MSH-stimulyatsiya qilingan melanogenezni bostirish va UVA-nurlangan keratinotsitlarda antioksidant Nrf2 yo'llarini faollashtirish orqali ektoinning terini oqartiruvchi ta'siri

Aloqa: Audrey Xu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Xseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1, Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 va Xsin-Ling Yang 8,*

Annotatsiya:Ultrabinafsha A (UVA) - nurlanish bilan bog'liq bo'lgan reaktiv kislorod turlari (ROS) haddan tashqari ko'p ishlab chiqarishga yordam beradi.melanogenezteri hujayralarida pigmentatsiyaga olib keladi. Biz tabiiy bakterial osmolit bo'lgan ektoinning ultrabinafsha nurlanishi bilan nurlangan inson (HaCaT) keratinotsitlarida pigmentatsiyani yo'qotish va anti-melanogen ta'sirini ko'rsatdik va asosiy molekulyar mexanizmlar aniqlandi. HaCaTcelllar past konsentratsiyali ektoin (0,5–1,5 mkM) bilan oldindan ishlov berildi va turli pigmentatsiya va anti-melanogen parametrlar uchun tahlil qilindi. Ushbu oldindan davolash ROS ishlab chiqarishni, -melanositlarni ogohlantiruvchi gormon (-MSH) ishlab chiqarishni va UVA-nurlangan HaCaT hujayralarida proopiomelanokortin (POMC) ifodasini sezilarli darajada pasaytirdi. Shuningdek,antioksidantgem oksigenaza-1 (HO-1),NAD(P)H dehidrogenaza [xinon 1] (NQO-1) va -glutamat-sistein ligaza katalitik subunit (-GCLC) oqsili ifodalari edi. Eritroid yadroviy omil2-bog'liq bo'lgan 2 (Nrf2) omilining yadroviy translokatsiyasi orqali vositachilik qilingan, uning ishdan chiqishi haqiqatan ham Nrf2 yo'lining muhimligini bildiruvchi bu ta'sirni buzgan. Ektoin Nrf2 ning p38, protein kinaz B (shuningdek, AKT deb ataladi), protein kinaz C (PKC) va kazein kinaz II protein kinaz (CKII) yo'llari orqali faollashishiga vositachilik qilgan. Ectoine oldindan ishlangan va UVA nurlangan HaCaT hujayralaridan olingan shartli vositatirozinaza, tirozinaza bilan bog'liq protein-1 va -2 (TRP-1/-2), siklik AMP (c-AMP) protein kinaz, c-AMPresponse elementini bog'lovchi oqsil (CREB) ) va mikroftalmiya bilan bog'liq transkripsiya omili (MITF) ifodalari, melanin sintezini inhibe qilgan B16F10 melanoma hujayralariga olib keladi. Qizig'i shundaki, -MSH-stimulyatsiya qilingan B16F10 hujayralarida bu anti-melanogen ta'sir faqat ektoinning 50-400 mkM kontsentratsiyasida kuzatilgan bo'lib, bu ektoin (0,5-1 mkM) bilan ishlov berilgan keratinotsitsin terisi o'ynagan asosiy rolni bildiradi.oqlasheffektlar. Biz Ektoinni depigmentatsiya va anti-melanogen ta'sirga ega samarali topikal tabiiy kosmetika vositasi sifatida ishlatish mumkin degan xulosaga keldik.

Kalit so‘zlar:ektoin; keratinotsitlar;melanogenez; tirozinaza; -MSH; Nrf2

Cistanche oksidlanishga qarshi ta'sirga ega.

1.Kirish

Inson terisini UVA nurlanishiga ta'sir qilish ROS hosil bo'lishiga va teri hujayralarida melaninning ortiqcha ishlab chiqarilishiga olib keladi. ROS ning nazoratsiz ishlab chiqarilishi melanoma sharoitlariga ham olib kelishi mumkin. Ko'pchilik terini oqartiruvchi vositalar maqsadli va minimallashtirishga harakat qilmoqdamelanogenezjarayon -MSH va inhibisyonu orqalitirozinazaishlab chiqarishlar [1]. Ko'pchilik teri rangini oqartiruvchi kremlar gidroxinon [2] yoki gidrokortizon [3] dan iborat bo'lib, ular melanin butarining shakllanishini kamaytiradi, shuningdek, jiddiy yon ta'sirlar bilan bog'liq. Masalan, akne, terining qichishi va qichishi, terining ko'k va qora rang o'zgarishi, oxronoz, terining yonishi va qichishi, hatto yallig'lanishi.oqlashTabiiy manbalardan olingan vositalar, masalan, Kojik kislotasi (Penicillium va Aspergillus turlaridan olingan qo'ziqorin hosilasi) ham sezgir teriga ega bo'lgan odamlarda "kontakt dermatit" ni keltirib chiqarishi haqida xabar berilgan. Bunday odamlarda kojik kislotaning 1 foizdan ko'prog'i kuchli yuqori sezuvchanlik yon ta'siriga olib kelishi mumkin [4,5]. Shuning uchun, faqat bir nechta tabiiy olingan terioqlashmahsulotlar (oleosin, qizilmiya ekstrakti, askorbin kislotasi, soya oqsili, N-atsetil glyukozamin va boshqalar) hozirda kosmetika sanoatida qo'llanilmoqda [6]. Biroq, asosan depigmentatsiya xususiyatlariga qaratilgan terini parvarish qilish mahsulotlari ba'zida UVA nurlanishidan kelib chiqqan ROS ishlab chiqarish vositachiligida yuzaga keladigan zararli ta'sirlarga qarshi turishga e'tibor qarata olmadi.melanogenezteri hujayralarida.

