidan apoptozni inhibe qilish COX-2 ekanligini ko'rsatdi.(siklooksigenaza)da tegishli rol o‘ynaydigipoksiya-induktsiya qilingan apoptotik hujayra o'limi (2a-rasm, yuqori panel, o'ngda). Aniqrog‘i, apoptozning EP retseptorlari antagonizmi orqali oldini olganligi, apoptozning COX-2 vositachiligida ekanligini ko‘rsatadi.(siklooksigenaza)-PGE ishlab chiqarishga bog'liq. Boshqa tomondan, iPGE hissa qo'shishi mumkingipoksiya-HK-2 hujayra o'limiga sabab bo'ldi, chunki u (i) PGT ni inhibe qilish (2a-rasm) yoki (i) iPGE2 ni o'z orqali faolsizlantiruvchi 15-PGDH (2b-rasm) haddan tashqari ekspressiyasi bilan oldini oldi. oksidlanish25 (esda tutingki, transfeksiya jarayoni HK-2 hujayralarining sezgirligini oshirdi.gipoksiya: transfektsiya qilinmagan hujayralardagi 15-20 foizga nisbatan nazorat sharoitida transfeksiya uchun hujayra o'limi 45-55 foizni tashkil etdi). iPGE hissasini qo'shimcha qo'llab-quvvatlashgipoksiya-induktsiyalangan HK-2 hujayra o'limi, bizning oldingi topilmalarimizgipoksiyaiPGE ning hujayra tarkibining ko'payishini aniqlaydi,1 va bu o'sish PGT inhibitörleri tomonidan oldini oldi (2c-rasm).

MAPK signalizatsiya yo'llari apoptozni qo'zg'atishi mumkin, chunki iEP retseptorlari epidermal o'sish omili retseptorini (EGFR) 36 transaktiv qiladi, bu HK-2 hujayralarida0 MAP kinazlari ERK1/2 va p38 faollashishiga olib keladi - HK{7}} hujayralarining EGFR faollashuvi AG1478 inhibitori bilan inkubatsiyasining oldini olish;gipoksiya- hujayra o'limiga olib keladi. Biz salbiy natijalarni topdik (2d-rasm) va shuning uchun EGFR transaktivatsiyasi HK{2}} hujayra o'limiga vositachilik qilishi dargumon.gipoksiya.

Bir nechta eksperimental modellarda mitoxondrial kelib chiqadigan ATP ning qisqarishigipoksiyaproapoptotik Bax oqsilining antiapoptotik protein Bcl{2}} ifoda nisbatining oshishiga olib keladi, bu esa sitozolga sitoxrom C ajralishiga, 9-kaspazaning faollashishiga va keyinchalik quyi oqim, effektorning parchalanishi va faollashishiga olib keladi. kaspazlar37,38. Biroq, ostida HK-2 hujayralarida PGT inhibitori BG bilan oldindan inkubatsiyagipoksiyaBc-2 va Bax (2e-rasm) ifodasi o'rtasidagi muvozanatning antiapoptotik siljishiga mos keladigan o'zgarishlarga olib kelmadi, bu HK-2 hujayradagi bu oqsillarning rolini qo'llab-quvvatlamaydi. ostida o'limgipoksiya.