Ektoin stressli sharoitlarda bir necha turdagi mikroorganizmlardan hosil bo'lgan "tabiiy ekstremolit" dir [7,8]. Ushbu birikma birinchi marta Misr cho'lida yashovchi bakteriyalarning Ectothiorhodospira turlaridan ajratilgan. Ushbu birikmani ishlab chiqarishda ekt operon genlari (ectA, ectB, ectC yoki ectD) kaskadi ishtirok etadi. Ektoin kimyoviy jihatdan 1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidinkarboksilik kislota [9] sifatida belgilangan. Ektoin namlikni bog'lovchi sifatida terining hujayra membranasini qayta qurishga yordam beradi [10], ultrabinafsha nurlanishidan va ifloslanishdan himoya qiladi [11,12], terini namlaydi [13], terining erta qarishini sekinlashtiradi [14] va hokazo. Ektoin atopik dermatit [15], Altsgeymer [16], shuningdek, OIV replikatsiyasini inhibe qilish [17], radio va kimyoterapiya [18] va jigar sirrozini davolashda foydali ekanligi isbotlangan. 19].Ektoin o'zining depigmentatsiya va terini oqartiruvchi xususiyatlarini istalmagan nojo'ya ta'sirlarni keltirib chiqarmasdan namoyon qilishi taxmin qilinadi [20]. Aksincha, Ektoin tomonidan ishlab chiqarilgan molekulyar mexanizmlar noma'lum. Shu sababli, ushbu tadqiqotning maqsadi hujayra model tizimi sifatida UVA nurlangan inson (HaCaT) keratinotsitlarida paydo bo'lgan ektoin vositachiligida depigmentatsiya va anti-melanogen mexanizmlarni aniqlash edi. HaCaT hujayralaridan terini himoya qiluvchi moddalarning ektoin tomonidan ishlab chiqarilgan sekretsiyasining madaniy muhitga (shartli muhit) ta'siri, shuningdek, odatdagi melanoma hujayralari (B16F10) liniyasi yordamida ham sinovdan o'tkazildi.

2. Materiallar va usullar

2.1. Reaktivlar va antikorlar

Ektoin (Mahsulot raqami: 81619, tozaligi 95 foizdan yuqori yoki unga teng) Sigma-Aldrichdan (Taufkichen, Germaniya) xarid qilingan. Homila sigir zardobi (FBS), penitsillin/streptomitsin, Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle'smedium (DMEM) va l-glutamin Invitrogen/Gibco BRL (Karlsbad, CA, AQSH) dan sotib olindi. l-DOPA, melanin, 3-4,5-dimetil-2-il-2,5-difenil tetrazolium bromid (MTT) va -MSH Sigma Chemical Co.dan xarid qilingan (Sent-Luis, MO, AQSH). N-asetilsistein (NAC) va 20,70-diklorofloressein-diatsetat (DCFH2-DA) Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSH) xarid qilingan. JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X) va CKII uchun zarur bo'lgan barcha farmakologik ingibitorlar Calbiochem (La Jolla, CA, AQSh) PI3K/AKT inhibitori (LY29402) dan olingan. Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSh). POMC, CREB, -aktin uchun barcha antikorlar,tirozinaza, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, Kelchga o'xshash ECH bilan bog'liq protein-1 (Keap-1) va TRP-1, TRP-2 Santa Cruz Biotechnology Inc.dan (Heidelberg, Germaniya) olingan. Antikorlar -GCLC va HO-1 Gene Tex Inc.dan (San-Antonio, TX, AQSh) xarid qilingan. Biz Abcamdan (Kembrij, MA, AQSh) c-AMP protein kinaz va CKII ga qarshi antikorlarni oldik. Gistonlar, MITF, p-p38, p38, p-AKT va AKT Cell Signal Technology (Beverli, MA, AQSh) dan olingan. Kengaytirilgan xemiluminesansni (ECL) aniqlash reagentlari Millipore, (Billerica, MA, AQSH) dan olingan. Boshqa barcha reagentlar (HPLC darajasida) Sigma-Aldrich yoki Merck & Co., Inc.dan sotib olingan. (Darmshtadt, Germaniya).

2.2. Hujayra madaniyati

Biz Cell Line Services (CLS, Eppelheim, Germaniya) va American Type Culture Collection (ATCC, VA, AQSH) dan inson terisi keratinotsit HaCaT va murin melanomasi B16F10 hujayralarini o'lmas holga keltirdik. Hujayralar 10 foiz issiqlik bilan faollashtirilgan FBS, 1 foiz streptomitsin/penitsillin va 2 mM L-glutamin bilan to'ldirilgan DMEMda 37 ◦C haroratda 5 foiz CO2 bilan to'ldirilgan namlangan inkubatorda yetishtirildi.

2.3. Hujayralarni davolash va UVA-nurlanish

UVA nurlanishidan oldin hujayralar Ectoine (0, 5-1,5 mM 24 soat) yoki transport vositasi (PBS) bilan oldindan ishlov berilgan. Inkubatsiyadan keyin PBS bilan yuvilgan hujayralar UV CROSS-LINKER CL-508 (UVItec, Kembrij, Buyuk Britaniya) [21].

2.4. Hujayra ichidagi ROS tahlili

HaCaT xujayralari 10% FBS bilan to'ldirilgan DMEMni o'z ichiga olgan 8-quduq Lab Teck kamerasiga 1,5 × 105 inç zichlikda ekilgan va 80 foiz qo'shilish darajasigacha o'stirilgan. Bu hujayralar avvaliga 1,5 mkM ektoin bilan ishlov berildi, so'ngra belgilangan vaqt davomida 3 J/sm2 UVA nurlanishiga ta'sir qilindi. Hujayralar PBS bilan yuvildi va hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarishni aniqlash uchun DCFH{10}}DA usuli qo'llanildi. har bir holat uchun Olympus Software yechim dasturidan foydalanish [21].

2.5. Melanin miqdorini aniqlash

6-Quduq plastinkasiga sichqoncha melanomasi B16F10 xujayralari 2,5 × 105 hujayra/quduq zichligida ekilgan. Ular -MSH yo'qligi yoki mavjudligida 2 soat davomida 100, 200 va 400 mkM ektoin bilan oldindan ishlov berilgan. (1 mkM). Melanin miqdorini aniqlash uchun ishlatiladigan protokol ilgari tasvirlangan usulga amal qilgan [21]. Biz melanin tarkibini 470 nm yutuvchi to'lqin uzunligiga ega ELISA mikroplastinka o'quvchi bilan o'lchadik.

cistanche melaninni inhibe qiladi.

2.7. Western Blot

HaCaT (1 × 106 hujayra/10 sm idish) yoki B16F10 (1 × 106 hujayra/10 sm idish) hujayralari turli konsentrasiyalarda ektoin (0,5, 1 va 1,5 mkM) yoki -MSH (1) bilan oldindan ishlov berilgan. mM) keyin belgilangan vaqt davomida UVA yo'qligida yoki mavjudligida nurlanish. PBS yuvilgan hujayralar yig'ib olindi, davolashdan so'ng protein tarkibi (yadro va sitozolik) ajratildi. Keyin hujayralar turli yadroviy va sitozolik oqsillarning ifodalarini aniqlash uchun ilgari qo'llanilgan Western blot usulidan o'tkazildi [21].

2.8. RNK ekstraktsiyasi va RT-PCR

Oldindan ishlov berilgan ektoin (1,5 mkM, 24 soat) HaCaT hujayralari bu hujayralardan umumiy RNKni ajratib olish uchun TRIzol reagentiga (Invitrogen, Carlsbad) ta'sir qildi. Bio-Rad iCycler PCR asbobi (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Qoʻshma Shtatlari).Nrf2 uchun toʻgʻridan-toʻgʻri va teskari primerlar ishlatilgan: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. GAPDH uchun oldinga va teskari primerlar ishlatilgan: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Tajriba oxirida PCR mahsuloti 1 foizli agaroz jeli yordamida tahlil qilindi. Keyin, etidiumbromid bilan bo'yash bilan ingl. Ichki nazorat sifatida biz GAPDH dan foydalandik [22].

2.9. Immunofloressensiya tahlili

HaCaT hujayralari 8-quduq Lab Tek kamerasida (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSH) 10% FBS bilan DMEM qo'shimchasida 1 × 104 hujayra/quduq zichligida yetishtirildi. Belgilangan vaqt davomida biz hujayralarni 1,5 mkM ektoin bilan oldindan qayta ishladik, so'ngra UVA yo'q yoki mavjud bo'lganda nurlanishni davom ettirdik. Hujayralar immunofluoresans tahlilidan o'tkazildi, bunda avval tavsiflangan usul qo'llaniladi [21].