Gipoksik ta'sirdan so'ng, reoksigenatsiya epizodlari (ishemiya/reperfuziya shikastlanishi) hujayraning qo'shimcha shikastlanishiga olib kelishi mumkin. Reoksigenatsiya shikastlanishining "paradoksi" hujayralar ferment faolligida, mitoxondriyal funktsiyada, sitoskeletal strukturada, membranani tashishda va antioksidant himoyada o'ziga xos o'zgarishlarga duchor bo'lishini hisobga olgan holda tushunilishi mumkin.gipoksiya, bu keyinchalik birgalikda reoksigenatsiya shikastlanishiga moyil bo'ladi39. Reoksijenatsiya ishemik insult, buyrak transplantatsiyasi, qon aylanish etishmovchiligi yoki buyrak va yurak-qon tomir jarrohlik operatsiyalari paytida o'tkir buyrak shikastlanishiga yordam beradi. Shu nuqtai nazardan, inhibisyonning potentsial terapevtik qiymatigipoksiya/COX ga aralashuv orqali reoksigenatsiya natijasida proksimal quvurli hujayralar o'limi-2(siklooksigenaza)/iPGE,/iEP retseptorlari yo'li aniq. Shuning uchun biz iPGE maxsus vositachilik qiladimi, deb so'radikgipoksiya-hujayra o'limiga olib keladi yoki vositachilik qiladigipoksiya/reoksigenatsiya natijasida kelib chiqqan hujayra o'limi (in vivo buyrak ishemiyasi/reperfuziya shikastlanishini taqlid qiluvchi in vitro modeli). 2f-rasmda ko'rsatilganidek, COX-2 tomonidan hujayra o'limi (tripan ko'k sho'ng'inni istisno qilish testi bilan baholangan) oldini oldi.(siklooksigenaza)selekoksib inhibitori, shuningdek, AH6809 yoki GW627368X EP retseptorlari antagonistlari tomonidan. 2a-rasmdagi kabi, bu natijalar COX-2 tegishli rol o'ynashini ko'rsatadigipoksiya/reoksigenatsiya natijasida kelib chiqqan hujayra o'limi va aniqrog'i, hujayra o'limiga COX vositachilik qiladi-2(siklooksigenaza)-PGE ning ishlab chiqarilishiga bog'liq, chunki u EP retseptorlari antagonizmi bilan to'xtatilgan. Biroq, hujayra o'limi PGT inhibitörleri bromokrezol yashil yoki bro-mosulfoftalein tomonidan to'sqinlik qilmaganligi sababli (2f-rasm va qo'shimcha 2d-rasm), ehtimol bu ko'proq.gipoksiya/reoksigenatsiya natijasida HK-2 hujayra o'limiga faqat hujayradan tashqari PGE vositachilik qiladi.

HIF{0}}COX ning transkripsiyaviy regulyatsiyasiga bog'liq-2(siklooksigenaza)gen ifodasi a ga hissa qo'shadigipoksiya-proksimal quvurli HK-2 hujayralarida iPGE ning ortishi. PGE, biosintez araxidon kislotasining membrana glitserofosfolipidlaridan fosfolipaza A tomonidan chiqarilishini, so'ngra araxidon kislotasining COX izoenzimlarini prostaglandin H ga aylantirishni va nihoyat, prostaglandinlarning H dagi prostaglandin E ga izomerlanishini o'z ichiga oladi. mikrosomal PGE sintaza-1 (mPGES-1)19 kabi. Biz buni topdikgipoksiya-HK-2 hujayralarida induktsiya qilingan apoptoz, ehtimol, COX-2 vositachiligida bo'ladi.(siklooksigenaza)-PGE ishlab chiqarishning o'sishiga bog'liq,(2-rasm). COX-2(siklooksigenaza)tomonidan ifodalanishi mumkin bo'lgan fermentgipoksiya, biz faraz qildikki, agipoksiya-PGE ning ko'payishi, HK-2 hujayralarida ishlab chiqarish COX-2 ifodasining oshishi oqibati bo'lishi mumkin.(siklooksigenaza). Gipotezamizni tasdiqlash uchun biz (i) ta'sirini o'rgandikgipoksiyaCOX ifodasi-2(siklooksigenaza)oqsil va mRNK va (ii) COX ta'siri-2(siklooksigenaza)selekoksib inhibitorigipoksiya-iPGE ning o'sishiga olib keldi, Bizning natijalar shuni ko'rsatdikigipoksiyaCOX ning transkripsiyaviy yuqori regulyatsiyasi vaqtinchalik tarzda aniqlanadi-2(siklooksigenaza)ifoda (3a,b-rasm) va bu COX-2(siklooksigenaza)inhibisyon ostida HK-2 hujayralarida iPGE ko'payishini to'xtatdigipoksiya(3c-rasm). Qizig'i shundaki,gipoksiyamPGES-1 oqsil ifodasining vaqtinchalik yuqori regulyatsiyasini ham aniqladi (3a-rasm, ichkari), lekin mPGES-1 mRNK ifodasiga ta'sir qilmadi (3b.-rasm). Bu natijalar COX-2 ifodasini oshirganligini ko'rsatdi.(siklooksigenaza)va mPGES-1 uchun javobgardirgipoksiya- iPGE ning ortishi.