2.10. Statistik tahlil

Biz ushbu tadqiqotda foydalanilgan barcha natijalar uchun o'rtacha ± standart og'ish (o'rtacha ± SD) dan foydalandik. Barcha ma'lumotlar dispersiya tahlili (ANOVA) bilan tahlil qilindi, so'ngra Dunnettning juftlik taqqoslashlari uchun testi o'tkazildi va o'rtacha ± SD uchtasi sifatida taqdim etildi. yoki ko'proq mustaqil tajribalar. Statistik ahamiyatlilik * p < 0="" da="" oʻrnatildi.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.0="" ishlov="" berilmagan="" nazorat="" hujayralari="" bilan="" solishtirganda="" 01="" va="" #="" p="">< 0,05;="" ##="" p=""><0,01; uva="" ta'siriga="" uchragan="" hacat="" hujayralari="" yoki="" -msh="" bilan="" ishlov="" berilgan="" b16f10="" hujayralari="" bilan="" solishtirganda="" ###="" p=""><>

3. Natijalar

3.1. Ektoin HaCaT hujayralarida UVA-induktsiyali ROS generatsiyasini inhibe qildi

Birinchidan, biz Ektoinning (1A-rasm) UVA nurlangan HaCaT hujayralariga sitotoksik ta'sirini sinab ko'rdik. Bizning MTT ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, ishlov berilmagan nazorat hujayralari bilan solishtirganda, ektoin oldindan ishlov berilgan (0,5–1,5 mkM) va 3 J / sm2 UVA ta'siriga uchragan HaCaT hujayralari hujayralilikning sezilarli pasayishini ko'rsata olmadi (1B-rasm). Bundan tashqari, ektoin bilan oldindan ishlov berish dozaga bog'liq holda UVA (3 J / sm2) tomonidan qo'zg'atilgan hujayra o'limini susaytirdi (1B-rasm). Bizning floresan ma'lumotlarimizga qo'shimcha ravishda, nazorat hujayralari bilan solishtirganda, 3 J/sm2 UVA nurlanishi va faqat ektoin bilan davolash (1,5 µM) ROS darajasini 5- va 2- barobarga sezilarli darajada oshirdi, mos ravishda. Biroq, Ectoinepretreatment holatida ROS darajalari sezilarli darajada pasaygan va biz Ektoinning mavjudligi haqida xulosa qilishimiz mumkin.antioksidantUVA nurlanishiga qarshi ta'sir. Bu, shuningdek, HaCaT hujayralarida bazal ROS darajasini keltirib chiqaradi (1C, D-rasm).

3.2. UVA-nurlangan HaCaT hujayralarida ektoin bostirilgan POMC va -MSH ifodalari

UVA ta'siriga duchor bo'lgan keratinotsitlar ROS-p53 vositachiligidagi POMC va shuningdek, POMC dan olingan kichikpeptid gormoni - MSH uchun rag'batlantirildi [23]. Shuning uchun biz Ectoine bilan oldindan ishlangan HaCaT hujayralarida -MSH, POMC va boshqa bog'langan oqsillarning o'zgarishini ifodalash modellarini aniqladik va keyin ularni UVA (3 J / sm2) ta'siriga duchor qildik. Western blot ma'lumotlari shuni ko'rsatdiki, UVA ta'siri ostida -MSH va POMC ifodalarining yuqori regulyatsiyasi Ektoinni oldindan davolash bilan pastga tushirilgan; Holbuki, UVA nurlanishisiz ektoinetreatment nurlanmagan HaCaT hujayralarining -MSH va POMC ifodalarini butunlay inhibe qilgan (2A-rasm). Keyinchalik, biz Ectoine bilan oldindan ishlangan va UVA nurlangan HaCaT hujayralaridan olingan "shartlangan o'rta" (10 ml/100 mm plastinka) ning ta'sirini sinovdan o'tkazdik.melanogenezB16F10 melanoma hujayralari. 2B-rasmda bu shartli muhit pastga regulyatsiya qilinganligini ko'rsataditirozinaza, B16F10 hujayralarida TRP-1, TRP-2, c-AMP protein kinaz, p-CREB, CREB va MITF darajalari.

3.3. -MSH-stimulyatsiya qilingan B16F10 hujayralarida ektoinni pasaytiradigan melanin va tirozinaz ifodasi

B16F10 melanoma hujayralari birinchi navbatda Ektoinning yuqori kontsentratsiyasiga duchor bo'ldi va MTT tahlili yordamida sitotoksiklik ta'siri aniqlandi. Shakl 3A shuni ko'rsatadiki, Ektoin B16F10 hujayralarining yuqori konsentratsiyalarda (72 soat davomida 100-400 mkM) hayotiyligiga sezilarli ta'sir ko'rsatmagan. Biroq, hujayra hayotiyligi Ektoin bilan davolashning 24 va 48 soatlarida ta'sirlanmadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Shuning uchun, bu konsentratsiyalar Ektoinning -MSH-rag'batlantiruvchi ta'sirini aniqlash uchun ishlatilganmelanogenezB16F10 hujayralarida. Melanin miqdorini aniqlash ma'lumotlari shuni ko'rsatdiki, nazorat hujayralari bilan solishtirganda, faqat -MSH (1 mkM) bilan davolash melanin darajasini 25 foizdan ko'proqqa sezilarli darajada oshirdi. Biroq, faqat -MSH bilan davolash bilan solishtirganda, ektoinning ortib borayotgan kontsentratsiyasiga (72 soatda 100-400 mkM) ta'sir ko'rsatadigan hujayralar dozaga bog'liq va melanin miqdorini sezilarli darajada pasaytiradi, maksimal pasaytirish atigi 85 foizga (yoki ishlov berilmaganga nisbatan -15 foiz) nazorati) 400 mkM ektoinga oldindan ishlov berishda kuzatildi (3B-rasm). Bundan tashqari, bizning Western blot ma'lumotlarimiz ham -MSH rag'batlantirilishini ko'rsatditirozinaza(24 soat) va p-CREB (2 soat) ifodalari ushbu melanoma hujayralarida Ektoinni oldindan davolash konsentratsiyasining ortishi bilan sezilarli darajada pasaygan (3C-rasm).