3-rasm. COX ning HIF ga bog'liq transkripsiya regulyatsiyasi-2(siklooksigenaza)gen ekspressiyasi proksimal quvurli HK-2 hujayralarida iPGE ning gipoksiyadan kelib chiqqan ko'payishiga yordam beradi.(a) COX ifodasi-2(siklooksigenaza)oqsil vaqtincha ko'payadigipoksiya(Western blot tahlili). Inset: mPGES-1 proteini ifodasi ham vaqtincha yuqori tartibga solinadigipoksiya. (b) COX ifodasi-2(siklooksigenaza)mRNK vaqtincha ko'payadigipoksiya. Inset: mPGES-1 mRNK ifodasi ta'sir qilmaydigipoksiya. (c) Selekoksib, COX ning oldini olish-2(siklooksigenaza)tomonidan qo'zg'atilgan iPGE o'sishining inhibitorigipoksiya. Hujayralar 3 mkM selekoksib bilan 1 soat davomida oldindan inkubatsiya qilindi. Chap∶PGE, mustaqil immunofloressensiyaga bog'liq yoki DAPI bilan yadroviy bo'yash bilan birlashtirilgan (original kattalashtirish, 40 ×). O'ngda: Image J dasturidan foydalangan holda chap panelda taqdim etilgan tasvirlarga miqdoriy yondashuv. (d) transkripsiya mexanizmlarining hissasi. Chapda: transkripsiya inhibitori aktinomitsin D (akt. D) a ni oldini oladigipoksiya- COX ning ortishi-2(siklooksigenaza)oqsil ifodasi (Western blot tahlili). Hujayralar 1 ug/ml akti bilan lh uchun oldindan ishlov berildi. D ta'sir qilishdan oldingipoksiya3 soat davomida. O'ngda: COX faolligining oshishi-2(siklooksigenaza)muxbir tuzilishi. (e) HIF-la YC-1 inhibitori oldini oladigipoksiya-induktsiyalangan transkripsiyali COX-2(siklooksigenaza)yuqori tartibga solish. Hujayralar 1 soat davomida 0,5 uM YC-1 bilan oldindan inkubatsiya qilindi. Chapda: COX ning oldini olish-2(siklooksigenaza)yuqori tartibga solish. Hujayralar ta'sir qilishdigipoksiya8 soat davomida. Markaz: COX faolligi oshishining oldini olish-2(siklooksigenaza)muxbir tuzilishi. O'ngda: HREga asoslangan reportyor konstruktsiyasining faoliyatini taqiqlash. Hujayralar ta'sir qilishdigipoksiya8 soat davomida (f) HIF-la inhibitori YC-1 apoptotik hujayralar o'limini oshiradi (oqim sitometriyasini o'rganish). Ta'sir qilishdan oldingipoksiya, hujayralar 1 soat davomida 0.5 mM YC-1 bilan oldindan inkubatsiya qilindi. Inset∶ YC-1 ni inhibe qiladigipoksiya-HIF-1ifadesining ortishi (Western blot tahlili). Umumiy ma'lumot: (1) Hujayralar "Usullar" da ko'rsatilganidek, normoksik (21 foiz O,) yoki gipoksik (1 foiz O,) sharoitda 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. (2) Mikrofotosuratlar uchta mustaqil tajribaning namunaviy namunasidir. (3)Western blot tahlili: Proteinning tengligi anti{8}}aktin antikori bilan tekshirish orqali tasdiqlandi (4) Grafiklardagi chiziqlar va xato chiziqlari: Har bir chiziq 3 xil tajribaning oʻrtacha±SEM koʻrsatkichini bildiradi *P<0.01 vs.="" other="">