3.4. Ektoin HaCaT hujayralarida HO -1, NQO-1 va -GCLC oqsillarining ifodasini kuchaytirdi

Vaqtning Nrf2 ning ektoin vositachiligida yadro translokatsiyasiga va HO -1, NQO-1 va -GCLC oqsillarining quyi oqimidagi ifodasiga ta'sirini aniqlash uchun HaCaT hujayralari 1,5 mkM Ektoinga ta'sir qildi va hujayra oqsillari yig'ildi. 0.Ektoinoterapiyadan 5, 1, 2, 4, 8 yoki 12 soat keyin. Western blot ma'lumotlari shuni ko'rsatdiki, -GCLC oqsilidan tashqari, 1,5 mkM Ektoin 4 soatlik vaqt nuqtasida HO-1, Nrf2 va NQO{18}} oqsillarining maksimal ifodalanishiga sabab bo'lgan. -GCLC 8 soatlik vaqt nuqtasida ko'rsatilgan (5A-rasm). Vaqt egri chizig'idan olingan ma'lumotlar bizni ektoin kontsentratsiyasining ifodaga ta'sirini sinab ko'rishga olib keladiantioksidantoqsillar 4 soat vaqt nuqtasida. 5B-rasmda barcha uchta antioksidant oqsilning 1,5 mkM ektoin kontsentratsiyasida maksimal ifodalanganligi ko'rsatilgan. Keyinchalik, Ektoinni oldindan davolashning ta'siri UVA nurlangan HaCaT hujayralarida Nrf2 va Keap{6}} nisbati ifodasi bo'yicha sinovdan o'tkazildi. G'arb ma'lumotlarini tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, 1,5 mkM ektoin bilan oldindan ishlov berish UVA nurlangan HaCaT hujayralarida Nrf2/Keap-1 nisbatining oshishini ko'rsatdi (5C-rasm). -1, H2O-1 va -GCLC oqsillari 3 J/sm2 UVA bilan nurlangan HaCaT hujayralarida Ectoine oldindan ishlov berilgan (5D-rasm). Ushbu ma'lumotlar ektoinni oldindan davolash UVA nurlangan HaCaT hujayralarida himoya rolini o'ynashini ko'rsatadi.

3.5. Ektoin bilan ishlov berilgan HaCaT hujayralarida Nrf2 faollashuvida turli signal yo'llari ishtirok etgan.

Biz Nrf2 ning Ektoin vositasida yadroviy translokatsiyasida ishtirok etadigan signalizatsiya yo'llarini aniqladik. HaCaT xujayralari PI3K/AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS va CKII signalizatsiya yo'llarining farmakologik ingibitorlari bilan, so'ngra 1,5 mkM Ektoin bilan oldindan davolandi. Nrf2 yadrosining Western blot ma'lumotlari p38 MAPK, PI3K/AKT, PKC va CKII yo'llari ushbu mexanizmda ishtirok etganligini ko'rsatdi (6A-rasm). Olingan ma'lumotlardan biz Ektoinni oldindan davolashning antioksidant oqsillarni ifodalashda ushbu yo'llarning roliga ta'sirini aniqladik. 6B-rasmda MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII va PKC yo‘llarining farmakologik inhibisyoni NQO-1, HO-1 va -GCLC ifodasini pasaytirganligini ko‘rsatadi.antioksidantHaCaT hujayralaridagi oqsillar. Bundan tashqari, Ektoin ta'sirida AKT, p38 fosforlanishi va PKC va CKII ifodasi uchun zarur bo'lgan vaqt shuni ko'rsatadiki, p-AKTdan tashqari, p38 fosforlanishi va PKC va CKII ifodalari keyinroq sodir bo'lgan. faqat vaqt nuqtalari (30 daqiqadan keyin) (6C-rasm). AKT holatida fosforlanish 15 daqiqadan boshlab 30 daqiqada cho'qqisiga etgan (6C-rasm) kuzatilgan. AKT holatida fosforillanish 30 daqiqada eng yuqori nuqtaga yetgan 15 daqiqadan boshlab kuzatildi (6C-rasm). Ushbu yig'ilgan natijalar p38, AKT, PKC va CKII signalizatsiya yo'llari Antioksidantlar Ektoin vositachiligida yadro translokatsiyasini faollashtirganini ko'rsatdi. Nrf2 antioksidant oqsillarni ifodalashga olib keladi.