Transkripsiya mexanizmlarining COX ko'payishiga qo'shgan hissasini batafsil o'rganish uchun-2(siklooksigenaza)ostida protein ifodasigipoksiya, COX ifodasi-2(siklooksigenaza)HK-2 hujayralarida baholandi, ular transkripsiya inhibitori aktinomitsin D bilan oldindan inkubatsiya qilingan.gipoksiya5 soat davomida. 3d-rasmda ko'rsatilganidek,gipoksiya- COX ning ortishi-2(siklooksigenaza)oqsilning ifodalanishi aktinomitsin D tomonidan to'xtatildi. Bundan tashqari,gipoksiyaCOX faolligi oshishini ham aniqladi-2(siklooksigenaza)ilgari HK-2 hujayralarida transfektsiyalangan promotor konstruktsiyasi (o'ngdagi 3d-rasm). 3d-rasmda ko'rsatilgan natijalar birgalikda olingan bo'lsa, transkripsiya mexanizmlari agipoksiya- COX ning ortishi-2(siklooksigenaza)protein ifodasi. Shunga qaramay, COX-2 promouterini faollashtirish vaqti va maksimal COX-2 vaqti o'rtasida tafovut bor edi.(siklooksigenaza)mRNK ifodasi: COX ning vaqtinchalik o'sishi-2(siklooksigenaza)mRNK ifodasi 2 soatdan keyin maksimal bo'ldi (3b-rasm), COX{2}} promotori 3 soatdan keyin faollashdi (3d-rasm), bu transkripsiyadan keyingi mexanizmlarning COX{{6 ko'payishiga qo'shgan hissasini aks ettiradi. }}(siklooksigenaza)ifoda 4. Shunga ko'ra, biz COX-2 deb taxmin qilamiz.(siklooksigenaza)mRNK ostida stabillashadigipoksiya, bu COX darajasining oshishiga olib keladi-2(siklooksigenaza)mRNK ifodasi (o'sha paytda) COX faolligining kuchayishi-2(siklooksigenaza)targ'ibotchi. Shu bilan birga, promotorning faollashishi va o'lchanadigan substratning to'planishi o'rtasidagi vaqt oralig'i COX-2 promouterining faollashuv vaqti va maksimal COX{{1 vaqti o'rtasidagi nomuvofiqlikka ham hissa qo'shishi mumkin. }}(siklooksigenaza)mRNK ifodasi.

HIF-1 - kislorodga bog'liq bo'lgan subbirlikdan va konstitutsiyaviy ifodalangan -subbirlikdan tashkil topgan geterodimerik transkripsiya omili. ostidagipoksiya, HIF-l to'planadi va yadroga kiradi, u erda HIF-1 bilan dimerlanishdan so'ng HIF-1 transkripsiya faktorini hosil qiladi. HIF-1 keyin oʻzining maqsadli genlarini bogʻlash orqali ifodalanishini ragʻbatlantiradigipoksiya- javob beruvchi elementlar (HREs) o'zlarining tartibga soluvchi mintaqalarida mavjud bo'lib, keyinchalik ular bilan kurashish uchun uyali adaptiv javoblarni tartibga soladi.gipoksiya 3. Sharti bilan; inobatga olgan holdagipoksiyaCOXni faollashtirishi mumkin-2(siklooksigenaza)COX-2 promouter ketma-ketligida mavjud bo'lgan funktsional HRE orqali-1-HIFga bog'liq holda ifodalanganda, biz HIF-l ning rolini ko'rib chiqdik.gipoksiya- COX ning ortishi-2(siklooksigenaza)ifoda. Shuningdek, biz HK-2 hujayralarida transfektsiyalangan COX-2 promouter konstruksiyasi faolligini ko‘rib chiqdik. 3e-rasmda ko'rsatilganidek, HIF-1ingibitor YC-1 bilan oldindan inkubatsiya qilishgipoksiya-HIF-la ifodasi va HRE muxbiri konstruksiyasi faolligining ortishi, COX ning ikkala ifodasi oshishining oldini olishga olib keldi-2(siklooksigenaza)va COX faoliyati-2(siklooksigenaza)HK-2dagi promouter konstruktsiyasiga taalluqligipoksiya. Xulosa qilib aytganda, natijalar 3a-e-rasmda ko'rsatilgan HIF{2}}COX ning transkripsiya ko'tarilishi-2ga bog'liq degan fikrni qo'llab-quvvatlaydi.(siklooksigenaza)uchun javobgardirgipoksiya-iPGE2 ning induktsiyalangan ko'payishi.

Garchi HIF{0}}a faollashuvining oqibatlarigipoksiya-induktsiyalangan apoptoz munozarali (ehtimol, ular kontekstga bog'liq bo'lishi mumkin), biz eksperimental tizimimizda HIF{2}}a rolini (oldindan) tahlil qildik. Biz COX ga aralashuvni oldindan aniqlaganimiz uchun-2(siklooksigenaza)/iPGE, EP retseptorlari yo'li HIF-la ifodasining ko'payishini inhibe qiladigipoksiya8,56 biz HIF-la ning inhibisyoni oldini olishga olib keladimi, deb so'radikgipoksiya-induktsiyalangan HK-2 hujayra apoptozi. 3f-rasmda ko'rsatilganidek, HIF-l inhibitori YC-1 bilan oldindan inkubatsiya haqiqatda oshdi.gipoksiya- qo'zg'atilgan apoptoz. Shuning uchun HlF-la bo'lishi dargumon