3.6. Ektoin vositachiligida anti-melanogen ta'sir Nrf2 ning ishdan chiqishi tufayli bostirildi.

Ektoin vositachiligida Nrf2 ning rolimelanogenezHaCaT hujayralarida Nrf2 ni o'chirish orqali aniqlandi. Western blot ma'lumotlari shuni ko'rsatdiki, 1,5 mkM ektoinga ta'sir qilgan Nrf2 nokdaun hujayralari NQO -1, HO -1 va -GCLC ning minimal ifodasini ko'rsatdi.antioksidantoqsillar (7A-rasm). Keyinchalik, biz Nrf2 nokdaunining UVA nurlangan (3 J / sm2) HaCaT hujayralarida -MSH darajasining ifodasiga ta'sirini sinab ko'rdik. Western blot natijalari shuni ko'rsatdiki, siRNK transfektsiyasilangan hujayralarni nazorat qilish uchun UVA-nurlanish ektoin ta'siriga uchramagan hujayralardagi -MSH darajasining ifodasini oshirishda muhim ahamiyatga ega (7B-rasm). Biroq, 1,5 mkM ektoin bu ta'sirni bostirdi. Boshqa holatda, siNrf2 bilan transfektsiyalangan hujayralar ham ishlov berilmagan, ham davolangan hujayralarda -MSH darajasining pasayishini ko'rsatdi (7B-rasm). -MSH ma'lumotlariga o'xshab, bizning floresan ma'lumotlarimiz ham UVA nurlanishi Ectoine ishlov berilmagan nazorat siRNA hujayralarida ROS ishlab chiqarishni sezilarli darajada oshirganligini ko'rsatdi (7C, D-rasm). Biroq, hujayralar 1,5 mkM ektoinga ta'sir qilganda bu ta'sir sezilarli darajada bostirildi. Boshqa tomondan, Nrf2 transfektsiyasilangan va UVA nurlangan HaCaT hujayralari UVA bilan nurlanmagan, ammo Ektoin bilan davolashga duchor bo'lgan Nrf2 transfektsiyasilangan hujayralarga nisbatan ROS darajasining taxminan 8- barobar ortganini ko'rsatdi (7C, D-rasm). Bu ma'lumotlarning barchasi UVA nurlangan HaCaT hujayralarida melanin ishlab chiqarishni minimallashtirishda Nrf2 tomonidan o'ynagan Ectoine vositachiligidagi himoya rolini bildiradi. Antioksidantlar 2020, 9, x FOR PEER REVIEW UVA bilan nurlangan, ammo ektoin bilan davolashga duchor bo'lgan 15 tadan 11 tasi (7C-rasm) . Bu ma'lumotlarning barchasi UVA-nurlangan HaCaT hujayralarida melanin ishlab chiqarishni minimallashtirishda Nrf2 tomonidan o'ynagan Ektoin vositachiligidagi himoya rolini anglatadi.

cistanche foydasi: terini oqartirish

4. Munozara

Har xil teri -oqlashagentlari kosmetika sanoatida qo'llaniladi. Ushbu agentlarning aksariyati kimyoviy kelib chiqishi va turli xil yon ta'sirlarni, shu jumladan saraton kasalliklarini keltirib chiqarish cheklovlaridan aziyat chekmoqda [24-26]. Shuning uchun, xavfsiz va tabiiy terini oqartiruvchi vositalarni aniqlash vaqt talabidir. Ektoin (1A-rasm) yuz kremlari va boshqa kosmetik vositalarning faol moddasi sifatida ishlatilgani ma'lum. Bu terini namlovchi vosita sifatida ishlaydi va terining erta qarishini ham kechiktiradi [27]. Deyarli barcha ma'lum bo'lgan terini oqartiruvchi vositalar terining pasayishiga qaratilgantirozinazaUV nurlangan hujayralardagi ferment faolligini pasaytiradimelanogenezteri hujayralarida.Yao va boshqalar. ni namoyish etdioqlashbiosintezlangan ektoinning xususiyatlari va uning aputativ oqartiruvchi vosita ekanligini taklif qildi. Ular o‘z tadqiqotida sichqoncha melanomasi (B16F0) va inson melanomasi (A2058) hujayra liniyalariga oqartiruvchi ta’siri uchun ektoinning yuqori konsentratsiyasini (500 mkM) sinab ko‘rdilar va Ektoin xavfsiz va xavfsiz ekanligi haqidagi xulosaga kelishdi. kosmetik va klinik qo'llash uchun potentsial agent [20]. Biroq, ushbu tadqiqotda biz ektoinning past konsentratsiyasining (0,5-1,5 mkM) UVA-nurlangan HaCaT hujayralariga foydali ta'sirini qo'shimcha sinovdan o'tkazdik va asosiy molekulyar mexanizmlar shifrlangan. Bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, Nrf2 / ARE yo'li orqali ektoin nafaqat antioksidant gen ekspressiyasini keltirib chiqardi, balki POMCni bostirish orqali UVA-nurlangan HaCaT hujayralarida -MSH darajasini pasaytirdi. -MSH darajasining pasayishi melanin ishlab chiqarishning pasayishiga olib keladigan tirozinaza fermenti faolligini pasaytirish bilan bog'liq edi. Bizning ma'lumotlarimizga ko'ra, bu birinchi bo'lib UVA-nurlangan HaCaT hujayralarida Ektoin tomonidan ishlab chiqarilgan mexanizm bilan tasdiqlangan hisobot. Ushbu tadqiqot hujayra modeli tizimi sifatida HaCaT hujayralarida Ektoin tomonidan ko'rsatilgan molekulyar mexanizmlarni tasvirlab berdi.