Munozara

To'qimagipoksiyaSurunkali buyrak kasalligi va o'tkir buyrak shikastlanishi patofiziologiyasida muhim ahamiyatga ega, chunki PTC buyrak kanalchalarining eng sezgir qismi hisoblanadi.gipoksiya. Bu erda biz PGE ning etkazilgan zarardagi rolini ko'rib chiqdikgipoksiyainson PTC va iPGE ishlab chiqarishning ko'payishi COX ning HIFga bog'liq bo'lgan yuqori regulyatsiyasidan kelib chiqqanligini aniqladi-2(siklooksigenaza)gen ifodasi va mPGES-1 ning ortib borayotgan ifodasi, hissa qo'shadigipoksiya-HK-2 hujayralarida apoptotik hujayralar o'limiga olib keldi. Naychali gipoksiya ham oʻtkir, ham surunkali buyrak kasalliklari-2 uchun tegishli omil ekanligini hisobga olsak, bu natijalar prostaglandin tashuvchi PGTni buyrak kasalliklarida yangi terapevtik maqsad sifatida koʻrsatadi.

Gipoksiyanafaqat iPGE ni oshiradi, balki uni hujayradan tashqari muhitga chiqaradi8, shuning uchun ajratilgan (hujayradan tashqari) PGE ham rol o'ynashi mumkin.gipoksiya-induktsiyalangan apoptoz (masalan, hujayra membranasida joylashgan EP retseptorlarining kanonik faollashuvi orqali apoptotik kaskadlarni qo'zg'atish). Oldingi ikkita tadqiqot shuni ko'rsatdiki, hujayra o'limi ostidagipoksiyaCOX tufayli ham bo'lgan-2(siklooksigenaza)-bog'liq PGE ishlab chiqarish,1345. Boshqa tomondan, ma'lum hujayra turlarida (fibroblastlar, mikrogliyalar, neyronlar va o'tkir limfoblastik leykemiya hujayra liniyalari) PGE tomonidan qo'zg'atilgan apoptoz EP-retseptorlarining PGE ga bog'liq faollashuvi46-48 orqali amalga oshiriladi. Biz buni shu yerda topdikgipoksiya-induktsiyalangan HK-2 hujayra apoptozi EP retseptorlari antagonizmi bilan ham oldini oldi (2a-rasm, yuqori panel, o'ng). Ammo EP retseptorlari klassik tarzda plazma membranasi retseptorlari sifatida ta'riflanganligi sababli, ular iPGE2-uchun etib bo'lmaydigan bo'lib, biz hipoksik HK-2 hujayralarida iPGE ning apoptotik ta'sirida vositachi bo'lgan EP retseptorlari ekanligini taxmin qilamiz. kichik to'plam hujayra ichida joylashgan (ya'ni iEP retseptorlari).

iPGE2 ning rolidan farqli o'laroqgipoksiya-HK-2 hujayralarida induktsiya qilingan apoptoz, biz faqat hujayradan tashqari PGE vositachilik qilishini aniqladik.gipoksiya/reoksigenatsiya natijasida kelib chiqqan HK-2 hujayra o'limi, chunki bu PGT inhibitörleri tomonidan to'xtatilmagan (2f-rasm). Keyinchalik hujayra shikastlanishining patologik mexanizmlari bo'lsa-dagipoksiya/reoksigenatsiya to'liq tushunilmagan, hujayra o'limi asosan haddan tashqari reaktiv kislorod turlarini (ROS) ishlab chiqarish orqali sodir bo'lishi qabul qilinadi. Bu, ayniqsa, HK-2 hujayralari49,50 uchun to'g'ri keladi. Biroq, garchigipoksiyaROS ishlab chiqarishni ham ko'paytirishi mumkin, bizning ma'lumotlarimiz bo'yicha ROS muhim rol o'ynashi haqida hech qanday dalil yo'qgipoksiya-HK-2 hujayralarining o'limiga olib keladi. Bu shuni ko'rsatadiki, HK-2 hujayralarida gipoksiya va gipoksiya/reoksigenatsiyaning halokatli ta'siri turli mexanizmlar tomonidan vositachilik qiladi, bu BG va BS ning nima uchun himoya ekanligini tushuntirishi mumkin.gipoksiyalekin qarshi emasgipoksiya/reoksigenatsiya. Binobarin, PGTni inhibe qilish PTCda gipoksiyadan kelib chiqqan hujayra shikastlanishiga qarshi terapevtik foyda keltirishi mumkin, ammo uning zararli ta'siriga qarshi emas.gipoksiya/reoksigenatsiya.