Biz birinchi navbatda Ektoinning halokatli kontsentratsiyasini, shuningdek, UVA nurlanishining HaCaT hujayralarining hayotiyligiga ta'sirini aniqladik. Bizning MTT ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, Ektoinning past konsentratsiyasi (0,5-1,5 mkM) HaCaT hujayralarining hayotiyligiga sezilarli ta'sir ko'rsatmaydi (1B-rasm). Ektoinni oldindan davolash 3 J/sm2 UVA nurlangan HaCaT hujayralarining hayotiyligini oshirdi (1B-rasm). Ushbu kuzatishlarga asoslanib, biz 3 J/sm2 dozalarda 1,5 mkM Ektoinni oldindan tozalash va UVA nurlanishidan foydalangan holda keyingi tajribalarni davom ettiramiz.

Teri keratinotsitlarida UVA nurlanishi ta'sirida ROS hosil bo'lishi hammaga ma'lum faktdir [28]. Shu sababli, biz HaCaT hujayralarida UVA-nurlanishdan kelib chiqadigan ROS ishlab chiqarishda Ectoine-ni oldindan davolashning har qanday foydali ta'sirini sinab ko'rdik. Bizning DCF-fluoresans intensivligi haqidagi ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, 1,5 mkM ektoin bilan oldindan ishlov berish UVA nurlanishidan kelib chiqqan ROS ishlab chiqarish inkeratinositlarini sezilarli darajada pasaytirgan. Bundan tashqari, 1,5 mkM ektoin HaCaT hujayralarida statistik ahamiyatga ega bo'lgan ROS darajasining bazal darajasining oshishiga olib kelishi mumkinligi ham kuzatildi (1D, E-rasm).

Russo va boshqalar. POMC inson epidermal keratinotsitlari va melanotsitlar tomonidan chiqariladi va rag'batlantiriladi.melanogenez[29]. Buni hisobga olgan holda, biz ham UVA nurlanishi va ektoinni oldindan davolashning HaCaT hujayralaridagi melanogenez bilan bog'liq oqsillarga ta'sirini sinab ko'rdik. Bizning Western blot ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, UVA-nurlangan HaCaT hujayralarida -MSH va POMC oqsillari ekspressiyasining dozaga bog'liq bo'lgan regulyatsiyasi Ectoine bilan oldindan ishlov berish natijasida yuzaga kelgan.melanogenez- bog'langan oqsillar. Ta'kidlash joizki, deyarli barcha sinovdan o'tgan oqsillar (Tirozinaza, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinkinaz, CREB va MITF) UVA-nurlangan HaCaT hujayralarida Ectoinepre-davolash kontsentratsiyasi ortib borishi bilan ifodalarning kamayishini ko'rsatdi (2A, B-rasm). Ushbu ma'lumotlar Ectoinening UVA nurlangan HaCaT hujayralarida anti-melanogen xususiyatlarga ega ekanligini ko'rsatadi.

Ektoinning anti-melanogen ta'siri qo'shimcha ravishda B16F10 hujayralarida sinovdan o'tkazildi.melanogeneztadqiqotlar [30]. Tadqiqotimizdagi e'tiborga molik kuzatuvlardan biri shundaki, HaCaT hujayralaridan farqli o'laroq, -MSH bilan stimulyatsiya qilingan B16F10 hujayralarida melanin sintezini bostirish uchun ektoinning yuqori konsentratsiyasi (100-400 mkM) zarur edi (3B-rasm). Bizning G'arbiy blot ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, Ektoin dozaga bog'liq ravishda ekspressionni pasaytiraditirozinazava -MSH-stimulyatsiya qilingan B16F10 hujayralarida p-CREBproteinlari yuqorida aytilgan effektga olib keladi (3C-rasm). Shu sababli, ektoinning yuqori konsentratsiyasi B16F10 hujayralarining hayotiyligiga ta'sir qilishi mumkinmi yoki yo'qmi, biz ham sinovdan o'tkazildi. Bizning MTT natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, ektoinning yuqori konsentratsiyasi (100–400 mkM) B16F10 hujayralarining hayotiyligiga ta'sir qilmaydi (3A-rasm). Ushbu natijalar keratinotsitlar ektoin-mediatedantida asosiy rol o'ynashini ko'rsatadi.melanogenezva depigmentatsiya effektlari.