HIF-1 -COX yuqori tartibga solinishiga bog'liq-2(siklooksigenaza)uchun muhim voqea edigipoksiya-induktsiyalangan HK-2 hujayra apoptozi (3e-rasm). Biroq, HIF inhibitori YC-1 apoptotik hujayralar o'limini kuchaytirganini kuzatishimiz (3f-rasm) hayratlanarli, garchi oldingi hisobotlarda shunga o'xshash natijalar ko'rsatilgan edi1. Mumkin tushuntirishlardan biri gipotetik stsenariy bo'lib, HIF-la nafaqat COX ning proapoptotik yuqori regulyatsiyasiga vositachilik qiladi-2(siklooksigenaza)shuningdek, himoya molekulalarining yuqori regulyatsiyasi. Darhaqiqat, HIF{1}}himoya molekulalarining ifodasini tartibga solgangipoksiyakabi uzoq kodlanmagan RNK DARS-AS1' va microRNK-2103 HK-2 hujayralarida maxsus topilgan. Biroq, bu dalillar bizning faraziy stsenariyimizni qo'llab-quvvatlasa ham, uni tasdiqlash uchun maxsus tajribalar o'tkazilishi kerak.

Buyrak hujayralarining javobini o'rganishgipoksiyabuyrak patologiyasi haqidagi tushunchamizni yaxshilashi mumkin. Biz, garchi dastlabki tarzda, proapoptotik protein Bax va antiapoptotik protein Bcl-2 ifoda nisbati ortishi rolini o'rgandik.gipoksiya-HK-2 hujayralarida induktsiya qilingan apoptoz. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, PGL ning inhibisyonu Bcl -2 va Bax (2e-rasm) ifodasi o'rtasidagi muvozanatdagi antiapoptotik siljish bilan mos keladigan o'zgarishlarga olib kelmadi, bu esa ushbu oqsillarning rolini qo'llab-quvvatlamaydi. ostida iPGE bog'liq HK-2 hujayra o'limigipoksiya. Bizning ma'lumotlarimizga ko'ra, Bcl{0}}/Bax o'qining PTCdagi gipoksiya bilan qo'zg'atilgan apoptozga ta'siri bo'yicha faqat ikkita tadqiqot mavjud va ularning ikkalasi ham anoksik" yoki deyarli anoksik O, konsentrasiyalarda ishtirok etgan5 PTC 0,2% O. taʼsirida boʻlganida, Bax ifodasi oʻzgarishsiz qoldi va apoptoz Bcl-2 ifoda darajasining pasayishi bilan bogʻliq edi, ammo Bcl-2 ifodasi 1 foiz O.ga taʼsir qilmadi. Apoptoz mavjudligi, bu bizning natijalarimizga to'g'ri keladi.Shuning uchun Bcl-2 yoki Bax ifodasidagi miqdoriy o'zgarishlarni talab qilmaydigan boshqa mexanizmlar ham ko'rib chiqilishi kerak: masalan, iPGE2 tomonidan yetishtirilgan glioma hujayralarida apoptozning induksiyasi faqat uning Bax bilan fizik assotsiatsiyasi, bu Baxning mitoxondriyaga ko'chirilishini qo'zg'atadi202. Shunday qilib, iPGE HK-2 hujayra apoptoziga hissa qo'shish mexanizmi qo'shimcha o'rganishga loyiqdir.

Guruhimiz COX-2 ekanligini aniqladi.(siklooksigenaza)-iPGE ga bog'liq o'sish, sisplatin ta'sirida HK-2 hujayralarida apoptotik o'limga vositachilik qiladi, apoptotik tanachalar7" vagipoksiya(hozirgi natijalarimiz). PGE hujayradan tashqariga tez ajratilgandan so'ng chiqariladi2, uning PGl orqali ichkariga tashilishi HK-2 hujayralarida iPGE tomonidan induktsiya qilingan apoptozda muhim rol o'ynaydi. Shuning uchun, agar PTC shikastlanishi iPGE vositachiligida bo'lsa, PGT ingibitorlari bilan davolash sisplatin tomonidan qo'zg'atilgan PTC shikastlanishining oldini olish, apoptotik tanalar orqali quvurli shikastlanishning tarqalishini inhibe qilish yoki potentsial ilovalar bilan foydali terapevtik yondashuv bo'lishi mumkin. ning zararli ta'sirigipoksiyaPTC-da.