Nrf2 transkripsiya omilining teri hujayralari metabolizmidagi roli yaxshi hujjatlashtirilgan [31]. Shuning uchun biz Nrf2/Keap{3}} yo'lining keratinotsitlardagi ektoin vositachiligidagi ta'sirida o'ynaydigan mexanizmlarni qo'shimcha sinovdan o'tkazdik. Shakl 4A Ektoin dozasiga bog'liq va Nrf2/Keap-1 nisbatini sezilarli darajada oshirganligini ko'rsatadi, maksimal ta'sir 1,5 mkM ektoin konsentratsiyasida kuzatilgan. Shuningdek, 1,5 mkM ektoin Nrf2 oqsilining yadroviy translokatsiyasini qo'llab-quvvatlagani, 2 soatlik vaqt nuqtasida kuzatilgan yadro oqsili fraktsiyasidan Nrf2 ning maksimal ifodalanishi (4B-rasm). HaCaT hujayralarining immunofluoresans bo'yashidan olingan ma'lumotlar ham bu ta'sirni qo'llab-quvvatladi (4D-rasm).

Inson melanotsitlari va keratinotsitlarida Marrot va boshqalar. va boshqalar foto-oksidlovchi stress reaktsiyalarida Nrf2 mudofaa yo'lining ahamiyatini tushuntirdilar [32]. Biz ham HaCaT hujayralarida Ectoinemediated antioksidant oqsil ifodasining ta'sirini o'rgandik. Bizning vaqt egri chizig'i ma'lumotlari shuni ko'rsatdiki, barcha uchta antioksidant oqsilning (HO -1, NQO -1, -GCLC) va Nrf2 ning ektoin vositachiligida ifodalanishi vaqt o'tishi bilan ikki fazali tarzda ifodalanishi ko'rsatilgan ({{ 8}}.5-12 soat) kuzatilishi mumkin bo'lgan ta'sir 4 soat vaqt nuqtasida qayd etilgan (5A-rasm). Bundan Ectoineconcentration ning ta'sirini o'lchaydigan konsentratsiya egri chizig'iantioksidantoqsil ifodasi ham 4 soatlik vaqt nuqtasida aniqlandi. 5B-rasmda ko'rsatilgandek, ishlov berilmagan hujayralar bilan solishtirganda, Ektoin bilan davolash dozaga bog'liq holda HO-1, NQO-1, -GCLC oqsillari ifodasini oshirgan. Shuningdek, biz ektoin kontsentratsiyasining UVA nurlanishiga duchor bo'lgan HaCaT hujayralarida qanday himoya ta'sirini ko'rsatishini o'lchadik. Western blot ma'lumotlari shuni ko'rsatdiki, Ektoin dozaga bog'liq ravishda antioksidant oqsillarni Nrf2/Keap-1 nisbatida keskin tartibga solish bilan ko'paytirdi (5C, D-rasm). Ushbu natijalar shuni ko'rsatdiki, Ectoinepretreatment (1,5 mkM, 4 soat) UVA ta'siridan kelib chiqadigan zararli ta'sirlarga qarshi turishi mumkin bo'lgan HaCaTcelllarda antioksidant oqsillarni ifodalash uchun potentsial ta'sirga ega.

antioksidant tsistanche

5. Xulosalar

Yuqoridagi ma'lumotlardan biz ektoinning past konsentratsiyasi (0,5-1,5 mkM) POMC va bostirish orqali -MSH va melanin ishlab chiqarishni kamaytirishi mumkin degan xulosaga keldik.tirozinazaUVA nurlangan HaCaT xujayralari yo'li, bu uning antiseptik ekanligini ko'rsatadi.melanogenezsamaradorlik. Bundan tashqari, ektoin HaCaT hujayralarida hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarishni bostirishda ham ishtirok etgan. HaCaT hujayralaridan farqli o'laroq, ektoinning yuqori konsentratsiyasi (50-400 mkM) B16F10 melanoma hujayralarida xuddi shunday ta'sir ko'rsatishi mumkin edi, bu keratinotsitlar ektoin vositachiligida asosiy rol o'ynashi mumkinligini ko'rsatdi.melanogenezva teri -oqlashteri hujayralariga ta'siri. Eng muhimi, Ektoin Nrf2 yo'lining faollashuvi orqali foydali ta'sir ko'rsatdi, bu esa ifodani keltirib chiqaradi.antioksidantoqsillari HO-1, NQO-1 va -GCLC. AKT Nrf2 ning faollashuvini boshlaydigan birinchi signal yo'li bo'lib, keyin boshqa yo'llar (p38, PKC va CKII) ko'rsatilgan. Nihoyat, Nrf2-ni o'chirish to'g'ridan-to'g'ri Nrf2 hujayra ichidagi ROS va -MSH ishlab chiqarishni tartibga solishda muhim rol o'ynashini isbotladi. Biz ektoinning asosiy oqartirish mexanizmi UVA-nurlangan HaCaT hujayralarida ROS-p53/POMC- -MSH yo'lini inhibe qilish bilan asoslanishi kerak degan xulosaga keldik. Shuning uchun ektoin yoki uning hosilalari namlovchi va losonlarning faol moddasi bo'lishi mumkin. ular potentsial va tabiiy asosli teri sifatida ishlatiladioqlashkosmetika sanoatida agentlar.

antioksidant cistanche qo'shimchasi